IV Zusammenfassung

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Für den Zusammenbau des HBV-Partikels ist die Interaktion zwischen Oberflächenproteinen und dem Nukleokapsid notwendig. Zur weiteren Charakterisierung der Bindungsstelle im LHBs wurden im Rahmen dieser Arbeit drei verschiedene synthetische Peptide verwendet. Sie enthalten überlappend die Bereiche der HBcAg-Bindungsdomäne im C-Terminus der PreS1-Region und das TLM, welches die Zellpermeabilität vermittelt. Die synthetischen Peptide sind nach Internalisierung vor allem im Kern lokalisiert. Mit den synthetischen Peptiden konnte Einfluss auf die Sekretion viraler Partikel genommen werden. Hierbei zeigte sich, dass die Aminosäuren 101-115 der PreS1-Region die Interaktion zum Nukleokapsid vermittelt, während die PreS2-Domäne keine Interaktion mit dem Nukleokapsid eingeht. Die Integrität der Zelle wurde nicht gestört. Durch die Interaktion der PreS1-Region mit dem Kapsid kommt es zu einer um 40-60% verminderten Sekretion von Hepatitis-B-Viren. Auch die Sekretion von Antigenen wird inhibiert. HBeAg, als Replikationsmarker, wird bis zu 60% weniger sekretiert. Die Lokalisation von HBcAg als Interaktionspartner in HBV-produzierenden Zellen verändert sich bei Inkubation mit den synthetischen Peptiden, es tritt vermehrt im Kern auf.

Als alternative Methodik wurden rekombinante Expressionsplasmide hergestellt, welche im N-Terminus überlappend die Bereiche der HBcAg-Bindungsdomäne der PreS1-Region und C-terminal die Zellpermeabilität-vermittelnde PreS2-Region besitzt. Nach Internalisierung sind die rekombinanten Proteine im Zytosol nachweisbar. Mit diesen rekombinanten Proteinen wurde eine ca. 25%ige Reduktion der Virussekretion erreicht. Die Sekretion von HBeAg wurde bis zu 30% reduziert. Zur Verifizierung dieser Zellkulturdaten könnte ein transgenes Mausmodell verwendet werden.

Das HBV-Genom kodiert zwei virale Aktivatoren, das HBx und die PreS2-Region im LHBs. Beide aktivieren den c-Raf-1/MEK-Signalweg. Die Bedeutung der beiden Aktivatoren auf die Virusreplikation wurde untersucht. Durch die selektive Inhibierung der Effektoren (Ras oder Proteinkinase C) von HBx oder PreS2 im LHBs konnte kein Effekt auf die Genexpression/ Sekretion nachgewiesen werden. Blockiert man aber die c-Raf-1/MEK-Signalkaskade an einem beiden Aktivatoren gemeinsamen Punkt (Raf oder MEK), so kommt die Virussekretion fast vollständig zum Erliegen. Die Ursache hierfür ist in einer reduzierten Neusynthese von viralen Proteinen zu finden und nicht in der Akkumulation der Proteine in der Zelle. Zur Untersuchung des Einflusses der Funktionalität der beiden Aktivatoren wurden HBx- bzw. PreS2- und HBx/PreS2-defiziente HBV-Expressionsplasmide generiert. Die Einzelmutanten zeigten nur einen geringen reduzierenden Einfluss auf die Genexpression/Virussekretion. Beim Einsatz der Doppelmutante wurde die Genexpression/Virussekretion fast vollständig inhibiert. HBx und PreS2 im LHBs sind für die Virusreplikation von Bedeutung aber sie können einander ersetzen.


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24.10.2005