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Grundlagen der quantitativen NMR-Spektroskopie

Es sollen hier nur die Grundlagen beschrieben werden, die in dieser Arbeit für die quantitative hochauflösende Flüssigkeits-NMR-Spektroskopie von Bedeutung sind. Die allgemeinen Grundlagen der NMR-Spektroskopie sind in Lehrbüchern von z.B. Derome [15], Günther [16], Friebolin [17] und Levitt [18] nachzulesen.

Die wichtigste Grundlage der quantitativen NMR-Spektroskopie ist die direkte Proportiona­lität von Intensität eines Signals Ix im Spektrum und der zur Resonanzlinie beitragenden Kernanzahl Nx

,

 

(3.1)

wobei kS hier als Spektrometerkonstante bezeichnet wird. Die Herleitung dieser Beziehung beruht auf der Beschreibung eines als Lorentzlinie dargestellten Signals S(ω) bei einer Frequenz ωim Frequenzspektrum durch folgende Gleichungen [19]:

 

(3.2)

mit

,

 

(3.3)

wobei für den Kernspin steht. Der in der 1D-NMR auszuwertende Realteil des Spektrums enthält das Absorptionssignal, das, aus Gleichung (3.2) hergeleitet, beschrieben wird durch:

.

 

(3.4)

Die Integration dieser Gleichung von -∞ bis +∞ (Lorentzlinie) nach Δω gibt die Intensität des Signals wieder, die bei Heranziehen der Gleichung (3.3) proportional zu N ist:

.

 

(3.5)

Für die in dieser Arbeit betrachtete 1H- und 13C-Single-Pulse-NMR-Spektroskopie ist kS bei Einhaltung der optimalen Aufnahmeparameter innerhalb eines Spektrums konstant. Beim Bezug zweier Signale in einem Spektrum zueinander kürzt sich damit kS heraus.

Theoretisch ist es möglich, die Signalintensität aus den Naturkonstanten und den Parame­tern der Probe und des Empfängers von der folgenden Formel ausgehend herzuleiten [19]:

,

 

(3.6)


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wobei R(ω) das Verhältnis zwischen Signalamplitude und Rauschen wiedergibt. Während die Parameter der ersten beiden Terme grundsätzlich bekannt oder bestimmbar sind, ist dies bei den folgenden Parametern des dritten Terms nicht der Fall: der Qualitätsfaktor der Spule Q, das Verhältnis zwischen der effektiven und der gesamten Induktivität ρ, der Füllfaktor der Empfänger-Spule ξ und die Rauschgröße des Vorverstärkers F.

Damit ist die quantitative NMR-Spektroskopie eine Relativmethode und kann zur Analyse von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen bei Vielstoffgemischen eingesetzt werden. Bei Zuwaage eines Standards sind Reinheitsanalysen sowie Konzentrations- und Gehaltsbe­stimmungen durchführbar. Als Vorteil gegenüber anderen analytischen Verfahren wird in vielen Publikationen herausgestellt, dass NMR-Analysen einfach handhabbar, kalibrierfrei, zerstörungsfrei und schnell sind. Ferner ist allgemein keine Aufarbeitung oder Isolierung des Analyten nötig sowie wegen der ausgezeichneten Selektivität der NMR-Spektroskopie die gleichzeitige Analyse mehrerer Analyten in einem Gemisch möglich. Als Nachteile sind gegebenenfalls Sättigungs- und Überlauf-Probleme sowie relativ hohe Anschaffungs- und Betriebskosten zu erwähnen [20].

3.1  Primäre Methode

Um all die Messgrößen und -methoden, von denen es heute eine Vielzahl gibt, miteinander vergleichen zu können, ist es wichtig, sie auf Einheitsnormale zurückzuführen. Das Bureau International des Poids et Mesures (BIPM) führte dazu das Konzept der primären Methoden ein. Dieses wurde für das CCQM wie folgt definiert:

A primary method of measurement is a method having the highest metrological qualities, whose operation can be completely described and understood, for which a complete uncertainty statement can be written down in terms of SI units.

A primary direct method: measures the value of an unknown without reference to a standard of the same quantity.

A primary ratio method: measures the value of ratio of an unknown standard of the same quantity; its operation must be completely described by a measurement equation. (Milton und Quinn, S. 293 [12])

Bisher sind die Coulometrie, die Gravimetrie, die Titriemetrie und die kolligativen Methoden als direkte und die Isotopenverdünnungs-Massenspektroskopie als relative primäre Metho­den vom CCQM anerkannt [21]. Ob eine Methode direkt oder relativ primär ist, wird einerseits entsprechend der Definition anhand der Notwendigkeit einer Referenzierung auf einen Standard entschieden. Ein weiteres, wichtiges Kriterium ist der Einfluss der empirischen Faktoren im Unsicherheitsbudget. Dominieren diese Faktoren, so handelt es sich nicht um eine direkte primäre Methode. Bei der Bestimmung von Relativgrößen (Stoffmengenverhältnis, -anteil) ist die NMR-Spektroskopie wegen ihrer metrologischen [Seite 6↓]Qualität (Einfluss der Integration) offensichtlich beschränkt und daher nur als relative primäre Methode anzusehen. Für die Bestimmung von Absolutgrößen (Reinheit, Konzentration, Gehalt) diskutierte Jancke [9], dass die quantitative NMR-Spektroskopie der Definition einer relativen primären Methode entspricht.

Die Messunsicherheit der 1H-NMR-Spektroskopie für die Stoffmengenanteil-Analyse wurde in der eigenen Diplomarbeit [14] untersucht. Daran anknüpfend sollen hier

  1. die Messgleichungen
  2. die Unsicherheitsbudgets und
  3. die metrologische Qualität mit Hilfe von Ringversuchen

für die verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten der quantitativen NMR bestimmt werden.

3.2  Single-Pulse-Experimente

Das Single-Pulse (SP)-Experiment ist das einfachste anzuwendende NMR-Experiment, dessen zeitlicher Ablauf in der Abbildung 3.1 dargestellt ist.

Abbildung 3.1: Zeitsequenz eines Impulses (1) in einem SP-NMR-Experiment mit Daten­akkumulation. Nach Ablauf einer Zeitsequenz τ (Puls-Intervall) erfolgt der nächste Impuls (2) (entnommen aus [16]).

Durch den Anregungsimpuls erfährt die Magnetisierung eine Auslenkung aus ihrer Ruhelage (z-Magnetisierung) in Richtung der x,y-Ebene. Die zeitliche Abnahme der y-Magnetisierung (transversale oder Quermagnetisierung) aufgrund derT1-Relaxation des Systems wird als Free Induction Decay (FID) bezeichnet und aufgenommen. Die Fourier-Transformation des FIDs liefert das auszuwertende Spektrum. Validierungen der 1H-SP-NMR zeigten [8, 14], dass die Methode gegenüber den meisten Parametern robust ist. Lediglich die Aufnahmezeit und das T2-Relaxationsintervall sind zu optimieren. Im Rahmen der eigenen Validierung der Methode zeigte sich, dass bei einem Signal-zu-Rausch-Verhältnis (S/N) von mindestens 150 eine relative Messunsicherheit von unter 1,5% erreichbar ist [14]. Eine Aufgabe dieser Arbeit ist es, dieses allgemein für alle quantitativen Anwendungen der NMR zu zeigen.


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Die Erkenntnisse aus der Validierung sind allgemein auf SP-Experimente mit anderen Kernen (z.B. 31P und 13C), der Festkörper MAS-Technik und der Low-Resolution-NMR übertragbar.

Für die Betrachtung weiterer quantitativer Anwendungen ist es nötig, den Einfluss aller Parameter auf die Ergebnisgenauigkeit zu untersuchen. Daher werden diese in den folgen­den drei Kapiteln kurz erläutert.

3.2.1  Aufnahme-Parameter

Eine wichtige Voraussetzung für den Ablauf eines NMR-Experiments ist die gute Auflösung des Spektrometers, um schmale Signale zu erhalten. Das Homogenisieren des Magnetfel­des zur optimalen Auflösung nennt man Shimmen. Den Ablauf der Aufnahme des FIDs beeinflussen mehrere Parameter. Mit Hilfe des Parameters Receiver Gain (RG) wird die Auflösung des Analog-Digital-Wandlers (ADC) für die zu untersuchende Probe optimiert. Bei quantitativen Analysen von sehr großen Signalamplitudenunterschieden ist es wichtig, den dynamischen Bereich optimal auszunutzen [22]. Für die Anregung des Spektrums ist die Kenntnis der Parameter des 90°-Impulses (Impulsstärke und -länge) erforderlich. Diese über das Intensitätsmaximum bei 90° zu bestimmen, kann zu falschen Werten führen [23]. Genauer wird der 180°- oder 360°-Nulldurchgang festgelegt. Direkt nach der Anregung findet bereits Emission statt, die während der Aufnahmeverzögerung nicht detektiert wird. Dadurch wirken sich unterschiedlicheT2-Zeiten (Transversale Relaxation) der einzelnen Struktur­gruppen auf die Richtigkeit1 negativ aus [24], während bei Signalen mit ungefähr gleichen Halbwertsbreiten (ähnlicheT2-Zeiten) die Variation der Aufnahmeverzögerung keinen Einfluss auf die Richtigkeit ausübt [14]. Die darauffolgende Aufnahme des FIDs (Aufnahmezeit) ist zu optimieren. Eine zu kurze Aufnahmedauer verringert wegen des zu frühen Abschneiden des FIDs die Richtigkeit und Präzision2 der Analyse, ebenso eine zu lange Aufnahmezeit aufgrund der alleinigen Aufnahme von Rauschen [25]. Eine zu kurze Zeitsequenz τ, auch Puls-Intervall oder Repetition time genannt, beeinflusst bei Datenakku­mulation in Abhängigkeit von den T1-Zeiten die Intensitätswiedergabe durch Sättigungs­effekte. Den erreichten Grad der Sättigung beschreibt die folgende Gleichung [26]:

.

 

(3.7)

Um den Fehler der Intensitätswiedergabe durch Sättigung kleiner als 0,1 % relativ zu halten, ist bei Anregung mit einem 90°-Impuls eine Zeitsequenz von mindestens siebenmal der längsten T1-Zeit aller auszuwertenden Signale notwendig [26]. Dazu ist unter Berücksichti­gung der Aufnahmezeit das Relaxationsintervall entsprechend lang zu setzen. Ein kleinerer [Seite 8↓]Anregungswinkel verkürzt die Zeitsequenz, führt aber gleichzeitig zu einem schlechteren S/N [26, 27]. Ebenso wirkt sich die Veränderung der Scananzahl ns (Datenakkumulation) mit S/N ~√ns auf das S/N aus [26].

Bei NMR-Spektrometern sind zwei Arten von Filtern (Analog- und Digitalfilter) gängig, die den außerhalb der eingestellten Spektrenweite3 angeregten Bereich herausfiltern. Während der Digitalfilter einen fast senkrechten „cut-off“ und somit schmale Grenzen hat, fällt der „cut-off“ beim Analogfilter kurvenförmig ab und besitzt einen breiten Grenzbereich. Die bei modernen NMR-Spektrometern eingesetzte Oversampling-Technik nimmt die Spektren mit maximaler Spektrenweite auf und filtert diesen gesamten Bereich analog. Zusätzlich wird der eingestellte Spektrenbereich mit einem Digitalfilter bearbeitet [28].

3.2.2 Prozessierungs-Parameter

Die Konvertierung des analog aufgenommenen FIDs mit dem Analog-Digital-Wandler (ADC) in die digitale Form kann zu systematischen Fehlern bei der Intensitätswiedergabe führen, wenn der dynamische Bereich nicht für die Darstellung schwacher Signale neben intensiven Signalen ausreicht. Ausschlaggebend ist hierfür das letzte Bit, das zwischen Signal oder Rauschen entscheidet [29]. ADCs mit Wortlängen von 12 Bit, 16 Bit oder 18 Bit sind in der Lage, maximale Signalamplituden-Unterschiede von ungefähr 2.000, 30.000 bzw. 130.000 darzustellen [15].

Vor der Fourier-Transformation (FT) wird der FID mit einer Apodizationsfunktion sowie dem Auffüllen mit Nullen (Zero-Filling) zur Verbesserung der Darstellung des Frequenzspektrums mathematisch manipuliert. In der 1D-NMR-Spektroskopie wird routinemäßig als Apodiza­tionsfunktion die exponentielle Multiplikation (em) der Form

 

(3.8)

zur Verbesserung des S/N auf Kosten der Auflösung (Signale werden breiter) eingesetzt. Der Faktor „a“ kann über das „line broadening (lb)“ variiert werden. Grundsätzlich hat die em keinen Einfluss auf die Intensitätswiedergabe im Spektrum, jedoch bei dicht beieinander­liegenden Signalen kann durch die Linienverbreiterung die Auswertung wegen Überlagerung unmöglich gemacht werden [14]. Ein lb-Faktor von 0,3 Hz erwies sich im Rahmen der eigenen Validierung als optimal. Die Anwendung der Gauß-Multiplikation als Apodizations­funktion für die quantitative Auswertung verfälscht nach Herzog und Messerschmidt [30] die Intensitäten im Spektrum.

Um die Intensitäten der Signale im Spektrum richtig wiederzugeben, müssen diese mit mindestens fünf Punkten oberhalb der halben Amplitude dargestellt werden [31, 32]. Bei [Seite 9↓]einer guten Auflösung des Spektrums ist das nicht immer gegeben. Infolgedessen werden dem FID Punkte mit dem Wert Null dazuaddiert (Zero-Filling), die keine weiteren Informa­tionen in das Spektrum hineinbringen [33]. Generell wird durch das Zero-Filling die Punkt­dichte im Spektrum erhöht. Dadurch wird eine Verbesserung der Messunsicherheit der Methode erreicht [26, 34].

3.2.3  Spektrenkorrekturen und Integration

Das Frequenzspektrum ist nach der Fourier-Transformation hinsichtlich Phase und Grund­linie zu korrigieren. Rabenstein [26] und Grivet [32] zeigten, dass eine ordentliche Korrektur des Spektrums und eine sorgfältige Integration Grundlagen für eine geringe Messunsicher­heit der Methode sind. Hierzu ist zuerst das Spektrum in Phase zu bringen. Während gleich­große frequenzunabhängige Phasenfehler keinen Einfluss auf das Verhältnis der Intensitä­ten in einem Spektrum ausüben, bewirkt ein frequenzabhängiger Phasenfehler von 5° einen Fehler von 1 % [26]. Die darauffolgende Korrektur der Grundlinie ist ausschlaggebend für richtige Ergebnisse. Abweichungen von einer idealen Grundlinie üben einen Einfluss auf die Richtigkeit der Integration aus. Die Bestimmung der integralen Signalintensitäten erfolgt routinemäßig mit der elektronischen Integration. Dabei ist die Setzung der Integralgrenzen von den Halbwertsbreiten der auszuwertenden Signale abhängig. Um 99 % der Gesamtin­tensität eines Signals mit einem Integral zu erfassen, müssen dessen Integrationsgrenzen 64 mal der Halbwertsbreite gesetzt werden; zur Erfassung von 99,9 % sogar 636 mal. Dieser Faktor ist innerhalb eines Spektrums konstant anzuwenden, um Intensitätsverhältnisse mit hoher Richtigkeit zu bestimmen. Er wird in dieser Arbeit als „Integrationsfaktor“ bezeichnet. Geringe Abweichungen von einer optimalen Phase oder Grundlinie – zu Erkennen an nicht geraden An- und Ausläufen der Integralzüge – können mit Hilfe der Korrekturfunktion BIAS und SLOPE am Integralzug ausgeglichen werden. Mit BIAS wird dabei die Grundlinie in der Vertikalen verändert und mit SLOPE die Steigung der Grundlinie beeinflusst. Integralzüge mit geradem An- und Auslauf geben die Intensität eines Signals richtig wieder.

3.3  Multi-Pulse-Experimente

Im Gegensatz zum SP-NMR-Experiment bestehen Multi-Pulse (MP)-Experimente aus min­destens zwei Impulsen. Bei den in dieser Arbeit betrachteten MP-Sequenzen wird der zweite Impuls bzw. mehrere Impulse entweder vor dem Anregungsimpuls (Presaturation, LC1WET), nach dem Anregungsimpuls (Watergate) oder auf einem zweiten Einstrahlkanal zeitgleich zum Anregungsimpuls (13C-NMR mit Entkopplung) eingesetzt.

3.3.1 Lösungsmittelunterdrückung (Solvent Suppression)

Vor allem bei wässrigen Lösungen ist es oftmals der Fall, dass der dynamische Bereich zur Darstellung schwacher Signale neben dem intensiven Wassersignal nicht ausreicht. Für die [Seite 10↓]Lösung dieses Problems wurden eine Reihe von verschiedenen Techniken entwickelt, die das Wassersignal unterdrücken [19]. Generell lassen sich diese Techniken in zwei Katego­rien einteilen: preacquisition methods und postacquisition methods [35]. Dabei verbessern nur erstere den dynamischen Bereich durch die Unterdrückung des Wassersignals.

Die drei in dieser Arbeit untersuchten Unterdrückungsmethoden (Presaturation, Watergate, LC1WET) gehören zu den preacquisition methods, deren relevanten Grundlagen hier kurz beschrieben werden. Einen allgemeinen Überblick über Lösungsmittelunterdrückung und verschiedene Techniken dazu gibt die Arbeit von Gueron et al. [36] wieder.

3.3.1.1 Presaturation

Die Presaturation – Vorsättigen des Wassersignals - ist die einfachste Lösungsmittel­unterdrückungs-Technik [19], deren zeitlicher Ablauf in Abbildung 3.2 dargestellt ist. Mit einem schwachen Radiofrequenzimpuls wird selektiv das Wassersignal direkt vor dem 90°-Anregungsimpuls gesättigt.

Abbildung 3.2: Zeitlicher Ablauf der Presaturation-Pulssequenz (entnommen aus [37]).

Um eine gute Wassersättigung zu erreichen, ist neben einer guten Auflösung des Spektro­meters eine Sättigungsdauer von 2s bis 3s notwendig, um die Populationsdifferenz aufzuhe­ben. Ferner kann mit der Impulsstärke des Sättigungsimpulses der Sättigungsbereich verändert werden. Eine höhere Impulsleistung führt zur besseren Sättigung aufgrund eines breiteren Sättigungsbereiches. Hingegen ist für eine hohe Selektivität ein minimaler Sättigungsbereich nötig. Folgerichtig muss ein Optimum zwischen Selektivität und Güte der Sättigung gefunden werden. In der Literatur sind hierfür als Richtwerte Sättigungsbreiten von 20Hz [15] bzw. 25Hz [37] angegeben.

3.3.1.2 Watergate

Die Watergate-Sequenz zur Wasserunterdrückung gehört seit der routinemäßig eingesetz­ten Gradiententechnik mit zu den am meisten eingesetzten Methoden [19]. Die zwischen dem Anregungsimpuls und der Aufnahmezeit eingebettete Pulssequenz besteht, wie in Abbildung 3.3 dargestellt, aus zwei identischen Gradientenimpulsen (Gauß-Shape), die eine 180°-Spinecho-Sequenz aus drei Pulspaaren (3-9-19) umschließen.


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Abbildung 3.3: Zeitlicher Ablauf der Watergate-Pulssequenz (entnommen aus [37]).

Die durch den Anregungsimpuls aufgebaute transversale Magnetisierung wird durch den ersten Gradientenimpuls dispergiert und anschließend durch die kombinierten Effekte der Spinecho-Sequenz und des zweiten identischen Gradientenimpulses mit Ausnahme des Wassersignals refokussiert. Insgesamt wird durch die selektive Dephasierung des Wasser­signals eine exzellente Wasserunterdrückung bewirkt [38]. Aufgrund der eingesetzten Binomial-Sequenz findet diese selektive Dephasierung zusätzlich in Abständen von 1/(2*d2) statt. Um richtige Intensitäten im Spektrum zu erhalten, ist die zeitliche Symmetrie zwischen den beiden Gradientenimpulsen aufgrund der Spin-Echo-Sequenz von großer Bedeutung. Nachteilig wirkt sich die Watergate-Sequenz auf in der Nähe des Wassersignals liegende Signale durch partielle Unterdrückung aus [39].

3.3.1.3 LC1WET

Abbildung 3.4: Zeitlicher Ablauf der LC1WET-Pulssequenz. Erstellt mit XWinNMR-Software („ppg“).

Die Sequenz besteht aus einer WET-Pulsfolge von Gauß-geshapten Anregungsimpulsen geringer Anregungsbreite und Anregungswinkeln von 81,4°, 101,4°, 69,3° und 161,0°. Dabei regt jeder Impuls selektiv das Wassersignal an, dessen aufgebaute transversale Magnetisierung durch den darauffolgenden Gradientenimpuls dispergiert wird. Durch die viermalige Anwendung wird eine gute Wasserunterdrückung erreicht. Dabei wird die Inho­mogenität des B1-Magnetfeldes reduziert und wegen der unterschiedlichen Gradienten­impulsstärken von 8:4:2:1 ein Gradientenecho verhindert. Die darauffolgende Composite-Pulsfolge 90x, 90y, 90-x, 90-y trägt zu einer weiteren Unterdrückung des Wassersignals sowie ebenfalls zur Reduzierung der Inhomogenität des Magnet-Feldes bei [40].


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3.3.2  1H-Breitband-Entkopplung in der 13C-NMR

13C-SP-NMR-Spektren zeigen neben 13C-13C-Kopplungen zusätzlich 13C-1H-Kopplungen, die das Spektrum komplex und linienreich machen. Obendrein werden die ohnehin schon schwachen Intensitäten (geringe natürliche Häufigkeit) durch Aufspaltung der Resonanzli­nien in Multipletts um ein Vielfaches verringert. Mit der 1H-Breitband (BB)-Entkopplungstech­nik werden die 1H-13C-Kopplungen aufgehoben. Hierbei wird mit Composite-Pulsen (WALTZ-16) über einen zweiten Sendekanal auf den gesamten Protonenfrequenzbereich kontinuier­lich eingestrahlt. Man erhält somit ein 1H-entkoppeltes 13C-Spektrum, das generell schmale und intensive Singulett-Signale zeigt. Durch die Entkopplungs-Einstrahlung auf die Protonen wird außerdem ein NOE-Effekt erzeugt, der sich auf die zu messenden 13C-Spins als Intensitätsänderung auswirkt. Dieses führt dazu, dass im Gegensatz zur SP-NMR die Spek­trometerkonstante kS bei der 1H-BB-entkoppelten 13C-NMR nicht mehr für alle Resonanzen konstant ist, sondern u.a. von T1 abhängig ist [41]:

.

 

(3.9)

Dabei ist k0 die nur von apparativen Faktoren abhängige Konstante und η der Kern-Overhau­ser-Verstärkungsfaktor. Die Größen η und Τ1 können je nach Bindungszustand und Mole­külgröße für die einzelnen 13C-Kerne verschiedene Werte annehmen. Um innerhalb des Spektrums ein konstantes kS zu erhalten, müssen nach Gleichung (3.9) die folgenden drei Forderungen erfüllt werden: Erstens muss η (NOE-Effekt) vernachlässigbar gering werden, damit der Term (1+η) gleich eins wird. Dieses wird mit der Inverse Gated 1H-Decoupling-13C-NMR-Pulssequenz erreicht, bei der zur Minimierung des NOE-Effektes nur während der Anregungs- und Aufnahmezeit entkoppelt wird (die zeitliche Abfolge der Pulssequenz ist in Abbildung 3.5 dargestellt).

Abbildung 3.5: Zeitlicher Ablauf der Inverse Gated 1H-Decoupling-13C-Pulssequenz (entnommen aus [37]).

Je kürzer dabei die Einstrahldauer des Entkopplerpulses ist, umso geringer wird der auftre­tende NOE-Effekt. Dazu ist eine möglichst kurze Aufnahmezeit zu wählen. Zweitens ist ein möglichst großes Verhältnis zwischen der Zeitsequenz τ und den T1-Zeiten zu erreichen, damit die e-Funktionen gegen Null und der Quotient gegen eins streben. Bei schnell [Seite 13↓]relaxierenden C-Atomen, die direkt mit Protonen gebunden sind, ist τ gleich 6,8∙T1 und bei quartären C-Atomen gleich 4,6∙T1 zu setzen. Bei unbekannten T1-Zeiten sollte generell eine Zeitsequenz von 300s eingestellt werden [42]. Drittens ist mit einem Anregungswinkel von 90° zu arbeiten, damit der Sinus-Term gleich eins wird [42]. Ferner führt die Zugabe von Relaxationsreagenzien zur Minimierung von η und T1 [41, 43].

3.4  Kern-Overhauser-Effekt

Als Kern-Overhauser-Effekt (Nuclear Overhauser Effect, NOE) bezeichnet man die Intensi­tätsänderung eines beobachteten Signals bei Einstrahlung auf eine andere Resonanzlinie. Hierdurch können 13C-NMR-Signale bei der 1H-BB-Entkopplung bis zu 200% an Intensität gewinnen [17]. Der Grad der Intensitätsänderung wird mit dem Verstärkungsfaktor η charak­terisiert, der wie folgt definiert ist [15]:

.

 

(3.10)

Dabei geben I bzw. I0 die Intensitäten mit und ohne Einstrahlung auf einen anderen Kern wieder. Veranschaulichen lässt sich die Wirkungsweise vom NOE-Effekt an einem heterogenen Zweispinsystem AX ohne Spin-Kopplung. Der auftretende NOE-Effekt ist nicht an skalare Kopplungen zwischen den Kernen A und X gebunden, sondern wirkt sich über den Raum aus, wobei die Effizienz der Übertragung zum Abstand zwischen eingestrahltem und beobachtetem Kern mit 1/r6 proportional ist [16].

Abbildung 3.6: Energieniveauschemas zur Darstellung des NOE-Effekts bei einem AX-System. A: Ausgangszustand; B: Zustand nach Sättigung der A-Übergänge. W0 und W2 stellen die Übergangswahrscheinlichkeiten der Null- und Doppelquantenübergänge durch Relaxation dar (entnommen aus [17]).

Ausgehend vom Ausgangszustand eines AX-Spin-Systems, dargestellt in Abbildung 3.6A, wird bei Einstrahlung auf Kern A ein Zustand der Sättigung erreicht (Abbildung 3.6B). Durch die zeitgleich stattfindenden, bei Sättigung erlaubten Übergänge W0 (Nullquanten-Übergang) und W2 (Doppelquantenübergang) zusätzlich zu den Einquantenübergängen wird eine vom Gleichgewicht abweichende Besetzungsverteilung erreicht, die sich auf die Intensität des X-[Seite 14↓]Kernes auswirkt. Mit W2 größer als W0 wird die Intensität des beobachteten X-Kernes verstärkt (kleine Moleküle), während ein größerer Beitrag von W0 zu einer Intensitäts­verminderung führt (große Moleküle) [44]. Diese Relaxationen werden als Kreuzrelaxation bezeichnet. Bei Mehrspinsystemen, z.B. einem linearen Dreispinsystem A-B-C tritt bei Einstrahlung auf Kern A ein positiver NOE bei B auf, bei C ist zudem ein negativer NOE erkennbar. Dieser Effekt wird als indirekter NOE bezeichnet, da er nicht direkt durch die Einstrahlung auf A bewirkt wird, sondern auf die Änderung des Besetzungsverhältnisses bei B zurückzuführen ist. Dagegen tritt bei einem gewinkelten A-B-C-Dreispinsystem bei Einstrahlung auf A ein positiver direkter NOE bei C ein [16].

3.5  Bestimmung von Relativgrößen

Die Bestimmung von relativen Intensitätsverhältnissen innerhalb eines Spektrums mit der 1H-SP-NMR-Spektroskopie ist die einfachste quantitative Anwendung, da bis auf das Über­führen ins NMR-Röhrchen und das Lösen bzw. Verdünnen des Analyten in einem geeig­neten Lösungsmittel keine weitere Probenpräparation notwendig ist. Unter der Bedingung einer konstanten kS über die gesamte Spektrenweite kann nach Gleichung (3.1) aus dem Verhältnis der normierten Intensitäten je eines Signals von zwei Komponenten X und Y das Verhältnis der Stoffmengen der beiden Komponenten direkt berechnet werden:

.

 

(3.11)

Des Weiteren ist es möglich, den Stoffmengenanteil einer Komponente X in einer Mehrkom­ponentenlösung direkt aus den Intensitäten aller m Komponenten – ohne Betrachtung des Lösungsmittels – nach folgender Gleichung zu bestimmen:

.

 

(3.12)

Ein großer Vorteil der NMR-Spektrometrie besteht darin, dass von jeder zu bestimmenden Komponente nur ein eindeutig zugeordnetes Signal ausgewertet werden muss.

3.6 Bestimmung von Absolutgrößen

Da die NMR-Spektroskopie eine Relativmethode ist, muss ein Standard bekannter Reinheit dazugewogen werden, um durch den Bezug auf diesen eine absolute Messgröße wie den Gehalt oder die Konzentration berechnen zu können. Hierbei handelt es sich nach DKD-4 [45] um eine Ein-Punkt-Kalibrierung. Um die metrologische Qualität des Ergebnisses des Analysenverfahrens zu bestätigen, spielen hier zertifizierte Referenzmaterialien (ZRM) eine große Rolle [3]. Nur durch diese ist eine Rückführung auf die SI-Einheiten und somit der [Seite 15↓]Nachweis der Richtigkeit gegeben [46]. Anstelle eines ZRMs kann auch ein auf ein ZRM zurückgeführter Standard eingesetzt werden.

3.6.1 Standards

In der Literatur finden sich eine Anzahl von Standards, die zu quantitativen NMR-Analysen eingesetzt wurden. Damit eine Substanz sich als Standard für die quantitative NMR-Spektroskopie eignet, sollte sie nach Wells und Cheung [47] folgende Eigenschaften haben: leichte Verfügbarkeit in reiner Form, billig, stabil, löslich sowohl in organischen als auch wässrigen Lösungsmitteln, nicht-hygroskopisch, chemisch inert, geringer Dampfdruck und möglichst wenig Resonanzlinien. Letzteres wird auch von Griffiths und Irving [48] für einen idealen Standard gefordert. Larive [49] diskutierte den großen Vorteil der quantitativen NMR gegenüber vielen anderen spektroskopischen Methoden, der darin besteht, dass zur Quantifizierung kein Standard mit hohem Reinheitsgrad benötigt wird. Jeder primäre analytische Standard könne eingesetzt werden, sofern seine Reinheit bekannt ist und seine Verunreinigungen die Analyse nicht behindern. Als optimal für eine hohe Richtigkeit ist ein Intensitätsverhältnis von ungefähr eins im Spektrum zwischen den auszuwertenden Signalen von Analyt und Standard [22].

Bei der Verwendung von Standards unterscheidet man zwischen internen Standards, die der Lösung direkt beigewogen werden, und externen Standards. Letzteres kann entweder mit einem zweiten NMR-Röhrchen, nacheinander im selben NMR-Röhrchen oder aber mit einer im Mess-Röhrchen befindlichen Kapillare gemeinsam erfolgen. Während interne Standards eine einfachere Handhabung des Verfahrens und der Berechung aufweisen, wird beim zweiten Verfahren die Kontamination der Analytlösung mit dem Standard vermieden. In dieser Arbeit wird wegen der einfacheren Handhabung und daraus resultierend dem einfacheren Unsicherheitsbudget nur mit internen Standards verfahren.

Eine weitere Möglichkeit von Standards zeigten Akoka et al. [50] und Silvestre et al.[51] mit der ERETIC-Methode (Electronic REference To access In vivo Concentrations). Hierbei wird als Standard ein künstlich erzeugter pseudo-FID über eine zweite Senderspule elektronisch zum FID eingespeist. Der Vorteil dieser Methode ist, dass das Signal an jede beliebige Stelle im Spektrum hingesetzt werden kann. Nachteilig wirkt sich die schlechte Präzision aus. Über einen Zeitraum von einem Monat betrug die Streuung der Kalibrierungen 3%.

3.6.2  Reinheitsbestimmung

Generell existieren zwei Möglichkeiten der Reinheitsanalyse, die der direkten Analyse über die Hauptkomponente und die der indirekten Analyse über die Verunreinigungen.

Bei der direkten NMR-Analyse wird die Hauptkomponente gegen einen internen Standard ausgewertet. Der Vorteil dieser Methode ist, dass nur die eindeutige Zuordnung eines opti­[Seite 16↓]mal auszuwertenden Signals der Hauptkomponente notwendig ist. Die Kenntnis über die Zu­sammensetzung bzw. die qualitative Zuordnung der Fremdsignale ist dabei allgemein nicht erforderlich. Für die Bestimmung des Reinheitsgrades der Hauptkomponente sind Analyt und Standard einzuwiegen (mAnl, mStd) und die Intensität der Hauptkomponente IAnl (ohne Verunreinigungen) gegen die Intensität des Standards IStd auszuwerten. Aus dem Intensitäts­verhältnis kann unter Berücksichtigung der zur Resonanz der ausgewerteten Signale beitra­genden Kernanzahl (NAnl, NStd), der Molmassen (MAnl, MStd) und Einwaagen von Standard und Analyt sowie des Reinheitsgrades des Standards PStd der Reinheitsgrad des Analyten PAnl(in g/g %) wie folgt berechnet werden:

.

 

(3.13)

Im Gegensatz zur direkten Analyse sind bei der indirekten alle Verunreinigungen zu identifizieren, deren Signale im Spektrum qualitativ zuzuordnen und quantitativ gegen einen Standard auszuwerten. Die Berechnung des Reinheitsgrades des Analyten erfolgt dabei als Differenz zu 100%. Das Problem dabei ist, dass nicht detektierbare Verunreinigungen (z.B. anorganische Salze für 1H- und 13C-NMR) bei der Berechnung des Reinheitsgrades nicht erfasst werden.

Für eine Analyse mit hoher Richtigkeit ist bei nicht genauer Kenntnis der enthaltenen Verun­reinigungen die direkte Methode über die Hauptkomponente die bessere Wahl und wird des­wegen in dieser Arbeit verwendet. Nur wenn die qualitative Zusammensetzung der Substanz bekannt ist, führt der zweite Weg ebenfalls zu einem richtigen Ergebnis. Die Obergrenze für einen bestimmbaren Gehalt des Hauptbestandteils ist von der Unsicherheit der Methode abhängig [52].

3.6.3 Gehaltsanalyse

Bei der Gehaltsanalyse wird der Gehalt eines Analyten in einer Matrix bestimmt. Hierfür ist bei der NMR-Spektroskopie die Analyse auf einen Standard mit bekanntem Reinheitsfaktor zurückzuführen. Die Vorgehensweise entspricht dem der direkten Reinheitsbestimmung mit einer ähnlichen Messgleichung, die wie folgt aussieht:

,

 

(3.14)

wobei mMatrix die Einwaage der Analytlösung (Matrix) und fStd den Reinheitsfaktor des Standards wiedergibt.


Fußnoten und Endnoten

1 Maß für die Abweichung des Analysenwertes vom (gravimetrischen) Referenzwert.

2 Maß für die Streuung der Einzelwerte.

3 Wird auch als Spektral-Weite bezeichnet.



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