III Diskussion

1. Etablierung der TaqMan-PCR zur Quantifizierung von Virus-DNA

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Zur Quantifizierung der Viruslast im Zellkultur-Überstand können verschiedene Methoden zum Einsatz kommen, wie zum Beispiel der endogene Polymerase-Assay, die Southern Blot Analyse oder die real time PCR (TaqMan-PCR). Um die bei den ersten beiden Methoden in der Regel genutzte Radioaktivität der Proben zu vermeiden und um eine hohe Sensitivität und gute Reproduzierbarkeit zu erreichen, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Methode der TaqMan-PCR bevorzugt.

Heid et al. (1996) berichten über eine Methode zur Quantifizierung von RNA und DNA, welche den 5´-Nuklease-Assay (Holland et al., 1991) und die PCR miteinander verbindet. Die Methode nutzt die 5´-Nuklease-Aktivität der Taq-Polymerase um eine nicht verlängerbare Hybridisierungsprobe während der Verlängerungsphase der PCR zu hydrolysieren. Die Probe ist mit zwei verschiedenen Fluorophoren markiert (Lee et al., 1993; Bassler et al., 1995; Livak et al., 1995a,b). Ein Fluoreszenzfarbstoff agiert am 5´-Ende als Reporter (FAM), sein Emissionsspektrum wird durch einen zweiten Fluoreszenzfarbstoff (TAMRA) am 3´-Ende gequencht. Durch die Nuklease-Aktivität der Taq-Polymerase wird die Probe degradiert, so dass der Reporterfarbstoff freigesetzt und nicht mehr gequencht wird. Dadurch nimmt die Fluoreszenz bei 518nm zu. Das ABI Prism (PE Applied Biosystems) erlaubt die Detektion der Fluoreszenz während der PCR, so dass die Reaktion in "Echtzeit" (real time) aufgenommen wird. ΔRn (Reporter-Fluoreszenzemission/Quencher-Fluoreszenzemission) reflektiert die Menge an degradierter Hybridisierungsprobe (Sonde).

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Verschiedene Arbeitsgruppen haben die real time PCR mit Fluoreszenzfarbstoffen zur Quantifizierung der Hepatitis-B-Viruslast in Seren genutzt. Hauptsächlich wurden die Primer und die Sonden im Bereich des PreS/S-Gens und im Bereich des x-Gens gewählt (Brechtbuehl et al., 2001; Weinberg et al., 2000; Abe et al., 1999; Zanella et al., 2002; Pas et al., 2000; Loeb et al., 2000). Brechtbuehl et al. (2001) und Weinberg et al. (2000) isolierten die DNA aus dem Serum. Nach einer nested PCR, um die Spezifität zu erhöhen, schloss sich die eigentliche real time PCR an. Damit konnten Konzentrationen von mindestens 100-400Kopien/ml Serum nachgewiesen werden. Andere nutzten nach DNA-Isolierung mehrere Primer und Sonden für die PCR, um sicher zu gehen dass wirklich spezifisch HBV amplifiziert wird (Abe et al., 1999), d.h. bei gleicher PCR-Effizienz sollte man für alle eingesetzten Fluoreszenzproben die gleiche Anzahl an Kopien pro Ansatz erwarten. Hier lag die Nachweisgrenze ähnlich wie bei dem nested PCR-Ansatz bei ca. 200Kopien/ml Serum. Bei Arbeitsgruppen, welche die real time PCR nur mit einer Sonde durchführten, lag das Minimum der Nachweisgrenze bei 400-1000 Kopien/ml Serum (Zanella et al., 2002; Pas et al., 2000; Loeb et al., 2000). Ziel der Arbeiten war eine möglichst geringe Nachweisgrenze.

Ein anderer Ansatz zur Erhöhung der Sensitivität ist die Möglichkeit der Bindung von fluoreszierenden Oligonukleotiden an das Amplifikat (Jardi et al., 2001). Hierbei werden zwei Oligonukleotide eingesetzt, die entweder am 5´- oder am 3´-Ende markiert sind. Durch die Anlagerung der beiden Sonden an das Amplifikat und damit die räumliche Annäherung der beiden Fluoreszenzfarbstoffe, ändert sich die Fluoreszenz, welche detektiert werden kann. Die Sensitivität der Methode lag bei 1000 Kopien/ml Serum (Jardi et al., 2001). Dieser Ansatz hat jedoch den Vorteil, dass ungebundener Fluoreszenzfarbstoff in der Sonde keinen Einfluss auf ΔRn hat.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Quantifizierung der Viruslast durch die TaqMan-PCR ohne vorhergehende PCR (nested PCR) durchgeführt. Dafür wurde zunächst die Primerkonzentration optimiert. Anschließend wurde versucht, eine optimale Standardreihe von HBV-enthaltenden Plasmiden für die Versuche herzustellen. Dabei zeigte sich, dass sich bei geringer Kopienzahl im Ansatz die Abweichung der einzelnen Werte deutlich vergrößerte (Abb. 12), was rein statistisch damit zusammenhängt, ob man tatsächlich 10 Kopien oder 1 Kopie pro Reaktionsansatz pipettiert. Auch in der Literatur findet man Angaben, dass die Abweichung bei 1Kopie/Reaktionsansatz nur einer Genauigkeit von 65% erreicht wurde (Zanella et al., 2002). Allerdings war es nicht Ziel die genaue Kopienzahl der viralen DNA zu bestimmen, sondern das relative Konzentrationsverhältnis zwischen den Proben.

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Eine sorgfältige Evaluation der Isolierungsmethoden von viraler DNA war notwendig, da trotz aller vorhergehender Optimierung der PCR die Reproduzierbarkeit der Menge an viraler DNA im Gegensatz zum HBV-Plasmid sehr schlecht war.

Die Isolierung von viraler HBV-DNA aus Seren wird häufig mittels eines kommerziell angeboten Kits durchgeführt (Weinberg et al., 2000; Abe et al., 1999; Zanella et al., 2002; Pas et al., 2000; Jardi et al., 2001; Loeb et al., 2000). Die Kriterien für die Auswahl einer geeigneten DNA-Isolierungsmethode aus Viren in Zellkultur-Überständen waren deshalb die Reproduzierbarkeit der Werte, die Menge an detektierter DNA und die Handhabbarkeit der Methode.

Jeder zusätzliche Arbeitsschritt birgt eine weitere Fehlerquelle. Die Menge an detektierbarer DNA kann sich verändern, wie man in den Abbildungen 14 und 15 sieht. Bei Abbildung 14 ist die Standardabweichung der konzentrierten Probe 3 geringer als bei der nicht aufkonzentrierten Probe 4. Im Gegensatz dazu ist es bei Abbildung 15 genau umgekehrt. Außerdem kann es von Vorteil sein, auf standardisierte Kits zurückzugreifen, da hier die Standardabweichungen geringer sind (Abb. 15). In Abhängigkeit von der Ausgangskonzentration der Viren im Zellkultur-Überstand, kann entweder eine Konzentrierung oder eine Verdünnung sinnvoll sein. Die Konzentrierung des Zellkultur-Überstandes scheint ohne anschließende Isolierung der viralen DNA einen inhibierenden Effekt auf die TaqMan-PCR zu haben, welcher wahrscheinlich durch die hohe Konzentration an Proteinen hervorgerufen wird (Abb. 15). Auch die alternativ mögliche Verdünnung der DNA ist ein zusätzlicher Schritt, bei dem Fehler auftreten können. Daher ist es nicht unbedingt sinnvoll die DNA zu verdünnen, wenn sich auch so eine angemessene Menge an DNA detektieren lässt (Abb. 16).

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Die Änderung der Fluoreszenz ist ein Maß für die Menge an degradierter Sonde und damit auch für die Menge an DNA. Daher ist die Reinheit der Sonde von Bedeutung. Reinheit bedeutet, dass möglichst beide Farbstoffmoleküle an das Oligonukleotid gekoppelt sein müssen. Ein Oligonukleotid an welchem der Reporter nicht gequencht wird, verursacht eine hohe Anfangsfluoreszenz. Es ist dann schwierig Reporter-Fluoreszenzen, welche durch die Degradation der Sonde hervorgerufen werden, von der Anfangsfluoreszenz zu unterscheiden.

Ursache für die geringe Änderung der Fluoreszenz (ΔRn) (Abb. 13) der Sonde HBsAg könnte die zu geringe Kopplungsrate der Fluoreszenzfarbstoffe bei der Sonde sein. Dies könnte an der verwendeten Charge liegen. Allerdings ließ sich das Problem nicht bei einer erneuten Bestellung bei einem anderen Hersteller beheben.

Im Handbuch des ABI PRISM 7700 sind mehrere Faktoren angegeben, die das Quenchen der Fluoreszenz beeinflusst. Die Sonde sollte möglichst keine "hairpins" bilden, noch sollte die Sequenz komplementär zu den Primern oder sich selbst sein. Durch Computeranalyse (Primer Premier 5, Firma Premier Biosoft) wurde festgestellt, dass in der Sequenz drei komplementäre Stellen vorhanden sind, d.h. die Sonde HBsAg kann mit sich selbst Multimere bilden. Auch ein Guanidin am 5´-Ende im Anschluss an den Reporterfarbstoff kann die Fluoreszenz quenchen. Außerdem wirken sich vier oder mehr gleiche Basen in einer Reihe negativ auf den Quenching-Effekt aus. Außer den komplementären Stellen in der Sonde wurden keine weiteren Eigenschaften gefunden, welche den Quenching-Effekt beeinflussen. Möglicherweise liegt hier die Ursache für die geringe Fluoreszenzänderung. In dem die Sequenz beschreibenden Artikel (Pas et al., 2000) ist keine Aussage über die Qualität und die Struktur der Sonde getroffen worden.

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Nach weiterer Literaturrecherche wurde eine Sonde verwendet, welche im überlappenden Bereich der HBV-Polymerase- und des HBx-Gens hybridisiert. Bei der Sonde HBxSondeTM1 ist die Änderung der Fluoreszenz (ΔRn) wesentlich stärker (Abb. 17), das bedeutet, dass die Kopplungsrate hoch war. Damit lassen sich auch geringere Mengen an DNA quantifizieren und auch geringere Konzentrationsunterschiede feststellen.

Für die TaqMan-PCR als Methode zur Quantifizierung von Viruslast wurde eine optimale Primerkonzentration von 900nM bei 250nM Sonde bestimmt. Relativ genaue Werte mit geringer Standardabweichung lassen sich im Bereich von 100-10.000.000 Kopien pro Ansatz nachweisen. Die Reinigung viraler DNA aus Zellkultur-Überstand erbrachte mit dem High pure viral nucleic acid kit (Roche) die besten Ergebnisse, in Bezug auf die Reproduzierbarkeit und die Genauigkeit der Werte. Zusätzliche alternative Arbeitschritte, wie verdünnen oder konzentrieren beeinflussen die Genauigkeit der Werte negativ. Die Sonde HBxSondeTM1 zeigte gegenüber der Sonde HBsAg eine größere Änderung der Fluoreszenz. Dadurch konnte die Genauigkeit der Messungen erhöht werden.

2. Antikörpergenerierung und -reinigung

Die PreS2-Region ist im MHBs auf der Außenseite des Virus lokalisiert und damit für Antikörper zugänglich. Sie ist sehr immunogen (Neurath et al., 1984). In der PreS2-Region sind unterschiedliche Subtypen-spezifische Epitope lokalisiert (Neurath et al., 1986b). Die PreS2-spezifische Antikörper reagieren auch mit subviralen Partikeln, in denen das MHBs enthalten ist.

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Das im Rahmen der Arbeit unter Verwendung von rekombinanten PreS2 gewonnene Antiserum ist PreS2-spezifisch (Abb. 32). Die N-terminalen 32 Aminosäuren der PreS2-Region bilden immundominante Epitope für T- und B-Zellen. Das Translokationsmotiv AS 41-52 wird nicht erkannt, was in Übereinstimmung mit der beobachteten geringen Immunogenität dieser Region steht. Dies bedeutet, dass die synthetischen Peptide mit dem Serum nicht detektiert werden können (Daten nicht gezeigt). Durch die Reinigung des Serums über eine Affinitätschromatographiesäule wurde eine höhere Spezifität der Antikörper erreicht.

3. Strukturelle Voraussetzungen der Virusreplikation

Der Zusammenbau von Virus-Partikeln ist ein essentieller Schritt im produktiven viralen Replikationszyklus. Die Interaktion des viralen Nukleokapsids mit den Hüllproteinen führt zur Bildung von umhüllten Viren (Simons & Garff, 1980). Diese Interaktion erfolgt entweder durch Matrixproteine, welche sich zwischen der äußeren Hülle und dem Kapsid befinden oder direkt über die Interaktion von Nukleokapsid und Hüllproteinen.

Für Alphaviren und Hepadnaviren wurde gezeigt, dass die Interaktion vom Nukleokapsid mit den viralen Oberflächenproteinen Voraussetzung für die Virusbildung ist (Bruss & Ganem, 1991a; Lopez et al., 1994; Suomalainen et al., 1992). Bei anderen umhüllten Viren (z.B. Rhabdoviren und Paramyxoviren) vermitteln Matrixproteine die Interaktion zwischen dem Nukleokapsid und der Virushülle (Capone & Ghosh, 1984; Portner & Murti, 1986). Auch für die Coronaviren konnte eine Interaktion zwischen Nukleoprotein und den Hüllproteinen nachgewiesen werden (Narayanan et al., 2000; Kuo & Masters, 2002). Bei dem Foamy-Virus (Spumavirus, Retroviridae) wurde der N-Terminus des Oberflächenproteins für die Interaktion mit dem gag-Protein bestimmt (Eastman & Linial, 2001; Wilk et al., 2001).

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Bei einigen umhüllten Viren (z.B. Rubella-Virus [Yao & Gillam, 2000] oder Maus Hepatitis Virus [MHV] [Kuo & Masters, 2002]) wurde festgestellt, dass, wenn man die Bindungsstelle mutiert, man die Virussekretion inhibieren kann. Für das Hepatitis B Virus ist die Bindungsstelle zwischen dem Kapsid und den Oberflächenproteinen in der zytosolischen PreS1-Region (AS 102-119) beschrieben (Bruss & Thomssen, 1994; Bruss & Vieluf, 1995). Die Untersuchung der Morphogenese von LHBs-Mutanten, welche im C-Terminus der PreS1-Region und im N-Terminus der PreS2-Region (postulierte Nukleokapsid-Bindungsstelle) deletiert sind, zeigt eine Inhibierung der Virussekretion (Bruss, 1997; Poisson et al., 1997; Le Seyec et al., 1998).

Für die Kompetition der Interaktion zwischen dem Kapsid und dem Oberflächenprotein wurden zellpermeable Fusionsproteine/Peptide verwendet. Die Vorteile, welche der Einsatz zellpermeabler Fusionsproteine/Peptide gegenüber der in der Einleitung erwähnten Methode der Mutagenese hat, sind vielfältig. Einmal können durch die Mutagenese andere Leserahmen betroffen sein. Des weiteren kann sich die Konformation des Proteins ändern und damit auch die Stabilität des gewünschten Proteins verringern. Dazu kommt bei der Mutagenese der hohe Zeitaufwand für die Einbringung entsprechender Mutationen, für die Klonierung und für die Selektionierung der richtigen Konstrukte. Vorteilhaft ist auch, dass man direkt in vivo, in der lebenden Zelle arbeiten kann, ohne dass durch die Zellpermeabilität-verleihende Sequenz die Integrität der Zelle gestört wird.

Leider haben die zellpermeablen Peptide auch Nachteile. Sie sind relativ teuer in der Beschaffung. Und man kann mit ihnen nur sequenzbedingte Interaktionen und nicht Konformations-gebundene Interaktionen analysieren. Die Möglichkeit des Nachweises solch kleiner Peptide mit Antikörpern ist eingeschränkt, da oft keine Antikörper vorhanden sind, die den interessierenden Bereich detektieren. Daher ist in der Regel eine Fluorophor-Markierung erforderlich.

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Die Zellpermeabilität der Proteine/Peptide ist ein reversibler Prozess, d.h. die Zellmembran kann in beiden Richtungen überwunden werden. Die Effekte, die in der Zelle durch die zellpermeablen Proteine/Peptide ausgelöst werden, sind durch die Halbwertszeit der Proteine/Peptide begrenzt, da sie auch durch zelleigene Proteasen abgebaut werden können.

3.1. Einfluss von synthetischen Peptiden auf HBV-produzierende Zellen

Die Möglichkeit synthetische Peptide für die Inhibierung der Interaktion von Nukleokapsiden mit den Oberflächenproteinen wurde gewählt, weil es damit möglich war nur die strukturell notwendigen Domänen (PreS1(n)) zu untersuchen.

Durch Dyson und Murray (1995) wurde gezeigt, dass im zellfreien System die Aminosäuresequenz ALLGRMKG die Interaktionen von Nukleokapsiden mit LHBs stört. Sie zeigten, dass mit einer Konzentration von 78µM die Interaktion von HBsAg mit HBcAg zu 50% inhibiert werden konnte. Im Rahmen der Arbeit wurden die Peptide PS 734/RP und PS735/RP als Positivkontrolle genutzt. Damit die Zellen nicht zu stark gestresst werden, wurde an die strukturellen Domänen noch ein TLM synthetisiert, anstatt eine Mikroinjektion der Peptide vorzunehmen.

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Um eine Möglichkeit zu schaffen, die Lokalisation der Peptide innerhalb der Zellen nachzuweisen, wurden die synthetischen Peptide Fluoreszenz-markiert. Die NHS-Kopplung des Fluoresceins an die Peptide erfolgte am N-Terminus, da außer bei den Peptiden PS 734/RP und PS735/RP keine zusätzliche freie Aminogruppe vorhanden ist. Eine Trennung des nicht markierten Peptids vom markierten Peptid erfolgt bei der Abtrennung des nicht gebundenen Farbstoffes. Das dargestellte Chromatogramm (Abb. 20) zeigt exemplarisch die Reinigung des mit Fluorescein markierten APO145. Da maximal nur ein Farbstoffmolekül pro Peptidmolekül gebunden wird, ist nur ein Peak zu sehen (Abb. 20: Fraktion A12 und A13).

Die Fluorescein-markierten Peptide sind sehr lichtempfindlich. Nach Inkubation von Zellen mit den markierten Peptiden war eine schnelle Betrachtung der Zellen notwendig, so dass keine weitere Behandlung der Zellen für Doppelimmunofluoreszenzen möglich war. Die markierten synthetischen Peptide lassen sich im Zellkern lokalisieren (Abb. 21: b). Die Kernlokalisation der synthetischen Peptide ist mit einer Änderung der Verteilung von HBcAg in der Zelle verbunden. In HBV-produzierenden Zellen befindet sich das HBcAg im Zytosol verteilt. Wirken die Peptide ein, so kann ein verstärktes Vorkommen im Kern beobachtet werden (Abb. 22: c). Das lässt auf eine Interaktion der Peptide mit dem HBcAg schließen. Das stärkere Vorkommen des HBcAg im Kern bei der Inkubation mit den synthetischen Peptiden als mit den rekombinanten Proteinen könnte an der Größe der PreS2-Region liegen.

Betrachtet man die Verteilung des HBsAg, so ist eine gleichmäßigere Verteilung im Zytosol zu erkennen, im Gegensatz zur punktuellen Anhäufung in Kernnähe in der Kontrolle (Abb. 22: b und d).

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Die Bindungsstelle für die Oberflächenproteine ist am Grunde der spike tips des Kapsids beschrieben (Ponsel & Bruss, 2003). So kann man sich vorstellen, dass sich die Peptide so anlagern, dass sie dem Kapsid die Translokation in den Zellkern ermöglichen. Das würde aber bedeuten, dass man diese Kapside auch im Zellkultur-Überstand findet, da das TLM allgemein die Eigenschaft der Zellpermeabilität vermittelt. Die Reduktion der Virussekretion HBV-produzierender Zellen aber spricht gegen diesen Mechanismus.

Eine weitere Hypothese ist möglich. Am Grund der spike tips befindet sich der C-Terminus der core-Proteine. Im C-Terminus sind nukleäre Lokalisationssequenzen (NLS) beschrieben worden (Yeh et al., 1990; Eckhardt et al., 1991). Desweiteren sind dort, mit den NLS überlappend, Phosphorylierungsstellen vorhanden (Liao & Ou, 1995), die dem core-Protein eine Bindung an den nuclear pore complex ermöglichen (Kann et al., 1999). Das Kapsid könnte durch die gebundenen Peptide nicht mehr sekretiert werden, so dass es zu einer Anreicherung kommen könnte. Ausserdem könnten die Peptide nach der Bindung die Struktur des Kapsids so verändern, dass sie die Phosphorylierung der core-Proteine mimikrieren und so die core-Proteine vermehrt an die Kernporen binden. Möglicherweise wird auch die NLS besser zugänglich, so dass die core-Proteine vermehrt im Kern nachweisbar sind.

Es ist möglich, dass die synthetischen Peptide auch an HBcAg-Dimere binden können und sie dadurch, ähnlich wie oben beschrieben, verstärkt in den Zellkern transportieren. Durch die höhere Konzentration an HBcAg im Kern könnte auch mehr pgRNA gebunden werden. Hierbei kann es zu einer sterischen Behinderung der Moleküle kommen, so dass sie nicht mehr aus dem Kern transportiert werden.

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In wie weit HBcAg im Kern einen direkten oder indirekten Einfluss auf die Virus-Replikation hat, ist nicht geklärt. Es wurde in Lebergewebe von chronisch HBV-infizierten Patienten unterschiedliche Lokalisationen von HbcAg beschrieben und in Korrelation zu detektierbarer HBV-DNA im Gewebe gebracht (Naoumov et al., 1993). Hierbei wurde festgestellt, dass bei nukleäre HBcAg-Lokalisation keine HBV-DNA im Gewebe detektierbar war.

Im Gegensatz zu den rekombinanten Proteinen ergibt sich bei den synthetischen Peptiden ein entgegengesetztes Bild der Virus-Sekretion. Hier wirkt der Bereich AS 110-119 am meisten inhibierend, dann AS 105-115 und ähnlich wie Peptid PS 735/RP der Bereich AS 101-110. Die Konzentration der eingesetzten Peptide zeigt bei 1,0µM den stärksten Effekt. Ursache dafür kann sein, dass bei viel Peptid sich TLM-Dimere bilden und damit die PreS1-Abschnitte nur schwer zugänglich sind. Bei zu geringer Konzentration können noch viele Bindungsstellen auf dem Nukleokapsid frei sein und an diese könnte das native LHBs binden. Da aber nicht vollständig verpackte Nukleokapside nicht sekretiert werden, könnte es zu einem verstärkten Transport der Nukleokapside zum Kern kommen und zur Freisetzung der viralen DNA in den Zellkern. Hier kommt es zu einer Komplettierung des (+)-Stranges und damit zu einer höheren Konzentration an ccc-DNA im Zellkern. Nur bei optimaler Peptidkonzentration wird eine maximale Reduzierung der Virussekretion erreicht.

Die Sekretion des Virus-Replikationsmarkers HBeAg wird durch die Inkubation mit den Domänen der PreS1-Region in den ersten 24h stimuliert, um dann nach weiteren 24h stark inhibiert zu werden. Die erhöhte HBeAg-Sekretion nach 24h kann auf die vermehrte Bildung von ccc-DNA im Kern und damit auf eine erhöhte Transkription des C-Gens zurückzuführen sein. Möglicherweise ist der inhibierende Effekt nach den zweiten 24h nur indirekt auf die synthetischen Peptide zurückzuführen. Guidotti et al. (1996) zeigten, dass bei Überexpression des PreC-Gens (HBeAg) in transgenen Mäusen die virale Replikation durch Destabilisierung des Nukleokapsids inhibiert wird es aber keinen Effekt auf den Gehalt an prägenomischer RNA gibt. Die Abnahme an sekretiertem HBsAg ist bei allen verwendeten Peptiden ähnlich stark, eine längere Inkubationszeit verstärkt den inhibierenden Effekt.

3.2. Einfluss von rekombinanten PreS1(n)PreS2-Proteinen auf HBV-produzierende Zellen

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Die Fusionsproteine aus den Pres1-spezifischen Sequenzen mit der PreS2-Region wurden als Alternative zu den relativ teuren synthetischen Peptiden hergestellt. Die Überlappung der Abschnitte aus der PreS1-Region sollte verhindern, dass die genaue Domäne getrennt wird. Die PreS2-Region verstärkt die Expression und enthält ein Translokationsmotiv (TLM) (Oess & Hildt, 2000), welches den Fusionsproteinen die Eigenschaft der Zellpermeabilität verleihen soll. Die PreS2-Region agiert somit als "carrier"-Molekül. Dies ist möglich, weil sie selbst nicht mit dem Nukleokapsid interagiert.

Die Zellpermeabilität der PreS2-Region wurde in der Literatur beschrieben (Saher & Hildt, 1999; Oess & Hildt, 2000). Die Zellpermeabilität der Fusionsproteine wurde durch Zellfraktionierung von HBV-produzierenden HepG2.2.15-Zellen nachgewiesen (Abb. 33). Die Fusionsproteine befinden sich im Zytosol, da hier auch die Interaktionspartner vorhanden sind. Da es sich bei der Abbildung um eine Koimmunopräzipitation mit einem HBcAg-spezifischen Antikörper handelt und dem Protein A40 (PreS2) die Kapsid-Interaktion-vermittelnde Domäne fehlt, ist auch die entsprechende Bande im Western Blot nicht sichtbar.

Die überlappenden Regionen der PreS1-Region in den Fusionsproteinen binden an das Nukleokapsid. Poisson et al. (1997) konnten bei in vitro-Experimenten keine Bindungsaffinität für die PreS2-Region an Kapside feststellen. Das konnte im Rahmen der Arbeit durch Koimmunopräzipitations-experimente bestätigt werden. Rekombinant produziertes PreS2 besitzt auch in Zellkultur keine Bindungsaffinität zu HBcAg (Abb. 33).

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Bei der Untersuchung der rekombinanten Fusionsproteine zeigte der Bereich von Aminosäure 101-115 einen stärker inhibierenden Einfluss auf die Virussekretion als der Bereich AS 115-119, wobei sich dieser Effekt noch verstärkte, je länger die Proteine einwirkten (Abb. 34). Da die Proteine, im Überschuss eingesetzt, mit den Nukleokapsiden interagieren, können die Nukleokapside nicht mehr mit ihrem eigentlichen Bindungspartner LHBs interagieren oder schon gebundenes LHBs wird verdrängt, so dass letztendlich immer weniger Virus sekretiert werden kann. Mittels in vitro-Bindungsassays zeigten Poisson et al. (1997), dass die Bindung der Interaktionsdomäne des PreS1 an das HBcAg konzentrationsabhängig ist.

Die Sezernierung von HBsAg zeigt nur einen geringen Unterschied zwischen den einzelnen Fusionsproteinen (Abb. 35). Trotzdem wird die Menge an sezerniertem HBsAg reduziert. Der Einfluss ist aber nicht sehr stark, da HepG2.2.15-Zellen einen großen Überschuss an 22nm-Partkeln bilden. Die zugegebenen Proteine werden nicht vom ELISA detektiert, da er SHBs-spezifisch ist. Die Sekretion von HBeAg als Marker für die Replikation wurde am meisten durch die Region AS 105-115 inhibiert, was mit den Daten der TaqMan-PCR übereinstimmt. Allerdings ist bei der Region AS 110-119 die Sekretion und damit auch die Replikation mehr inhibiert als bei der Region AS 101-110, was den Daten der TaqMan-PCR widerspricht.

Durch Nutzung des TLM als "carrier"-Molekül konnten die synthetisch hergestellten, HBcAg-Interaktion-vermittelnden Regionen des LHBs in Zellen gebracht werden. Die synthetischen Peptide sind zum großen Teil im Zellkern lokalisiert. Auch bei den rekombinanten Proteinen konnte eine Internalisierung beobachtet werden. Sie ließen sich im Zytosol als Interaktionspartner des HBcAgs nachweisen. Ursache für die unterschiedliche Lokalisation der rekombinanten Proteine zu den synthetischen Peptiden könnten Interaktionen der rekombinanten Proteine mit anderen Proteinen sein. Das rekombinante PreS1S2-Protein ebenso wie die synthetischen Proteine bewirken zudem eine Änderung der Verteilung der viruseigenen Proteine. Das normalerweise fast ausschließlich im Zytosol vorliegende HBcAg lässt sich auch im Kern nachweisen.

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Die Sekretion viraler Partikel und Antigene wird durch die Inkubation mit synthetischen Peptiden oder rekombinanten Proteinen beeinflusst. Eine Konzentration bei den synthetischen Proteine von 1,0µM scheint fast optimal zu sein. Es können Reduktion in der Virussekretion von ca. 60% bei APO 146 gemessen werden. Bei 2µM für die rekombinanten Proteine konnte eine ca. 40%ige Verringerung der Viruslast (PreS1 105-115) im Zellkultur-Überstand erreicht werden. Bei der Sekretion von HBeAg wurde nach 24h bei den rekombinanten Proteinen, im Gegensatz zu den synthetischen Peptiden, eine Reduktion erreicht (ca. -25% gegenüber +100% bei der Region PreS1 105-115). Die Sekretion von HBsAg ist nach der Inkubation in allen Fällen reduziert und zwar in annähernd gleichem Maß.

4. Funktionelle Voraussetzungen der HBV-Replikation

Die c-Raf-1/MEK-Signalkaskade beeinflusst das Wachstumsverhalten der Zellen, wie z.B. die Proliferation, Transformation, Differenzierung und Apoptose, abhängig davon, wie sie aktiviert wird. Im Hepatitis-B-Virus gibt es zwei bekannte Aktivatoren, zum einen das HBx und zum anderen die zytosolische PreS2-Region. Beide Aktivatoren können die c-Raf-1/ MEK-Signalkaskade auslösen, die eine Reihe von Transkriptionsfaktoren aktiviert, z.B. AP-1 oder NF-κB (Benn & Schneider, 1994; Su und Schneider, 1996, Klein et al., 1997, Su et al., 2001; Hildt et al., 1993, 2002; Natoli et al., 1992; Meyer et al., 1992). AP-1 wiederum kann an den Enhancer I im HBV-Genom binden und so die Transkription stimulieren (Ben-Levy et al., 1989).

Für das HBx wurde eine aktivierende Funktion auf den core-Promotor beschrieben aber die Expression von HBx hatte keinen Einfluss auf die Synthese von core-mRNA in HBV-transgenen Mäusen (Reifenberg et al., 1999). Zoulim et al. (1994) demonstrierten durch Mutationen im x-ORF, dass sich das WHV ohne das x-Protein nicht replizieren kann. Über ein im Enhancer I des HBV-Genoms gelegenes x-responsive element kann nukleäres HBx als Aktivator den Enhancer I aktivieren und somit seine eigene Transkription stimulieren (Spandau & Lee, 1988). Auch der zytosolische PreS2-Aktivator kann den Enhancer I aktivieren (Meyer et al., 1992).

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Um zu untersuchen, wie wichtig die beiden Aktivatoren für den viralen Lebenszyklus sind, wurde der jeweilige Aktivator selektiv geblockt oder die Signalkaskade wurde an den gemeinsamen Stellen gehemmt.

Es scheinen beide Aktivatoren wichtig zu sein, da sie beide die gleiche Signalkaskade aktivieren können. Wenn man die Eingangspunkte (Proteinkinase C und Ras) in die Signalkaskade blockiert, so ändert sich nichts in der HBV-Expression (Abb. 36). Es werden fast genauso viele Viren hergestellt, wie ohne die Blockade. Ähnliches wird beobachtet, wenn man die Aktivatoren des HBV selektiv ausschaltet. Die Menge an sekretierten Viren verändert sich nicht stark (Abb. 41). Wenn aber beide gleichzeitig ausgeschaltet sind, wird die Virusproduktion stark reduziert. Das bedeutet, dass die Aktivatoren sich gegenseitig ersetzen können. Die vorhandene Restaktivität könnte auf eine weitere aktivierte Signalkaskade zurückzuführen sein. So zeigte sich bei transienter Transfektion von HBx in nicht-HBV produzierende Zellen, dass HBx außer die c-Raf-1/MEK-Signalkaskade auch die JNK-Signalkaskade über Ras aktivieren kann (Benn et al., 1996).

Bouchard et al. (2001) wiesen durch Inhibierungsversuche nach, dass HBx über Pyk2 die Scr-Kinase aktiviert, welche wiederum Ras aktiviert. Pyk2 ist eine zytosolische, Ca2+ abhängige Kinase. Bouchard et al. (2001) vermuten, dass zytosolisches HBx die Fähigkeit besitzt, die Kalziumspeicher der Zelle (ER und Mitochondrien) zu öffnen und so eine Erhöhung des intrazellulären Kalziumspiegels hervorzurufen. Wenn intrazelluläres Ca2+ durch Chelatoren gebunden wird, wird weniger Pyk2 phosphoryliert. Gleichzeitig wird die Menge an HBV-DNA reduziert. Das kann bedeutet, wenn der Kalziumspiegel sich erhöht, verstärkt sich auch die HBV-Replikation. Daraus schließen die Autoren, dass es einen direkten Effekt von HBx auf die Virusreplikation gibt, welcher zum großen Teil nichts mit der Transkriptionsaktivierung zu tun hat.

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Der intrazelluläre Kalziumspiegel hat auch einen Einfluss auf die Aktivierung der Proteinkinase C durch den zytosolischen PreS2-Aktivator (Hildt & Hofschneider, 1998). Wird die Proteinkinase C aktiviert, kann sie die c-Raf-1/MEK-Signalkaskade aktivieren.

Welchen Einfluss die c-Raf-1/MEK-Signalkaskade auf die Virusreplikation hat, konnte durch Inhibierung einzelner Punkte in dieser Signalkaskade nachgewiesen werden. Die Inhibierung der Replikation durch einen Eingriff in eine Signalkaskade ist auch bei anderen Viren zu beobachten. Beim DHBV ist zu beobachten, dass, wenn eine cAMP-abhängige Signalkaskade aktiviert wird, die DHBV-Infektion inhibiert wird (Hild et al., 1998). Für das Influenza-Virus wurde eine Abhängigkeit der Replikation von MEK beschrieben (Pleschka et al., 2001). Durch die Inhibierung der NF-κB-Aktivierung kann die HTLV-Replikation reduziert werden (Schreck et al., 1992).

Basierend auf den dargelegten Ergebnissen, kann man über die Anwendung von Inhibitoren des Signalweges für die antivirale Therapie spekulieren. Problematisch ist allerdings, dass man in eine fundamentale intrazelluläre Signalkaskade eingreift. Würde man die Inhibitoren über einen längeren Zeitraum nutzen, würden die Zellen geschädigt. Bei einer kürzeren "Wirkungsdauer" sollte die Anwendung auf die infizierten Zellen beschränkt sein. Da die Wirkung der Inhibitoren auf die Virusreplikation sehr stark war, könnte man mit einer kurzen Behandlungsdauer und in Kombination mit anderen antiviralen Therapien versuchen, die Viren zu eliminieren.


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24.10.2005