V Material und Methoden

Die Chemikalien, Salze und Lösungsmittel wurden in der Qualität "reinst" oder "analytic grade" bezogen. Das verwendete Wasser entstammte einer Reinstwasseranlage der Firma MILLIPORE (Milli Q).

Die beschriebenen Experimente wurden unter Verwendung zweier HBV-Expressionsplasmide (Abb. 42) durchgeführt.

Das Plasmid pSM2 (Sells et al., 1987) besitzt ein zweifaches in Tandemformation vorliegendes HBV-Genom des HBV-Subtyps ayw2 (3182bp) und basiert auf dem Vektor pMac5-8 (siehe Anhang). Die beiden Genome wurden über die EcoRI-Schnittstelle aneinandergefügt und in den Vektor insertiert. Die Nomenklatur erfolgt nach Galibert et al. (1979).

Das Plasmid pSPT1.2xHBV (Weiss et al., 1996) kodiert für ein 1,2faches HBV-Genom des Subtyps adr4 und basiert auf dem Vektor pSPT19 (siehe Anhang). Die terminale Redundanz gewährleistet die Synthese übergenomlanger, prägenomischer 3,5kB RNA.

Die Oligonukleotide wurden von den Firmen MWG (Ebersberg) und TIB-Molbiol (Berlin) hergestellt. Die Restriktionsschnittstellen sind unterstrichen.

Die verwendeten Zelllinien wurden von DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkultur, Braunschweig) bezogen.

Nukleinsäurefragmente von 0,1 bis 20kB Größe werden für analytische und präparative Zwecke in horizontalen 0,6-2,3%igen Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt. Nach dem Schmelzen der Agarose in 1x TAE-Puffer wird vor dem Gießen des Gels Ethidiumbromid (Endkonzentration: 50ng/ml) in die Agaroselösung gegeben. Die Auftrennung erfolgt bei einer Feldstärke von 2-10V/cm.

Der Verdau von DNA durch Typ II Restriktionsenzyme erfolgt nach Herstellerangaben (ROCHE). Der Volumenanteil des Enzyms sollte dabei 10% im Reaktionsansatz nicht überschreiten.

Nach präparativer Agarose-Gelelektrophorese von linearisierter DNA wird das gewünschte Fragment unter UV-Licht mit einem Skalpell ausgeschnitten in ein Eppendorf-Gefäß überführt. Die Elution der DNA aus dem Gel erfolgte unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) nach Herstellerangaben. Die Reinigung der DNA erfolgt nun wie unter 13.5. beschrieben.

Die Umsetzung linearisierter Vektoren mit alkalischer Phosphatase dient zur Verhinderung der Religation durch das Entfernen der 5´terminalen Phosphatgruppen. Dazu werden bis zu 15µg linearisierte DNA mit 1/10 des Endvolumens 10x CIP-Puffer und 5U alkalischer Phosphatase (ROCHE) versetzt.

Nach 30 minütiger Inkubation bei 37°C werden weitere 5U Enzym zugesetzt und erneut für 30min inkubiert. Die Inaktivierung der alkalischen Phosphatase erfolgte durch Erhitzen des Ansatzes auf 68°C für 10min sowie anschließender Reinigung der mittels QIAquick Spin-Säulen (siehe 13.5.).

Um DNA aus PCR-Reaktionen, Restriktionsverdaus, oder Ligase-Reaktionen zu reinigen, werden QIAquick Spin PCR Purification-Säulen (QIAGEN) verwendet. Maximal 10µg der zu reinigenden Nukleinsäure werden auf 600µl mit PB-Puffer versetzt, auf eine Spinsäule gegeben und durch Zentrifugation (10.000g, 1min) auf der Silica-Membran immobilisiert. Nun werden 750µl Puffer PE auf die Säule gegeben und die DNA durch Zentrifugation gewaschen (10.000g, 1min). Dies wird ein zweites mal wiederholt bevor die DNA mit 30-50µl H₂O_dd eluiert wird.

Bei Sequenzierreaktionen müssen die nicht in den DNA Strang eingebauten Nukleotidmonomere abgetrennt werden. Dies wird über kommerziell erhältliche Gelfiltrationssäulen (QIAGEN, DyeEx-Spinsäulen) durchgeführt. Die Säulen werden nach den Herstellerangaben vorbereitet, der Reaktionsansatz auf das Gelbett gegeben und durch Zentrifugieren die DNA-Moleküle ab einer Länge von ca. 30 Basenpaaren eluiert.

Zur Konzentrierung und Reinigung wird die Nukleinsäure unter Hochsalzbedingungen (2M Ammoniumacetat oder 0,8M Lithiumchlorid) mit 2,5 Volumina eiskaltem Ethanol oder 0,7 Volumina Isopropanol gefällt. Bei geringen DNA-Mengen oder kurzen Fragmenten wird zur Erhöhung der Fällungseffizienz 10µg RNA pro Ansatz zugegeben und über Nacht bei -20°C inkubiert, bevor die DNA durch Zentrifugation für 30min bei 10.000g und 4°C pelletiert wird. Das Pellet wird zum Entfernen von Salzresten mit 70%igem Ethanol gewaschen. Nach dem vollständigen Entfernen der Ethanolreste wird die Nukleinsäure in H₂O_dd gelöst.

Die Extinktion der Nukleinsäuren wird photometrisch bei 260nm bestimmt. Einer Extinktion von 1 entspricht eine Konzentration von 50µg/ml doppelsträngige DNA bzw. 35µg/ml einzelsträngige DNA oder RNA. Das Verhältnis der Extinktionen OD_{26 0 nm} zu OD_{28 0 nm}, das ein Maß für die Reinheit der Präparation darstellt, sollte bei DNA zwischen 1,7-1,9 liegen.

Die Ligase des Phagen T4 katalysiert in einer ATP-abhängigen Reaktion die kovalente Verknüpfung der 5`Phosphatgruppe des einen DNA-Moleküls mit der 3´OH-Gruppe des anderen. Die Ligation erfolgt bei einem 3-fachen molaren Überschuss des DNA-Fragmentes gegenüber dem Vektor. 100-150ng des linearisierten Vektors und die entsprechende Menge des Inserts werden mit H₂O_dd auf ein Volumen von 8µl gebracht, 1µl 10x Ligasepuffer und 1µl T4-Ligase zugesetzt. Die Inkubation erfolgt für 20min auf Eis, dann für mindestens 3h bei 16°C.

Die Insertmenge berechnet sich nach folgender Gleichung:

Die DNA-Sequenzierung erfolgt nach einer modifizierten Form der Strangabbruchmethode nach Sanger et al. (1977). Anstelle von radioaktiv markierten Didesoxynukleotiden werden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierte Nukleotide verwendet. Die Reaktion kann in einem PCR-Ansatz ausgeführt werden.

Zu 250–300ng des zu sequenzierenden Plasmides werden 0,5µl Primer (10µM) und 2µl Premix (BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, PE Applied Biosystem) gegeben und auf 10µl Gesamtvolumen mit H₂O_dd aufgefüllt. Die PCR-Reaktion erfolgt nach folgendem Schema:

Mit Hilfe der PCR können in einem zyklischen Prozess, katalysiert von der hitzestabilen Taq-DNA-Polymerase, DNA-Fragmente selektiv amplifiziert werden. Eine Standard-PCR hat ein Gesamtvolumen von 50µl. 10ng (bei Plasmiden) bis 2µg (bei chromosomaler DNA) Template wird mit je 100pmol Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Endkonzentration 2µM) und je 25nmol jedes der vier dNTP´s (Endkonzentration 500µM) und H₂O_dd auf ein geeignetes Volumen gebracht. Nach Zugabe von 0,5U Polymerase (CLONTECH, Advantage2-Polymerase) werden die Zyklen (i. R. 30 Zyklen) in einem Thermoblock gestartet. Die erhaltene DNA wird wie unter 1.4 beschrieben aufgearbeitet.

Die Quantitative TaqMan-PCR (real-time-PCR) wird zur quantitativen Nukleinsäureanalyse eingesetzt. Mit Hilfe dieser Methode ist es möglich, den Ablauf der PCR quantitativ über die Zeit zu verfolgen und nicht nur eine Endpunktanalyse durchzuführen.

Bei der TaqMan-PCR gibt es neben den Primern noch eine Detektionssonde, die an den DNA-Bereich zwischen den Primern hybridisiert. Die TaqMan-Sonden sind am 5´-Ende mit der fluoreszenten Reporterfarbe FAM (6-Carboxyfluoreszein), einem Fluoreszeinderivat, und am 3´-Ende mit der Quencherfarbe TAMRA (6-Carboxytetramethylrhodamin), einem Rhodaminderivat, markiert.

Durch ihre 5’-3’-Exonukleaseaktivität separiert die Taq-DNA-Polymerase während der Elongation das fluoreszierende Nukleotid von dem Quencher, wodurch das Nukleotid zur Fluoreszenz befähigt wird (Abb. 43). Die Akkumulation des PCR-Produkts kann so direkt an der Erhöhung der Fluoreszenz abgelesen werden.

Die TaqMan-PCR wird mit einem ABI PRISM 7700 Sequence Detector (PE Applied Biosystems) durchgeführt. Als Reaktionsgefäße werden spezielle hitzestabile, optisch durchlässige 96-Loch-Platte verwendet. Die 96-Loch-Platte wird mit einer spezielle hitzestabile, optisch durchlässige Folie verklebt.

Mit der TaqMan-PCR sollten Nachweis und Quantifizierung von Virus-DNA in den HBV-produzierenden Zelllinien erfolgen.

Im 2x Universal MasterMix (Perkin Elmer) ist neben der AmpliTaq Gold Polymerase ein weiteres Enzym, Uracil N´-glycosylase, enthalten, welches kontaminierende Nukleinsäuren aus vorhergehenden PCRs durch Spaltung der glycosidischen Bindung zwischen Desoxyribose und Uracil, inaktiviert.

Von jeder Probe werden mindestens Doppelwerte bestimmt. Als Negativkontrollen dienen PCR-Ansätze ohne DNA zum Ausschluß einer Kontamination mit Template. Das pSM2-Plasmid oder pSPT1.2xHBV wurde als Standard mitgeführt.

Um umhüllte virale DNA von transfizierter DNA unterscheiden zu können, werden die zu untersuchenden Lösungen auf 4mM MgCl₂ eingestellt, 200U/ml DNase (ROCHE) hinzugegeben und eine Stunde bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Um die DNase zu deaktivieren wird der Ansatz 10min bei 95°C gekocht.

In der PCR wird mit den Primern TaqMan-f HBsAg und TaqMan-b HBsAg ein 89bp-Fragment des viralen S-Gens amplifiziert (Pas et al., 2000). Mit den Primern HBxfTM1 und HBxrTM1 entsteht ein 96bp-Fragment im überlappenden Genbereich für das x-Protein und die DNA-Polymerase (Loeb et al. 2000).

Die Auswertung erfolgt durch die „Sequence Detections Systems“-Software von PE Applied Biosystems. Für jede Probe wird der PCR-Zyklus errechnet, ab welchem die Menge des Amplifikationsproduktes über das "Untergrundrauschen" (threshold line, C_T) ansteigt. Dazu schlägt der Computer einen C_T vor, der bei der 10fachen Standardabweichung der Fluoreszenzwerte zwischen den Zyklen 3-15 liegt. Der C_T-Wert kann manuell verändert optimiert werden, so dass man die unterschiedlichen Proben besser unterscheiden kann. Über eine Standardkurve kann die absolute Virus-DNA-Kopienanzahl in jeder Probe ermittelt werden.

800ml LB-Medium werden mit 10ml einer Übernachtkultur von E. coli angeimpft und bis zu einer OD_{60 0 nm} von 0,5 geschüttelt. Anschließend werden die Bakterien steril abzentrifugiert und in 50ml eiskaltem TFB1 Puffer resuspendiert. Nach einer Inkubation von 90min auf Eis wird die Suspension im vorgekühlten Rotor abzentrifugiert und die Bakterien in 15 bis 20ml TFB2 resuspendiert. Die Suspension wird in Eppendorf-Gefäßen in 200–500µl Mengen aliquotiert, die in einer Kältemischung aus Ethanol/Trockeneis vorgekühlt werden. Die Lagerung der kompetenten Zellen erfolgt bei -70°C.

Die eisgekühlte DNA-Lösung (Plasmid- bzw. Ligationsansatz) wird mit 100µl kompetenter Zellsuspension versetzt und für mindestens 30min auf Eis inkubiert. Der anschließende Hitzeschock erfolgt für 60s bei 42°C, dann folgt eine 3 minütige Abkühlung auf Eis. Nach dem Zusatz von 500µl kaltem LB-Medium und der Inkubation für 30min bei 37°C unter Schütteln werden die Bakterien auf einem geeigneten Selektionsmedium ausplattiert (LB Agar mit Antibiotika).

Für eine solche Präparation wird je nach benötigter Plasmid-DNA-Menge der QIAprep Spin Miniprep Kit oder für eine größere Ausbeute der QIAprep Maxiprep Kit (QIAGEN) verwendet. Sie basieren auf dem von Birnboim und Doly (1979) beschriebenen Verfahren. Dabei werden die Bakterien unter alkalischen Bedingungen lysiert und die bakterielle DNA sowie Proteine denaturiert. Die bakterielle RNA wird bereits während der alkalischen Lyse durch die im Resuspendierungspuffer anwesende RNase A abgebaut. Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte aus einer Übernachtkultur. Hierzu werden für eine Miniprep 3-5ml LB-Medium und für eine Maxiprep 500ml mit einer Einzelkolonie beimpft und über Nacht kultiviert. Die Bakterien werden gemäß dem Herstellerprotokoll bearbeitet. Zur Kontrolle der DNA Präparation werden 1-5µl auf ein Agarosegel aufgetragen.

Zur Isolierung viraler DNA aus Zellkulturüberständen und Zelllysaten wurden verschiedene Methoden getestet. Teilweise wurden die Viren aus Zellkultur-Überständen durch Fällung mit PEG 8000 (1/10 Volumenanteile w/v) und anschließender Zentrifugation angereichert. Da bei dieser Fällung auch andere Proteine mit abzentrifugiert werden, wurde das Pellet in TNE-Puffer aufgenommen und über ein Sucrose-Kissen zentrifugiert. Die Viren sind im Pellet enthalten.

Eine andere Möglichkeit der Konzentrierung des Zellkulturüberstandes bestand in der Zentrifugation über eine Macrosep 300K (Zentrifugalkonzentratoren MWCO 300kDa, PALL).

Das Prinzip des "High pure viral nucleic acid kit" (Roche) und des "QIAamp Blood Mini Kit" (QIAGEN) sind weitgehend identisch. Durch einen Proteinase K-Verdau in einem SDS- und chaotropen Salz-haltigem Puffer wird die Virushülle und im Kulturmedium enthaltene Proteine verdaut und so die DNA freigesetzt. Zur Fällung wird dann Isopropanol bzw. Ethanol (Roche bzw. QIAGEN) zugesetzt und die Lösung auf die Spin-Säulen gegeben. Bei dem Roche-Kit handelt es sich um Glasfaserfleece beim Säulenmaterial, wohingegen die Säulen bei QIAGEN Silicagel enthalten. Anschließend wird zur Entfernung störender Proteine und anderer Kontaminationen noch mal mit einem chaotropen Puffer gewaschen. Nach ein- bis zweimaligem Waschen mit einem Ethanol-haltigem und wenig Salz-haltigem Puffer (QIAGEN/Roche) wird die DNA mit 10mM Tris/HCl; 0,5mM EDTA; pH 9,0 oder Wasser (QIAGEN/Roche) eluiert. Bei beiden Kits wurden jeweils 100µl zur Elution eingesetzt, ansonsten wurde sich an die Anweisungen der Hersteller gehalten.

Hierzu wird Silica in Wasser resuspendiert (1g/ml) und mit HCl (1µl/ml) auf einen pH von 2 gebracht. Von dieser Suspension werden 40µl mit 900µl Lysis-Puffer L6 homogenisiert. Zu dieser Mischung werden 50µl Probe gegeben, gemischt und 10min bei Raumtemperatur inkubiert und nochmals gemischt. Nach kurzer Zentrifugation (15s, 12.000g) wird der Überstand verworfen und das Pellet zweimal mit Wasch-Puffer L2, zweimal mit 70% Ethanol und einmal mit Aceton gewaschen. Das Pellet wird bei 56°C 10min getrocknet und mit 100µl TE-Puffer gevortext und noch mal 10min bei 56°C inkubiert. Anschließend wird die Suspension 2min bei 12.000g zentrifugiert. Der Überstand enthält die DNA.

Kaneko et al. (1989, 1990) haben aus Serum durch alkalische Lyse die Virushülle zerstört und so die virale DNA freigesetzt.

100µl Zellkulturüberstand werden mit 100µl 0,2M NaOH versetzt und 60min bei 37°C inkubiert. Im Anschluss werden 100µl 0,12M HCl zur Neutralisierung hinzugefügt. Aus dieser Lösung werden dann die Proben für die TaqMan-PCR entnommen.

Die immortalisierten Zelllinien werden in geeignetem Medium (DMEM bzw. RPMI 1640 Komplettmedium) bei 37°C, 5% CO₂ und 90% Feuchtigkeit kultiviert. Bei ca. 70%iger Konfluenz, werden die Zellen passagiert. Dafür werden die Zellen nach Waschen mit PBS mit Trypsin (0,5mg/ml) versetzt, für 3-5min bei 37°C inkubiert. Die Zellen lassen sich durch leichtes Schlagen gegen die Flaschenseite vom Zellkulturflaschenboden ablösen. Durch die darauf folgende Medien-Zugabe wurde das Trypsin inaktiviert. Die Zellen wurden 1:4 verdünnt wieder in Zellkulturflaschen ausgelegt.

Zur Konservierung werden trypsinierte Zellen in 1,5ml Einfriermedium suspendiert und langsam durch ein Kryostat (das mit Isopropanol gefüllt ist und über den Temperaturkoeffizienten von Isopropanol eine kontrollierte Abkühlrate der Zellen von 1°C pro Minute gewährleistet) auf –80°C gebracht, um sie dann in flüssigem Stickstoff zu lagern.

Zum Auftauen wird die eingefrorene Zellsuspension durch Schwenken des Kryoröhrchens im 37°C warmen Wasserbad fast vollständig aufgetaut. Die Zellen werden dann zügig in vorgewärmtes Medium aufgenommen, pelletiert und einmal gewaschen, um das DMSO vollständig zu entfernen. Anschließend werden die Zellen in Kultur genommen. Um das Wachstum und die Proliferation der aufgetauten Zellen zu fördern, werden sie für die erste Passage nach dem Auftauen im Kulturmedium mit 20% FCS gehalten.

Das Prinzip dieser Transfektionsmethode besteht darin, dass zu einer Mischung aus Calciumchlorid und DNA unter ständigem Mischen Phosphat zugegeben wird, so dass Calciumphosphat-Kristalle ausfallen und die DNA dabei kopräzipitiert. Die entstandenen feinen Kristalle werden nun von den Zellen phagozytiert (Graham & van der Eb, 1973). Ein Ansatz bezieht sich auf eine 10cm-Schale, auf der die Zellen bis zu 70-80%iger Konfluenz gewachsen sind. Zwei Stunden vor der Transfektion wird das Medium gewechselt. Zu einem 250µl-Ansatz, der 4-8µg DNA und 50µl einer 2,5M CaCl₂-Lösung enthält, werden innerhalb von 30s 250µl 2xHBS-Puffer zugetropft. Zur Ausbildung von Kristallen wird diese Mischung 30min stehengelassen bevor sie gleichmäßig über die Zellen verteilt wird. Nach 12-18h wird das Medium abgesaugt, die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, mit frischem Medium versetzt und für weitere 2-5 Tage bei 37°C inkubiert ehe die Zellen lysiert und weiter verwendet werden.

Zur Transfektion einer 10cm-Schale werden in einem Reaktionsgefäß 7,5µg Plasmid-DNA mit FCS-freiem Medium auf 75µl (RPMI 1640 bzw. DMEM) aufgefüllt, in einem zweiten Reaktionsgefäß 45µl DOTAP (Roth) mit FCS-freiem Medium gemischt. Anschließend wird das DNA-Gemisch in das DOTAP-Gemisch überführt, gemischt und nochmals 15min bei RT inkubiert. Das Medium der zu transfizierenden Zellkulturschalen wird nun durch 6ml FCS- und antibiotikafreies Medium ersetzt, das DNA/DOTAP Gemisch hinzugegeben und für 3-10h bei 37°C inkubiert. Anschließend wird das Medium durch Komplettmedium ersetzt und der Transfektionsansatz bei 37°C für weitere 2-5 Tage inkubiert.

Bei der Transfektion von Objektträgern oder 6cm-Schalen werden die Mengen der eingesetzten Reagenzien proportional zu der zu transfizierenden Fläche verringert.

Hierzu werden HepG2 nach 2.3.2 transfiziert. Die Expression des Gens in eukaryotischen Zellen wird im pcDNA3.1(-) durch den hCMV-Promotor reguliert und durch eine Neomycinresistenz soll sichergestellt werden, dass nur Zellen mit diesem Plasmid selektioniert werden. Das Selektionsmedium enthielt G418.

Die entsprechenden Konzentrationen wurden durch Verdünnung in 0,5% FCS-haltigem RPMI 1640 –Medium hergestellt.

Bei transient transfizierten Zellen wurden die Zellen nach der Transfektion gleichmäßig verteilt, damit man von einer gleichen Menge produzierten HBV-Partikel ausgehen konnte. Die Inkubation mit synthetischen Peptiden / rekombinanten Protein erfolgte nach den im jeweiligen Experiment angegebenen Zeiten und Konzentrationen.

Typischerweise wird eine 10cm Zellkulturschale 2 bis 4 Tage nach der Transfektion (siehe 14.3.) mit 5ml PBS gewaschen mit 1ml Lysis-Puffer versetzt und für 10min bei 4°C inkubiert. Die Zellen werden abgeschabt und in ein Reaktionsgefäß überführt. Die nicht löslichen Anteile werden durch Zentrifugation (1min, 10.000g, 4°C) entfernt. Bis zur weiteren Verwendung kann das Lysat bei –20°C gelagert werden.

Die Zellen werden in einer 6cm kultiviert, nach mit PBS gewaschen und mit 0,7ml Dignam A 10min auf Eis inkubiert und anschließend abgeschabt. Nach dem Pottern wird das Lysat 18min bei 430.000g (entsprechen 60min bei 100.000g) und 4°C in der Ultrazentrifuge zentrifugiert. Dadurch werden die nicht löslichen Bestandteile abgetrennt und man erhält das Zytosol.

Zur Anreicherung von Viren oder Proteinen aus zellulären Lysaten und Zellkulturüberständen werden Immunopräzipitationen durchgeführt.

Für die Protein- oder Virus-Präzipitation wird der erste Antikörper mit 40µl Protein A/G-Sepharose versetzt, auf 500µl mit PBS aufgefüllt und 16h bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Um vorhandenes NaN₃ zu entfernen wird das Ak-Protein A/G-Sepharose Konjugat dreimal mit 1ml PBS gewaschen. Das Virus-Konzentrat oder Zelllysat wird nun zu dem Ak/Sepharose-Konjugat gegeben und wiederum ÜN unter Schütteln bei 4°C inkubiert. Das Präzipitat wird 3 mal mit 1ml PBS gewaschen und kann nun gelelektrophoretisch getrennt (siehe 15.4.) werden.

Bakterienkulturen werden in Schüttelkolben in LB-Medium oder auf den entsprechenden Agarplatten bei 37°C gehalten. Die Konservierung erfolgt als Glycerolkultur bei -20°C. Je nach Resistenzgen des in den Bakterien enthaltenden Plasmides werden die Kulturen mit Ampicillin (100µg/ml) und/oder Kanamycin (25µg/ml) versetzt.

Die Zellen einer Induktionskultur werden abzentrifugiert, mit PBS gewaschen und in 30ml Lysis-Puffer/l Induktionskultur suspendiert. Anschließend werden die Zellen durch Ultraschall (3x1min, 100% Leistung, 60% Zyklus) aufgeschlossen, die unlöslichen Bestandteile durch Zentrifugation (30min, 12.000g, 4°C) entfernt und das Lysat weiterverwendet (siehe 15.3.1.).

Bei dem verwendeten Expressionsplasmid pQe8 liegt das zu exprimierende Gen unter der Kontrolle eines IPTG-abhängigen Promotors/Operators (Lac). Die Proteinsynthese wird durch 1mM Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert.

Etwa 900ml mit Ampicillin (100µg/ml) und Kanamycin (25µg/ml) versetztes LB-Medium wird mit 100ml einer Übernachtkultur angeimpft. Die 3 bis 5 stündige Induktion erfolgt durch Zugabe von 1ml IPTG-Stammlösung entsprechend einer Endkonzentration von 1mM. Die Zellen werden geerntet, einmal mit PBS gewaschen und können nun zur Proteingewinnung aufgeschlossen werden.

Durch die Bindung an Proteine verschiebt sich das Absorptionsmaximum von Coomassie Brilliant Blue G250 von 465 nach 595nm (Bradford, 1976). Allerdings ist diese Methode nicht bei Anwesenheit von Detergenzien anwendbar und die Sensitivität variiert je nach Protein (Stoscheck, 1990).

1ml Bradfordreagenz (1:5 verdünnt aus der BIORAD-Stammlösung) werden in einer Küvette mit 3-10µl der Probe gemischt und die Extinktion innerhalb einer Stunde bei 595nm gemessen.

Tryptophan, sowie schwächer auch Tyrosin und Phenylalanin, absorbieren bei 280nm. Aufgrund dieser Absorption kann die Konzentration von Proteinen ermittelt werden. Der Wert berechnet sich nach folgender Formel:

c_Protein=1,55xE₂₈₀-0,76xE₂₆₀ [mg/ml] (Warburg & Christian, 1941)

Die Formel berücksichtigt Verunreinigungen der Probe durch Anwesenheit von Nukleinsäuren.

Die mit dem pQe8-System in E. coli exprimierten Proteine können aufgrund des aminoterminalen HisTags an einer mit Ni²⁺-NTA-Agarose-Matrix immobilisiert werden (QIAGEN). Durch die Häufung von 6 Histidinresten erfolgt eine sehr starke Bindung an das Ni²⁺, welche eine Trennung von den auf Grund weniger Histidinresten nicht so stark bindender Proteine ermöglicht.

Diese und unspezifisch gebundene Proteine werden bei einem pH von 6,3 (isoelektrischer Punkt von Histidin) von der Säule gewaschen. Die spezifisch gebundenen Proteine werden durch eine hohe Imidazol-Konzentration im Elutionspuffer von der Säule eluiert. Nach der Elution wird die Säule durch das Waschen mit einem mit dem Auftragungspuffer regeneriert.

Die Probe wurde mit einem Fluss von 0,5ml/min auf die mit Auftragungspuffer äquilibrierte Säule geladen und solange gespült, bis die Extinktion wieder einen Basiswert erreichte. Gewaschen wurde nun mit Waschpuffer bei einem Fluss von 1ml/min. Die Elution erfolgte durch einen Gradienten von Waschpuffer gegen Elutionspuffer (Fluss von 1ml/min über 3 Säulenvolumina). Nach der Beendigung des Gradienten wird mit 4 Säulenvolumina Puffer C nachgespült.

Die Detektion der eluierten Proteine erfolgt durch Messung der Absorption bei 215nm, 260nm und 280nm Wellenlänge.

Mit Hilfe der Gelfiltrationschromatographie können Proteine, Peptide und Farbstoffe entsprechend ihrer Größe und Oligomerisierungsgrades getrennt werden.

Zur Trennung der markierten synthetischen Peptide von nicht gebundenen Fluoreszenzfarbstoffen wird eine Superdex Peptide 10/30 (Amersham Biosciences) verwendet. Als Laufmittel wird PBS pH 7,2 gewählt.

Über die Reversed-Phase-Chromatographie kann man Peptide, Proteine, Oligonukleotide und andere Biomoleküle nach ihrer Polarität trennen.

Zur Trennung von unmarkiertem Peptid von markiertem wurde eine Sephasil Peptide C18 5µm Säule genutzt. Es wurde ein linearer Gradient bis 70% Acetonitril mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) gefahren. Die Detektion der eluierten Proteine erfolgt bei 215nm, 280nm und 548nm (Cy3™).

Proteine größer als 30kDa werden nach dem Verfahren nach Laemmli (1975), kleinere Proteine nach Schägger und v. Jagow (1987) gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die Zusammensetzung des Trenngels wird dabei der Größe des gesuchten Proteins angepasst.

Die Proteinproben werden in einem Volumenverhältnis von 1:5 mit 5x SDS-Probenpuffer versetzt und durch Erhitzen auf 95°C für 5min denaturiert. Das Einlaufen der Proben erfolgt bei 80V für 15min, danach wird die Spannung auf 130V erhöht. Die Erwärmung der Gele wird durch Wasserkühlung verhindert. Als Größenstandard werden Rainbow-Marker verschiedener Zusammensetzung (Amersham) verwendet.

Zum Nachweis von Proteinmengen (>30ng) werden die Gele für 20min in 0,1%iger Coomassie Brilliant Blue R250 Lösung (in 30% Ethanol, 10% Eisessig) bei 55°C gleichzeitig fixiert und gefärbt. Die Entfärbung des Hintergrundes erfolgt in 25% Ethanol, 10% Eisessig.

Zum Nachweis von kleinen Proteinmengen (bis zu 3ng) wird die Silberfärbung nach Heukeshoven and Dernick (1988) angewendet. Das Prinzip beruht auf der selektiven Reduktion der von Proteinen komplexierten Silberionen durch Formaldehyd. Dabei entstehen Silberkeime, die während der Entwicklung des Gels die weitere Reduktion von Silberionen katalysieren.

Die Fixierung der Gele erfolgt für 20min in Silbergel-Fixierlösung, die Konditionierung in Konditionierlösung für 30min. Nach fünfmaligem Waschen in H₂O_dd für je 5min wird das Gel in 0,1%iger Silbernitratlösung (mit 40µl Formaldehyd pro 100ml) geschwenkt. Die Proteinbanden werden durch Inkubation in Entwicklerlösung sichtbar gemacht. Gestoppt wird die Reaktion durch Zugabe 10%iger Essigsäure.

Der Transfer gelelektrophoretisch aufgetrennter Proteine auf eine Nitrozellulosemembran wird nach dem diskontinuierlichen "Semi-dry"-Verfahren bei 2-4mA/cm² für 45min durchgeführt (Kyhse-Andersen, 1984).

Nach dem Waschen des Blots für mindestens 30min in PBST beginnt die Inkubation mit dem ersten Antikörpers (in 10% Milchpulver in PBST) für 2h bei Raumtemperatur. Nicht gebundener Antikörper wird durch fünfmaliges Waschen mit PBST entfernt. Die nun folgende Inkubation mit dem zweiten Peroxidase-konjugierten Antikörper erfolgt ebenfalls in 10% Milchpulver/ PBST.

Nach erneutem Waschen wird der Blot entwickelt. Als Substrat dient Luminol (3-Aminophtalhydrazid) und H₂O₂. Als Produkte entstehen 3-Aminophtal-säure, Stickstoff und Lichtquanten bei einer Wellenlänge von 425nm. Die Detektion der Lichtquanten erfolgt durch Auflegen eines Röntgenfilms.

Zur Gewinnung von PreS2-spezifischen Antiserum wurde ein Kaninchen immunisiert. Dazu wurden 100µg Antigen in 250µl 20mM NaP_i pH 6,5 suspendiert und mit 250µl komplettem Freunds Adjuvans versetzt, gut gemischt und injiziert. Dieser Vorgang wurde nach 14 Tagen mit inkomplettem Freunds Adjuvans wiederholt , außerdem wurde zu diesem Zeitpunkt Blut aus der Ohrvene entnommen, um Serum zum testen zu gewinnen. Nach weiteren 14 Tagen wurde nochmals Antigen injiziert aber diesmal mit inkompletten Freudsches Adjuvans verwendet. Nach insgesamt 6 Wochen wurde das gesamte Blut für die Antiserumgewinnung entnommen.

9ml Antiserum werden über Nacht bei 4°C mit 2,817g (NH₄)₂SO₄ gefällt, dann 30min bei 9000rpm und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wird in 5ml PBS aufgenommen und in zwei Schritten gegen PBS dialysiert, um das (NH₄)₂SO₄ zu entfernen. Anschließend wird das Dialysat auf 10ml mit PBS aufgefüllt und nochmals zentrifugiert (1h, 10.000rpm, 4°C).

Das gesamte Volumen wird auf eine Säule mit PreS1S2 beladener NHS-Sepharose gegeben, mit PBS gewaschen und mit 100mM Glycin (pH 2,7) eluiert und sofort mit 1M Tris/HCl (pH 8,8) neutralisiert. Nach Dialyse gegen PBS, wird der gereinigte PreS2-Antikörper aliquotiert und bei 4°C gelagert.

Die Markierung der Peptide beruht auf der Spaltung des N-Hydroxysuccinimid-Esters (NHS) mit dem Fluoreszenzfarbstoff durch primäre Amine (ε-Aminogruppe bei Lysin, N-Terminus) im alkalischen pH-Bereich. Die Spaltung wird auch durch Wasser und Cysteinreste (muss in großer Menge vorhanden sein) herbeigeführt. Ist der pH-Wert nicht sehr alkalisch dauert die Kopplung länger.

Bei der Kopplung mit NHS-Cy3™ und NHS-Fluorescein wurde nach Herstellerangaben vorgegangen.

NHS-Fluorescein wird in DMSO gelöst, das Peptid in PBS (pH 7,2). Die beiden Lösungen werden gemischt und mindestens 2h auf Eis inkubiert.

Das in Na₂CO₃ (pH 9,3) gelöste Peptid wird in ein mit trockenem Cy3™-NHS-Ester befülltes Reaktionsgefäß gegeben und mindestens 30min bei Raumtemperatur inkubiert.

Zur Quantifizierung der Oberflächenantigene, des HBc- und HBeAg werden kommerziell erhältliche ELISA (DADE BEHRING, Schwalbach) verwendet. Die Durchführung der Tests erfolgt nach den jeweiligen Protokollen der Herstellerfirma.

Hepatitis-B-Viren können aufgrund ihrer Dichte mit Hilfe eines Sucrose-Kissens von Fremdproteinen sowie von subviralen Partikeln getrennt werden. Hierfür wird die zu untersuchende Probe in Ultrazentrifugengefäßen vorgelegt und mit einer 30%igen Sucrose-Lösung (10-20% des Zentrifugengefäßvolumens) unterschichtet. Die Sedimentation durch das Sucrose-Kissen erfolgt in einem Ausschwingrotor bei 200.000g für 2h bei 10°C. Nach der Zentrifugation kann der Überstand fraktioniert, das Pellet resuspendiert und für weitere Untersuchungen verwendet werden.

Pro Objektträgerfeld werden etwa 0,2*10⁶Zellen (HepG2) ausgelegt. Die Zellen werden mit den Peptiden für 30min inkubiert. Dabei werden die in Peptide mit 0,5% FCS-haltigem Medium verdünnt. Nach dem zweimaligen Waschen der Zellen mit PBS erfolgt die Fixierung durch Inkubation mit 4%igem Formaldehyd in PBS für 10min. Durch die Gegenwart von 1mg/ml DAPI wird hierbei die DNA und somit indirekt der Zellkern gefärbt.

Anschließend werden unspezifische Bindungen durch die Inkubation mit 10%BSA in PBST abgeblockt, bevor der erste Antikörper in einer 10% BSA/PBST Verdünnung für 30min auf die Zellen gegeben wird. Um das Austrocknen der Präparate zu vermeiden wird die Inkubation in einer feuchten Kammer durchgeführt. Die Objektträger werden anschließend 30min unter viermaligem Wechseln des Puffers mit PBST gewaschen. Der zweite Antikörper, konjugiert mit den Fluoreszenzfarbstoffen Cy2™ oder Cy3™, wird ebenfalls in 10% BSA/PBST verdünnt zugesetzt und für 30min inkubiert. Abschließend werden die Präparate für weitere 30min unter viermaligem Wechsel des Puffers mit PBST gewaschen.

Auf die fixierten Zellen wird dann ein Tropfen 10%ige Glycerollösung gegeben und mit einem Deckglas blasenfrei abgedeckt. Die Betrachtung der Präparate erfolgt nun im Fluoreszenz- oder im Durchlicht.