V Material und Methoden

1. Puffer und Lösungen

↓85

Agarosegel

Dignam A

0,8-2,0% Agarose in TAE-Puffer

10mM Hepes, pH 7,9

 

1,5mM MgCl2

Ampicillin-Stammlösung (1000x)

10mM KCl

5g Ampicillin

10mM β-Mercaptoethanol

ad 50ml H2O

0,5mM PMSF

sterilfiltrieren, Lagerung bei -20°C

 
 

DMEM-Komplettmedium

Anodenpuffer I

500ml DMEM

300mM Tris

50ml FCS

20% (v/v) Ethanol

5ml Natrium-Pyruvat-Lösung

vor Gebrauch entgasen

(100mM) (HepG2 und HepG2.2.15)

 

5ml L-Glutamin-Lösung (200mM)

Anodenpuffer II

(HuH7)

25mM Tris

5ml Penicillin/Streptomycin-

20% (v/v) Ethanol

Lösung (100U/ml/0,1mg/ml)

vor Gebrauch entgasen

 
 

Elutionspuffer (für Ni2+-NTA)

Auftragungspuffer (für Ni2+-NTA)

6M Harnstoff

6M Harnstoff

10mM Tris-HCl

10mM Tris-HCl

100mM Na2HPO4

100mM Na2HPO4

250mM Imidazol

pH 8,0

pH 6,3

  

Coomassie-Färbelösung für

Einfriermedium

Polyacrylamidgele

20% FCS

0,8g Coomassie brilliant blue R250

10% DMSO

200ml Methanol

in RPMI 1640 oder DMEM

200ml H2O

 

40ml Eisessig

Entfärberlösung nach

 

Coomassiefärbung

Denhardt’s solution (50x)

25% Methanol

5g Ficoll

10% Eisessig

5g Polyvinylpyrrolidin

65% H2O

5g BSA

 

ad 500ml H2O

Entwicklerlösung

sterilfiltieren; Lagerung bei –20°C

2,5g Natriumcarbonat, wasserfrei

 

120µl Formaldehydlösung (37%)

Dialysepuffer für PreS1 (n) PreS2-

ad 100ml mit H2Odd

Proteine

 

20mM Na-Acetat pH5,5

Ethidiumbromid-Stammlösung

10% Sucrose

1g Ethidiumbromid

 

ad 100ml H2O

HBS-Puffer (2x)

Lysis-Puffer (für Ni2+-NTA)

8,0g NaCl

6M Guanidin-HCl

0,38g KCl

10mM Tris

0,19g Na2HPO4x2H2O

100mM Na2HPO4

1,0g Glucose

pH 8,0

5,0g Hepes

 

ad 500ml mit H2Odd

Lysis-Puffer (für Zelllysat)

pH 7,12 einstellen

10mM Tris/HCl, pH 8,0

sterilfiltrieren

100mM NaCl

 

1mM EDTA

IPTG-Stammlösung (0,1M)

0,1% Triton X-100

238mg IPTG

 

ad 10ml H2O

Lysis-Puffer L6

Lagerung bei –20°C

120g GuSCN

 

100ml 0,1M Tris/HCl, pH 6,4

Kanamycin-Stammlösung (1000x)

22ml 0,2M EDTA, pH 8,0

1,25g Kanamycinsulfat

2,6g Triton X-100

ad 100ml mit H2O

 

sterilfiltrieren, Lagerung bei –20°C

PBS (10x)

 

400g NaCl

Kathodenpuffer

10g KCl

40mM Capronsäure

57,5g Na2HPO4x2H2O

20% (v/v) Ethanol

10g KH2PO4

vor Gebrauch entgasen

in ca. 3l H2O lösen,

 

autoklavieren und mit autoklaviertem

Konditionierlösung

H2O dann auf 5000ml auffüllen

30ml Ethanol

 

20ml 2M NaAc pH 6,0

PBST

2ml Glutardialdehyd (25%)

0,05% Tween 20 in PBS

100mg Na2S2O3x5H2O

 

ad 100ml mit H2Odd

Probenpuffer (5x) (für Agarosegele)

 

10mM Tris/HCl pH 8,0

10x Laufpuffer für die SDS-PAGE

100mM NaCl

30,28g Tris

0,25% Bromphenolblau

144g Glycin

30% Glycerol

10g SDS

 

ad 1000ml mit H2O

Proteinase K-Stammlösung

 

50mM Tris-HCl pH 8,0

LB-Medium:

1mM CaCl2

10g/l Bacto Trypton

10mg/ml Proteinase K

5g/l Hefeextrakt

Lagerung bei 4 °C

5g/l NaCl

 

zzgl. 100µg/ml Ampicillin und/oder

RPMI 1640-Komplettmedium

25µg/ml Kanamycin

500ml RPMI 1640

 

50ml FCS

LB-Agarplatten:

5ml Natrium-Pyruvat-Lösung

LB-Medium

5ml Penicillin/Streptomycin-

15g/l Agar

Lösung (100U/ml/0,1mg/ml)

zzgl. 100µg/ml Ampicillin und/oder

 

25µg/ml Kanamycin

 

Sammelgelpuffer (4x) für SDS-PAGE

TFB1-Puffer

0,5M Tris-HCl pH 6,8

100mM Rubidiumchlorid

0,4% SDS

50mM Manganchlorid

0,1% NaN3

30mM Kaliumacetat

 

10mM Calciumchlorid

SDS-Probenpuffer (5x)

15% Glycerol

250mM Tris/HCl pH 6,8

pH 5,8

8% SDS

sterilfiltrieren, Lagerung bei 4°C

40% Glycerol

 

10% DTT

TFB2-Puffer

0,04% (w/v) Bromphenolblau

10mM MOPS pH 8,0

aliquotiert bei –20°C lagern

10mM Rubidiumchlorid

 

75mM Calciumchlorid

SSC (20x)

15% Glycerol

876,5g NaCl

sterilfiltrieren, Lagerung bei 4 °C

441,0g Na-Citrat

 

ad 5000ml H2O

TNE-Puffer

 

10mM Tris/HCl, pH 7,5

Stop-Lösung für die DNA-

100mM NaCl

Sequenzierung

1mM EDTA

95% Formamid

 

20mM EDTA

Trenngelpuffer (4x) für SDS-PAGE

0,05% Bromphenolblau

1,5M Tris-HCl pH 8,8

0,05% Xylencyanol

0,4% SDS

  

Sucrose-Lösung

Trypsin-Lösung

10mM Tris/HCl

0,25% Trypsin

100mM NaCl

1mM EDTA

1mM EDTA

in PBS

30% Sucrose

steril filtriert

  

TAE-Puffer (50x):

Waschpuffer (für Ni2+-NTA)

242g Tris

6M Harnstoff

57,1ml HAc

10mM Tris-HCl

100ml 0,5M EDTA (pH 8,0)

100mM NaPi

ad 1000ml H2O

pH 6,3

  

TE-Puffer

Wasch-Puffer L2

10mM Tris/HCl

120g GuSCN

1mM EDTA

100ml 0,1M Tris/HCl, pH 6,4

pH 8,0

 

2. Chemikalien und Verbrauchsmittel

Chemikalien

Hersteller

Acrylamid

Roth, Karlsruhe

Agarose

Promega, Mannheim

Ammoniumperoxodisulfat

Sigma, Deisenhofen

Bromphenolblau

Sigma, Deisenhofen

BSA (bovines Serum Albumin)

Sigma, Deisenhofen

Butanol

Merck, Darmstadt

Chloroform

Merck, Darmstadt

Calciumchlorid

Sigma, Deisenhofen

Dinatriumhydrogenphosphat

Merck, Darmstadt

Didesoxynukleotide

Roche, Mannheim

Dimethylsulfoxid

Fluka, Deisenhofen

DTT (Dithiothreitol)

Sigma, Deisenhofen

EDTA (Ethylendiaminotetraessigsäure)

Merck, Darmstadt

Ethanol

Riedel de Haën, Seelze

Ethidiumbromid

Sigma, Deisenhofen

Glycerol

Sigma, Deisenhofen

Guanidiniumchlorid

Sigma, Deisenhofen

Guanidiniumisothiocyanat

Sigma, Deisenhofen

Harnstoff

Sigma, Deisenhofen

Isoamylalkohol

Merck, Darmstadt

Isopropanol

Merck, Darmstadt

Kaliumacetat

Sigma, Deisenhofen

Magnesiumchlorid

Merck, Darmstadt

Magermilchpulver

Fluka, Deisenhofen

Manganchlorid

Sigma, Deisenhofen

2-Mercaptoethanol

Sigma, Deisenhofen

MOPS

Sigma, Deisenhofen

Natriumacetat

Sigma, Deisenhofen

Natriumchlorid

Sigma, Deisenhofen

Natriumcarbonat, wasserfrei

Sigma, Deisenhofen

Natriumhydrogencarbonat

Merck, Darmstadt

Natriumdihydrogenphosphat

Merck, Darmstadt

Nonidet-P-40

Sigma, Deisenhofen

PD 98059 (MEK-Inhibitor)

Calbiochem, Bad Soden

Protein G-Sepharose

Roche, Mannheim

Rubidiumchlorid

Sigma, Deisenhofen

SB 202 474

Calbiochem, Bad Soden

SDS (Natriumdodecylsulfat)

Fluka, Deisenhofen

Silica (SiO2)

Sigma, Deisenhofen

Sucrose

Sigma, Deisenhofen

TEMED (N,N,N´,N´-tetramethylaminomethan)

Sigma, Deisenhofen

Trifluoressigsäure

 

Trishydroxymethylaminomethan

Merck, Darmstadt

Triton-X-100

Fluka, Deisenhofen

Die Chemikalien, Salze und Lösungsmittel wurden in der Qualität "reinst" oder "analytic grade" bezogen. Das verwendete Wasser entstammte einer Reinstwasseranlage der Firma MILLIPORE (Milli Q).

↓86

Verbrauchsmittel

Hersteller

Filterpapier 3MM

Whatman

Hybond-P

APBiotech, Schweden

Ultrazentrifugenröhrchen (Polyallomer)

Beckman, USA

Zentrifugalkonzentratoren

Pall Filtron, USA

3. Enzyme

Restriktionsendonukleasen Typ II

Roche, Mannheim

DNase

Roche, Mannheim

Trypsin

Roche, Mannheim

Aprotinin

Sigma, Deisenhofen

Taq DNA Polymerase

QIAGEN, Hilden

Advantage 2 Polymerase

Clontech, Heidelberg

Proteinase K

Roche, Mannheim

Klenow-Fragment

Roche, Mannheim

Lysozym

Sigma, Deisenhofen

alkalische Phosphatase

Roche, Mannheim

4. Antikörper

4.1. Primäre Antikörper

rabbit anti HBc-Ag Serum

Dako, USA

mouse anti HBc-Ag mAk (mAb 16989)

Chemicon, USA

goat anti HBs-Ag Serum

Dako, USA

PreS1 spezifischer Antikörper MA 18/07

Gerlich, Gießen

rabbit anti-PreS2

Malkowski,Berlin

mouse Mab anti PreS2 F124

Budkowska, Paris

mouse Mab anti PreS2 Q 19-10

Gerlich, Gießen

4.2. Sekundäre Antikörper

↓87

donkey anti-rabbit IgG Peroxidase-konjugiert

Amersham Biosciences

goat anti-mouse Ig Peroxidase-konjugiert

Amersham Biosciences

rabbit anti-goat Ig Peroxidase-konjugiert

Jackson Immuno-
Research

Cy2-konjugierter goat anti-mouse IgG

Jackson Immuno-
Research

Cy3-konjugierter donkey anti-rabbit IgG

Jackson Immuno-
Research

5. Materialien für die Zellkultur

DMEM (Dulbecco´s Modified Eagles Medium)

Sigma, Deisenhofen

 

GIBCO BRL,

RPMI-1640

Sigma, Deisenhofen

 

GIBCO BRL

DMEM ohne Methionin

Sigma, Deisenhofen

FCS (fötales Kälberserum)

PAA, Linz, Österreich

Natrium-Pyruvat-Lösung

Sigma, Deisenhofen

 

PAA, Linz, Österreich

Trypsin-Lösung

Sigma, Deisenhofen

 

PAA, Linz, Österreich

Penicillin-Streptomycin-Lösung

Sigma, Deisenhofen

 

PAA, Linz, Österreich

G418

PAA, Linz, Österreich

6. Längenstandards

Rainbow Marker RPN 755/756

Amersham Biosciences

Multimarker

Novex, Frankfurt /M.

DNA Längenstandard X

Roche, Mannheim

7. Verwendete Kits

↓88

QIAprep Spin Miniprep Kit

QIAGEN, Hilden

QIAprep Maxi Kit

QIAGEN, Hilden

QIAquick Gel Extraction Kit

QIAGEN, Hilden

QIAquick PCR Purification Kit

QIAGEN, Hilden

HBs ELISA Enzygnost® HBsAg 5.0

DADE BEHRING, Marburg

HBe ELISA Enzygnost® HBe monoclonal

DADE BEHRING, Marburg

ECL 1 & 2 Substrat

Amersham Biosciences

BigDye™ Terminator Cycle Sequencing

 

Ready Reaction Kit

PE Applied Biosystem

High pure viral nucleic acid Kit

Roche, Mannheim

QIAamp Blood Mini Kit

QIAGEN, Hilden

8. Plasmide

8.1. HBV-Plasmide

pSPT1.2xHBV, HBV Subtyp adr4

Weiss et al., 1996

pSM2, HBV Subtyp ayw2

Sells et al., 1987

PreS1S2, Subtyp ayw2

Saher & Hildt, 1999

A40, PreS2 Subtyp ayw2

Hildt et al., 1995

pRafC4

Bruder et al,. 1992

pRasN17

von W. Fantl, UCSF

pHaRas

von W. Fantl, UCSF

Die beschriebenen Experimente wurden unter Verwendung zweier HBV-Expressionsplasmide (Abb. 42) durchgeführt.

↓89

Das Plasmid pSM2 (Sells et al., 1987) besitzt ein zweifaches in Tandemformation vorliegendes HBV-Genom des HBV-Subtyps ayw2 (3182bp) und basiert auf dem Vektor pMac5-8 (siehe Anhang). Die beiden Genome wurden über die EcoRI-Schnittstelle aneinandergefügt und in den Vektor insertiert. Die Nomenklatur erfolgt nach Galibert et al. (1979).

Das Plasmid pSPT1.2xHBV (Weiss et al., 1996) kodiert für ein 1,2faches HBV-Genom des Subtyps adr4 und basiert auf dem Vektor pSPT19 (siehe Anhang). Die terminale Redundanz gewährleistet die Synthese übergenomlanger, prägenomischer 3,5kB RNA.

8.2. kommerziell erhältliche Plasmide

↓90

pcDNA3.1(-)

Invitrogen, USA

pQe8

QIAGEN, Hilden

9. Synthetische Oligonukleotide

Die Oligonukleotide wurden von den Firmen MWG (Ebersberg) und TIB-Molbiol (Berlin) hergestellt. Die Restriktionsschnittstellen sind unterstrichen.

9.1. PCR-Primer:

Bezeichnung

Art

Länge (bp)

Sequenz

PreS1-110-120

fw

27

AAA ggA TCC CCT TTg AgA AAC ACT CAT

PreS1-105-115

fw

63

TTT ggA TCC CCT ACC CCg CTg TCT CCA CCT TTg AgA AAC ACT ATg CAg Tgg AAT TCC ACA ACC

PreS1-101-110

fw

60

TTT ggA TCC ACA ggA Agg CAg CCT ACC CCg CTg TCT CCA ATg CAg Tgg AAT TCC ACA ACC

A40 fw BamH1

fw

18

AAA ggA TCC ATg CAg Tgg

PreS2-HindIII

bw

24

AAA AAg CTT gTT CAg CgC Agg gTC

9.2. Primer für die Sequenzanalyse:

↓91

Bezeichnung

Art

Länge (bp)

Sequenz

pcDNA3.1-seq-fdw

fw

18

TAA TAC gAC TCA CTA TAg

pcDNA seq bw

bw

18

TAg AAg gCA CAg TCg Agg

pQe seq fw

fw

20

Cgg ATA ACA ATT TCA CAC Ag

9.3. Primer und Sonden für TaqMan-PCR

Bezeichnung

Art

Länge (bp)

Sequenz

TaqMan-f HBsAg

fw

20

ggA CCC CTg CTC gTg TTA CA

TaqMan-b HBsAg

bw

24

gAg AgA AgT CCA CCM CgA AgT CTA gA

Sonde HBsAg

31

6FAM- TgT TgA CAA RAA TCC TCA CCA TAC CRC AgA -TAMRA

HBxfTM1

fw

21

CCg TCT gTg CCT TCT CAT CTg

HBxrTM1

bw

29

AgT CCA AgA gTY CTC TTA TgY AAg ACC TT

HBxSondeTM1

26

6FAM- CCg TgT gCA CTT CgC TTC ACC TCT gC -TAMRA

10. Synthetische Peptide

Bezeichnung

Länge (AS)

Sequenz

PS 734/RP

26

H-APLSSIFSRIGDPGGGRSLLGRMKGA-OH

PS 735/RP

27

H-GGRSLLGRMKGAGGGPLSSIFSRIGDP-OH

APO144

22

H-PLSSIFSRIGDPSRGQPTPLSP-OH

APO145

23

H-PLSSIFSRIGDPPTPLSPPLRNT-OH

APO146

21

H-PLSSIFSRIGDPPLRNTHPQA-OH

716.1

22

H-GFKQSSKALPLSSIFSRIGDPK-OH

PKC-Inhibitor

30

H-PLSSIFSRIGDPRFARKGALRNKNVHDVKN-OH

Kontrolle

17

H-PLSSIFSRIGDPKKLAP-OH

11. Geräte

11.1. Elektrophorese- und Blotsysteme

↓92

Horizontal-Elektrophorese-Systeme

 

GNA 100 und 200 mit EPS 301 (Hoefer)

Amersham Biosciences

Vertikale-Elektrophorese-Systeme,

 

SE 260 und 600 mit EPS 301 (Hoefer)

Amersham Biosciences

Semi-Dry-Blotkammer Semiphor und

 

Multiphor II mit EPS 301 (Hoefer)

Amersham Biosciences

11.2. Zentrifugen / Rotoren

Tischzentrifugen Biofuge fresco

Heraeus, Osterode

Untertischzentrifuge Minifuge 2

Heraeus, Osterode

Kühlzentrifuge Superspeed RC-5B mit

 

folgenden Rotoren:

 

HB 4, GS 3, SM 24, SS34

Sorvall-Instruments,

Ultrazentrifuge L8 mit Ti 50 Rotor

Beckman, USA

11.3. Chromatographiegeräte / Säulen

Äkta Explorer

Amersham Biosciences

Ettan LC

Amersham Biosciences

Gelfiltrationssäule SuperdexPeptide

Amersham Biosciences

Affinitätschromatographiesäule Ni2+-NTA

QIAGEN, Hilden

Affinitätschromatographiesäule Strep-tag

IBA, Gießen

Sephasil Peptide C18 5µm ST 4.6/100

Amersham Biosciences

11.4. Mikroskope

↓93

Lichtmikroskop Diavert

Leitz, Wetzlar

Fluoreszenzmikroskop DM RBE und

Leitz, Wetzlar

Fotoeinheit

Leica, Solms

11.5. Sonstige Geräte

Thermo-Cycler PTC-100

MJ Research, USA

Thermomixer Compact

Eppendorf, Hamburg

Inkubationsschüttler Unitron

HT-Infors, Bottmingen,

Wasserbad GFL 1083

GFL, Burgwedel

Universalwaage

Saratorius, Göttingen

Feinwaage 1608 MP

Saratorius, Göttingen

Photometer Ultraspec 3300 pro

Amersham Biosciences

Brutschrank

Heraeus, Osterode

Sterilbank HeraSafe

Heraeus, Osterode

Tischschüttler Duomax 1030,

Heidolph

Homogenisator Sonoplus HD 2070

Bandelin, Berlin

pH-Meter 765 Calimatic

Knick, Berlin

Automatischer Filmentwickler

Agfa Curix 60 Aqua, Köln

E max precision mikroplate reader

Molecular Devices, USA

ABI PRISM 7700 Sequence Detector

PE Applied Biosystems

12. Zelllinien und Bakterienstämme

Die verwendeten Zelllinien wurden von DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkultur, Braunschweig) bezogen.

12.1. Eukaryontische Zelllinien

↓94

Zelllinie

Zellart

DSMZ-Nummer

HuH7

Zelllinie eines humanen

(Nakabayashi et al., 1982)

 

hepatozellulären Karzinoms

 

HepG2

Zelllinie eines humanen

ACC 180

 

hepatozellulären Karzinoms

 

HepG2.2.15

Stabil HBV produzierende Zelllinie

(Sells et al., 1987)

 

auf Basis von HepG2-Zellen

 

12.2. Bakterienstämme

Zelllinie

 

E. coli K12 DH5α

F-,φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rK - , mK +), phoA, supE44, λ-, thi-1, gyrA96, relA1, (Gibco/BRL)

E. coli K12 strain

M15 [pREP4]

F-, NalS, StrS, RifS, Thi-, Lac-, Ara+, Gal+, Mtl-, RecA+, Uvr+, Lon+ (QIAGEN, Hilden)

13. Molekularbiologische Methoden

13.1. Agarose-Gelelektrophorese

Nukleinsäurefragmente von 0,1 bis 20kB Größe werden für analytische und präparative Zwecke in horizontalen 0,6-2,3%igen Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt. Nach dem Schmelzen der Agarose in 1x TAE-Puffer wird vor dem Gießen des Gels Ethidiumbromid (Endkonzentration: 50ng/ml) in die Agaroselösung gegeben. Die Auftrennung erfolgt bei einer Feldstärke von 2-10V/cm.

13.2. Restriktionsverdau von DNA

↓95

Der Verdau von DNA durch Typ II Restriktionsenzyme erfolgt nach Herstellerangaben (ROCHE). Der Volumenanteil des Enzyms sollte dabei 10% im Reaktionsansatz nicht überschreiten.

13.3. DNA-Fragmentisolierung aus präparativen Agarosegelen

Nach präparativer Agarose-Gelelektrophorese von linearisierter DNA wird das gewünschte Fragment unter UV-Licht mit einem Skalpell ausgeschnitten in ein Eppendorf-Gefäß überführt. Die Elution der DNA aus dem Gel erfolgte unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) nach Herstellerangaben. Die Reinigung der DNA erfolgt nun wie unter 13.5. beschrieben.

13.4. Dephosphorylierung von DNA

Die Umsetzung linearisierter Vektoren mit alkalischer Phosphatase dient zur Verhinderung der Religation durch das Entfernen der 5´terminalen Phosphatgruppen. Dazu werden bis zu 15µg linearisierte DNA mit 1/10 des Endvolumens 10x CIP-Puffer und 5U alkalischer Phosphatase (ROCHE) versetzt.

↓96

Nach 30 minütiger Inkubation bei 37°C werden weitere 5U Enzym zugesetzt und erneut für 30min inkubiert. Die Inaktivierung der alkalischen Phosphatase erfolgte durch Erhitzen des Ansatzes auf 68°C für 10min sowie anschließender Reinigung der mittels QIAquick Spin-Säulen (siehe 13.5.).

13.5. Reinigung von DNA

Um DNA aus PCR-Reaktionen, Restriktionsverdaus, oder Ligase-Reaktionen zu reinigen, werden QIAquick Spin PCR Purification-Säulen (QIAGEN) verwendet. Maximal 10µg der zu reinigenden Nukleinsäure werden auf 600µl mit PB-Puffer versetzt, auf eine Spinsäule gegeben und durch Zentrifugation (10.000g, 1min) auf der Silica-Membran immobilisiert. Nun werden 750µl Puffer PE auf die Säule gegeben und die DNA durch Zentrifugation gewaschen (10.000g, 1min). Dies wird ein zweites mal wiederholt bevor die DNA mit 30-50µl H2Odd eluiert wird.

13.6. Entfernen von Nukleotidmonomeren über Gelfiltrationschromatographie

Bei Sequenzierreaktionen müssen die nicht in den DNA Strang eingebauten Nukleotidmonomere abgetrennt werden. Dies wird über kommerziell erhältliche Gelfiltrationssäulen (QIAGEN, DyeEx-Spinsäulen) durchgeführt. Die Säulen werden nach den Herstellerangaben vorbereitet, der Reaktionsansatz auf das Gelbett gegeben und durch Zentrifugieren die DNA-Moleküle ab einer Länge von ca. 30 Basenpaaren eluiert.

13.7. Fällung von Nukleinsäuren

↓97

Zur Konzentrierung und Reinigung wird die Nukleinsäure unter Hochsalzbedingungen (2M Ammoniumacetat oder 0,8M Lithiumchlorid) mit 2,5 Volumina eiskaltem Ethanol oder 0,7 Volumina Isopropanol gefällt. Bei geringen DNA-Mengen oder kurzen Fragmenten wird zur Erhöhung der Fällungseffizienz 10µg RNA pro Ansatz zugegeben und über Nacht bei -20°C inkubiert, bevor die DNA durch Zentrifugation für 30min bei 10.000g und 4°C pelletiert wird. Das Pellet wird zum Entfernen von Salzresten mit 70%igem Ethanol gewaschen. Nach dem vollständigen Entfernen der Ethanolreste wird die Nukleinsäure in H2Odd gelöst.

13.8. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

Die Extinktion der Nukleinsäuren wird photometrisch bei 260nm bestimmt. Einer Extinktion von 1 entspricht eine Konzentration von 50µg/ml doppelsträngige DNA bzw. 35µg/ml einzelsträngige DNA oder RNA. Das Verhältnis der Extinktionen OD26 0 nm zu OD28 0 nm, das ein Maß für die Reinheit der Präparation darstellt, sollte bei DNA zwischen 1,7-1,9 liegen.

13.9. DNA-Ligation

Die Ligase des Phagen T4 katalysiert in einer ATP-abhängigen Reaktion die kovalente Verknüpfung der 5`Phosphatgruppe des einen DNA-Moleküls mit der 3´OH-Gruppe des anderen. Die Ligation erfolgt bei einem 3-fachen molaren Überschuss des DNA-Fragmentes gegenüber dem Vektor. 100-150ng des linearisierten Vektors und die entsprechende Menge des Inserts werden mit H2Odd auf ein Volumen von 8µl gebracht, 1µl 10x Ligasepuffer und 1µl T4-Ligase zugesetzt. Die Inkubation erfolgt für 20min auf Eis, dann für mindestens 3h bei 16°C.

↓98

Die Insertmenge berechnet sich nach folgender Gleichung:

13.10. Sequenzierung von DNA

Die DNA-Sequenzierung erfolgt nach einer modifizierten Form der Strangabbruchmethode nach Sanger et al. (1977). Anstelle von radioaktiv markierten Didesoxynukleotiden werden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierte Nukleotide verwendet. Die Reaktion kann in einem PCR-Ansatz ausgeführt werden.

↓99

Zu 250–300ng des zu sequenzierenden Plasmides werden 0,5µl Primer (10µM) und 2µl Premix (BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, PE Applied Biosystem) gegeben und auf 10µl Gesamtvolumen mit H2Odd aufgefüllt. Die PCR-Reaktion erfolgt nach folgendem Schema:

13.11. Polymerase Kettenreaktion (PCR)

Mit Hilfe der PCR können in einem zyklischen Prozess, katalysiert von der hitzestabilen Taq-DNA-Polymerase, DNA-Fragmente selektiv amplifiziert werden. Eine Standard-PCR hat ein Gesamtvolumen von 50µl. 10ng (bei Plasmiden) bis 2µg (bei chromosomaler DNA) Template wird mit je 100pmol Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Endkonzentration 2µM) und je 25nmol jedes der vier dNTP´s (Endkonzentration 500µM) und H2Odd auf ein geeignetes Volumen gebracht. Nach Zugabe von 0,5U Polymerase (CLONTECH, Advantage2-Polymerase) werden die Zyklen (i. R. 30 Zyklen) in einem Thermoblock gestartet. Die erhaltene DNA wird wie unter 1.4 beschrieben aufgearbeitet.

↓100

13.12. PCR / TaqMan-PCR

Die Quantitative TaqMan-PCR (real-time-PCR) wird zur quantitativen Nukleinsäureanalyse eingesetzt. Mit Hilfe dieser Methode ist es möglich, den Ablauf der PCR quantitativ über die Zeit zu verfolgen und nicht nur eine Endpunktanalyse durchzuführen.

↓101

Bei der TaqMan-PCR gibt es neben den Primern noch eine Detektionssonde, die an den DNA-Bereich zwischen den Primern hybridisiert. Die TaqMan-Sonden sind am 5´-Ende mit der fluoreszenten Reporterfarbe FAM (6-Carboxyfluoreszein), einem Fluoreszeinderivat, und am 3´-Ende mit der Quencherfarbe TAMRA (6-Carboxytetramethylrhodamin), einem Rhodaminderivat, markiert.

Durch ihre 5’-3’-Exonukleaseaktivität separiert die Taq-DNA-Polymerase während der Elongation das fluoreszierende Nukleotid von dem Quencher, wodurch das Nukleotid zur Fluoreszenz befähigt wird (Abb. 43). Die Akkumulation des PCR-Produkts kann so direkt an der Erhöhung der Fluoreszenz abgelesen werden.

↓102

Die TaqMan-PCR wird mit einem ABI PRISM 7700 Sequence Detector (PE Applied Biosystems) durchgeführt. Als Reaktionsgefäße werden spezielle hitzestabile, optisch durchlässige 96-Loch-Platte verwendet. Die 96-Loch-Platte wird mit einer spezielle hitzestabile, optisch durchlässige Folie verklebt.

Mit der TaqMan-PCR sollten Nachweis und Quantifizierung von Virus-DNA in den HBV-produzierenden Zelllinien erfolgen.

Reaktionsansatz:

6,2500µl

2xTaqMan® Universal PCR Master Mix

 

0,3125µl

TaqMan-Sonde 20µM

 

je 0,2250µl

Vorwärts- und Rückwärtsprimer je 100µM

 

10,0000µl

der zu untersuchenden Probe

 

7,9875µl

H2Odd

↓103

Im 2x Universal MasterMix (Perkin Elmer) ist neben der AmpliTaq Gold Polymerase ein weiteres Enzym, Uracil N´-glycosylase, enthalten, welches kontaminierende Nukleinsäuren aus vorhergehenden PCRs durch Spaltung der glycosidischen Bindung zwischen Desoxyribose und Uracil, inaktiviert.

Von jeder Probe werden mindestens Doppelwerte bestimmt. Als Negativkontrollen dienen PCR-Ansätze ohne DNA zum Ausschluß einer Kontamination mit Template. Das pSM2-Plasmid oder pSPT1.2xHBV wurde als Standard mitgeführt.

Um umhüllte virale DNA von transfizierter DNA unterscheiden zu können, werden die zu untersuchenden Lösungen auf 4mM MgCl2 eingestellt, 200U/ml DNase (ROCHE) hinzugegeben und eine Stunde bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Um die DNase zu deaktivieren wird der Ansatz 10min bei 95°C gekocht.

↓104

In der PCR wird mit den Primern TaqMan-f HBsAg und TaqMan-b HBsAg ein 89bp-Fragment des viralen S-Gens amplifiziert (Pas et al., 2000). Mit den Primern HBxfTM1 und HBxrTM1 entsteht ein 96bp-Fragment im überlappenden Genbereich für das x-Protein und die DNA-Polymerase (Loeb et al. 2000).

Die Auswertung erfolgt durch die „Sequence Detections Systems“-Software von PE Applied Biosystems. Für jede Probe wird der PCR-Zyklus errechnet, ab welchem die Menge des Amplifikationsproduktes über das "Untergrundrauschen" (threshold line, CT) ansteigt. Dazu schlägt der Computer einen CT vor, der bei der 10fachen Standardabweichung der Fluoreszenzwerte zwischen den Zyklen 3-15 liegt. Der CT-Wert kann manuell verändert optimiert werden, so dass man die unterschiedlichen Proben besser unterscheiden kann. Über eine Standardkurve kann die absolute Virus-DNA-Kopienanzahl in jeder Probe ermittelt werden.

13.13. Herstellung kompetenter E. coli

800ml LB-Medium werden mit 10ml einer Übernachtkultur von E. coli angeimpft und bis zu einer OD60 0 nm von 0,5 geschüttelt. Anschließend werden die Bakterien steril abzentrifugiert und in 50ml eiskaltem TFB1 Puffer resuspendiert. Nach einer Inkubation von 90min auf Eis wird die Suspension im vorgekühlten Rotor abzentrifugiert und die Bakterien in 15 bis 20ml TFB2 resuspendiert. Die Suspension wird in Eppendorf-Gefäßen in 200–500µl Mengen aliquotiert, die in einer Kältemischung aus Ethanol/Trockeneis vorgekühlt werden. Die Lagerung der kompetenten Zellen erfolgt bei -70°C.

13.14. Transformation von kompetenten E. coli

↓105

Die eisgekühlte DNA-Lösung (Plasmid- bzw. Ligationsansatz) wird mit 100µl kompetenter Zellsuspension versetzt und für mindestens 30min auf Eis inkubiert. Der anschließende Hitzeschock erfolgt für 60s bei 42°C, dann folgt eine 3 minütige Abkühlung auf Eis. Nach dem Zusatz von 500µl kaltem LB-Medium und der Inkubation für 30min bei 37°C unter Schütteln werden die Bakterien auf einem geeigneten Selektionsmedium ausplattiert (LB Agar mit Antibiotika).

13.15. Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli

Für eine solche Präparation wird je nach benötigter Plasmid-DNA-Menge der QIAprep Spin Miniprep Kit oder für eine größere Ausbeute der QIAprep Maxiprep Kit (QIAGEN) verwendet. Sie basieren auf dem von Birnboim und Doly (1979) beschriebenen Verfahren. Dabei werden die Bakterien unter alkalischen Bedingungen lysiert und die bakterielle DNA sowie Proteine denaturiert. Die bakterielle RNA wird bereits während der alkalischen Lyse durch die im Resuspendierungspuffer anwesende RNase A abgebaut. Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte aus einer Übernachtkultur. Hierzu werden für eine Miniprep 3-5ml LB-Medium und für eine Maxiprep 500ml mit einer Einzelkolonie beimpft und über Nacht kultiviert. Die Bakterien werden gemäß dem Herstellerprotokoll bearbeitet. Zur Kontrolle der DNA Präparation werden 1-5µl auf ein Agarosegel aufgetragen.

13.16. Isolierung viraler DNA

Zur Isolierung viraler DNA aus Zellkulturüberständen und Zelllysaten wurden verschiedene Methoden getestet. Teilweise wurden die Viren aus Zellkultur-Überständen durch Fällung mit PEG 8000 (1/10 Volumenanteile w/v) und anschließender Zentrifugation angereichert. Da bei dieser Fällung auch andere Proteine mit abzentrifugiert werden, wurde das Pellet in TNE-Puffer aufgenommen und über ein Sucrose-Kissen zentrifugiert. Die Viren sind im Pellet enthalten.

↓106

Eine andere Möglichkeit der Konzentrierung des Zellkulturüberstandes bestand in der Zentrifugation über eine Macrosep 300K (Zentrifugalkonzentratoren MWCO 300kDa, PALL).

13.16.1. kommerziell angebotene Kits

Das Prinzip des "High pure viral nucleic acid kit" (Roche) und des "QIAamp Blood Mini Kit" (QIAGEN) sind weitgehend identisch. Durch einen Proteinase K-Verdau in einem SDS- und chaotropen Salz-haltigem Puffer wird die Virushülle und im Kulturmedium enthaltene Proteine verdaut und so die DNA freigesetzt. Zur Fällung wird dann Isopropanol bzw. Ethanol (Roche bzw. QIAGEN) zugesetzt und die Lösung auf die Spin-Säulen gegeben. Bei dem Roche-Kit handelt es sich um Glasfaserfleece beim Säulenmaterial, wohingegen die Säulen bei QIAGEN Silicagel enthalten. Anschließend wird zur Entfernung störender Proteine und anderer Kontaminationen noch mal mit einem chaotropen Puffer gewaschen. Nach ein- bis zweimaligem Waschen mit einem Ethanol-haltigem und wenig Salz-haltigem Puffer (QIAGEN/Roche) wird die DNA mit 10mM Tris/HCl; 0,5mM EDTA; pH 9,0 oder Wasser (QIAGEN/Roche) eluiert. Bei beiden Kits wurden jeweils 100µl zur Elution eingesetzt, ansonsten wurde sich an die Anweisungen der Hersteller gehalten.

13.16.2. nach Boom et al. (1990)

Hierzu wird Silica in Wasser resuspendiert (1g/ml) und mit HCl (1µl/ml) auf einen pH von 2 gebracht. Von dieser Suspension werden 40µl mit 900µl Lysis-Puffer L6 homogenisiert. Zu dieser Mischung werden 50µl Probe gegeben, gemischt und 10min bei Raumtemperatur inkubiert und nochmals gemischt. Nach kurzer Zentrifugation (15s, 12.000g) wird der Überstand verworfen und das Pellet zweimal mit Wasch-Puffer L2, zweimal mit 70% Ethanol und einmal mit Aceton gewaschen. Das Pellet wird bei 56°C 10min getrocknet und mit 100µl TE-Puffer gevortext und noch mal 10min bei 56°C inkubiert. Anschließend wird die Suspension 2min bei 12.000g zentrifugiert. Der Überstand enthält die DNA.

13.16.3. nach Kaneko et al. (1989, 1990)

↓107

Kaneko et al. (1989, 1990) haben aus Serum durch alkalische Lyse die Virushülle zerstört und so die virale DNA freigesetzt.

100µl Zellkulturüberstand werden mit 100µl 0,2M NaOH versetzt und 60min bei 37°C inkubiert. Im Anschluss werden 100µl 0,12M HCl zur Neutralisierung hinzugefügt. Aus dieser Lösung werden dann die Proben für die TaqMan-PCR entnommen.

14. Zellbiologische Methoden

14.1. Kultivierung und Passagieren von eukaryotischen Zellen

Die immortalisierten Zelllinien werden in geeignetem Medium (DMEM bzw. RPMI 1640 Komplettmedium) bei 37°C, 5% CO2 und 90% Feuchtigkeit kultiviert. Bei ca. 70%iger Konfluenz, werden die Zellen passagiert. Dafür werden die Zellen nach Waschen mit PBS mit Trypsin (0,5mg/ml) versetzt, für 3-5min bei 37°C inkubiert. Die Zellen lassen sich durch leichtes Schlagen gegen die Flaschenseite vom Zellkulturflaschenboden ablösen. Durch die darauf folgende Medien-Zugabe wurde das Trypsin inaktiviert. Die Zellen wurden 1:4 verdünnt wieder in Zellkulturflaschen ausgelegt.

14.2. Einfrieren und Auftauen von immortalisierten Zellen

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Zur Konservierung werden trypsinierte Zellen in 1,5ml Einfriermedium suspendiert und langsam durch ein Kryostat (das mit Isopropanol gefüllt ist und über den Temperaturkoeffizienten von Isopropanol eine kontrollierte Abkühlrate der Zellen von 1°C pro Minute gewährleistet) auf –80°C gebracht, um sie dann in flüssigem Stickstoff zu lagern.

Zum Auftauen wird die eingefrorene Zellsuspension durch Schwenken des Kryoröhrchens im 37°C warmen Wasserbad fast vollständig aufgetaut. Die Zellen werden dann zügig in vorgewärmtes Medium aufgenommen, pelletiert und einmal gewaschen, um das DMSO vollständig zu entfernen. Anschließend werden die Zellen in Kultur genommen. Um das Wachstum und die Proliferation der aufgetauten Zellen zu fördern, werden sie für die erste Passage nach dem Auftauen im Kulturmedium mit 20% FCS gehalten.

14.3. Transfektion von Säugerzellen

14.3.1. Calciumphosphat-Methode

Das Prinzip dieser Transfektionsmethode besteht darin, dass zu einer Mischung aus Calciumchlorid und DNA unter ständigem Mischen Phosphat zugegeben wird, so dass Calciumphosphat-Kristalle ausfallen und die DNA dabei kopräzipitiert. Die entstandenen feinen Kristalle werden nun von den Zellen phagozytiert (Graham & van der Eb, 1973). Ein Ansatz bezieht sich auf eine 10cm-Schale, auf der die Zellen bis zu 70-80%iger Konfluenz gewachsen sind. Zwei Stunden vor der Transfektion wird das Medium gewechselt. Zu einem 250µl-Ansatz, der 4-8µg DNA und 50µl einer 2,5M CaCl2-Lösung enthält, werden innerhalb von 30s 250µl 2xHBS-Puffer zugetropft. Zur Ausbildung von Kristallen wird diese Mischung 30min stehengelassen bevor sie gleichmäßig über die Zellen verteilt wird. Nach 12-18h wird das Medium abgesaugt, die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, mit frischem Medium versetzt und für weitere 2-5 Tage bei 37°C inkubiert ehe die Zellen lysiert und weiter verwendet werden.

14.3.2. Lipofektion

↓109

Zur Transfektion einer 10cm-Schale werden in einem Reaktionsgefäß 7,5µg Plasmid-DNA mit FCS-freiem Medium auf 75µl (RPMI 1640 bzw. DMEM) aufgefüllt, in einem zweiten Reaktionsgefäß 45µl DOTAP (Roth) mit FCS-freiem Medium gemischt. Anschließend wird das DNA-Gemisch in das DOTAP-Gemisch überführt, gemischt und nochmals 15min bei RT inkubiert. Das Medium der zu transfizierenden Zellkulturschalen wird nun durch 6ml FCS- und antibiotikafreies Medium ersetzt, das DNA/DOTAP Gemisch hinzugegeben und für 3-10h bei 37°C inkubiert. Anschließend wird das Medium durch Komplettmedium ersetzt und der Transfektionsansatz bei 37°C für weitere 2-5 Tage inkubiert.

Bei der Transfektion von Objektträgern oder 6cm-Schalen werden die Mengen der eingesetzten Reagenzien proportional zu der zu transfizierenden Fläche verringert.

14.4. Herstellung einer stabil transfizierten Zelllinie

Hierzu werden HepG2 nach 2.3.2 transfiziert. Die Expression des Gens in eukaryotischen Zellen wird im pcDNA3.1(-) durch den hCMV-Promotor reguliert und durch eine Neomycinresistenz soll sichergestellt werden, dass nur Zellen mit diesem Plasmid selektioniert werden. Das Selektionsmedium enthielt G418.

14.5. Inkubation eukaryotischer Zellen mit synthetischen Peptiden / rekombinanten Proteinen

↓110

Die entsprechenden Konzentrationen wurden durch Verdünnung in 0,5% FCS-haltigem RPMI 1640 –Medium hergestellt.

Bei transient transfizierten Zellen wurden die Zellen nach der Transfektion gleichmäßig verteilt, damit man von einer gleichen Menge produzierten HBV-Partikel ausgehen konnte. Die Inkubation mit synthetischen Peptiden / rekombinanten Protein erfolgte nach den im jeweiligen Experiment angegebenen Zeiten und Konzentrationen.

14.6. Zelllysatpräparation aus eukaryotischen Zellen

14.6.1. mit Triton X-100 haltigem Puffer

Typischerweise wird eine 10cm Zellkulturschale 2 bis 4 Tage nach der Transfektion (siehe 14.3.) mit 5ml PBS gewaschen mit 1ml Lysis-Puffer versetzt und für 10min bei 4°C inkubiert. Die Zellen werden abgeschabt und in ein Reaktionsgefäß überführt. Die nicht löslichen Anteile werden durch Zentrifugation (1min, 10.000g, 4°C) entfernt. Bis zur weiteren Verwendung kann das Lysat bei –20°C gelagert werden.

14.6.2. mit Dignam A

↓111

Die Zellen werden in einer 6cm kultiviert, nach mit PBS gewaschen und mit 0,7ml Dignam A 10min auf Eis inkubiert und anschließend abgeschabt. Nach dem Pottern wird das Lysat 18min bei 430.000g (entsprechen 60min bei 100.000g) und 4°C in der Ultrazentrifuge zentrifugiert. Dadurch werden die nicht löslichen Bestandteile abgetrennt und man erhält das Zytosol.

14.7. Immunopräzipitation

Zur Anreicherung von Viren oder Proteinen aus zellulären Lysaten und Zellkulturüberständen werden Immunopräzipitationen durchgeführt.

Für die Protein- oder Virus-Präzipitation wird der erste Antikörper mit 40µl Protein A/G-Sepharose versetzt, auf 500µl mit PBS aufgefüllt und 16h bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Um vorhandenes NaN3 zu entfernen wird das Ak-Protein A/G-Sepharose Konjugat dreimal mit 1ml PBS gewaschen. Das Virus-Konzentrat oder Zelllysat wird nun zu dem Ak/Sepharose-Konjugat gegeben und wiederum ÜN unter Schütteln bei 4°C inkubiert. Das Präzipitat wird 3 mal mit 1ml PBS gewaschen und kann nun gelelektrophoretisch getrennt (siehe 15.4.) werden.

14.8. Kultivierung von E. coli

↓112

Bakterienkulturen werden in Schüttelkolben in LB-Medium oder auf den entsprechenden Agarplatten bei 37°C gehalten. Die Konservierung erfolgt als Glycerolkultur bei -20°C. Je nach Resistenzgen des in den Bakterien enthaltenden Plasmides werden die Kulturen mit Ampicillin (100µg/ml) und/oder Kanamycin (25µg/ml) versetzt.

14.9. Lyse von E. coli durch Ultraschall

Die Zellen einer Induktionskultur werden abzentrifugiert, mit PBS gewaschen und in 30ml Lysis-Puffer/l Induktionskultur suspendiert. Anschließend werden die Zellen durch Ultraschall (3x1min, 100% Leistung, 60% Zyklus) aufgeschlossen, die unlöslichen Bestandteile durch Zentrifugation (30min, 12.000g, 4°C) entfernt und das Lysat weiterverwendet (siehe 15.3.1.).

15. Proteinchemische Methoden

15.1. Induktionskultur von E. coli

Bei dem verwendeten Expressionsplasmid pQe8 liegt das zu exprimierende Gen unter der Kontrolle eines IPTG-abhängigen Promotors/Operators (Lac). Die Proteinsynthese wird durch 1mM Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert.

↓113

Etwa 900ml mit Ampicillin (100µg/ml) und Kanamycin (25µg/ml) versetztes LB-Medium wird mit 100ml einer Übernachtkultur angeimpft. Die 3 bis 5 stündige Induktion erfolgt durch Zugabe von 1ml IPTG-Stammlösung entsprechend einer Endkonzentration von 1mM. Die Zellen werden geerntet, einmal mit PBS gewaschen und können nun zur Proteingewinnung aufgeschlossen werden.

15.2. Proteinkonzentrationsbestimmung

15.2.1. nach Bradford

Durch die Bindung an Proteine verschiebt sich das Absorptionsmaximum von Coomassie Brilliant Blue G250 von 465 nach 595nm (Bradford, 1976). Allerdings ist diese Methode nicht bei Anwesenheit von Detergenzien anwendbar und die Sensitivität variiert je nach Protein (Stoscheck, 1990).

1ml Bradfordreagenz (1:5 verdünnt aus der BIORAD-Stammlösung) werden in einer Küvette mit 3-10µl der Probe gemischt und die Extinktion innerhalb einer Stunde bei 595nm gemessen.

15.2.2. durch Absorptionsmessung bei 280nm

↓114

Tryptophan, sowie schwächer auch Tyrosin und Phenylalanin, absorbieren bei 280nm. Aufgrund dieser Absorption kann die Konzentration von Proteinen ermittelt werden. Der Wert berechnet sich nach folgender Formel:

cProtein=1,55xE280-0,76xE260 [mg/ml] (Warburg & Christian, 1941)

Die Formel berücksichtigt Verunreinigungen der Probe durch Anwesenheit von Nukleinsäuren.

15.3. Säulenchromatographische Methoden

15.3.1. Affinitätschromatographie

↓115

Die mit dem pQe8-System in E. coli exprimierten Proteine können aufgrund des aminoterminalen HisTags an einer mit Ni2+-NTA-Agarose-Matrix immobilisiert werden (QIAGEN). Durch die Häufung von 6 Histidinresten erfolgt eine sehr starke Bindung an das Ni2+, welche eine Trennung von den auf Grund weniger Histidinresten nicht so stark bindender Proteine ermöglicht.

Diese und unspezifisch gebundene Proteine werden bei einem pH von 6,3 (isoelektrischer Punkt von Histidin) von der Säule gewaschen. Die spezifisch gebundenen Proteine werden durch eine hohe Imidazol-Konzentration im Elutionspuffer von der Säule eluiert. Nach der Elution wird die Säule durch das Waschen mit einem mit dem Auftragungspuffer regeneriert.

Die Probe wurde mit einem Fluss von 0,5ml/min auf die mit Auftragungspuffer äquilibrierte Säule geladen und solange gespült, bis die Extinktion wieder einen Basiswert erreichte. Gewaschen wurde nun mit Waschpuffer bei einem Fluss von 1ml/min. Die Elution erfolgte durch einen Gradienten von Waschpuffer gegen Elutionspuffer (Fluss von 1ml/min über 3 Säulenvolumina). Nach der Beendigung des Gradienten wird mit 4 Säulenvolumina Puffer C nachgespült.

↓116

Die Detektion der eluierten Proteine erfolgt durch Messung der Absorption bei 215nm, 260nm und 280nm Wellenlänge.

15.3.2. Gelfiltrationschromatographie

Mit Hilfe der Gelfiltrationschromatographie können Proteine, Peptide und Farbstoffe entsprechend ihrer Größe und Oligomerisierungsgrades getrennt werden.

Zur Trennung der markierten synthetischen Peptide von nicht gebundenen Fluoreszenzfarbstoffen wird eine Superdex Peptide 10/30 (Amersham Biosciences) verwendet. Als Laufmittel wird PBS pH 7,2 gewählt.

15.3.3. Reversed-Phase-Chromatographie

↓117

Über die Reversed-Phase-Chromatographie kann man Peptide, Proteine, Oligonukleotide und andere Biomoleküle nach ihrer Polarität trennen.

Zur Trennung von unmarkiertem Peptid von markiertem wurde eine Sephasil Peptide C18 5µm Säule genutzt. Es wurde ein linearer Gradient bis 70% Acetonitril mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) gefahren. Die Detektion der eluierten Proteine erfolgt bei 215nm, 280nm und 548nm (Cy3™).

15.4. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Proteine größer als 30kDa werden nach dem Verfahren nach Laemmli (1975), kleinere Proteine nach Schägger und v. Jagow (1987) gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die Zusammensetzung des Trenngels wird dabei der Größe des gesuchten Proteins angepasst.

↓118

Die Proteinproben werden in einem Volumenverhältnis von 1:5 mit 5x SDS-Probenpuffer versetzt und durch Erhitzen auf 95°C für 5min denaturiert. Das Einlaufen der Proben erfolgt bei 80V für 15min, danach wird die Spannung auf 130V erhöht. Die Erwärmung der Gele wird durch Wasserkühlung verhindert. Als Größenstandard werden Rainbow-Marker verschiedener Zusammensetzung (Amersham) verwendet.

15.5. Färben von Proteingelen

15.5.1. Coomassie-Färbung

Zum Nachweis von Proteinmengen (>30ng) werden die Gele für 20min in 0,1%iger Coomassie Brilliant Blue R250 Lösung (in 30% Ethanol, 10% Eisessig) bei 55°C gleichzeitig fixiert und gefärbt. Die Entfärbung des Hintergrundes erfolgt in 25% Ethanol, 10% Eisessig.

15.5.2. Silberfärbung nach Heukeshoven und Dernick

Zum Nachweis von kleinen Proteinmengen (bis zu 3ng) wird die Silberfärbung nach Heukeshoven and Dernick (1988) angewendet. Das Prinzip beruht auf der selektiven Reduktion der von Proteinen komplexierten Silberionen durch Formaldehyd. Dabei entstehen Silberkeime, die während der Entwicklung des Gels die weitere Reduktion von Silberionen katalysieren.

↓119

Die Fixierung der Gele erfolgt für 20min in Silbergel-Fixierlösung, die Konditionierung in Konditionierlösung für 30min. Nach fünfmaligem Waschen in H2Odd für je 5min wird das Gel in 0,1%iger Silbernitratlösung (mit 40µl Formaldehyd pro 100ml) geschwenkt. Die Proteinbanden werden durch Inkubation in Entwicklerlösung sichtbar gemacht. Gestoppt wird die Reaktion durch Zugabe 10%iger Essigsäure.

15.6. "Western Blotting", Immunoblot

Der Transfer gelelektrophoretisch aufgetrennter Proteine auf eine Nitrozellulosemembran wird nach dem diskontinuierlichen "Semi-dry"-Verfahren bei 2-4mA/cm2 für 45min durchgeführt (Kyhse-Andersen, 1984).

Nach dem Waschen des Blots für mindestens 30min in PBST beginnt die Inkubation mit dem ersten Antikörpers (in 10% Milchpulver in PBST) für 2h bei Raumtemperatur. Nicht gebundener Antikörper wird durch fünfmaliges Waschen mit PBST entfernt. Die nun folgende Inkubation mit dem zweiten Peroxidase-konjugierten Antikörper erfolgt ebenfalls in 10% Milchpulver/ PBST.

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Nach erneutem Waschen wird der Blot entwickelt. Als Substrat dient Luminol (3-Aminophtalhydrazid) und H2O2. Als Produkte entstehen 3-Aminophtal-säure, Stickstoff und Lichtquanten bei einer Wellenlänge von 425nm. Die Detektion der Lichtquanten erfolgt durch Auflegen eines Röntgenfilms.

15.7. Generierung von Antiserum

Zur Gewinnung von PreS2-spezifischen Antiserum wurde ein Kaninchen immunisiert. Dazu wurden 100µg Antigen in 250µl 20mM NaPi pH 6,5 suspendiert und mit 250µl komplettem Freunds Adjuvans versetzt, gut gemischt und injiziert. Dieser Vorgang wurde nach 14 Tagen mit inkomplettem Freunds Adjuvans wiederholt , außerdem wurde zu diesem Zeitpunkt Blut aus der Ohrvene entnommen, um Serum zum testen zu gewinnen. Nach weiteren 14 Tagen wurde nochmals Antigen injiziert aber diesmal mit inkompletten Freudsches Adjuvans verwendet. Nach insgesamt 6 Wochen wurde das gesamte Blut für die Antiserumgewinnung entnommen.

15.8. Aufreinigung des PreS2-Antiserums

9ml Antiserum werden über Nacht bei 4°C mit 2,817g (NH4)2SO4 gefällt, dann 30min bei 9000rpm und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wird in 5ml PBS aufgenommen und in zwei Schritten gegen PBS dialysiert, um das (NH4)2SO4 zu entfernen. Anschließend wird das Dialysat auf 10ml mit PBS aufgefüllt und nochmals zentrifugiert (1h, 10.000rpm, 4°C).

↓121

Das gesamte Volumen wird auf eine Säule mit PreS1S2 beladener NHS-Sepharose gegeben, mit PBS gewaschen und mit 100mM Glycin (pH 2,7) eluiert und sofort mit 1M Tris/HCl (pH 8,8) neutralisiert. Nach Dialyse gegen PBS, wird der gereinigte PreS2-Antikörper aliquotiert und bei 4°C gelagert.

15.9. Fluoreszenzmarkierung synthetischer Peptide

Die Markierung der Peptide beruht auf der Spaltung des N-Hydroxysuccinimid-Esters (NHS) mit dem Fluoreszenzfarbstoff durch primäre Amine (ε-Aminogruppe bei Lysin, N-Terminus) im alkalischen pH-Bereich. Die Spaltung wird auch durch Wasser und Cysteinreste (muss in großer Menge vorhanden sein) herbeigeführt. Ist der pH-Wert nicht sehr alkalisch dauert die Kopplung länger.

Bei der Kopplung mit NHS-Cy3™ und NHS-Fluorescein wurde nach Herstellerangaben vorgegangen.

15.9.1. Fluorescein-Markierung

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NHS-Fluorescein wird in DMSO gelöst, das Peptid in PBS (pH 7,2). Die beiden Lösungen werden gemischt und mindestens 2h auf Eis inkubiert.

15.9.2. Cy3™-Markierung

Das in Na2CO3 (pH 9,3) gelöste Peptid wird in ein mit trockenem Cy3™-NHS-Ester befülltes Reaktionsgefäß gegeben und mindestens 30min bei Raumtemperatur inkubiert.

16. Virologische Methoden

16.1. ELISA

Zur Quantifizierung der Oberflächenantigene, des HBc- und HBeAg werden kommerziell erhältliche ELISA (DADE BEHRING, Schwalbach) verwendet. Die Durchführung der Tests erfolgt nach den jeweiligen Protokollen der Herstellerfirma.

16.2. Sedimentation von Virus-Partikeln durch Sucrose-Kissen

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Hepatitis-B-Viren können aufgrund ihrer Dichte mit Hilfe eines Sucrose-Kissens von Fremdproteinen sowie von subviralen Partikeln getrennt werden. Hierfür wird die zu untersuchende Probe in Ultrazentrifugengefäßen vorgelegt und mit einer 30%igen Sucrose-Lösung (10-20% des Zentrifugengefäßvolumens) unterschichtet. Die Sedimentation durch das Sucrose-Kissen erfolgt in einem Ausschwingrotor bei 200.000g für 2h bei 10°C. Nach der Zentrifugation kann der Überstand fraktioniert, das Pellet resuspendiert und für weitere Untersuchungen verwendet werden.

17. Indirekte Immunfluoreszenz von eukaryotischen Zellen

Pro Objektträgerfeld werden etwa 0,2*106Zellen (HepG2) ausgelegt. Die Zellen werden mit den Peptiden für 30min inkubiert. Dabei werden die in Peptide mit 0,5% FCS-haltigem Medium verdünnt. Nach dem zweimaligen Waschen der Zellen mit PBS erfolgt die Fixierung durch Inkubation mit 4%igem Formaldehyd in PBS für 10min. Durch die Gegenwart von 1mg/ml DAPI wird hierbei die DNA und somit indirekt der Zellkern gefärbt.

Anschließend werden unspezifische Bindungen durch die Inkubation mit 10%BSA in PBST abgeblockt, bevor der erste Antikörper in einer 10% BSA/PBST Verdünnung für 30min auf die Zellen gegeben wird. Um das Austrocknen der Präparate zu vermeiden wird die Inkubation in einer feuchten Kammer durchgeführt. Die Objektträger werden anschließend 30min unter viermaligem Wechseln des Puffers mit PBST gewaschen. Der zweite Antikörper, konjugiert mit den Fluoreszenzfarbstoffen Cy2™ oder Cy3™, wird ebenfalls in 10% BSA/PBST verdünnt zugesetzt und für 30min inkubiert. Abschließend werden die Präparate für weitere 30min unter viermaligem Wechsel des Puffers mit PBST gewaschen.

↓124

Auf die fixierten Zellen wird dann ein Tropfen 10%ige Glycerollösung gegeben und mit einem Deckglas blasenfrei abgedeckt. Die Betrachtung der Präparate erfolgt nun im Fluoreszenz- oder im Durchlicht.


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24.10.2005