Charakterisierung funktioneller und struktureller Voraussetzungen der Hepatitis-B-Virus-Replikation

D i s s e r t a t i o n

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium

( Dr. rer. nat.)

im Fach Virologie

eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Dipl.-Biochem. Beate Malkowski


geboren am 9. Dezember 1970 in Berlin

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Detlev Krüger
2. PD Dr. Helmut Hengel

Eingereicht: 25.06.2003

Tag der mündlichen Prüfung: 30.09.2004

Widmung:

Meinen Eltern


Zusammenfassung

Für den Zusammenbau des HBV-Partikels ist die Interaktion zwischen Oberflächenproteinen und dem Nukleokapsid notwendig. Sich überlappende synthetische Peptide aus dem Bereich der HBcAg-Bindungsdomäne im C-Terminus der PreS1-Region und dem TLM, sind nach Internalisierung vor allem im Kern lokalisiert. Die Aminosäuren 101-115 der PreS1-Region interagieren mit dem Nukleokapsid, während die PreS2-Domäne keine Interaktion mit dem Nukleokapsid eingeht. Mit den synthetischen Peptiden konnte Einfluss auf die Sekretion viraler Partikel genommen werden. Die Lokalisation von HBcAg als Interaktionspartner in HBV-produzierenden Zellen verändert sich bei Inkubation mit den synthetischen Peptiden, es tritt vermehrt im Kern auf.

Rekombinante Proteine ähnlich den synthetischen Peptiden aber mit der vollständigen PreS2-Region, sind nach Internalisierung im Zytosol nachweisbar. Die Sekretion viraler Partikel wurde partiell inhibiert.

Das HBV-Genom kodiert zwei virale Aktivatoren, das HBx und die PreS2-Region im LHBs. Beide aktivieren den c-Raf-1/MEK-Signalweg. Durch die selektive Inhibierung der Effektoren (Ras oder Proteinkinase C) von HBx oder PreS2 im LHBs konnte kein Effekt auf die Genexpression/ Sekretion nachgewiesen werden. Durch simultane Inhibierung der Signalkaskade so kommt die Virussekretion fast vollständig zum Erliegen. Die Ursache hierfür ist in einer reduzierten Neusynthese von viralen Proteinen zu finden und nicht in der Akkumulation der Proteine in der Zelle. Zur Untersuchung des Einflusses der Funktionalität der beiden Aktivatoren wurden HBx- bzw. PreS2- und HBx/PreS2-defiziente HBV-Expressionsplasmide generiert. Die Einzelmutanten zeigten nur einen geringen reduzierenden Einfluss auf die Genexpression/Virussekretion. Beim Einsatz der Doppelmutante wurde die Genexpression/Virussekretion fast vollständig inhibiert. HBx und PreS2 im LHBs sind für die Virusreplikation von Bedeutung aber sie können einander ersetzen.

Schlagworte: HBV, Interaktion, Nukleokapsid, Aktivator, Signalkaskade, Virussekretion

Abstract

Assembly of HBV particles and subsequent secretion of mature virus requires the interaction of the nucleocapsid with defined domains of the surface proteins. Overlapping synthetic peptides covering the C-terminal part of the PreS1 domain and the cell permeable domain of PreS2 (TLM) were shown to localize most of all in the nucleus. Based on these peptides aa 101-115 of PreS1 were found to be essential for the interaction with the nucleocapsid, while the PreS2 domain does not interact with the nucleus. Presence of the peptides that compete the nucleocapsid surface protein interaction a block of HBV and antigen secretion was achieved. HBcAg as natural interaction partner of the surface proteins then arises increased in the nucleus.

Recombinant proteins similar to the synthetic peptides but with the whole PreS2 domain localize in the cytoplasm and block HBV and antigen secretion.

The genome of HBV encodes two transcriptional activators: the HBx protein and the PreS2 activator LHBs. Both trigger activation of c-Raf-1/MEK kinase cascade. To evaluate the importance of both activators for viral replication selective inhibitions of signal transduction cascades were performed and do not result in a decrease of viral replication. Simultaneous inhibition of both activators abolished viral secretion. It is due to a reduced de novo synthesis and not to an accumulation of viral proteins in cells. The relevance of activator function was tested by mutated HBV genome defective for HBx and / or PreS2 activator function. After transfection single mutants show no significant reduced HBV expression whereas at the double mutated HBV genome a strong reduced virus expression could be observed. The HBx protein and the PreS2 activator LHBs are important for viral replication but they can replace each other.

Keywords: HBV, interaction, nucleocapsid, activator, kinase cascade, viral secretion

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24.10.2005