Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

• I Einführung

  • 1. Das Hepatitis-B-Virus

  • 2. Verlauf einer HBV-Infektion

  • 3. Aufbau des Virus und der sekretierten Antigene

  • 4. Das HBV-Genom

  • 5. HBV-Replikation

  • 6. HBV-Transkription

  • 7. Die viralen Proteine

    • 7.1. Die HBV-Polymerase

    • 7.2. Das HBSP

    • 7.3. Das HBx-Protein

    • 7.4. Das Nukleokapsidprotein und HBeAg

    • 7.5. Die Oberflächenproteine

      • 7.5.1. Das kleine Oberflächenprotein SHBs

      • 7.5.2. Das mittlere Oberflächenprotein MHBs

      • 7.5.3. Das große Oberflächenprotein LHBs

      • 7.5.4. Das LHBs als transkriptioneller Aktivator

      • 7.5.5. Die Rolle der Oberflächenproteine bei der Virusmorphogenese

  • 8. Zellpermeable Peptide und Proteine

    • 8.1. Das Translokationsmotiv

  • 9. Ansätze und Ziele dieser Arbeit

• II Ergebnisse

  • 1. Etablierung der TaqMan-PCR zur Quantifizierung von Virus-DNA

    • 1.1. HBsAg-spezifische Primer und Sonde

      • 1.1.1. Verschiedene DNA-Isolierungsmethoden

    • 1.2. HBx-spezifische Primer und Sonde

  • 2. Strukturelle Voraussetzungen der Virusreplikation

    • 2.1. Synthetische Peptide

      • 2.1.1. Die Struktur der synthetischen Peptide

      • 2.1.2. Peptidmarkierung und -isolierung

      • 2.1.3. Internalisierung der synthetischen Peptide

    • 2.2. Einfluss synthetisch hergestellter TLM-PreS1(n) Peptide

      • 2.2.1. Sekretion von Virus-Partikeln

      • 2.2.2. Sekretion von viralen Antigenen

    • 2.3. Herstellung rekombinanter PreS1(n)PreS2 Proteine

      • 2.3.1. Konstruktion prokaryotischer Expressionsplasmide

      • 2.3.2. Isolierung prokaryotisch produzierter Proteine

      • 2.3.3. Konstruktion eukaryotischer Expressionsplasmide

        • 2.3.3.1. Stabil transfizierte HepG2-Zelllinien

      • 2.3.4. Antikörpergenerierung und -reinigung

    • 2.4. Charakterisierung rekombinanter PreS1(n)PreS2-Proteine

      • 2.4.1. Zellpermeabilität der rekombinanten Proteine und Interaktion von HBcAg und PreS1(n)PreS2-Proteinen

      • 2.4.2. Sekretion von viralen Partikeln

      • 2.4.3. Sekretion von viralen Antigenen

  • 3. Funktionelle Voraussetzungen der HBV-Replikation

    • 3.1. Einfluss der HBV-Aktivatoren auf die HBV-Expression

    • 3.2. Einfluss der c-Raf-1/ MEK-Signalkaskade auf die HBV-Expression

    • 3.3. Einfluss der Funktionalität der HBV-Aktivatoren auf die Virusproduktion

• III Diskussion

  • 1. Etablierung der TaqMan-PCR zur Quantifizierung von Virus-DNA

  • 2. Antikörpergenerierung und -reinigung

  • 3. Strukturelle Voraussetzungen der Virusreplikation

    • 3.1. Einfluss von synthetischen Peptiden auf HBV-produzierende Zellen

    • 3.2. Einfluss von rekombinanten PreS1(n)PreS2-Proteinen auf HBV-produzierende Zellen

  • 4. Funktionelle Voraussetzungen der HBV-Replikation

• IV Zusammenfassung

• V Material und Methoden

  • 1. Puffer und Lösungen

  • 2. Chemikalien und Verbrauchsmittel

  • 3. Enzyme

  • 4. Antikörper

    • 4.1. Primäre Antikörper

    • 4.2. Sekundäre Antikörper

  • 5. Materialien für die Zellkultur

  • 6. Längenstandards

  • 7. Verwendete Kits

  • 8. Plasmide

    • 8.1. HBV-Plasmide

    • 8.2. kommerziell erhältliche Plasmide

  • 9. Synthetische Oligonukleotide

    • 9.1. PCR-Primer:

    • 9.2. Primer für die Sequenzanalyse:

    • 9.3. Primer und Sonden für TaqMan-PCR

  • 10. Synthetische Peptide

  • 11. Geräte

    • 11.1. Elektrophorese- und Blotsysteme

    • 11.2. Zentrifugen / Rotoren

    • 11.3. Chromatographiegeräte / Säulen

    • 11.4. Mikroskope

    • 11.5. Sonstige Geräte

  • 12. Zelllinien und Bakterienstämme

    • 12.1. Eukaryontische Zelllinien

    • 12.2. Bakterienstämme

  • 13. Molekularbiologische Methoden

    • 13.1. Agarose-Gelelektrophorese

    • 13.2. Restriktionsverdau von DNA

    • 13.3. DNA-Fragmentisolierung aus präparativen Agarosegelen

    • 13.4. Dephosphorylierung von DNA

    • 13.5. Reinigung von DNA

    • 13.6. Entfernen von Nukleotidmonomeren über Gelfiltrationschromatographie

    • 13.7. Fällung von Nukleinsäuren

    • 13.8. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

    • 13.9. DNA-Ligation

    • 13.10. Sequenzierung von DNA

    • 13.11. Polymerase Kettenreaktion (PCR)

    • 13.12. PCR / TaqMan-PCR

    • 13.13. Herstellung kompetenter E. coli

    • 13.14. Transformation von kompetenten E. coli

    • 13.15. Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli

    • 13.16. Isolierung viraler DNA

      • 13.16.1. kommerziell angebotene Kits

      • 13.16.2. nach Boom et al. (1990)

      • 13.16.3. nach Kaneko et al. (1989, 1990)

  • 14. Zellbiologische Methoden

    • 14.1. Kultivierung und Passagieren von eukaryotischen Zellen

    • 14.2. Einfrieren und Auftauen von immortalisierten Zellen

    • 14.3. Transfektion von Säugerzellen

      • 14.3.1. Calciumphosphat-Methode

      • 14.3.2. Lipofektion

    • 14.4. Herstellung einer stabil transfizierten Zelllinie

    • 14.5. Inkubation eukaryotischer Zellen mit synthetischen Peptiden / rekombinanten Proteinen

    • 14.6. Zelllysatpräparation aus eukaryotischen Zellen

      • 14.6.1. mit Triton X-100 haltigem Puffer

      • 14.6.2. mit Dignam A

    • 14.7. Immunopräzipitation

    • 14.8. Kultivierung von E. coli

    • 14.9. Lyse von E. coli durch Ultraschall

  • 15. Proteinchemische Methoden

    • 15.1. Induktionskultur von E. coli

    • 15.2. Proteinkonzentrationsbestimmung

      • 15.2.1. nach Bradford

      • 15.2.2. durch Absorptionsmessung bei 280nm

    • 15.3. Säulenchromatographische Methoden

      • 15.3.1. Affinitätschromatographie

      • 15.3.2. Gelfiltrationschromatographie

      • 15.3.3. Reversed-Phase-Chromatographie

    • 15.4. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

    • 15.5. Färben von Proteingelen

      • 15.5.1. Coomassie-Färbung

      • 15.5.2. Silberfärbung nach Heukeshoven und Dernick

    • 15.6. "Western Blotting", Immunoblot

    • 15.7. Generierung von Antiserum

    • 15.8. Aufreinigung des PreS2-Antiserums

    • 15.9. Fluoreszenzmarkierung synthetischer Peptide

      • 15.9.1. Fluorescein-Markierung

      • 15.9.2. Cy3™-Markierung

  • 16. Virologische Methoden

    • 16.1. ELISA

    • 16.2. Sedimentation von Virus-Partikeln durch Sucrose-Kissen

  • 17. Indirekte Immunfluoreszenz von eukaryotischen Zellen

• Literatur

• Anhang

• Abkürzungsverzeichnis

• Eigene Veröffentlichung

• Erklärung

• Danksagung

• Tabelle 2 : Darstellung des Vergleichs verschiedener DNA-Isolierungs-methoden aus HepG2.2.15-Zellkultur-Überständen

• Tabelle 3 : Darstellung des Vergleich verschiedener DNA-Isolierungs-methoden aus HepG2.2.15-Zellkultur-Überstand (Abb. 15)

• Abb. 1: Schema einer Hepatitis-B-Infektion mit Darstellung der Antigene und Antikörper, die im Rahmen einer akuten Hepatitis B im Serum nachgewiesen werden können. Quelle: Thomas (Hrsg.): Labor und Diagnose, Die Med. Verlagsgesellschaft, Marburg 1992

• Abb. 2: Schematische Darstellung der drei verschiedenen Partikel, die im Blut von HBV-infizierten Personen zu finden sind. LHBs, MHBs, SHBs: Large (großes), Middle (mittleres), Small (kleines) Hepatitis-B surface-Protein; HBc: Hepatitis-B core-Protein; hsc70: Heat shock cognate 70; Pk: Proteinkinase; Pri: Primer-Protein; RT: reverse Transkriptase; PreS1, PreS2: PreS1-, PreS2-Domäne; S: S-Domäne (Hüllproteine) (nach Kann & Gerlich, 1998, modifiziert)

• Abb. 3: Genomstruktur des Hepatitis-B-Virus mit Darstellung der vier konservierten ORFs des HBV-Genoms am Beispiel des Genotyps A (HBsAg Subtyp adw2).  Pol: DNA-Polymerase; Pr: Primer-Protein; E1, E2: Enhancer 1 und 2; GRE: glucocorticoid responsive elements; PREα, PREβ: posttranscriptional regulatory elements; DR1, DR2: direct repeat 1 und 2; (+):Plusstrang-DNA; (-): Minusstrang-DNA; ε: Epsilon-RNA Verpackungssignal (nach Kann & Gerlich, 1998, modifiziert)

• Abb. 4: Lebenszyklus des Hepatitis-B-Virus (aus Fabrizi et al., 2002)

• Abb. 6: Die MAPK- (Mitogen-activated protein kinase) und die JAK/STAT- (Janus kinases/signal transducer and activators of transcription) Signalkaskaden werden durch HBx aktiviert. (aus Arbuthnot et al., 2000)

• Abb. 7: hypothetische Beeinflussung des intrazellulären Ca²⁺-Spiegels und der HBV-Replikation durch HBx.  Der Haupteffekt auf die HBV-Replikation geschieht eher auf der Ebene der HBV-DNA als auf RNA-Ebene (Bouchard et al., 2001) (dicke Pfeile). CAM: Calmodulin; CAMK: Ca²⁺-Calmodulin-abhängige Kinase; CN: Calcineurin; Cyt c: Cytochrom c; DAG: Diacylglycerol; Ins(1,4,5)P3: Inositol-1,4,5-trisphosphat; NOS: Stickstoffmonoxid-Synthase; PKA: (cAMP-abhängige) Proteinkinase A; PKC: (Ca²⁺-abhängige) Proteinkinase C; PLCγ: Phospholipase Cγ; PTP: permeable Übergangspore (nach Bouchard et al., 2002)

• Abb. 12: Standardreihe von zwei verschiedenen pSM2-Präparationen und sechs verschiedenen Verdünnungsreihen Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg

• Abb. 14: Vergleich verschiedener DNA-Isolierungsmethoden aus 80µl HepG2.2.15-Zellkultur-Überständen 1. Die DNA-Isolierung erfolgte mit Hilfe von Silica coarse nach  PEG8000-Fällung (Boom et al., 1990). 2. Der Zellkultur-Überstand wurde mit einem Zentrifugal-  konzentrator aufkonzentriert und die DNA nicht isoliert. 3. Der Zellkultur-Überstand wurde mit einem Zentrifugal-   konzentrator aufkonzentriert und die DNA mit dem QIAamp   Blood DNA Kit (QIAGEN) isoliert. 4. Der Zellkultur-Überstand wurde mit dem QIAamp Blood DNA Kit   (QIAGEN) isoliert. 5. DNA aus Zellkultur-Überstand Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg

• Abb. 15: Vergleich verschiedener DNA-Isolierungsmethoden aus 80µl HepG2.2.15-Zellkultur-Überständen Die konzentrierten (konz.) Proben wurden alle aus dem gleichen Zellkultur-Überstand entnommen. Der Zellkultur-Überstand wurde mit PEG8000 gefällt, die Viren durch Zentrifugation über ein 20% Sucrose-Kissen pelletiert. Die nicht aufkonzentrierten Proben (unkonz.) stammen aus einer anderen Charge. Aus den Viren des konzentrierten und nicht konzentrierten Zellkultur-Überstandes wurde durch High pure viral nucleic acid kit (Roche), QIAamp Blood DNA Kit (QIAGEN) und Lyse mit NaOH die virale DNA isoliert. Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg

• Abb. 16: 1:10 Verdünnungen der viralen DNA im Gegensatz zu unverdünnter DNA Die 1:10 Verdünnungen sind auf die 10fache Menge umgerechnet. Die Zellkultur-Überstände sind mit einem Zentrifugalkonzentrator aufkonzentriert, die DNA mit dem QIAamp Blood DNA Kit (QIAGEN) isoliert. Primer: TaqMan-f HBsAg, TaqMan-b HBsAg; Sonde: Sonde HBsAg

• Abb. 18: Struktur der synthetischen Peptide

• Abb. 20: Chromatogramm des Fluorescein-Markierungsansatzes für APO145 mittels Superdex Peptide 200-Säule Die Auftrennung erfolgte mit PBS bei einer Flussrate von 0,5ml/min. Die Fraktionen A12 und A13 enthalten das markierte Peptid. Die blaue Linie markiert die Absorption bei 215nm (Peptidbindung), die rote Linie die Absorption bei 490nm (Fluorescein). Die violette Linie gibt die Absorption bei 280nm wider. Die braune Linie stellt die Leitfähigkeit dar.

• Abb. 23: Abhängigkeit der Virus-Sekretion transient transfizierter HuH7-Zellen von der Konzentration der synthetisch hergestellten TLM-PreS1(n)-Peptide HuH7-Zellen wurden mittels DOTAP mit pSM2 (Sells et al., 1987) transfiziert. Die DNA der sekretierten Viren wurde per TaqMan-PCR quantifiziert. Als Positiv-Kontrollen dienten PS 734/RP, PS 735/RP und PreS1S2, als Negativ-Kontrolle dienten transient transfizierte HuH7 ohne Peptidinkubation. Primer: HBxfTM1, HBxrTM1; Sonde: HBxSondeTM1

• Abb. 26: Chromatogramm der Reinigung von E.coli-Lysaten (PreS1 110-119 PreS2) mittels Ni-NTA-Agarose-Säule  Die mit Pfeilen gekennzeichneten Fraktionen wurden zur Dialyse eingesetzt.  Die blaue Linie gibt die Absorption bei 280nm wieder. Die violett-gestrichelte Linie zeigt die Absorption bei 260nm, die nicht gestrichelte violette Linie die Absorption bei 215nm. Die gestrichelte grüne Linie stellt die Konzentration des Harnstoffes dar und die braune Linie die Leitfähigkeit.

• Abb. 36: Quantifizierung von HBV-spezifischer DNA in Zellkultur-Überständen von transfizierten HepG2-Zellen per TaqMan-PCR.

• Abb. 37: Quantifizierung von HBV-spezifischer DNA in Zellkultur-Überständen von transfizierten HepG2-Zellen per TaqMan-PCR zur Untersuchung des Einflusses der Raf/MEK-Signalkaskade auf die HBV-Expression.

• Abb. 38: Quantifizierung von HBsAg und HBcAg mittels ELISA im Zellkultur-Überstand von transient transfizierten HepG2-Zellen mit pSPT1,2HBV zur Untersuchung des Einflusses der Raf/MEK-Signalkaskade auf die HBV-Expression.

• Abb. 41: Quantifizierung von HBV-spezifischer DNA in Zellkultur-Überständen von transfizierten HepG2-Zellen per TaqMan-PCR.