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Stoffmengenverhältnisse und -anteile

Zu den Aufgaben des CCQM gehört es, Messunsicherheiten chemisch-analytischer Messmethoden zu beschreiben und die Richtigkeit zu verbessern. Das Labor I.31 der BAM wurde vom CCQM mit der Organisation von internationalen Ringversuchen zur Ermittlung der Leistungsfähigkeit der quantitative NMR-Spektroskopie beauftragt. Die Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen mit der 1H-SP-Technik ist – wie in den Kapiteln 3.2 und 3.5 beschrieben – die einfachste Anwendung der quantitativen NMR-Spektroskopie und eignet sich daher ideal zur Ermittlung der metrologischen Qualität der Methode (Spektrenaufnahme, -prozessierung und -auswertung).

5.1 Grundvoraussetzungen zur Bestimmung der Genauigkeit der Methode

Die Bestimmung der Messunsicherheit einer Methode erfordert neben der Evaluierung und Validierung die Durchführung von Ringversuchen zur Ermittlung der Vergleichspräzision. Während die ersten beiden Punkte schon ausführlich bearbeitet wurden [14, 8], sind die bisher in der Literatur in geringer Zahl veröffentlichten Ringversuche entweder nur mit einer kleinen Teilnehmeranzahl [60] oder mit einem spezifizierten Gerät [61] organisiert worden. Es ist jedoch wichtig, eine allgemeingültige Aussage über die Leistungsfähigkeit der NMR-Spektroskopie unabhängig vom Hersteller oder der Magnetfeldstärke zu treffen, die auf einer großen Anzahl von Teilnehmerdaten beruht. Daher wurden parallel zu den internationalen Ringversuchen, an denen sich nur Nationale Metrologieinstitute bzw. von diesen beauftragte Labore beteiligten, entsprechende Ringversuche auf nationaler Ebene mit Teilnehmern aus Industrie, Forschung und Hochschulen ausgerichtet.

5.1.1  Anforderungen an eine ideale Modell-Lösung

Die Messunsicherheit der Methode sollte unter optimalen Bedingungen bestimmt werden. Hierzu gehört die unproblematische Auswertung des 1H-Spektrums einer zu analysierenden Modell-Lösung. Dafür wurden folgende Ansprüche an eine ideale Modell-Lösung gestellt:


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5.1.2  Arbeitsanweisung zur Aufnahme und Auswertung quantitativer Single-Pulse-NMR-Spektren

Die Notwendigkeit einer Arbeitsanweisung für die Aufnahme und Auswertung quantitativer 1H-SP-NMR-Spektren zum Erhalt von Messergebnissen mit hoher Richtigkeit und Präzision wurde aus den ersten beiden von der BAM organisierten Ringversuchen NMR-1 und CCQM-4 deutlich [62, 63]. Hierbei zeigten die unter Laborroutine aufgenommenen und ausgewer­teten Spektren gravierende Abweichungen sowohl zum gravimetrischen Referenzwert (bis 100 % relativ) als auch zwischen den einzelnen Teilnehmern, die auf falsche Parameterwer­te, auf unzureichende Spektrenkorrekturen (Phase und Grundlinie) und die Handhabung der Integration zurückzuführen waren. Andererseits wurde bei der Validierung der Methode bei sorgfältiger Arbeitsweise laborintern eine relative Messunsicherheit von unter 1,5 % erreicht [14]. Aufbauend auf dieser Validierung wurde die folgende Arbeitsanweisung zur Aufnahme, Prozessierung und Auswertung quantitativer SP-NMR-Spektren erarbeitet.

Tabelle 5.1: Standardparameter zur Aufnahme quantitativer 1H-SP-NMR-Spektren.

Parameter

Bruker-Nomenklatur

Wert

90°-Impuls-Stärke

Pl1

gerätespezifisch

90°-Impuls-Länge

P1

gerätespezifisch

Spin Rotation

 

Optional

Messtemperatur

TE

300 K

Anregungsfrequenz

o1

Mitte des Spektrums

Anregungswinkel

 

30°

Aufnahmeverzögerung

DE

5 µs

Aufnahmezeit

AQ

3,41 s

Relaxationsintervall

D1

≥ (7/3)x längste T1-Zeit

Spektralweite

SW

12 ppm

Filterweite

FW

≥14 ppm

Anzahl der Datenpunkte des FID

TD

32 k

Anzahl der Scans

ns

abhängig vom erreichten S/N

Signal-zu-Rausch-Verhältnis

S/N

≥ 150

Line broadening

lb

0,3 Hz

Anzahl der Spektrenpunkte

SI

64 k

Die Aufnahme und Prozessierung der Spektren erfolgt mit den in Tabelle 5.1 aufgeführten validierten Werten für die wichtigsten Parameter. Geräte- und probenspezifische Parameter­größen wie die Impuls-Stärke und -Länge des 90°-Anregungsimpulses, der Receiver Gain (RG) sowie die längste T1 -Zeit der auszuwertenden Signale zur Setzung des Relaxations­intervalls (D1) sind vor der Messung zu bestimmen. Bei einer guten Auflösung des Spektrums kann es notwendig sein, die Anzahl der Datenpunkte (TD) zu verdoppeln und [Seite 27↓]damit proportional die Aufnahmezeit (AQ) zu erhöhen, um ein zu frühes Abschneiden des FIDs zu vermeiden.

Nach der Fourier-Transformation mit vorheriger exponentieller Multiplikation des FIDs sind Phasen und Grundlinie im Spektrum sorgfältig zu korrigieren. Die Integrationsgrenzen sind in Abhängigkeit von den Halbwertsbreiten der auszuwertenden Signale mit einem konstanten Integrationsfaktor multipliziert zu setzten. Dabei ist die Erfassung der 13C-Satelliten aus der 1J(CH)-Kopplung bei allen Signalen gleich zu handhaben. Die partielle Mitintegration dieser 13C-Satelliten ist bei der Auswertung zu berücksichtigen (Korrektur der Intensität entspre­chend je 13C-Satellit um 0,55%). Die 13C-Satelliten aus den 2J(CH)-Kopplungen liegen bei einem Integrationsfaktor von 64 bei Halbwertsbreiten von generell >0,6Hz immer im Integrationsbereich. Anschließend sind die gesetzten Integrale einzeln auf maximale Darstellung auf dem Monitor zu vergrößern und gegebenenfalls mit BIAS und SLOPE (Bruker-Nomenklatur) auf geraden Integralzuganlauf und -auslauf zu korrigieren. Die Berechnung von Stoffmengenverhältnissen aus den Intensitätswerten des Spektrums erfolgt nach Gleichung (3.11), die von Stoffmengenanteilen nach Gleichung (3.12).

5.2  Nationaler und internationaler Ringversuch (NMR-2, CCQM-P3)

Ziel des zweiten vom CCQM beauftragten internationalen Ringversuchs CCQM-P3 sowie des parallel verlaufenden nationalen Ringversuches NMR-2 war die Bestimmung der Mess­unsicherheit von quantitativen Aussagen der 1H-NMR an einer Modell-Lösung, deren Spektren nach einer Arbeitsanweisung aufgenommen und ausgewertet werden sollten.

Die Darstellung der Ergebnisse der beiden Ringversuche erfolgte in Diagrammen, die tabel­larische Wiedergabe der Teilnehmerwerte befindet sich im Anhang (Kapitel 9). Die erweiterte Unsicherheit für ein 95%iges Konfidenzintervall wurde aus den Angaben der Teilnehmer nach den Gleichungen (4.1) und (4.4) mit n=5 und k=2,8 berechnet. Zusätzlich zur Angabe der Absolutwerte sind die Abweichungen der Messwerte von den gravimetri­schen Referenzwerten entsprechend Gleichung 4.14 und deren erweiterte Unsicherheiten berechnet worden und zur besseren Ablesbarkeit der Richtigkeit der Teilnehmerdaten als zweite Ordinate in den Diagrammen mit dargestellt. Ein Erwartungsbereich von ±2% relativer Abweichung sowie der gravimetrische Referenzwert werden durch Hilfslinien in den Diagrammen wiedergegeben.

5.2.1 Probenzusammensetzung

Die Einhaltung der im Kapitel 5.1.1 aufgeführten Forderungen bei der Auswahl der Substan­zen und des Lösungsmittels erwies sich als schwierig. Viele der mit dem geforderten Rein­heitsgrad von ≥99% infrage kommenden Substanzen waren entweder nicht stabil, zeigten keine Singuletts oder überlagerten sich mit anderen Signalen im Spektrum. Ferner enthalten [Seite 28↓]viele Lösungsmittel mit hohem Deuterierungsgrad (> 99,5%) intensive Fremdsignale, die im Gegensatz zur Strukturanalytik bei quantitative Analysen stören (Abbildung 5.1).

Abbildung 5.1: Reinheitsspektren von Benzol-D6 (99,5% Deuterierungsgrad); A: Kontroll­spektrum der Firma Merck KG (200MHz); B: Spektrum am DMX 400 mit 128 Scans.

Deuteriertes Chloroform (CDCl3) reagierte mehrfach mit den ausgewählten Substanzen (speziell mit substituierten Benzol-Systemen). Nach wenigen Tagen konnten, wie in der Abbildung 5.2 erkennbar, Fremdsignale mit einer relativen Intensität von ca. 0,5% und mehr nachgewiesen werden.

Abbildung 5.2: Reaktion von [2,2]-Paracyclophan mit CDCl3. A: Ausgangsspektrum, B: drei Tage später.

Indessen erwies sich deuteriertes Benzol (C6D6) als ein chemisch inertes und somit geeigne­tes Lösungsmittel. Somit wurden aus den fünf in Tabelle 5.2 aufgeführten, in C6D6 gelösten kommerziellen Produkten mit einer vom Hersteller angegebenen Reinheit von jeweils >99% (Ausnahme: D4 >98%) Modell-Lösungen für die beiden Ringversuche hergestellt.


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Tabelle 5.2: Komponenten der Ringlösungen CCQM-P3 und NMR-2.

Komponente

Summenformel

Molmasse in g mol-1

Monitor Signal in ppm

Ethyl-4-toluolsulfonat

ETS

C9H12O3S

200,2

CH3 (t)

0,77

[2,2]-Paracyclophan

Par

C16H16

208,3

(CH2)4 (s)

2,83

1,2,4,5-Tetramethylbenzol

Dur

C10H24

134,2

(CH3)4 (s)

2,08

Cyclododekan

Cy12

C12H24

168,3

(CH2)12 (s)

1,34

Oktamethylcyclotetrasiloxan

D4

C8H24O4Si4

296,6

(CH3)8 (s)

0,21

Lediglich beim ETS konnte der angegebene Reinheitsgrad nicht bestätigt werden. Das 1H-NMR-Spektrum enthielt intensive Signale der o-isomeren Verbindung, deren relativer Stoff­mengenanteil, wie in Abbildung 5.3 dargestellt, zu 2% bestimmt wurde. Die Integration des ETS-Signals inklusive der o-isomeren Verbindung gibt die der Einwaage entsprechende Intensität richtig wieder.

Abbildung 5.3: Bestimmung des Stoffmengenanteils der o-isomeren ETS-Komponente in der NMR-2 Ringlösung.

Die molare Zusammensetzung der für den internationalen Ringversuch zu analysierenden Modell-Lösung wurde vom CCQM vorgegeben. Diese sollte aus einer Haupt- und vier Nebenkomponenten mit je einem relativen Stoffmengenanteil im Bereich von 1% bis 2% bestehen. Für den nationalen Ringversuch NMR-2 wurde der Stoffmengenanteil der Neben­komponenten auf jeweils ca. 1% zur Hauptkomponente verringert. Die daraus resultieren­den Einwaagen und molaren Zusammensetzungen der beiden Ringlösungen CCQM-P3 und NMR-2 sind den Tabellen 5.3 und 5.4 zu entnehmen.


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Tabelle 5.3: Einwaagen und molare Zusammensetzungen der Ringlösung CCQM-P3 (gelöst in 100ml Benzol-d6). Gravimetrische Referenzwerte für die Bestimmung der Stoffmengen­verhältnisse und -anteile.

 

mi

ni

 

in mg

in mmol

in mol mol-1

in mol mol-1 %

ETS

64,38 ± 0,03

0,3215 ± 0,0001

1,1486 ± 0,0007

1,8385 ± 0,0009

Par

45,64 ± 0,03

0,2191 ± 0,0001

0,7828 ± 0,0006

1,2530 ± 0,0008

Dur

2211,41 ± 0,03

16,4758 ± 0,0002

58,863 ± 0,021

94,221 ± 0,002

Cy12

31,99 ± 0,03

0,1901 ± 0,0002

0,6790 ± 0,0007

1,0868 ± 0,0010

D4

83,03 ± 0,03

0,2799 ± 0,0001

1

1,6007 ± 0,0006

Tabelle 5.4: Einwaagen und molare Zusammensetzungen der Ringlösung NMR-2 (gelöst in 250ml Benzol-d6). Gravimetrische Referenzwerte für die Bestimmung der Stoffmengen­verhältnisse und -anteile.

 

mi

ni

 

in mg

in mmol

in molmol-1

in mol mol-1 %

ETS

41,67 ± 0,03

0,2081 ± 0,0001

2,697 ± 0,004

1,0244 ± 0,0007

Par

29,72± 0,03

0,1427 ± 0,0001

1,849 ± 0,003

0,7024 ± 0,0007

Dur

2647,28± 0,03

19,7231 ± 0,0002

255,6 ± 0,3

97,100 ± 0,002

Cy12

27,11± 0,03

0,1611 ± 0,0002

2,087 ± 0,004

0,7929 ± 0,0009

D4

22,89± 0,03

0,0772 ± 0,0001

1

0,3799 ± 0,0005

Die Abbildung 5.4 gibt das 1H-NMR-Spektrum der auszuwertenden Signale im aliphatischen Bereich der beiden Ringlösungen sowie deren Zuordnung zu den Substanzen wieder. Um die Stabilität der Lösungen zu kontrollieren, wurden vor Versenden der Probe – und bis zu einem Jahr später – mehrfach Spektren aufgenommen sowie die Lösungen einer thermi­schen Belastung (drei Wochen bei 44°C) ausgesetzt. Die Auswertungen der Spektren bestätigten die Stabilität der Lösungen.


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Abbildung 5.4: 1H-Spektrum der auszuwertenden aliphatischen Signale der beiden Ringlö­sungen für CCQM-P3 (rot) und NMR-2 (schwarz). Zur besseren Darstellung wurde das schwarze Spektrum um 0,06 ppm Richtung Hochfeld verschoben.

5.2.2  Vorschriften zur Messung und Auswertung

Die Teilnehmer der Ringversuche erhielten je eine Ampulle mit 1,2ml Ringlösung (ausrei­chend zur Befüllung eines 5mm NMR-Probenröhrchens), die Arbeitsanweisung sowie ein Mess- und Ergebnisprotokoll. Zur Bestimmung der Vergleichspräzision war die Probe mit den validierten Standardparametern (Tabelle 5.1) an fünf verschiedenen Tagen je einmal zu messen. Das Relaxationsintervall (D1) war entsprechend der längsten T1-Zeit aller auszuwertenden Signalen – hier 4,0s für ETS – auf 15 s einzustellen. Die Akkumulation von 128 Scans sollte generell bei allen NMR-Spektrometern zu einem ausreichenden S/N (>150) führen. Die Auswertung der Spektren hatte nach dem im Kapitel 5.1.2 beschriebenen Verfahren zu erfolgen, wobei bei der Setzung der Integrale ein Integrationsfaktor von 64 anzuwenden war, um mindestens 99% der Gesamtintensität jedes Signals mit dem Integral zu erfassen. Alle verwendeten Parameter sowie die chemischen Verschiebungen, Halbwertsbreiten, Integrationsbereiche und die Intensitäten eines jeden Signals waren ins Messprotokoll aufzunehmen. Ferner sollten Abweichungen von der Arbeitsanweisung – auch gerätespezifische (z.B. Parameter für den 90°-Impuls) – im Messprotokoll dokumentiert werden. Im Ergebnisbericht waren die Stoffmengenverhältnisse bezogen auf D4 – nach Gleichung 3.11 berechnet – sowie die Schätzwerte und deren Standardabweichungen anzugeben. Die Analyse sollte in zwei Monaten durchgeführt und anschließend das Mess- und Ergebnisprotokoll inklusive eines Spektrums zurückgesendet werden.


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5.2.3  Auswertung des internationalen Ringversuchs CCQM-P3

Tabelle 5.5: Teilnehmer am internationalen Ringversuch CCQM-P3.

Nationales Metrologieinstitut

Abkürzung

Staat

National Analytical Reference Laboratory

NARL

Australien

National Research Council of Canada

NRC

Kanada

Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung

BAM

Deutschland

National Office of Measures

OMH

Ungarn

Korea Research Institute of Standards and Science

KRISS

Korea

National Metrology Institute of Japan

NIMC

Japan

Nederlands Meetinstituut

NMI

Niederlande

D.I. Mendeleyev Institute for Metrology

VNIIM

Russland

Slovak Institute of Metrology

SMU

Slowakei

Eidgenössische Materialprüfungs- und Forschungsanstalt

EMPA

Schweiz

Zehn Nationale Metrologieinstitute – in Tabelle 5.5 aufgelistet – nahmen am internationalen Ringversuch CCQM-P3 teil. Dabei lieferte die BAM zwei voneinander unabhängige Messergebnisse ab, so dass insgesamt elf Teilnehmerergebnisse vorlagen. Die eingesand­ten Analysenergebnisse der Teilnehmer sind der Tabelle 11.1 zu entnehmen und wurden in der Abbildung 5.5 als Diagramme graphisch dargestellt.

Abbildung 5.5: Ergebnisse des internationalen Ringversuchs CCQM-P3 bei der Auswertung als Stoffmengenverhältnisse bezogen auf D4 (A: ETS, B: Par, C: Cy12, D: Dur).


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Aus diesen ist erkennbar, dass die Analysenergebnisse von acht der elf Teilnehmern generell eine Richtigkeit zu je besser als98% aufweisen. Dagegen weichen die Ergebnisse der Institute NIMC, KRISS und SMU allgemein um mehr als zwei Prozent von den Referenzwerten ab. Zudem zeigen die Analysenergebnisse des Instituts KRISS eine geringe Präzision.

Um die Messunsicherheit der Methode zu bestimmen, wurden die Teilnehmerergebnisse jeder Komponente gemittelt, die Abweichungen zu den gravimetrischen Referenzwerten und deren Unsicherheiten entsprechend den Gleichungen 4.14 und 4.15 berechnet und in Tabelle 5.6 zusammengefasst.

Tabelle 5.6: Fehleranalyse der Ergebnisse des internationalen Ringversuchs CCQM-P3 (Stoffmengenverhältnisse). Auflistung der Mittelwerte und deren Abweichungen von den gravimetrischen Referenzwerten sowie deren Unsicherheiten. Entscheidung über signifi­kante Abweichungen nach Gleichung 4.16.

Komponente


in mol mol-1


in mol mol-1

|Δxi|
in mol mol-1

2u(Δxi)
in mol mol-1

Signifikante Abweichung?

ETS

1,139

0,008

0,010

0,015

nein

Par

0,804

0,009

0,021

0,017

ja

Dur

59,8

0,5

0,9

1,0

nein

Cy12

0,692

0,005

0,013

0,010

ja

Gemäß der Gleichung 4.16 stellten sich bei den beiden Komponenten Par und Cy12 die Abweichungen der gemittelten Analysenergebnisse zu den gravimetrischen Referenzwerten als signifikant heraus. Eine Analyse der hierfür verantwortlichen Einflussgrößen war daher notwendig und wird im Kapitel 5.3 beschrieben. Die relative Messunsicherheit (k = 2,
p=95%) der Methode wurde entsprechend Gleichung 4.17 beim ETS zu 2,2%, beim Dur und Cy12 zu 4% und beim Par zu 6% bestimmt.

Aus den Intensitätswerten der Einzelmessungen wurden analog zum CCQM-4 nach Gleichung (3.12) die Stoffmengenanteile berechnet (Tabelle 11.2). Die graphische Dar­stellung dieser Werte zeigt in Abbildung 5.6 ein ähnliches Bild wie die Darstellung der Stoff­mengenverhältnisse in Abbildung 5.5. Auch hier weichen allgemein die Messergebnisse der Institute KRISS, NIMC und SMU um mehr als 2 % von den gravimetrischen Referenzwerten ab. Beim Dur hingegen liegen die Analysenwerte aller Teilnehmern innerhalb eines Bereiches von ±1 % relativer Abweichung zum Referenzwert, was jedoch auf den hohen Stoffmengenanteil von 94,2% dieser Komponente zurückzuführen war.


[Seite 34↓]

Abbildung 5.6: Ergebnisse des internationalen Ringversuchs CCQM-P3 bei der Auswertung als Stoffmengenanteile (A: ETS, B: Par, C: Cy12, D: D4, E: Dur).

Die Mittlung der Teilnehmerergebnisse zeigte bei den Komponenten Par, Dur, Cy12 und D4 geringfügige Abweichungen der Mittelwerte von den gravimetrischen Referenzwerten, (Tabelle 5.7). Lediglich die Komponente ETS wies hier eine signifikante Abweichung auf. Anhand dieses Ringversuches konnte die relative Messunsicherheit (k=2; p=95%) der Methode zur Bestimmung von Stoffmengenanteilen für die Hauptkomponente Dur zu unter 0,2% und für die Nebenkomponenten für Cy12 zu 1,2%, Par zu 2,5%, für D4 zu 3,3% und für ETS zu 5 % berechnet werden.


[Seite 35↓]

Tabelle 5.7: Fehleranalyse der Ergebnisse des internationalen Ringversuchs CCQM-P3 (Stoffmengenanteile). Auflistung der Mittelwerte und deren Abweichungen von den gravi­metrischen Referenzwerten sowie deren Unsicherheiten. Entscheidung über signifikante Abweichungen nach Gleichung 4.16.

Komponente


in mol mol-1


in mol mol-1

|Δxi|
in mol mol-1

2u(Δxi)
in mol mol-1

Signifikante Abweichung?

ETS

1,797

0,015

0,041

0,03

ja

Par

1,267

0,007

0,014

0,014

nein

Dur

94,27

0,03

0,05

0,6

nein

Cy12

1,091

0,005

0,004

0,010

nein

D4

1,578

0,012

0,023

0,024

nein

Zusammenfassend konnte aus dem Vergleich der Ergebnisse dieses Ringversuches mit denen des vorangegangenen (CCQM-4) generell eine Verbesserung der Messunsicherheit der Methode durch den Einsatz einer Arbeitsanweisung festgestellt werden. Die Fehlerana­lyse der gemittelten Analysenergebnisse der Teilnehmer bezogen auf die gravimetrischen Referenzwerte ergab bei beiden Auswertungsarten erhebliche systematische Abweichun­gen. Zur Verbesserung der Messunsicherheit sind daher weitere Einflussgrößen zu ermit­teln. Dieses wird im Kapitel 5.3 behandelt.

5.2.4 Auswertung des nationalen Ringversuchs NMR-2

Die Auswertung des nationalen Ringversuches NMR-2 erfolgte analog zu der des CCQM-P3, jedoch unter anonymer Darstellung der Ergebnisse. Von den insgesamt 39 Analysener­gebnissen der 33 teilnehmenden Laboratorien (Teilnehmerliste in Tabelle 11.7) wurden 38 in die Auswertung mit einbezogen, da aufgrund eines offensichtlichen Fehlers (ungeeigneter Messkopf) die Werte eines Teilnehmers – mit seinem Einverständnis – nicht berücksichtigt werden konnten. Die BAM gab zwei von einander unabhängige Analysenergebnisse mit den Labor-Identifizierungsnummern 12 und 14 ab. Am Ringversuch waren Teilnehmer mit NMR-Spektrometern der drei Herstellerfirmen Bruker, Varian und Jeol vertreten, wobei die Vielfalt der eingesetzten Gerätetypen von 4,7 T (200 MHz) bis 14,1 T (600 MHz) reichte. Hierbei handelte es sich sowohl um mit Analog- als auch mit Digital-Filter (mit und ohne Oversamp­ling-Technik) ausgestattete NMR-Spektrometer.

Die zugesandten Schätzwerte und deren erweiterte Messunsicherheiten für die Stoffmen­genverhältnisse (bezogen auf D4) sind in Tabelle 11.3 aufgelistet.


[Seite 36↓]

Abbildung 5.7: Ergebnisse des nationalen Ringversuchs NMR-2 bei der Auswertung als Stoffmengenverhältnis bezogen auf D4 (A: ETS, B: Par, C: Dur, D: Cy12).


[Seite 37↓]

Aus der graphischen Darstellung der Teilnehmerdaten in der Abbildung 5.7 ist zu erkennen, dass die Stoffmengenverhältnisse der drei Komponenten Par, Dur und Cy12 von den meisten Teilnehmer mit einer Richtigkeit von besser als 98 % bestimmt wurden. Nur wenige Labore weichen mit ihren Messwerten um mehr als ± 2 % relativ von den gravimetrischen Referenz­werten ab. Eine systematische Entwicklung zu positiven Abweichungen ist indessen offensichtlich. Andererseits scheint beim ETS ein Trend von zu kleinen Werten vorzuliegen. Die meisten Messwerte befinden sich hierbei innerhalb eines Bereiches von –5 % bis +1 % relativer Abweichung zum Referenzwert. Auffallend sind die Ergebnisse der Institute 10, 34, 35 und 36, die generell neben einer geringen Präzision (große Unsicherheitsbalken) auch die größten Abweichungen ihrer Ergebnisse von den gravimetrischen Referenzwerten aufweisen.

Die Fehler-Analyse der gemittelten Teilnehmerwerte bezüglich der gravimetrischen Refe­renzwerte zeigte beim Par eine erhebliche Abweichung, während die Abweichungen der anderen drei Komponenten geringfügig sind (Tabelle 5.8).

Tabelle 5.8: Fehleranalyse der Ergebnisse des nationalen Ringversuchs NMR-2 (Stoffmen­genverhältnisse). Auflistung der Mittelwerte und deren Abweichungen von den gravi­metrischen Referenzwerten sowie deren Unsicherheiten. Entscheidung über signifikante Abweichungen nach Gleichung 4.16.

Komponente


in mol mol-1


in mol mol-1

|Δxi|
in mol mol-1

2u(Δxi)
in mol mol-1

Signifikante Abweichung?

ETS

2,670

0,020

0,027

0,041

nein

Par

1,887

0,014

0,038

0,029

ja

Dur

263,4

4,1

7,8

8,2

nein

Cy12

2,120

0,014

0,013

0,029

nein

Aus den Ringversuchsergebnisses wurde die relative Messunsicherheit der Methode (k=2,
p=95%) für ETS zu 2,5%, für Par zu 5%, für Dur zu 7% und für Cy12 zu 1,9% bestimmt.

Analog zum Ringversuch CCQM-P3 wurden aus den Intensitätswerten der Einzelmessun­gen die relativen Stoffmengenanteile nach Gleichung 3.12 berechnet (Tabelle 11.4). Die graphische Darstellung der Stoffmengenanteile in der Abbildung 5.8 zeigt, dass bei der Kom­ponente Dur die Analysenwerte aller Teilnehmern um weniger als 1% vom Referenzwert abweichen und bei den beiden Komponenten Par und Cy12 die Abweichungen der Analysenergebnissen vieler Teilnehmer weniger als 2 % betragen.

[Seite 38↓]
Abbildung 5.8: Ergebnisse des nationalen Ringversuchs NMR-2 bei der Auswertung als Stoffmengenanteile (A: ETS, B: Par, C: Dur, D: Cy12, E: D4).


[Seite 39↓]

Hingegen wurden bei der Komponente D4 von elf und beim ETS von 24 Laboratorien signifikant zu geringe Stoffmengenanteile bestimmt. Dieses spiegelte sich beim Soll-Ist-Vergleich der gemittelten Teilnehmerergebnisse mit den gravimetrischen Referenzwerten wider. Während die Abweichungen der gemittelten Teilnehmerergebnisse von den Komponenten Par, Dur und Cy12 sich als geringfügig herausstellten, waren die der beiden Komponenten ETS und D4 signifikant (Tabelle 5.9).

Tabelle 5.9: Fehleranalyse der Ergebnisse des nationalen Ringversuchs NMR-2 (Stoffmen­genanteile). Auflistung der Mittelwerte und deren Abweichungen von den gravimetrischen Referenzwerten sowie deren Unsicherheiten. Entscheidung über signifikante Abweichungen nach Gleichung 4.16.

Komponente


in mol mol-1


in mol mol-1

|Δxi|
in mol mol-1

2u(Δxi)
in mol mol-1

Signifikante Abweichung?

ETS

0,989

0,008

0,035

0,016

ja

Par

0,700

0,007

0,002

0,014

nein

Dur

97,15

0,03

0,05

0,06

nein

Cy12

0,786

0,006

0,007

0,012

nein

D4

0,371

0,004

0,009

0,008

ja

Die relative Messunsicherheit (k=2; p=95%) der Methode wurde hier für die Haupt­komponente Dur zu 0,12% und für die Nebenkomponenten ETS zu 7%, für Par zu 2,1%, für Cy12 zu 2,4% und für D4 zu 5% ermittelt. Nichtsdestoweniger war gegenüber dem ersten nationalen Ringversuch NMR-1 trotz eines größeren Verhältnisses zwischen der Haupt- und den Nebenkomponenten eine Verbesserung der Messunsicherheit der Methode erzielt worden, wie in der Abbildung 5.9 zu ersehen.

Abbildung 5.9: Verbesserung der Messunsicherheit der Methode: Vergleich zwischen den beiden nationalen Ringversuchen NMR-1 und NMR-2.


[Seite 40↓]

5.2.5  Zusammenfassung

Die Auswertungen der beiden Ringversuche CCQM-P3 und NMR-2 zeigten ein ähnliches Bild. Die Analysen nach der Arbeitsanweisung führten zu einer deutlichen Verbesserung der Genauigkeit der Methode. Dabei wurden bei beiden Auswertungsarten (Stoffmengenverhält­nisse und -anteile) die Komponenten von den meisten Teilnehmern mit einer Richtigkeit von besser als 98 % analysiert. Aus der Mittlung aller Teilnehmerdaten mit Bezug auf die gravimetrischen Referenzwerte wurden für die Analysen von Stoffmengenverhältnisse und -anteilen die relativen Messunsicherheiten (k=2; p=95%) zu zwischen 1,2 % und 7 % bestimmt. Lediglich bei der Analyse von Stoffmengenanteilen für die Hauptkomponente wurde eine relative Messunsicherheit von weniger als 0,2 % erzielt. Die Fehler-Analysen der Ergebnisse der Ringversuche zeigten jedoch erhebliche systematische Abweichungen. So traten bei beiden Ringversuchen die folgenden gleichartigen Probleme auf:

  1. zu große Analysenwerte bei den drei Komponenten Par, Dur und Cy12 bei der Auswertung als Stoffmengenverhältnisse bezogen auf D4,
  2. zu kleine Analysenwerte des D4 bei der Auswertung als Stoffmengenanteile und
  3. zu geringe ETS-Analysenwerte bei beiden Auswertungsarten.

Um die Messunsicherheit dieser beiden Methoden zu verbessern, war die Klärung dieser Effekte nötig. Die Ergebnisse wurden den Teilnehmern der beiden Ringversuche mitgeteilt, wobei zur Vereinfachung nur die Standardunsicherheiten betrachtet wurden [64, 65].

5.3  Ermittlung von Einflussgrößen

Die im Kapitel 5.2 beschriebenen Abweichungen der Teilnehmerergebnisse von den gravi­metrischen Referenzwerten machten die Ermittlung weiterer Einflussgrößen notwendig. Deren Auswirkungen auf die Messunsicherheit der Methode werden wegen der größeren Anzahl an Datenwerten an den Teilnehmerergebnissen des nationalen Ringversuchs NMR-2 diskutiert. Diese gelten adäquat für den internationalen Ringversuch CCQM-P3.

5.3.1 Auswertung der Spektren

Die Auswertung der Messprotokolle und der eingesandten Spektren legte bei den Instituten 10, 24, 28, 35, 36 und 37 dar, dass die Spektrenkorrekturen (Grundlinie und Phase) nicht sorgfältig und die Integration entgegen der Messvorschrift durchgeführt wurden. Die bei den Laboratorien 24 und 37 um 1,1 % relativ zu großen Analysenwerte des Durols sind auf die Miterfassung der 13C-Satelliten bei dessen Intensitätsermittlung ohne Berücksichtung bei der Auswertung zurückzuführen. Die Spektren von Labor 10 enthielten bei 1,10 ppm ein Triplett, bei dem es sich um eine vom Teilnehmer zugeführte Verunreinigung sekundärer Art handelte. Die Miterfassung dieses Signals bei der Auswertung des ETS-Signals bei zwei der [Seite 41↓]fünf Spektren führte zu einem zu großen Intensitätswert sowie zu einer geringen Präzision des gemittelten Analysenergebnis dieses Teilnehmers. Die unzureichende und zwischen den Spektren unterschiedlich gehandhabte Korrektur der Grundlinie und Phase sowie der Integralzüge wirkte sich bei den Laboratorien 28, 35 und 36 negativ auf die Richtigkeit und Präzision der Analysenergebnisse aus. Besonders beim Institut 35 wurde anhand der mitgesandten Spektren die Nichteinhaltung der Arbeitsanweisung und ihre Auswirkungen deutlich (Abbildung 5.10).

Abbildung 5.10: Zugesandtes Spektrum des Labors 35.

Neben einer schlechten Auflösung (zu breite Signale) weisen diese Spektren signifikante frequenzabhängige Phasenfehler auf, wodurch die Intensitätswerte verfälscht im Spektrum wiedergegeben werden (s. Kapitel 3.2.3). Zudem wurden die Integrationsgrenzen beliebig und von Spektrum zu Spektrum unterschiedlich gesetzt (die Integrationsfaktoren streuen zwischen 5 und 92). Dies bewirkte innerhalb eines Spektrums eine geringe Richtigkeit der wiedergegebenen Intensitäten, wie das Intensitätsverhältnis der beiden ETS-Signale bei ca. 1100 Hz (Quartett) und ca. 200 Hz (Triplett) von 0,05 : 0,18 (Abweichung von ca. 200 % zum natürlichen Verhältnis von 2 : 3) in der Abbildung 5.10 belegt, und zwischen den Spektren eine große Streuung der Analysenergebnisse. Eine derartige Auswertungsroutine muss zwangsläufig zu ungenauen Ergebnissen führen.

Insgesamt führte die nicht sorgfältige Auswertung der Spektren durch den Operator zu ungenauen Ergebnissen und somit zu einer höheren Messunsicherheit der Methode.

5.3.2  Integration des ETS (o-Isomer)

Die große Anzahl an Teilnehmer-Werten bei der Komponente ETS im Bereich -2 % bis -6 % relativer Abweichung zum Referenzwert bei beiden Auswertungsarten deuteten auf ein Problem bei der Auswertung dieser Komponente hin. Aus den Angaben der Integrations­[Seite 42↓]bereiche in den Messprotokollen sowie der Darstellung der Integrale in den beigefügten Spektren war zu entnehmen, dass viele Teilnehmer – entgegen der Arbeitsanweisung – den Integrationsbereich zur vollständigen Erfassung der o-isomeren Verbindung des ETS nicht erweitert hatten. Aufgrund des Anteils des o-Isomeren sollte dies nur zu einem maximal um 2 % relativ zu geringen Analysenwert führen. Eigene Auswertungen zeigten jedoch, dass die Integration des ETS-Signals mit einem Integrationsfaktors von 64 mit anschließender Korrektur des Integralzuges zu einem um 4 % zu geringes Stoffmengenverhältnis des ETS (bezogen auf D4) führte (Abbildung 5.11). Ursache für diese Intensitätsverfälschung ist die Korrektur des Integralzuges einer signifikant nicht vollständig erfassten Signalintensität (hier die des o-Isomeren). Die Korrektur des eigentlich steigenden Integralzuges zu einem gerade auslaufenden mittels der SLOPE-Funktion (Veränderung der Steigung der Grundlinie) verfälschte die Signalintensität und führte zu einem zu geringen Analysenwert.

Auch hier zeigte sich, dass bei der Setzung der Integralgrenzen Anforderungen an den Operator zu stellen sind, um richtige Analysenergebnisse zu erzielen. So ist der entspre­chend dem Integrationsfaktor berechnete Integrationsbereich auf Signale zu untersuchen, bei denen zur vollständigen Erfassung der Integrationsbereich gegenüber dem Integrations­faktor zu vergrößern ist.

Verallgemeinernd ist daher zu sagen, dass überlagernde Einzelsignale (hier o- und p-ETS) mit einem Integralzug vollständig zu erfassen sind.

Abbildung 5.11: Vergleich der Intensitätswiedergabe bei der Setzung der Integrationsgren­zen des ETS-Signals und anschließender Korrektur der Integralzüge: A: Integrationsfaktor 64; B: größerer Integrationsbereich zur vollständigen Erfassung des o-Isomeren (0,75 ppm).


[Seite 43↓]

5.3.3  Spektren- und Filterweite

Die generell zu großen Teilnehmerwerte der 15 Laboratorien (1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 24, 25, 27, 28, 34 und 35) bei der Auswertung als Stoffmengenverhältnisse und zugleich zu geringe D4-Stoffmengenanteile deuteten auf einen systematischen Fehler bei der Intensitätswieder­gabe des D4 hin.

Abbildung 5.12: Ergebnisse des nationalen Ringversuchs NMR-2 bei der Auswertung als Stoffmengenverhältnisse bezogen auf Cy12 (A: ETS, B: Par, C: Dur, D: D4).


[Seite 44↓]

Dieser bewirkt bei der Berechnung von Stoffmengenverhältnissen bezüglich D4 zu große Analysenergebnisse. Daher wurden zur Überprüfung dieser Vermutung die Stoffmengen­verhältnissen auf einen anderen Standard bezogen neu berechnet. Hierzu eignete sich Cy12 aufgrund seiner Lage im Spektrum am besten. Bei der Auswertung auf Cy12 wurde von oben genannten 15 Laboratorien generell eine nun bessere Richtigkeit erreicht. Allgemein konnten bei dieser Auswertung die Stoffmengenverhältnisse der beiden Komponenten Par und Dur jetzt von fast allen Teilnehmern mit einer Richtigkeit von besser als 98 % bestimmt werden (Abbildung 5.12). Indessen lagen bei der Komponente ETS recht viele Teilnehmerwerte im Bereich –2 % bis –8 % relativer Abweichung zum gravimetrischen Referenzwert (wurde im Kapitel 5.3.2 ausführlich behandelt). Es bestätigte sich, dass die zu großen Analysenwerte bei der vorgeschriebenen Auswertungsart auf eine verfälschte Intensitätswiedergabe des D4 im Spektrum zurückzuführen waren. Ursache hierfür ist der Profil-Verlauf des Analogfilters, der, wie im Kapitel 3.2.1 beschrieben, die Intensitäten im Grenzbereich liegender Signale (hier D4) partiell reduziert. Bestätigt wird dies in der Abbildung 5.12 durch die zu geringen Analysenergebnisse der Labore 1 bis 11 und 34 bei der Komponente D4, die mit Analogfilter ausgestatteten NMR-Spektrometern arbeiteten. Vergleichsmessungen an einem mit einem Analogfilter ausgestatteten Bruker AMX 600 Spektrometer an der Humboldt-Universität zu Berlin (HUB) belegten, dass die vorgegebenen Einstellparametern für die Spektren- und Filterweite von 12 ppm und 14 ppm eine Reduzierung der Intensität des D4-Signals im Spektrum durch das Profil des Analogfilters ausübten (hier um 2,1 %). Bei größerer Spektren- und Filterweite von 15 ppm bzw. 33 ppm wurde die D4-Intensität im Spektrum richtig wiedergegeben (-0,4 % relative Abweichung vom gravimetrischen Referenzwert).

Die in den letzten drei Kapiteln diskutierten Einflussgrößen (sorgfältige Korrektur der Spek­tren, Integration und Filterweiten) erklären den größten Teil der signifikant abweichenden Teilnehmerergebnisse. Schließt man daher bei der Mittelwertbildung die beiden Institute 35 und 36 aufgrund der flüchtigen Auswertung der Spektren (signifikante Nichteinhaltung der Arbeitsanweisung) aus und berechnet die Stoffmengenverhältnisse auf Cy12, so betragen die daraus ermittelten relativen Messunsicherheiten (k=2; p=95%) beider Methoden (Stoff­mengenverhältnisse und -anteile) für die Komponenten Par, Dur und Cy12 zu unter 1,5% (Tabellen 5.10 und 5.5.11). Die hohe relative Messunsicherheit bei der Komponente ETS von 6% ist auf den systematischen Fehler der nicht vollständigen Integration des o-Isomeren zurückzuführen (Kapitel 5.3.2). Schließt man die Institute, die mit Analogfiltertechnik ausgestatteten NMR-Spektrometern arbeiteten (Institute 1 bis 11 und 34), bei der Komponente D4 ebenfalls aus, so liegt die relative Messunsicherheit hier ebenfalls unter
1,5%. Die bei Dur und D4 noch auftretenden signifikanten Abweichungen von unter 1% sind akzeptabel und sollen daher nicht weiter betrachtet werden.


[Seite 45↓]

Tabelle 5.10: Fehleranalyse der Ergebnisse des nationalen Ringversuchs NMR-2 (Stoffmengenverhältnisse bezogen auf Cy12). Auflistung der Mittelwerte (ohne die Institute 35 und 36) und deren Abweichungen von den gravimetrischen Referenzwerten sowie deren Unsicherheiten. Entscheidung über signifikante Abweichungen nach Gleichung 4.16.

Komponente


in mol mol-1


in mol mol-1

|Δxi|
in mol mol-1

2u(Δxi)
in mol mol-1

Signifikante Abweichung?

ETS

1,258

0,008

0,034

0,016

ja

Par

0,892

0,005

0,004

0,010

nein

Dur

123,0

0,5

0,6

1,2

nein

D4 4

0,476

0,001

0,003

0,002

ja

Tabelle 5.11: Fehleranalyse der Ergebnisse des nationalen Ringversuchs NMR-2 (Stoffmengenanteile). Auflistung der Mittelwerte (ohne die Institute 35 und 36) und deren Abweichungen von den gravimetrischen Referenzwerten sowie deren Unsicherheiten. Entscheidung über signifikante Abweichungen nach Gleichung 4.16.

Komponente


in mol mol-1


in mol mol-1

|Δxi|
in mol mol-1

2u(Δxi)
in mol mol-1

Signifikante Abweichung?

ETS

0,994

0,006

0,030

0,012

ja

Par

0,705

0,003

0,003

0,06

nein

Dur

97,14

0,01

0,04

0,02

ja

Cy12

0,790

0,003

0,003

0,006

nein

D4 4

0,378

0,001

0,002

0,002

nein

5.3.4  Operator-Einfluss

Zur Bewertung des Einflusses des Operators und der unterschiedlichen Gerätetypen wurden die Teilnehmer des NMR-2 Ringversuches um die Zusendung ihrer FIDs (im JCAMP-DX-Format) gebeten. Die von 16 Instituten zur Verfügung gestellten FIDs wurden unter XWinNMR in das Bruker-Format konvertiert und eigenhändig nach Arbeitsanweisung pro­zessiert, korrigiert und integriert. Dabei sandten die Labor 23 und 32 nur jeweils ein FID zu, so dass hier keine Unsicherheiten berechnet werden konnten. Die Gegenüberstellung der eigenen Analysenergebnisse – Stoffmengenanteile bezogen auf Cy12 zur Vermeidung der Analog-Filter-Problematik (Tabelle 11.5) – gegen die Originaldaten der Teilnehmer in Abbil­dung 5.5.13 verdeutlichten den Einfluss des Operators auf die Messunsicherheit bei Betrachtung derselben Institutsnummer. Besonders beim Labor 28 war der Einfluss des Operators auf die Richtigkeit sowie bei den Laboren 3 und 10 auf die Präzision der Mess­[Seite 46↓]werte erkennbar. Bei der eigenen Prozessierung und Auswertung lagen generell alle Werte in einem Bereich ± 2 % relativer Abweichung zu den gravimetrischen Referenzwerten. Größere Abweichungen bei der Komponente D4 waren bei den Laboren 3 und 11 auf die Analogfilter-Technik der eingesetzten NMR-Spektrometer zurückzuführen. Ein Einfluss des verwendeten NMR-Spektrometers war mit Ausnahme des Analog-Filter-Effektes nicht erkennbar.

Abbildung 5.13: Gegenüberstellung der Analysenergebnisse der eigenen Auswertung gegen die der Teilnehmer (Auswertung als Stoffmengenverhältnisse bezogen auf Cy12).


[Seite 47↓]

Die Fehleranalyse der gemittelten Messwerte der eigenen Auswertungen (Tabelle 5.12) zeigte keine signifikanten Abweichungen auf. Die relative Messunsicherheit (k=2; p=95%) wurde entsprechend Gleichung 4.17 für alle vier Komponenten zu unter 1,5 % bestimmt.

Tabelle 5.12: Fehleranalyse der Ergebnisse bei Auswertung der eingesandten FIDs durch eigene Nachauswertung. (Stoffmengenverhältnisse bezogen auf Cy12). Auflistung der Mittelwerte und deren Abweichungen von den gravimetrischen Referenzwerten sowie deren Unsicherheiten. Entscheidung über signifikante Abweichungen nach Gleichung 4.16.

Komponente


in mol mol-1


in mol mol-1

|Δxi|
in mol mol-1

2u(Δxi)
in mol mol-1

Signifikante Abweichung?

ETS

1,290

0,005

0,002

0,010

nein

Par

0,889

0,006

0,003

0,012

nein

Dur

122,9

0,2

0,4

0,5

nein

D4

0,477

0,0014

0,002

0,003

nein

Zur weiteren Überprüfung des Einflusses vom eingesetzten NMR-Spektrometer auf die Genauigkeit der Methode wurden eigene Vergleichsmessungen bei der Firma Bruker mit einem 500 MHz und einem 800 MHz NMR-Spektrometer (NMR-2 Lösung) und an der HUB mit einem 300 MHz und einem 600 MHz NMR-Spektrometer (CCQM-P3-Lösung) nach Arbeitsanweisung (Ausnahme 600 MHz NMR-Spektrometer: Spektren- und Filterweite aufgrund Analog-Filter auf 15 ppm bzw. 33 ppm heraufgesetzt) durchgeführt. Die Auswertungen dieser Vergleichsmessungen dokumentierten die Unabhängigkeit der Metho­de vom eingesetzten Gerät (Tabelle 5.13).

Tabelle 5.13: Ergebnisse der Vergleichsmessungen zur Ermittlung des Einflusses der Magnetfeldstärke auf die Messunsicherheit der Methode.

Komponente

NMR-2 Lösung

CCQM-P3 Lösung

400 MHz

(BAM)

500 MHz

(Bruker)

800 MHz

(Bruker)

400 MHz

(BAM)

300 MHz

(HUB)

600 MHz

(HUB)

ETS

in mol mol-1

2,693

2,692

2,698

1,144

1,142

1,144

in mol mol-1

0,010

0,003

0,005

0,004

0,005

0,08

rel. Δxi in %

-0,2

-0,2

0,04

-0,4

-0,5

-0,4

Par

in mol mol-1

1,862

1,867

1,857

0,784

0,790

0,789

in mol mol-1

0,002

0,001

0,001

0,001

0,001

0,002

rel. Δxi in %

0,7

1,0

0,4

0,2

0,9

0,8

Dur

in mol mol-1

255,3

253,95

253,86

58,87

59,17

58,26

in mol mol-1

0,4

0,08

0,14

0,03

0,10

0,09

rel. Δxi in %

-0,1

-0,7

-0,7

0,01

0,5

-1,0

Cy12

in mol mol-1

2,079

2,097

2,092

0,682

0,685

0,682

in mol mol-1

0,003

0,003

0,002

0,001

0,002

0,002

rel. Δxi in %

-0,4

0,5

0,2

0,4

0,9

0,4


[Seite 48↓]

Alle Analysenergebnisse lagen einschließlich ihrer Unsicherheit innerhalb des Bereiches der im Kapitel 5.3.3 ermittelten relativen Messunsicherheit der Methode von 1,5 %. Insgesamt stellte sich heraus, dass der Operator bei der Auswertung der Spektren einen großen, nicht zu vernachlässigenden Einfluss auf die Richtigkeit und Präzision des Analysenergebnisses ausübt. Die eigenen Vergleichsmessungen an den verschiedenen NMR-Geräten und ebenso die Auftragung der NMR-2 Ergebnisse sortiert nach Herstellern belegten die Unabhängigkeit der Methode vom Gerätetyp (mit entsprechender Parameterwahl bei Analoggeräten (größere Spektren- und Filterweite)).

5.3.5 Auswertungsmethoden und -programme

Als weitere mögliche Einflussgröße bezüglich der Messunsicherheit der Methode kommt die verwendete Software zur Auswertung der Spektren in Frage. Neben den von den Herstellern mitgelieferten Auswertungsprogrammen sind kommerzielle (Origin, Nuts, AMIX, etc.) sowie frei im Internet zugängliche Software-Programme (z. B. MestRe-C5) erhältlich, mit denen NMR-Spektren eingelesen und ausgewertet werden können. Aus den Ringversuchsprotokol­len war es nicht ersichtlich, welche Programme die Teilnehmer für die Auswertung einsetz­ten. Daher wurden die im eigenen Labor verfügbaren, von der Firma Bruker mitgelieferten Auswertungsprogramme XWinNMR und WinFit sowie MestRe-C [66] bezüglich ihrer Leistungsfähigkeit der quantitativen Auswertung von NMR-Spektren untersucht. Den manu­ellen Korrekturen der Phasen und der Grundlinie wurden die automatischen Korrekturen gegenübergestellt und auf ihre Eignung untersucht. Zur Auswertung wurden die fünf NMR-2 Spektren (Labor 12) den in Tabelle 5.14 aufgeführten Variationen an Auswertungs­programmen und Korrekturen unterzogen.

Tabelle 5.14: Varianten der Auswertungsprogramme und der Korrekturmaßnahmen (Man.= Manuell; Auto.= Automatik; Entf.= Entfällt).

Korrektur

XWinNMR

MestRe-C

WinFit

XWN-1

XWN-2

XWN-3

XWN-4

MR-1

MR-2

MR-3

WF

Phasen

Man.

Man.

Auto.

Auto.

Man.6

Man.7

Auto.

Man.8

Grundlinie

Man.

Man.

Auto.

Auto.

Man.

Man.

Auto.

Man.8

Integral

Man.

Keine

Keine

Man.

Keine

Keine

Keine

Entf.


[Seite 49↓]

Aus den Ergebnissen, in Tabelle 5.15 dargestellt, geht hervor, dass mit XWinNMR bei sorg­fältiger manueller Korrektur der Phasen und der Grundlinie präzise und richtige Analysen­werte erhalten wurden unabhängig von der Anwendung der Korrektur der Integralzüge (XWN-1 und XWN-2). Die Korrektur-Algorithmen für die Phasen und die Grundlinie führten trotz mehrfacher Anwendung zu einer zu tief liegenden Basislinie beim ETS-Signal, worauf die Intensität dieses Signals bei der Integration (XWN-3) zu gering wiedergegeben wurde. Durch Korrektur dieser Integralzüge (Ausgleich der Grundlinie) wurden richtige Messergeb­nisse (XWN-4) erzielt.

Tabelle 5.15: Einfluss der verschiedenen Auswertungsprogramme und Auswertungs­methoden (manuelle Korrekturen gegen die automatischen) auf die Messunsicherheit der Methode.

Komponente

XWN-1

XWN-2

XWN-3

XWN-4

MR-1

MR-2

MR-3

WF

ETS

in mol mol-1

2,693

2,691

2,592

2,682

2,696

2,589

2,083

2,527

rel. in %

0,4

0,4

0,24

0,5

0,6

3

11

1,4

rel. Δxi in %

-0,1

-0,2

-3,9

-0,6

-0,02

-4,0

-22

-6,3

Par

in mol mol-1

1,862

1,855

1,853

1,861

1,857

1,837

1,561

1,683

rel. in %

0,11

0,16

0,15

0,09

0,4

0,6

10

1,7

rel. Δxi in %

0,7

0,3

0,2

0,6

0,4

-0,7

-15

-8,9

Dur

in mol mol-1

255,3

254,5

255,6

255,7

254,6

260,1

260,8

248,2

rel. in %

0,15

0,05

0,06

0,16

0,2

0,9

2

1,4

rel. Δxi in %

-0,1

-0,4

0,0

0,03

-0,4

1,7

2,0

-2,9

Cy12

in mol mol-1

2,079

2,084

2,084

2,079

2,088

2,117

2,093

1,950

rel. in %

0,14

0,07

0,08

0,11

0,19

0,5

2

1,5

rel. Δxi in %

-0,4

-0,1

-0,1

-0,4

0,1

1,4

0,3

-6,6

Die Software MestRe-C erwies sich für die quantitative Auswertung als ungeeignet. Das Ergebnis der Korrektur-Algorithmen waren Spektren mit eindeutigen Phasen- und Grundli­nienfehlern, deren Auswertung zwangsläufig zu ungenauen Ergebnissen (rel. Abweichungen bis zu –22 % und Streuung der Einzelwerte bis zu 11 %) führen musste (MR-3). Ferner blieben bei der manuellen Phasenkorrektur mittels der dafür vorgesehenen Drehscheibe (auf 1° genau) Phasenfehler in den Spektren bestehen (MR-2). Erst bei der manuellen Eingabe der Werte für die Phasenkorrektur auf 0,1° genau (MR-1) waren die Phasenfehler zu korrigieren, worauf richtige und präzise Analysenergebnisse erhalten wurden. Aufgrund der schwierigen Handhabung der Korrektur der Integralzüge wurde bei der Auswertung darauf verzichtet. Die Auswertung mittels WinFit wurde mit einer optimierten Lorentz-Gauß-Linie im Verhältnis 9:1 vorgenommen, die jedoch ebenfalls zu signifikanten Abweichungen der Ergebnisse von den gravimetrischen Referenzwerten führte (relative Abweichungen bis zu
–9 %). Ursache hierfür ist die nicht einwandfreie Lorentz-Linienform – bedingt durch Shim-Fehler und B1-Feldinhomogenitäten – der gemessenen Signale, die nicht durch Lorentz-Gauß-Linien simuliert werden können.


[Seite 50↓]

Auch hier zeigte sich wieder, dass an den Operator große Anforderungen zu stellen sind, da nur sorgfältige manuelle Korrekturen der Grundlinie und der Phasen im Spektrum zu richtigen und präzisen Analysenergebnissen führen, und somit zu einer geringen Messunsicherheit.

Die Spektrenaufnahme nach Maniara [8], Signale nacheinander mit identischen Parametern in ein Spektrum aufzunehmen, erwies sich aufgrund des schlechteren S/N als nachteilig. Ebenso lieferte die Auswertung mit der Software NMRQuant signifikant abweichende Messergebnisse [14]. Augner diskutierte die nicht ausreichende Genauigkeit der Simulation von Spektren mit WIN-DAISY [67].

5.3.6  Messköpfe

Der Ausschluss eines Teilnehmers beim NMR-2 Ringversuch aufgrund eines nicht geeig­neten Messkopfes war ausschlaggebend für die Experimente zur Bestimmung des Einflus­ses vom verwendeten Messkopf auf die Intensitätswiedergabe im Spektrum. Hierzu wurden anhand der NMR-2 Lösung nach Arbeitsanweisung laborintern vier verschiedene Messköpfe (QNP, TXI, 10mm HR, Si-spezial) sowie bei Bruker am 500 MHz Spektrometer ein TXI-Kryo-Messkopf auf ihre quantitativen NMR-Eigenschaften ausgetestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5.16 als Stoffmengenverhältnisse bezogen auf D4 dargestellt.

Tabelle 5.16: Richtigkeit der Analysenergebnisse in Abhängigkeit des Messkopfes.

Komponente

QNP

TXI

10mm HR

Si-spezial

TXI-Kryo

ETS

in mol mol-1

2,693

2,701

2,744

2,758

2,704

rel. Δxi in %

-0,1

0,2

1,8

2,3

0,2

Par

in mol mol-1

1,862

1,862

1,874

1,947

1,865

rel. Δxi in %

0,7

0,7

1,3

5,3

0,9

Dur

in mol mol-1

255,3

254,2

272,0

276,9

251,9

rel. Δxi in %

-0,1

-0,6

6,4

8,3

-1,4

Cy12

in mol mol-1

2,079

2,088

2,095

2,188

2,098

rel. Δxi in %

-0,4

-0,2

0,4

4,8

0,5

Es zeigte sich, dass die für 1H-NMR-Messungen nicht vorgesehene Messköpfe (10 mm HR und Si-spezial) bei der Aufnahme derartiger Spektren die Intensitäten im Spektrum falsch wiedergeben (relative Abweichungen zu den Referenzwerten von bis zu 9 %). Indessen wurden bei den Messungen mit dem QNP-Messkopf als auch mit den beiden TXI-Messköpfen die Stoffmengenverhältnisse der vier Komponenten durchgängig mit einer Richtigkeit von besser als 99 % wiedergegeben. Lediglich der Analysenwert für das Dur wurde beim TXI-Kryo-Messkopf mit einer relativen Abweichung von –1,4 % ermittelt. Dieses ist jedoch nicht auf die Aufnahme des Spektrums, sondern auf dessen Auswertung [Seite 51↓]zurückzuführen. Die Hauptkomponente wurde im Spektrum mit einer im Gegensatz zu den anderen Komponenten schlechteren Auflösung (größere Halbwertsbreite ν½) wiedergegeben (ν½(Dur) : ν½(D4) beim TXI-Kryo 8:1 gegenüber beim QNP 1,7:1). Dieser Effekt wird als Radiation Damping bezeichnet und im Kapitel 5.3.7 ausführlicher behandelt. Wegen der Verbreiterung dieses Signals musste aufgrund benachbarter Signale ein kleinerer Integrationsfaktor (14) beim Dur – im Gegensatz zu 32 bei den anderen vier Signalen – angesetzt werden, was zu einer geringeren prozentualen Erfassung der Gesamtintensität des Signals führte, und somit eine signifikant negative Abweichung des Analysenergebnis­ses bedingte. Angesichts seiner hohen Empfindlichkeit wird dieser Messkopf eher routine­mäßig bei Messungen mit stark verdünnten Lösungen bzw. bei Kernspins mit einer geringen natürlichen Häufigkeit eingesetzt, bei denen sich dieser Effekt kaum bzw. gar nicht auswirkt.

Insgesamt wurden mit für die 1H-NMR-Spektroskopie konstruierten Messköpfen bei quanti­tativen Messungen die Intensitäten im Spektrum richtig wiedergegeben. Jedoch ist beim Einsatz eines Kryo-Messkopfes mit einem starken Radiation-Damping-Effekt zu rechnen, der die Auswertung intensiver Signale aufgrund der Signalverbreiterung erschwert. Bei Messköpfen, die nicht speziell für 1H-NMR-Messungen vorgesehen sind, können die Intensitäten im Spektrum verfälscht wiedergegeben werden.

5.3.7  Radiation Damping

Der im Kapitel 5.3.6 erwähnte Effekt des Radiation Dampings wurde erstmals 1954 [68] in der Literatur erwähnt. Es beschreibt einen zusätzlichen Relaxations-Mechanismus T rd beruhend auf der Wechselwirkung zwischen der transversalen Magnetisierung der Messprobe und der RF-Spule. Hierbei wird T rd durch die folgende Gleichung definiert:

,

 

(5.1)

wobei fden Füllfaktor und Q den Qualitätsfaktor des Probenkopfes wiedergibt [69]. Das dabei erzeugte entgegenwirkende Magnetfeld Brd wird durch die Gleichung

 

(5.2)

in Abhängigkeit vom Anregungswinkel und T rd beschrieben. Detaillierte Informationen über das Radiation Damping sind dargestellt in [70, 71, 72].

Für die meisten Proben und Kernarten ist das Radiation Damping ein schwacher, gegenüber den anderen Relaxations-Mechanismen (T1 undT1) zu vernachlässigender Effekt. In den letzten Jahren wurde es jedoch aufgrund der immer stärker werdenden Magnetfeldern sowie der empfindlicheren Messköpfe zu einem bei der 1H-NMR nicht mehr zu vernachlässigenden [Seite 52↓]physikalischen Phänomen, das sich unter anderem auf die Linienbreite (Verbreiterung) intensiver Signale im Spektrum auswirkt [73].

Beim Vergleich der Messköpfe im Kapitel 5.3.6 stellte sich heraus, dass die Halbwertsbreite des intensivsten Signals (Dur) – dargestellt als Verhältnis der Halbwertsbreiten zwischen Dur und D4 – mit der Empfindlichkeit des Messkopfes von 1,7:1 beim QNP- über 2,1:1 beim TXI- bis 8:1 beim TXI-Kryo-Messkopf zunahm. Dasselbe Verhalten zeigte sich mit der Zunahme der Magnetfeldstärke (Kapitel 5.3.4) von 2,1:1 bei 9,4 T über 2,4:1 bei 11,7 T bis zu 3,2:1 bei 18,8 T. Die Ergebnisse in den Kapiteln 5.3.4 und 5.3.6 zeigen, dass das Radiation Damping eine Verbreiterung intensiver Signale, jedoch keine Verfälschung von deren Intensitäten im Spektrum bewirkt.

5.3.8 Zusammenfassung

Aufgrund bei der Fehleranalyse der Ringversuchsergebnisse festgestellten erheblichen systematischen Abweichungen bezüglich der gravimetrischen Referenzwerte wurden folgende Einflussgrößen umfangreich untersucht:

Der Einsatz von modernen NMR-Spektrometern und Kryo-Messköpfen führte zu Radiation Damping-Effekten (Linienverbreiterung) bei intensiven Signalen. Ein Einfluss auf die Signalintensität konnte nicht festgestellt werden. Allgemein wurde die Unabhängigkeit der Messunsicherheit von der Magnetfeldstärke des eingesetzten NMR-Spektrometers gezeigt.

Anhand der ermittelten Einflussgrößen wurden zur Berechnung der Messunsicherheit der Methoden (Stoffmengenverhältnis, -anteile) Institute, die bei der Auswertung der Spektren [Seite 53↓]sich definitiv nicht an die Arbeitsvorschrift hielten, ausgeschlossen. Ferner wurden die Stoffmengenverhältnisse auf Cy12 bezogen, um das Problem der interner Referenzierung zu lösen. Aus den so gemittelten Teilnehmerergebnissen des Ringversuches NMR-2 wurde für beide Methoden eine relative Messunsicherheit von unter 1,5 % bestimmt (Ausschluss der Teilnehmer mit Analogfilter-NMR-Spektrometer bei der Komponente D4).

Die Erkenntnisse aus diesen Untersuchungen wurden den Teilnehmern auf einem vom Labor I.31 der BAM veranstalteten Workshop vorgestellt und gemeinsam diskutiert [74].

5.4 Modell-Mixturen mit überlagerten Signalen

Die bisher in den Kapiteln 5.2 und 5.3 betrachteten Modell-Lösungen enthielten jeweils einzeln integrierbare Signale im Spektrum. Oftmals weisen die Spektren realer Proben über­lagerte Signale auf, deren Auswertungsweise und die dabei erreichbare Genauigkeit in diesem Kapitel ermittelt werden soll.

5.4.1  Benzoesäure - Ethylbenzoat

Zuerst sollte ein System untersucht werden, bei dem sich die Signale der einen Komponente mit einigen, nicht allen Signalen der anderen Komponente überlagern.

Abbildung 5.14: Strukturen und 1H-NMR-Spektrum der Benzoesäure und des Ethylbenzoats.


[Seite 54↓]

Das untersuchte Modell-System, bestehend aus Benzoesäure und Ethylbenzoat, zeigt ein Spektrum, bei dem sich die aromatischen Protonensignale (7,5 - 8,2 ppm) der Benzoesäure mit denen des Ethylbenzoats überlagern, indessen letzteres zusätzlich aliphatische Protonensignale (CH3 bei 1,4 ppm und CH2 4,4 ppm) im Spektrum aufweist (Abbildung 5.14). Die Intensität des aliphatischen Signals bei 1,4 ppm Ialiph gibt die Methyl-Protonen des Ethylbenzoats wieder. Dagegen werden in der Intensität der aromatischen Signale Iarom die aromatischen Protonen beider Substanzen berücksichtigt. Aus der Kenntnis der Intensität der aliphatischen Signale des Ethylbenzoats kann durch entsprechende Gewichtung die Intensität der aromatischen Ethylbenzoat-Protonen berechnet werden. Die Differenz aus der Intensität aller aromatischen Protonen und der Intensität der aromatischen Ethylbenzoat-Protonen gibt die Intensität der aromatischen Protonen der Benzoesäure nach folgender Gleichung wieder:

.

 

(5.3)

Demzufolge berechnet sich das Stoffmengenverhältnis entsprechend nach Gleichung (3.11):

.

 

(5.4)

Zur Bestimmung der metrologischen Qualität dieser Auswertungsweise wurden fünf sich im Stoffmengenverhältnis unterscheidende Modell-Lösungen (10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10) in deuteriertem DMSO-d6 angesetzt und je viermal mit dem Standardparameter-Satz (Tabelle 5.1, D1= 30 s; ns= 16) gemessen und nach Arbeitsanweisung ausgewertet (Integrations­faktor: 400). Die Fehleranalyse der Analysenergebnisse bezüglich der gravimetrischen Referenzwerte (Gleichung 4.16) zeigte bei drei Lösungen (2, 4 und 5) akzeptable Abweichungen (< 1% relativ), die anderen beiden sind im Vergleich zur Standardunsicher­heit unerheblich (Tabelle 5.17).

Tabelle 5.17: Relative Messunsicherheit der Methode bei Auswertung überlagerter Signale durch Differenzbildung (Benzoesäure und Ethylbenzoat).

 

x Ref
in mol mol-1


in mol mol-1


in mol mol-1

|Δxi|
in mol mol-1

2u(Δxi)
in mol mol-1

rel. U in %

(k=2; p=95%)

(1)

9,807 ± 0,003

9,790

0,012

0,017

0,024

0,4

(2)

4,891 ± 0,002

4,935

0,003

0,044

0,007

1,8

(3)

1,0949 ± 0,0003

1,093

0,002

0,002

0,007

0,5

(4)

0,1934 ± 0,0001

0,1945

0,0001

0,0011

0,0003

1,1

(5)

0,10751 ± 0,00003

0,10792

0,00004

0,00041

0,0001

0,8


[Seite 55↓]

Nach Gleichung 4.17 ergab sich somit aus den Standardunsicherheiten der Analysen- und Referenzwerte sowie den Abweichungen der Analysenwerte von den Referenzwerten generell eine relative Messunsicherheit (k=2; p=95%) dieses Verfahrens von zu unter 1,5 %. Lediglich bei Lösung 2 wurde eine geringere Messunsicherheit von 1,8 % ermittelt.

5.4.2 Ethylbenzoat - Phthalsäurediethylester

Anhand von Ethylbenzoat und Phthalsäurediethylester soll ein System betrachtet werden, bei dem nur überlagerte Signale auftreten, die intramolekularen Protonenverhältnisse der Signale der beiden Komponenten sich aber voneinander unterscheiden (Abbildung 5.15).

Abbildung 5.15: Strukturformeln von Phthalsäurediethylester und Ethylbenzoat.

Die Intensität des Integrals der aromatischen Protonensignale I arom setzt sich entsprechend den jeweiligen Stoffmengen gewichtet aus den vier aromatischen Protonen des Phthalsäure­diethylesters und den fünf aromatischen Protonen des Ethylbenzoats zusammen. Folgerich­tig ergeben die drei aliphatischen CH3-Protonen des Ethylbenzoats und die sechs aliphati­schen CH3-Protonen die Intensität der aliphatischen CH3-Signale I aliph (Abbildung 5.16).

Abbildung 5.16: 1H-NMR-Spektrum der Modell-Lösung bestehend aus Ethylbenzoat und Phthalsäurediethylester.


[Seite 56↓]

Demzufolge erhält man folgendes lösbares Gleichungssystem mit zwei Gleichungen und zwei unbekannten Variablen x (Ethylbenzoat) und y (Phthalsäurediethylester):

.

 

(5.5)

Als Lösung dieses Gleichungssystems erhält man:

.

 

(5.6)

Das Stoffmengenverhältnis berechnet sich dann demzufolge:

.

 

(5.7)

Entsprechend dem Vorgehen in Kapitel 5.4.1 wurden fünf Lösungen mit äquivalenten Stoff­mengenverhältnissen in DMSO-d6 angesetzt und ausgewertet. Die Fehleranalyse der Analysenergebnisse bezüglich der gravimetrischen Referenzwerte (Gleichung 4.16) zeigte generell akzeptable Abweichungen (≤ 1% relativ) (Tabelle 5.18).

Tabelle 5.18: Relative Messunsicherheit der Methode bei Auswertung überlagerter Signale mittels eines Gleichungssystems (Ethylbenzoat und Phthalsäurediethylester).

 

x Ref
in mol mol-1


in mol mol-1


in mol mol-1

|Δxi|
in mol mol-1

2u(Δxi)
in mol mol-1

rel. U in %

(k=2;p=95 %)

(1)

10,072 ± 0,003

10,018

0,011

0,054

0,023

1,1

(2)

4,854 ± 0,002

4,805

0,004

0,049

0,009

2

(3)

1,2208 ± 0,0004

1,2249

0,0005

0,0041

0,0013

0,7

(4)

0,25191 ± 0,0006

0,2544

0,0002

0,0025

0,0013

2

(5)

0,11889 ± 0,00003

0,1185

0,0006

0,0004

0,0012

1,2

Nach Gleichung 4.17 ergab sich somit aus den Standardunsicherheiten der Analysen- und Referenzwerte sowie den Abweichungen der Analysenwerte von den Referenzwerten generell eine relative Messunsicherheit (k=2; p=95%) dieses Verfahrens von zu 2 %. Diese gegenüber den einfachen Verfahren von der Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen leicht erhöhte Messunsicherheit war auf die umfangreichere Messgleichung zurückzuführen, in der die Intensitätswerte mehrfach eingehen.


[Seite 57↓]

5.4.3  Xylol-Isomere

Der schwierigste anzunehmende Fall ist die Auswertung eines Spektrums, bei dem nur überlagerte Signale auftreten und deren Komponenten sich nicht im intramolekularen Protonenverhältnis der Signalgruppen unterscheiden. Als Modell-System ist hier eine Lösung bestehend aus den drei Stellungsisomeren o-, m- und p-Xylol unter Zusatz des Konstitutionsisomeren Ethylbenzol untersucht worden (Abbildung 5.17).

Abbildung 5.17: Strukturformeln der drei Stellungsisomeren o-, m- und p-Xylol und des Konstitutionsisomeren Ethylbenzols.

Die Abbildung 5.18 zeigt das 1H-NMR-Spektrum einer Lösung, die 61,2 mg Ethylbenzol, 148,0 mg p-Xylol, 92,6 mg m-Xylol und 65,6 mg o-Xylol enthält. Während die aliphatischen Signale des Ethylbenzols einzeln ausgewertet werden können, ist dies bei den übrigen Signalen wegen der Überlagerung der aromatischen Signale aller vier Komponenten und der aliphatischen Signale der drei Xylole (die eindeutige qualitative Zuordnung der Signale erfolgte mittels Handversuchen) nicht möglich.

Abbildung 5.18: 1H-NMR-Spektrum (400 MHz) der Xylole (o, m und p). Abszisse und Ordinate sind zu besseren Darstellung unterbrochen worden.

Aufgrund der identischen Verhältnisse zwischen aromatischer und aliphatischer Protonenan­zahl der drei Xylole ist die Bestimmung mittels Gleichungssystems hier nicht möglich. Die Auswertung der aliphatischen CH3-Signale mittels WinFit lieferte erheblich abweichende Analysenwerte (relative Abweichungen von bis zu 4 % hinsichtlich der gravimetrischen Referenzwerten). In den folgenden drei Kapiteln werden Versuche zur Trennung der aliphatischen Signale mittels Lösungsmittelwechsel, Verschiebungsreagenz und größerem Magnetfeld diskutiert.


[Seite 58↓]

5.4.3.1  Einfluss des Lösungsmittels

Wechselwirkungen zwischen Lösungsmittel und gelösten Molekülen führen häufig zu Signal­verschiebungen im Spektrum [16]. Zum Erhalt möglichst extremer Lösungsmitteleffekte wurde die Xylol-Ethylbenzol-Lösung mit unpolaren (CCl4 und CDCl3) sowie mit einem Lö­sungsmittel (C6D6) verdünnt, das einen starken Anisotropie-Effekt bewirkt. Die in der Tabelle 5.19 dargestellten Signal-Lagen der aliphatischen Signale zeigen zwischen den beiden unpolaren Lösungsmitteln zu vernachlässigende Unterschiede auf. Hingegen veränderte sich beim Benzol-d6 neben der absoluten Lage aller Signale um ca. 0,2 ppm Richtung Tieffeld auch signifikant die Signalabstände untereinander, so dass hier eine vollständige Überlagerung der m- und p-Xylol-Signale auftrat.

Tabelle 5.19: Einfluss des Lösungsmittels auf die Lagen aliphatischer Signale der Xylole im Spektrum.

Lösungsmittel

Signal-Lage in ppm

Signalabstand zum p-Xylol in ppm

o-Xylol

m-Xylol

p-Xylol

o-Xylol

m-Xylol

CDCl3

2,29

2,35

2,34

0,05

0,01

CCl4

2,30

2,36

2,35

0,05

0,01

C6D6

2,03

2,14

2,14

0,11

0

Der Wechsel von einem unpolaren zu einem Lösungsmittel, welches einen starken Anisotropie-Effekt bewirkte, führte zur einer insgesamt schlechteren Konstellation der Signal-Lagen im Spektrum.

5.4.3.2 Einsatz von Verschiebungsreagenzien

Die Anwendung von Verschiebungsreagenzien (Lanthaniden-Komplexe) ist in der qualitati­ven NMR-Spektroskopie ein gängiges Verfahren zur Vereinfachung von Spektren mit überla­gerten Signalen und geht auf Hinckley [75] zurück. Das Fehlen von Donor-Atomen wie z.B. Sauerstoff oder Stickstoff bei dem hier betrachteten Modell-System verhindert die Bildung des notwendigen Komplexes.

Abbildung 5.19: Schematische Darstellung der Bindung des Silber-Lanthaniden-Komplexes an ein Alken (entnommen aus [77]).


[Seite 59↓]

Erst durch die zusätzliche Verwendung von Silbersalzen war es Evans et al. [76] gelungen, an Alkenen paramagnetische Shifts zu bewirken. Die Abbildung 5.19 gibt schematisch die Koordinierung des Silber-Lanthaniden-Komplexes an eine π–Bindung wieder. Dambska und Janowski setzen erfolgreich Silbertrifluoracetat (CF3CO2Ag) und Tris-[1,1,1,2,2,3,3-heptafluoro-7,7-dimethyl-4,6-oktandionat]-Europium (Eu(fod)3) zur quantitativen Analyse von m- und p-Xylol in Tetrachlorkohlenstoff ein [78]. Um den Einfluss von Shiftreagenzien (in Abhängigkeit vom Stoffmengenverhältnis Shiftreagenz zu Xylol) auf ein Gemisch aus den drei stellungsisomeren Xylolen zu untersuchen, wurden entsprechend den Vorgaben von Dambska und Janowski im molaren Verhältnis 1:1 angesetzte Lösungen aus dem jeweiligen Shiftreagenz (Eu(fod)3 bzw. Pr(fod)3) und Silbertrifluoracetat mit der Xylol-Lösung in molaren Verhältnissen von 0,1:1, 0,25:1, 0,5:1, 1:1 und 2:1 versetzt, zwei Tage stehen gelassen, filtriert und die Filtrate in NMR-Röhrchen gemessen. Es zeigte sich, dass der tieffeld­verschiebende Einfluss des Eu(fod)3 sowie der hochfeldverschiebende Einfluss des Pr(fod)3 sich auf die aliphatischen Protonen des o-Xylols am stärksten und auf die des p-Xylols am schwächsten ausübt. Die dadurch erhaltenden Signalabstände der drei aliphatischen CH3-Signale zueinander sind in Tabelle 5.20 erfasst.

Tabelle 5.20: Einfluss des Verschiebungsreagenz auf die Lage der aliphatischen Signale der Xylole im Spektrum in Abhängigkeit vom Stoffmengenverhältnis Shiftreagenz zu Analyt.

Shiftreagenz: Eu(fod)3

Shiftreagenz: Pr(fod)3

Signalabstand o- zu p-Xylol

Signalabstand m- zu p-Xylol

Signalabstand o- zu p-Xylol

Signalabstand m- zu p-Xylol

in mol mol-1

in ppm

in Hz

in ppm

in Hz

in ppm

in Hz

in ppm

in Hz

---

0,05

18

0,01

3,2

0,05

18

0,01

3,2

0,1 : 1

0,01

4,0

0,02

9,4

0,13

51

0,03

11

0,25 : 1

0,02

5,9

0,04

14

0,19

77

0,06

23

0,5 :1

0,04

15

0,05

18

0,19

75

0,06

23

1 : 1

0,06

25

0,06

25

0,25

99

0,08

31

2 : 1

0,07

27

0,07

27

0,21

85

0,07

29

Pr(fod)3 erwies sich hierbei als das bessere Verschiebungsreagenz. Die größten Signal­abstände wurden bei einem molaren Verhältnis zwischen 1:1 und 2:1 (Shiftreagenz zu Xylol) erreicht. Dies widerspricht der Arbeit von Dambska und Janowski [78], die ein Stoff­mengenverhältnis von 0,2 bis 0,25zu1 (Eu(fod)3 zu Xylol ) als optimal zur Trennung der aliphatischen CH3-Signale von m- und p-Xylol beschrieben. Die erreichten Abstände sind für qualitative Unterscheidung ausreichend, nicht jedoch für quantitative Analysen, da bei einer Halbwertsbreite von ca. 1,3Hz der aliphatischen Signale ein Integrationsfaktor von 64 nicht zur einzelnen Auswertung der Signale eingesetzt werden kann. Des Weiteren wäre der Einfluss der aufwendigen Probenpräparation (Filtration) auf die Messunsicherheit des Verfahrens festzustellen.


[Seite 60↓]

Eine quantitative Auswertung der drei Xylol-Isomere unter den in dieser Arbeit vorgege­benen Bedingungen (Integrationsfaktor: 64) ist also auch mit Verschiebungsreagenzien nicht möglich.

5.4.3.3 Größere Magnetfeldstärke

Eine weitere Möglichkeit, die Abstände (in Hz) zwischen zwei Signalen zu vergrößern, ist die Messung bei höherem Magnetfeld. Hierzu wurde bei der Firma Bruker die Xylol-Lösung in CDCl3 an einem 18,8 T NMR-Spektrometer (1H: 800 MHz) aufgenommen. Der erwartete Vorteil durch die größeren Abstände der Signale (in Hz) wegen der doppelten Messfrequenz wurde angesichts der schlechteren Auflösung (doppelt so breite Signale) kompensiert (Tabelle 5.21).

Tabelle 5.21: Vergleich der Signalabstände und Halbwertsbreiten der Xylol-Isomere bei 400 MHz und 800 MHz NMR-Spektrometern.

 

400 MHz (BAM)

800 MHz (Bruker)

Signalabstand zum p-Xylol

Halbwerts-breite in Hz

Signalabstand zum p-Xylol

Halbwerts-breite in Hz

in ppm

in Hz

in ppm

in Hz

o-Xylol

0,05

19

1,0

0,04

35

1,8

m-Xylol

0,008

3,2

1,2

0,009

6,9

2,4

p-Xylol

1,1

1,8

Insgesamt stellte sich bei den Untersuchungen heraus, dass mit der 1H-SP-NMR eine quantitative Auswertung der drei Xylol-Isomere unter den in dieser Arbeit geforderten Auswertebedingungen (Integrationsfaktor von 64) nicht möglich ist. Auf den Einsatz der 13C-NMR zur Bestimmung der Reinheit von Xylolen wird in Kapitel 6.2.1 eingegangen.

5.5 Unsicherheitsbudget

Das Unsicherheitsbudget enthält bei der Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen wegen der einfachen Probenpräparation nur einen Unsicherheitsbeitrag, das Verhältnis der beiden Intensitätswerte, dessen Unsicherheit sich aus den Einzelmessungen nach Gleichung (4.1) ableitet. Anders sieht es bei der Analyse von Stoffmengenanteile von mindestens drei Kom­ponenten aus. Hierbei gehen nach Gleichung (3.12) die Intensitätswerte aller auszuwerten­den Substanzen in das Analysenergebnis einer Komponente ein. Die Korrelation zwischen diesen Ausgangsgrößen wurde bereits im Rahmen des nationalen Ringversuches NMR-1 nachgewiesen [14]. Der GUM schreibt bei korrelierenden Ausgangsgrößen vor, zusätzlich zum Ergebnis die Kovarianzmatrix oder die Matrix der Korrelationskoeffizienten mitanzu­geben [11, Kapitel 7.2.5]. Letztere wird für m Komponenten in folgender Form angegeben:


[Seite 61↓]

.

 

(5.8)

Hierbei gibt ri,j die Korrelation zwischen der Komponente i und der Komponente j wieder. Berechnet werden diese, indem die Kovarianz durch die jeweiligen Standardun­sicherheiten der beiden Komponenten dividiert wird:

.

 

(5.9)

Die Kovarianz wiederum berechnet sich wie folgt:

.

 

(5.10)

Der Korrelationskoeffizient ist dimensionslos und nimmt nur Werte zwischen +1 und -1 an. Hierbei gibt ein Betrag von eins eine streng lineare Abhängigkeit an. Bei positiven Werten liegt eine gleichgesinnte, bei negativen eine entgegengesinnte Korrelation vor. Im Falle von |ri,j | < 0,1 kann die Korrelation zwischen den beiden Komponenten vernachlässigt werden. Dies bedeutet aber nicht, dass sie voneinander unabhängig sind. Als Beispiel wurde aus den eigenen Messdaten von NMR-2 die Korrelationsmatrix berechnet:

.

 

(5.11)

Aus dieser Korrelationsmatrix können die Korrelation zwischen den einzelnen Komponenten in ihrer Richtung und Stärke entnommen werden. So zeigte sich, dass Dur zu allen anderen Komponenten stark und entgegengesetzt korreliert. Dagegen treten beim ETS zu Par und D4 nur sehr schwache, gleichgerichtete Korrelationen auf.

5.6 Zusammenfassung

Anhand von Modell-Lösungen wurde systematisch die Messunsicherheit der Analyse von Stoffmengengemischen (Stoffmengenverhältnis, -anteil) für mögliche Konstellationen von einzelnen und überlagerten Analytensignale im Spektrum untersucht.


[Seite 62↓]

Die Messunsicherheit der Methode bei einzeln zu integrierenden Signalen (einer Fünf-Komponenten-Lösung) wurde mittels eines nationalen und eines internationalen Ringversuches (NMR-2, CCQM-P3) unter Vorgabe der wichtigsten Parameter für Aufnahme, Prozessierung und Auswertung der Spektren in einer Arbeitsanweisung ermittelt. Die Fehleranalyse der Ergebnisse der Ringversuche zeigte, dass die Validierung der wichtigsten Parameter zur Aufnahme und Auswertung des Spektrums nicht ausreichend war, und machte die Ermittlung von weiteren Einflussgrößen notwendig. Folgende Erkenntnisse wurden dabei erzielt:

Zusammenfassend sind daher folgende wichtige Bedingungen zur Aufnahme und Auswer­tung quantitativer 1H-SP-NMR-Spektren einzuhalten, um eine geringe Messunsicherheit zu erzielen: Messungen sind nur mit Probenköpfen durchzuführen, die auch für die 1H-NMR geeignet sind. Die Zeitsequenz bei der Datenakkumulation sollte mindestens 7/3 mal der längsten T1 -Zeit aller auszuwertenden Signale bei Anregung mit einem 30° Impuls betragen, und die Anzahl der Datenakkumulationen sollte ausreichend sein, um für alle auszuwertende Signale ein S/N ≥ 150 zu erreichen. Die Filtergrenze ist dabei großzügig zu wählen (30 ppm und mehr stellen heute kein Problem für NMR-Spektrometer dar). Der aufgenommene FID [Seite 63↓]wird entsprechend durch Zero filling erweitert (um alle Signale mit mindestens fünf Punkten oberhalb der Halbwertsbreite im Spektrum darzustellen) und mit „em (0,3 Hz)“ prozessiert. Die Grundlinien- und Phasenkorrekturen des Spektrums sind manuell und sorgfältig zu handhaben. Ebenso sorgfältig ist die Integration (Auswertung) des Spektrums durch den Operator auszuführen. Neben konstanten Integrationsfaktoren ≥ 64 ist bei der Setzung der Integrationsgrenzen auf die vollständige Erfassung aller im Integrationsbereich liegender Signale zu achten. Überlagerte Einzelsignale sind mit einem Integral zu erfassen. Gegebe­nenfalls ist hierbei der Integrationsbereich zu erweitern. Bei sorgfältiger Korrektur der Grundlinie und Phasen ist eine Korrektur des Integralzuges nicht notwendig. Die Korrektur und Auswertung des Spektrums stellen allgemein hohe Anforderungen an den Operator, die sich nicht objektiv in einer Arbeitsanweisung erfassen lassen.

Bei Einhaltung dieser Arbeitsanweisung wurde die relative Messunsicherheit (k=2; p=95%) für die beiden hier untersuchten Auswertungsmethoden (Stoffmengenverhältnisse, -anteile) anhand der Teilnehmerergebnisse des nationalen Ringversuchs NMR-2 und eigener Messungen an verschiedenen NMR-Spektrometern zu unter 1,5% bestimmt. Die hierbei zu analysierende minimale Stoffmengenkonzentration betrug 0,3 mmol l-1 (D4 bei NMR-2).

Die Messunsicherheit (k=2, p=95%) der Methode bei Auswertung von Spektren mit über­lagerten Signale wurden nach der obigen Arbeitsanweisung an Modell-Lösungen untersucht.

Die hierbei gewonnenen Erkenntnisse sind generell auf Stoffsysteme mit ähnlichen Spektrenbildern übertragbar.


Fußnoten und Endnoten

4 Ausschluss der Institute 1 bis 11 und 34.

5 http://qobrue.usc.es/jsgroup/MestRe-C/MestRe-C.html

6 Phasenkorrektur erfolgte durch Eingabe der Werte über die Tastatur auf 0,1° genau.

7 Phasenkorrektur erfolgte über Drehscheibe auf 1° genau.

8 Manuelle Phasen- und Grundlinienkorrektur erfolgte unter XWinNMR.



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24.02.2005