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Gehaltsanalyse

Die Bestimmung des Gehaltes oder der Konzentration einer Komponente in einer Matrix gehört ebenso zu den Schwerpunkten der Analytik wie die Reinheitsbestimmung. Publikatio­nen aus Bereichen wie z.B. der Pharmazie [51, 92, 93, 94, 39], der Agrar- [95, 96] und der Werkstofftechnik [97] zeigen, dass die quantitative NMR-Spektroskopie auch hier als analy­tisches Verfahren eingesetzt werden kann. Die in diesen Arbeiten angegebenen Präzisionen beruhen ausschließlich auf den experimentell ermittelten Standardabweichungen. Es sollte daher an Modell- und Referenzlösungen im Hinblick auf den internationalen Ringversuch CCQM-P35 ein Verfahren zur Gehaltsanalyse mit der NMR-Spektroskopie unter Berücksich­tigung eines aufzustellenden Unsicherheitsbudgets erarbeitet werden

7.1  3-Trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsäure-Natriumsalz
in D2O

Abbildung 7.1: Struktur des 3-Trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsäure-Natriumsalz.

3-Trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsäure-Natriumsalz (TSP) (Abbildung 7.1) ist in der qualitativen 1H-NMR-Spektroskopie ein gängiger Verschiebungsstandard in wässrigen Lösungen [16]. In mehreren Publikationen [93, 94, 39, 98] wurde es angesichts seiner optimalen Lage im Spektrum (0ppm) und seines schmalen Singulett-Signals für quantitative Analysen als ein geeigneter Standard beschrieben. Wegen seiner hygroskopischen Eigen­schaft kann es jedoch nur als Standardlösung eingesetzt werden. Daher wurde für die Ethanol-Gehaltsanalyse im folgenden Kapitel 7.2 eine Standardlösung mit einem Gehalt von (9,125 ± 0,038) mg g-1 TSP (Fa. Merck AG, Reinheitsgrad >99%) D2O angesetzt, deren genauer TSP-Gehalt zur weiteren Verwendung als internem Standard auf das ZRM Benzoesäure zurückgeführt werden sollte.

7.1.1 Probenpräparation und Spektrenaufnahme

Die allgemeine Probenpräparation des Verfahrens der Gehaltsanalyse mit der NMR-Spektroskopie entspricht dem im Kapitel 6.1.1.1 beschriebenen allgemeinen Präparations­verfahren der Reinheitsbestimmung, wobei anstelle des Analyten die zu analysierende Ma­trix eingewogen wird. Die Spektrenaufnahme erfolgte mit den in der Tabelle 5.1 optimierten Parametern zur quantitativen Analyse. Zur Gehaltsanalyse des TSP wurden drei Aliquots, bestehend aus der TSP-Lösung und dem ZRM Benzoesäure als internem Standard, eingewogen (Tabelle 7.1) und 0,4ml DMSO-d6 zum vollständigen Lösen der Benzoesäure hinzugegeben. Die Spektrenaufnahme erfolgte entsprechend den bestimmten T1-Relaxationszeiten­[Seite 89↓] T1 (ZRM)<4s und T1 (TSP)<2,5s mit einem Relaxationsintervall von D1=30s. Die Akkumulation von 64 Scans führte zu einem ausreichenden S/N von ungefähr 7000.

Tabelle 7.1: Einwaagen der drei Aliquots zur Gehaltsanalyse der TSP-Standardlösung.

 

Aliquot A

Aliquot B

Aliquot C

mTSP-Lösung in mg

982,8

990,9

1049

mBenzoesäure in mg

31,15

29,42

31,70

7.1.2 Auswertung

Die Prozessierung und Auswertung der Spektren erfolgte nach der im Kapitel 5.1.2 beschrie­benen Arbeitsanweisung. Das in Abbildung 7.2 dargestellte 1H-NMR-Spektrum gibt bei
0 ppm das Signal vom TSP sowie bei 7,54ppm (H2), 7,65ppm (H) und 7,99ppm (H2) die aromatischen Protonensignale der Benzoesäure wieder.

Abbildung 7.2: 1H-NMR-Spektrum der Gehaltsanalyse des TSP mit Benzoesäure als internem Standard.

Die Auswertungen der Spektren (mit einem Integrationsfaktor von 500 bei Erfassung der drei Signale der Benzoesäure mit einem Integral) lieferten die in der Tabelle 7.2 aufgeführten, nach Gleichung (3.14) berechneten TSP-Gehalte.

Tabelle 7.2: Ergebnisse der TSP-Gehaltsanalyse der TSP-Standardlösung.

 

Gehalt in mgg-1

Messung 1

Messung 2

Messung 3

Messung 4

Aliquot A

9,116

9,131

9,081

9,106

Aliquot B

9,084

9,135

9,097

9,149

Aliquot C

9,160

9,113

9,046

9,089


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Aus den insgesamt zwölf Messungen wurde der Schätzwert des TSP-Gehalts der Standardlösung zu 9,109mgg-1 mit einer geringen Standardunsicherheit von ±0,010mgg-1 bestimmt, die wie im Kapitel 6.1.1.2 auf das gute S/N von über 7000 für alle Signale und die großen Integrationsbereiche zurückzuführen war.

Die von Larive beschriebene zeitliche Konzentrationsabnahme vom TSP im wässrigen Me­dium durch Adsorption an den Glaswänden einer Kapillare [49] konnte nur partiell bestätigt werden. In den NMR-Messröhrchen wurden nach fünf Wochen beim Aliquot A der TSP-Gehalt mit einer Richtigkeit von besser als 99% wiedergegeben, hingegen beim Aliquot C ein um 2 % relativ und beim Aliquot B ein um 6% relativ geringerer TSP-Gehalt bestimmt. Der in der Stammlösung (aufbewahrt in einer 200ml Schliffflasche) bei einer erneuten Einwaage von 31,79mg ZRM und 1010,4mg der TSP-Lösung ermittelte TSP-Gehalt von 9,17mgg-1 bestätigte die Stabilität der Stammlösung über einen Zeitraum von zwei Monaten. Ursache für die partiell auftretenden zeitlichen Konzentrationsabnahmen des TSP ist das Verhältnis vom Volumen der Lösung zur benetzten Glasoberfläche. Je kleiner dieses Verhältnis ist (z.B. in der Kapillare), umso mehr TSP kann prozentual aus der Lösung adsorbiert werden. Zur Aufbewahrung einer TSP-Standardlösung ist daher auf ein großes Lösungsvolumen bei gleichzeitiger geringer Benetzung der Glasoberfläche zu achten.

7.1.3  Unsicherheitsbudget

In das allgemeine Unsicherheitsbudget für die Gehaltsanalyse mit der NMR-Spektroskopie gehen gemäß der Messgleichung (3.14) die Unsicherheit der Integration (Intensitätsverhält­nis) nach Gleichung (4.1), die Unsicherheiten der Molmassen (Gleichung (4.6)) und Einwaa­gen (Gleichung (4.9)) von Analyt und Standard sowie die Unsicherheit des Reinheitsfaktors des Standards ein. Die kombinierte Unsicherheit berechnet sich demzufolge als Wurzel aus der Quadratsumme der Einzelunsicherheitsbeiträge nach Gleichung (4.13). In der Tabelle 7.3 wurden die einzelnen Unsicherheitsbeiträge sowie die daraus berechnete kombinierte Messunsicherheit für die Gehaltsanalyse der TSP-Standardlösung aufgeführt.

Tabelle 7.3: Unsicherheitsbudget des Verfahrens der Gehaltsanalyse des TSP mit ZRM Benzoesäure als internem Standard.

Unsicherheitsbeitrag

Integration

9,109

0,010

0,11 %

11

Molmasse Benzoesäure

122,121gmol-1

0,006gmol-1

0,005 %

50

Molmasse TSP

172,269gmol-1

0,005gmol-1

0,003 %

50

Einwaage Benzoesäure

31,15 mg

0,03 mg

0,10 %

1000

Einwaage TSP-Lösung

982,8 mg

0,2 mg

0,02 %

1000

Reinheitsfaktor Benzoesäure

0,999958 g g-1

0,000012 g g-1

0,0012 %

11

Komb. Standardunsicherheit uc(y)

 

0,014 mg g-1

0,15 %

37


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Analog zur Reinheitsbestimmung beeinflussten auch hier hauptsächlich die Unsicherheiten der beiden Einwaagen und der Integration die kombinierte Standardunsicherheit. Entsprechend dem effektiven Freiheitsgrad von 37 wurde mit einem Erweiterungsfaktor von k = 2 bei einem Konfidenzniveau von 95 % eine erweiterte Unsicherheit von U = ± 0,3 mg g-1 ermittelt.

Aufgrund der Rückführung des Ergebnisses von der Gehaltsanalyse auf ein ZRM (äquivalent zur Reinheitsbestimmung der Maleinsäure im Kapitel 6.1.1) kann die TSP-Standardlösung für weitere quantitative Analysen als ein auf ein ZRM zurückgeführter Standard eingesetzt werden. Diese Standardlösung wurde den Teilnehmern des Ringversuches CCQM-P35 (Kapitel 7.3) als internem Standard zur Rückführung des Messwertes zugestellt.

7.1.4 Messunsicherheit des Verfahrens

Zur Bestimmung der Messunsicherheit des Verfahrens wurde der Analysenwert auf den ein­gewogenen TSP-Gehalt referenziert. Der Analysenwert und dessen kombinierte Unsicher­heit, die Abweichung zum Referenzwert, deren Unsicherheit sowie die nach Gleichung 4.15 daraus berechnete relative Messunsicherheit (k=2; p=95%) von 1,0 % sind in Tabelle 7.4 dargestellt. Die Abweichung des Analysenwertes vom Referenzwert erwies sich als geringfügig.

Tabelle 7.4: Fehleranalyse und Bestimmung der relativen Messunsicherheit (k=2; p=95%) des Verfahrens der Gehaltsanalyse mit der 1H-NMR am Beispiel des TSP-Gehalts mit ZRM Benzoesäure als internem Standard.

xRef

in mg g-1

in mg g-1


in mg g-1

|Δxi|

in mg g-1

2u(Δxi)

in mg g-1

rel. U in %

(k=2; p=95%)

9,125 ± 0,038

9,109

0,014

0,016

0,081

1,0

Zusammenfassend wurde am Modell-System einer wässrigen TSP-Lösung (TSP in D2O) mit Benzoesäure als internem Standard die Messunsicherheit des Verfahrens der Gehaltsbe­stimmung untersucht. Der zu analysierende Stoffmengengehalt lag bei ungefähr 50 µmol g-1. Wie auch bereits im Kapitel 6.1.1 führte die Auswertung der Spektren bei einem S/N von über 7000 und einem Integrationsfaktor von 500 zu einer relativen Messunsicherheit des Verfahrens (k=2; p=95%) von 1 %. TSP ist aufgrund seiner Lage im Spektrum und seines schmalen Singulett-Signals ein geeigneter interner Standard, sofern er als eine Lösung bekannten Gehalts eingesetzt wird. Die Stabilität dieser Lösung kann über einen längeren Zeitraum gesichert werden, wenn bei der Aufbewahrung auf ein großes Verhältnis zwischen Volumen und benetzter Glasoberfläche geachtet wird. Durch die Rückführung mittel des ZRM Benzoesäure steht er somit als ein auf ein ZRM zurückgeführter Standard zur Verfügung.


[Seite 92↓]

7.2  Ethanol in Wasser (forensische Chemie)

Seit 2001 werden an der BAM in der Fachgruppe I.2 forensische Ethanol-Referenzlösungen (Ethanol-Gehalt um die 0,1%) für Atemalkohol-Messungen hergestellt und mit einem Referenzverfahren unter Einsatz der Gas-Chromatographie (GC) kontrolliert [99].

Die NMR-Spektroskopie sollte vom Prinzip her die Analyse der Ethanol-Gehaltsbestimmung solcher Referenzlösungen schnell und einfach lösen können. Da in der Literatur bisher kein solches Analysenverfahren mit der quantitativen NMR-Spektroskopie beschrieben wurde, sollte erstmals ein Verfahren entwickelt werden. So war für die Vorbereitung von Ringversuchen auf nationaler (NMR-3) und internationaler Ebene (CCQM-P35) für die Ermittlung der metrologischen Güte des Verfahrens (vom Labor I.31 organisiert) eine Arbeitsanweisung zu erarbeiten, nach der an jedem NMR-Spektrometer die Gehaltsanalysen solcher Referenzlösungen mit einem auf SI-Einheiten zurückgeführten Unsicherheitsbudget bearbeitet werden können. Bei einer ausreichenden Messunsicherheit dieses Verfahrens könnte die quantitative NMR in dieses Referenzverfahren eingegliedert werden.

Die in dieser Arbeit dargestellte Reihenfolge der Ergebnisse entspricht nicht dem zeitlichen Ablauf. Erfahrungen mit dem Umgang von wässrigen Ethanollösungen sowie mit NMR-Wasserunterdrückungstechniken waren im Labor nicht vorhanden und mussten schrittweise erworben werden.

7.2.1  Direkte Auswertung ohne Standard

In dem speziellen Fall, dass die zu untersuchende Lösung aus genau zwei Komponenten besteht, kann der Gehalt direkt aus dem Verhältnis der Intensitäten der beiden auszuwertenden Signalen berechnet werden.

Abbildung 7.3: 1H-NMR-Spektrum der Ethanol-Gehaltsbestimmung aus dem Verhältnis der Intensitäten des Ethanol-Signals (CH3) und des Wasser-Signals.


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Für das hier betrachtete System (Ethanol und entionisiertes Wasser, Abbildung 7.3) wurde aus den Intensitäten des Wassersignals (4,8 ppm) und des CH3-Ethanolsignals (1,18 ppm) der Ethanol-Gehalt nach folgender Gleichung bestimmt:

 

(7.1)

wobei der Term das mit dem Wassersignal überlagernde OH-Signal des Ethanols berücksichtigt. Die quantitative Aufnahme und Auswertung nach der im Kapitel 5.1.2 beschriebenen Arbeitsanweisung (D1=30s, ns=1810, Integrationsfaktor 64) führte zu einem hinsichtlich des GC-Referenzwertes um 4 % zu hoch liegenden Ethanol-Gehalt von 1,36mgg-1. Das S/N von 1800 für das CH3-Ethanolsignal reichte für eine präzise Auswertung aus. Hingegen kann die enorme Verbreiterung des Wassersignals durch Radiation Damping diese Abweichung des Analysenergebnisses verursacht haben. Wie im Kapitel 3.2.1 beschrieben, bewirken von einander sich stark unterscheidende Halbwerts­breiten der auszuwertenden Signale einen unterschiedlichen Grad an Nichterfassung der auftretenden Emission während der Aufnahmeverzögerung (Pulse-Delay, Totzeit). Dieses führt zu signifikant abweichenden Analysenergebnissen [24].

7.2.2 Auswahl an internen Standards

Wie die Analyse im Kapitel 7.2.1 zeigte, war eine genaue Gehaltsbestimmung ohne Standard nicht möglich. Es sollte daher der Ethanol-Gehalt über die Rückführung auf einen internen Standard ermittelt werden. Die beiden folgen­den Standards wurden ausgewählt:


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Beide Standards wurden bereits im Rahmen dieser Arbeit auf das ZRM Benzoesäure zurückgeführt (TSP-Standardlösung: Kapitel 7.1; Maleinsäure: Kapitel 6.1.1) und können infolgedessen als auf ein ZRM zurückgeführte Standards eingesetzt werden. Somit ist die Rückführung der Analysenergebnisse der Ethanol-Gehaltsbestimmung auf die SI-Einheiten gegeben.

7.2.3 Single-Puls-Experiment

Zur Analyse des Ethanol-Gehalts über einen internen Standard wurden 153,9 mg TSP-Standardlösung zu 1038,5mg einer Ethanol-Referenzlösung eingewogen. Die quantitative Aufnahme und Auswertung erfolgte wie bereits im Kapitel 7.2 beschrieben, jedoch mit einer Akkumulation von 128 Scans. Das so erhaltene Spektrum erwies sich als auswertbar und der ermittelte Ethanol-Gehalt von 1,026mgg-1 wich vom gravimetrischen Referenzwert von (1,032±0,001)mgg-1 um weniger als 1% ab. Aufgrund des großen Signalhöhen-Unterschieds zwischen dem Wassersignal und den Signalen des Ethanols und des TSP kommt es zu einer schlechten Ausnutzung des dynamischen Bereiches für die auszuwertenden Signale. Somit könnten NMR-Geräte mit einer geringen Wortlänge des ADCs (z.B. 8 Bit) Probleme bei der Intensitätswiedergabe dieser Signale haben. Es wurden daher Methoden zur Verbesserung des dynamischen Bereiches untersucht.

7.2.4  Wasser-Unterdrückungsmethoden (Multi-Puls-Experimente)

Um die vertikale Auflösung der auszuwertenden Signale zu verbessern, war die Reduzie­rung des Wassersignal notwendig. Hierzu wurden drei ausgewählte Unterdrückungs-Sequenzen, deren Grundlagen bereits im Kapitel 3.3 beschrieben wurden,

auf ihre quantitativen Eigenschaften hin untersucht und miteinander verglichen.

7.2.4.1 Presaturation

Die Vorsättigungstechnik (Presaturation) enthält von den drei ausgewählten Unter­drückungsmethoden die einfachste Multi-Pulse (MP)-Sequenz, die im Vergleich zur SP-Technik nur einen weiteren Impuls, den der Vorsättigung, enthält. Aufbauend auf der Validierung der SP-Methode war dieser Vorsättigungsimpuls zu optimieren.


[Seite 95↓]

Das von Bruker mitgelieferte Pulsprogramm „zgpr“ ist für qualitative Messungen ausgelegt (Sättigung während des gesamten Relaxationsintervalls). Für quantitative Messungen wurde in einer modifizieren Pulssequenz („zgpr.fm“) die Sättigungsdauer vom Relaxationsintervall getrennt (das Bruker- und das modifizierte Pulsprogramm sind im Kapitel 9 aufgeführt). Bei dieser routinemäßig eingesetzten cw-Presaturation-Technik erfolgt die Einstrahlung des Sättigungs- und Anregungsimpuls aus der gleichen Richtung (p1(x) p2(x)). Zum Vergleich wurde eine entsprechende Presaturation-Sequenz (phase-gated, pg) untersucht, bei der die beiden Impulse um 90° versetzt (p1(x) p2(y)) eingestrahlt werden („zgpr.jp“). Mao et al. [73] beschreibt bei Anwendung dieser pg-Presaturation-Technik im Gegensatz zur cw-Presaturation eine besseren Sättigung des Wassersignals.

7.2.4.1.1  Optimierung des Sättigungspulses

Die Optimierung des Sättigungsimpulses erfolgte an zwei Modell-Lösungen, bestehend aus Ethanol in D2O mit TSP als Referenzsignal. Hierbei wurden die Sättigungsstärke und -länge jeweils einzeln variiert. Die Aufnahme und Auswertung der Spektren erfolgte nach der Arbeitsanweisung im Kapitel 5.1.2 (D1=60s, ns=32, Integrationsfaktor=200).

Zur Optimierung der Sättigungsstärke wurde diese ausgehend von einer Dämpfung von
66 dB in 6 dB Schritten bis 42 dB variiert. Die Sättigungsdauer von 1,5 s wurde dabei konstant gehalten. Die aus jeweils fünf Messungen ermittelten Schätzwerte der Intensitäts­verhältnisse zwischen CH2-Ethanol- und TSP-Signal bzw. CH3-Ethanol- und TSP-Signal sowie deren Standardunsicherheiten sind für die entsprechenden Leistungen des Sätti­gungsimpulses in der Tabelle 7.5 aufgelistet.

Tabelle 7.5: Variation des Impulsleistung des Sättigungsimpulses beim Presaturation. Auswertung des Intensitätsverhältnisse zwischen den Ethanolsignalen und dem TSP-Signal.

 

SP (90°)

Impulsleistung des Sättigungspulses

66 dB

(28 Hz)

60 dB

(49 Hz)

54 dB

(105 Hz)

48 dB

(213 Hz)

42 dB

(426 Hz)

CH2-Ethanol

ICH2 /ITSP

9,054

8,982

8,847

8,56

7,50

5,04

u(x)

0,027

0,018

0,027

0,04

0,05

0,05

CH3-Ethanol

ICH3 /ITSP

13,585

13,56

13,523

13,55

13,51

13,10

u(x)

0,027

0,04

0,027

0,05

0,05

0,08

Aus dieser Tabelle ist deutlich die mit zunehmender Sättigungsleistung stärker werdende Teilsättigung des CH2-Ethanolsignals erkennbar. Dass die Angabe der Impulsleistung in dB weder zwischen Bruker-Spektrometern (abhängig von der Gerätekonstellation) einheitlich noch zu NMR-Spektrometern der Hersteller Varian und Jeol eindeutig ist, war zu diesem Zeitpunkt der Arbeit im Labor nicht bekannt. Erst im Verlaufe der Auswertung des nationalen [Seite 96↓]Ringversuches NMR-3 (Kapitel 7.3.3) stellte sich dieses Problem heraus. Die Angabe der entsprechenden Anregungsbreite in Hz ist dagegen ein allgemeingültiger Parameter, aus dem an jedem NMR-Spektrometer die Sättigungsleistung ermittelt werden kann. Daher wurden zusätzlich zu den Impulsleistungen des hier eingesetzten NMR-Spektrometers die entsprechenden Anregungsbreiten des Vorsättigungsimpulses aufgeführt.

Zur Verdeutlichung des Einflusses der Sättigungsstärke auf die Intensitäten der Ethanol­signale wurden die ermittelten Intensitätsverhältnisse der jeweiligen Sättigungsleistung auf die der SP-90°-Messung referenziert und in Abbildung 7.4 dargestellt.

Abbildung 7.4: Abhängigkeit der partiellen Mitsättigung der beiden Ethanolsignale von der Stärke des Sättigungsimpulses bei Sättigung des Wassersignals mit Presaturation.

Dieses Diagramm gibt die partielle Intensitätssättigung des CH2- bzw. CH3-Ethanolsignals in Abhängigkeit von der Sättigungsstärke wieder. Die dabei eingezeichneten kombinierten Messunsicherheiten berechneten sich aus den Unsicherheitsbeiträgen der Referenzmes­sung (SP-90) u(xSP) und des Messwertes u(xi) nach folgender Gleichung:

.

 

(7.2)

Mit zunehmender Impulsleistung des Sättigungsimpulses stellte sich eine Verbreiterung des Sättigungsbereiches ein. Bereits ab einer Impulsstärke von 60 dB (49 Hz Anregungsbreite) wird das näher am Wassersignal liegende CH2-Ethanolsignal (Abstand von ca. 450 Hz) signifikant mitgesättigt. Das CH3-Signal erfährt aufgrund des größeren Abstands zum Wassersignal (ca. 1440 Hz) erst bei einer Sättigungsstärke von 42 dB (426 Hz Anregungsbreite) eine signifikante Mitsättigung. Die Intensität des CH2-Ethanolsignals wird bei dieser Leistung des Sättigungsimpulses bereits um fast 50 % reduziert.

Als optimaler Parameterwert für die Sättigungsstärke am 400MHz-Spektrometer (TXI-Messkopf) erwies sich eine Dämpfung von 66 dB, die einer Anregungsbreite des [Seite 97↓]Vorsättigungsimpulses von 20Hz bis 30Hz entspricht. Bei dieser Sättigungsleistung werden beide Signale des Ethanols, und damit auch die der beiden in dieser Arbeit betrachteten Standards, noch nicht beeinflusst.

Der zweite Parameter, die Sättigungsdauer, wurde bei einer Pulsstärke variiert, die einer Anregungsbreite von 40 Hz entspricht. Hier wurden dem SP-90°-Experiment – als Referenz­spektrum – Presaturation-Experimente mit Sättigungsimpulslängen von 1,5s, 5s, 10s und 60s gegenübergestellt. Zusätzlich wurde das Bruker-Presaturation-Pulsprogramm zgpr ausgetestet, bei dem zeitgleich zum Relaxationsintervall (D1 = 60 s) die Sättigung des Wassersignals erfolgt. Die Spektren wurden analog zur Optimierung der Impulsstärke aufgenommen und ausgewertet. In der Tabelle 7.6 sind die auf das TSP-Signal normierten Intensitäten des CH3-Ethanolsignals aufgeführt.

Tabelle 7.6: Variation der Länge des Sättigungsimpulses beim Presaturation. Auswertung des Intensitätsverhältnisse zwischen dem CH3-Ethanolsignal und dem TSP-Signal.

 

SP (90°)

Impulslänge des Sättigungspulses

1,5s

5 s

10 s

60 s

zgpr

(D1=60 s)

CH3-Ethanol

ICH3 /ITSP

2,430

2,434

2,483

2,525

2,554

2,551

u(x)

0,007

0,005

0,005

0,013

0,018

0,015

Die Darstellung in Abbildung 7.5, welche die relativen Signalintensitätsveränderung des beobachteten CH3-Ethanolsignals bezogen auf das SP-90°-Experiment wiedergibt, verdeut­licht die Abhängigkeit von der Sättigungsdauer.

Abbildung 7.5: Abhängigkeit der Signalintensitätsverstärkung des CH3-Ethanolsignals von der Länge des Sättigungsimpulses bei Sättigung des Wassersignals mit Presaturation


[Seite 98↓]

Die Unsicherheitsbalken geben die kombinierte Messunsicherheit, nach Gleichung (7.2) berechnet, wieder. Mit zunehmender Sättigungsdauer wurde hier eine stetig steigende Inten­sitätsverstärkung des CH3-Ethanolsignals beobachtet. Lediglich eine Vorsättigungsdauer von 1,5 s gibt die Intensität des CH3-Ethanolsignals im Vergleich zum Referenzspektrum richtig wieder. Die Einstrahlung des Sättigungsimpulses auf das Wassersignal, und somit auch auf das OH-Signal des Ethanols, induziert NOE-Effekte, die sich auf die anderen beiden Strukturgruppen des Ethanols auswirken. Aufgrund der gewinkelten Anordnung des Ethanols ist dabei ein positiver NOE-Effekt beim CH3-Ethanolsignal zu beobachten (Kapitel 3.4). Mit zunehmender Einstrahldauer werden diese intensiver. NOE-Differenzspektren an dieser Modell-Lösung bestätigten den positiven NOE-Effekt auf die CH3-Gruppe des Ethanols. Eine Sättigungsdauer von 1,5 s erwies sich als optimal.

Zusammenfassend ist als optimaler Parameter für die Sättigungslänge zur quantitativen Anwendung der 1H-Presaturation-Technik wurden bei der Optimierung des Vorsättigungs­impulses eine Dauer von 1,5 s bestimmt. Ferner ist die Sättigungsleistung so zu setzen, dass eine Anregungsbreite des Sättigungsimpulses von 20Hz bis 30Hz erreicht wird. Mit diesen Parametern sollten generell an jedem NMR-Spektrometer die Intensitäten des Ethanols und der beiden hier betrachteten Standards bei quantitativ aufgenommenen
1H-NMR-Spektren mit Presaturation des Wassersignals mit einer Richtigkeit von besser als 99 % wiedergeben werden. Stärkere und längere Sättigungsimpulse führten zur besseren Sättigung des Wassersignals, verfälschten aber die Intensitätswiedergabe der Ethanolsignale im Spektrum.

7.2.4.2  Watergate

Während die Presaturation-Technik an jeder NMR-Gerätekonstellation eingesetzt werden kann, benötigt die Watergate-Sequenz Gradiententechnik (z-Gradientenverstärker, Mess­kopf mit z-Gradient). Der in dieser Arbeit verwendete z-Gradientenverstärker leistete anstelle der üblichen 10A eine Leistung von 40A. Dadurch mussten die Gradientenstärken im Pulsprogramm („p3919gp“) von 20 % auf 5 % herabgesetzt werden. Als Messkopf wurde der 5 mm TXI mit z-Gradient verwendet. Die Messparameter wurden entsprechend den Vorga­ben des Pulsprogramms gesetzt; unter Berücksichtigung der Parameter aus Tabelle 5.1 zur quantitativen Aufnahme (D1=60s und ns=32). Das so aufgenommene 1H-NMR-Spektrum der Modell-Lösung zeigte ein Restwassersignal geringer Intensität. Dabei wurden die Multiplett-Signale des Ethanols im Gegensatz zum Singulett-Signal des TSP mit Phasenfehler dargestellt (Abbildung 7.6). Ursache für diese Phasenfehler ist die zeitliche Weiterentwicklung der Spin-Spin-Kopplungen, die nicht durch die Spin-Echo-Sequenz beein­flusst werden. Dabei wird die Mitte eines Multipletts phasenrichtig wiedergegeben und mit größer werdenden Abstand zur Multiplett-Mitte ein wachsender Phasenfehler aufgebaut. [Seite 99↓]Dieser Phasenfehler φ läst sich in Abhängigkeit der Sequenzlänge τ und der Kopplungs­konstante J nach folgender Gleichung berechnen:

.

 

( 7.3 )

Entsprechend dieser Gleichung wurde für die hier eingesetzte Watergate-Sequenz mit einer Sequenzlänge von τ=7,8ms und der Kopplungskonstante des ausgewerteten Signals von
J=7Hz ein Phasenfehler von 19,7° berechnet.

Abbildung 7.6: 1H-NMR-Spektrum einer forensischen Ethanol-Probe mit Watergate aufgenommen. Phasenfehler beim Triplett-Signal der CH3-Protonen des Ethanols.

7.2.4.2.1 Einfluss des optimalen Gradientenverhältnisses

Nach den Vorgaben von Bruker sollen im Pulsprogramm zwei Gradientenpulse gleicher Stärke verwendet werden. Mittels des Gradienten-Echo-Tests (Experiment 11.3 aus [37]) wurde das Verhältnis der beiden Gradientenstärken zu 5%:4,7% (maximale Intensitäts­wiedergabe) optimiert. Ein Einfluss auf das Analysenergebnis wurde dabei nicht festgestellt, da alle Signale in der gleichen Art und Weise davon betroffen waren.

7.2.4.2.2 Modifizierte Watergate-Sequenzen

Liu et al. [100] beschreibt den Einsatz zweier modifizierter Watergate-Sequenzen (W4 und W5), die im Vergleich zur ursprünglichen Watergate-Sequenz eine bessere Selektivität der Wasserunterdrückung aufweisen. Bei diesen beiden Sequenzen wird die aus drei Impuls-Paaren aufgebaute Spin-Echo-Sequenz durch Sequenzen mit vier (W4: 10,4°, 29,4°, 60,5° und 132,8°) bzw. fünf (W5: 7,8°, 18,5°, 37,2°, 70,4° und 134,2°) symmetrisch aufgebauten Impuls-Paaren ersetzt. Die demzufolge längeren Sequenzlängen τ (zwischen 90°-Anre­gungsimpuls und Beginn der Aufnahme) von 8,4ms bei der W4-Sequenz und 9,0ms bei der W5-Sequenz führten zu größeren Phasenfehlern φ bei den Multiplett-Signalen (21,2° bzw. [Seite 100↓]22,7° nach Gleichung 7.3). Diese sind in der Abbildung 7.7 am Beispiel des Triplett-Ethanolsignals der ursprünglichen Watergate-Sequenz gegenübergestellt.

Abbildung 7.7: Zunahme des Phasenfehlers beim Triplett-Signal des Ethanols in Abhän­gigkeit von der Sequenzlänge τ. W3 (Original-Watergate-Sequenz): τ = 7,8 ms; W4-Sequenz: τ = 8,4 ms; W5-Sequenz: τ = 9,0 ms.

Beim Exciting Sculpting, einer weiteren Modifikation der Watergate-Technik, wird die Watergate-Sequenz zweimal hintereinander mit unterschiedlichen Gradientenstärken
(10:1,75) eingesetzt (Experiment 11.14 nach [37]). Wegen der nun deutlich längeren Sequenzlänge τ von 15,6 ms werden die Multiplett-Signale des Ethanols mit einem nach Gleichung (7.3) berechneten Phasenfehler von 39° im Spektrum wiedergegeben. Wie in der Abbildung 7.8 dargestellt, ist die Triplett-Form des auszuwertenden CH3-Ethanolsignals aufgrund des Phasenfehlers nicht mehr eindeutig erkennbar.

Abbildung 7.8: Triplett des Ethanols bei Unterdrückung des Wasser-Signals mit der doppelten Watergate-Sequenz

Angesichts der größer werdenden Phasenfehler wurden die modifizierten Watergate-Sequenzen für die Anwendung zur quantitativen Auswertung nicht weiter betrachtet .

7.2.4.3 LC1WET

Die LC1WET-Technik setzt ebenso wie die Watergate-Sequenz Gradiententechnik voraus. Analog zur Untersuchung der Watergate-Sequenz wurden hier die im Pulsprogramm vorgeschriebenen Parametern (Gradientenstärken im Pulsprogramm durch vier dividiert) unter Berücksichtigung der Parameter zur quantitativen Aufnahme von NMR-Spektren aus [Seite 101↓]Tabelle 5.1 verwendet (D1 = 60 s, ns = 32). Hierzu wurde nach Experiment 7.1 [37] der optimale Shape-Impuls zu 65,4µs bestimmt. Das mit diesen Parametern aufgenommene
1H-NMR-Spektrum zeigte ein schmales Restwassersignal mit geringer Intensität und gut auswertbaren Signalen des Ethanols und des Standards.

7.2.5  Vergleich der Wasserunterdrückungsmethoden

In diesem Kapitel sollen die drei Wasserunterdrückungsmethoden anhand von vier Kriterien (Unterdrückung, Spektrenform, Anregungsprofil, Richtigkeit) unter Verwendung der im Kapitel 7.2.4.1.1 optimierten Parameter für die Presaturation-Technik mit einander verglichen werden. Die Experimente wurden, sofern nicht anders erwähnt, an einer Lösung bestehend aus 153,9 mg TSP-Standardlösung in 1038,5 mg einer forensischen Ethanol-Referenzlösung durchgeführt. Um unter identische Bedingungen den Vergleich durchzu­führen, wurden die Spektren generell mit einem Relaxationsintervall von 60 s und einer Scananzahl von 32 aufgenommen.

7.2.5.1 Erreichte Dämpfung des H2O-Signals

Zum Vergleich des Grades der erreichten Dämpfung des Wassersignals (Unterdrückung) wurden die Spektren der drei Wasserunterdrückungstechniken dem SP-90°-Experiments gegenübergestellt (Abbildung 7.9).

Abbildung 7.9: Vergleich der bewirkten Wasserunterdrückung, ausgehend von einem Signalhöhen-Verhältnis von 120 : 1 (Wasser : CH3-Ethanol) des SP-Experiments.


[Seite 102↓]

Aus dieser Abbildung geht hervor, dass mit allen drei Techniken eine deutliche Unterdrüc­kung des Wassersignals, und damit eine Verbesserung des dynamischen Bereiches erzielt wurde. Ausgehend von einem Signalamplitudenverhältnis zwischen dem Wasser- und dem CH3-Ethanolsignal von 120:1, wie in der Abbildung 7.9 dargestellt, wurde mit Presaturation durch Sättigung des Wassersignals ein Verhältnis von ungefähr 5:1 erhalten. Im Vergleich dazu konnte mit der LC1WET-Technik eine fünffach bessere (1:1) und mit der Watergate-Sequenz sogar eine 50fach bessere Wasserunterdrückung erzielt werden (1:10).

7.2.5.2 Spektrenform

Beim Vergleich der Spektrenformen wurde die Güte der Auswertbarkeit des Spektrums (Grundlinie und Form des Restwassersignals) beurteilt. In Abbildung 7.10 sind die Spektren der Wasserunterdrückung – nach manueller Phasenkorrektur – wiedergegeben.

Abbildung 7.10: Vergleich der Spektrenformen nach manueller Phasenkorrektur.

Die LC1WET-Technik zeigte beim Vergleich der vier Unterdrückungstechniken die beste Spektrenform. Sie weist eine gerade Grundlinie und – aufgrund der Unabhängigkeit der Methode von B1-Feldinhomogenitäten – ein sehr schmales Restwassersignal auf. Auch das Spektrum der Watergate-Sequenz gab eine gute Grundlinie wieder, hingegen enthält es ein dispersives und breites Restwassersignal. Das Spektrum der cw-Presaturation entsprach von der Form her dem der Watergate-Sequenz. Die schlechteste Spektrenform wurde bei der pg-Presaturation erhalten. Bedingt durch die um 90° versetzte Sättigungseinstrahlung baute sich während der Akkumulation ein immenser Phasenfehler des Restwassersignals auf. Dieser führte zu einer gekrümmte Grundlinie über den gesamten Spektrenbereich.


[Seite 103↓]

7.2.5.3  Anregungsprofil der Unterdrückungsmethoden

Der Vergleich der Profile der Unterdrückungsmethoden erfolgte an einer Modell-Lösung, bestehend aus Maleinsäure in D2O, da bei Anwendung der Watergate-Methode im Gegen­satz zum Triplett-Ethanolsignal kein Phasenfehler bei dem Singulett-Signal der Maleinsäure entsteht. Ausgehend von der Lage des Maleinsäuresignals (o1 = 6,4 ppm) wurde o1 schrittweise um je 100 Hz Richtung Tieffeld versetzt und das Maleinsäure-Signal ausgewertet. Die Intensität des Maleinsäuresignal beim maximalen Offset von 1900 Hz wurde zur Referenzierung gleich eins gesetzt. Der Bezug der Intensitätswerte der übrigen Spektren auf diesen Referenzwert gibt das Profil und somit den Grad der Signalunter­drückung in Abhängigkeit vom Offset zur Einstrahlfrequenz der drei getesteten Methoden wieder.

Abbildung 7.11: Signalunterdrückung in Abhängigkeit vom Offset der Einstrahlfrequenz. Vergleich der drei Wasserunterdrückungsmethoden Presaturation (Presat), LC1WET und Watergate. Der Wert eins gibt die volle Intensität wieder, der Wert Null vollständige Unterdrückung.

Aus der graphischen Darstellung der Ergebnisse in Abbildung 7.11 geht hervor, dass von den drei untersuchten Unterdrückungsmethoden die LC1WET-Methode den schmalsten Unterdrückungsbereich, also die höchste Selektivität aufweist. Mit zunehmendem Offset von der Einstrahlfrequenz wurde dabei eine kontinuierliche Abnahme der Intensitätswiedergabe im Spektrum (über 1900Hz 2% relativ) beobachtet. Dieser Effekt ist nach Zhang et al. [40, [Seite 104↓] 101] auf die Composite-Pulsfolge der LC1WET-Sequenz zurückzuführen. Der breiteste Unterdrückungsbereich (geringe Selektivität) wurde bei der Watergate-Sequenz festgestellt. Die Intensität des Maleinsäuresignals wurde noch bei einem Offset von 800 Hz zur Einstrahl­frequenz signifikant durch partielle Unterdrückung verfälscht im Spektrum wiedergegeben. Größere Offsets geben einen sinusförmigen Verlauf (zurückzuführen auf die Binomial-Spin-Echo-Sequenz) der Intensitätswiedergabe in Abhängigkeit vom Offset wieder, deren Mess­werte innerhalb eines Bereiches von 1% relativ liegen. Dieses aufgenommene Profil der Watergate-Sequenz steht in Übereinstimmung mit der Arbeit von Liu [100]. Die Breite des Sättigungsbereich vom Presaturation lag in ihrer Größenordnung zwischen dem der anderen beiden Methoden. Das Maleinsäuresignal wurde bei Offsets bis zu 300 Hz von der Einstrahl­frequenz signifikant mitgesättigt. Bei größeren Offsets wurde nur noch eine geringfügige Streuung der Intensitätswerte bezogen auf den Referenzwert beobachtet.

7.2.5.4 Richtigkeit der Messergebnisse

Das wichtigste Vergleichskriterium war die richtige Intensitätswiedergabe der Signale von Ethanol und Standard im Spektrum. Der gravimetrische Referenzwert des Ethanol-Gehalts der eingesetzten Referenzlösung betrug (1,032±0,001)mgg-1. Mit der SP-90°-Technik wurde der Ethanol-Gehalt anhand einer Einzelmessung zu 1,026mgg-1 und mit der pg-Presaturation-Methode zu 1,028mgg-1 ermittelt. Anhand einer weiteren Modell-Lösung wurde gezeigt, dass zwischen pg- und cw-Presaturation kein signifikanter Unterschied in der Richtigkeit vorlag. Der Ethanol-Gehalt der Referenzlösung wurde mit der LC1WET-Technik zu 1,037mgg-1 bestimmt, zum Referenzwert also nur +0,5% relativ abweichend, jedoch ungefähr 1% relativ höher als mit dem SP- und dem Presaturation-Verfahren. Dies entspricht dem im Kapitel 7.2.5.3 beschriebenen Anregungsprofil der LC1WET-Technik. Der ermittelte Ethanol-Gehalt bei der Watergate-Sequenz wich mit 1,002mgg-1 um 3% relativ sowohl vom Referenzwert als auch vom Ergebnis der Presaturation ab. Zurückzuführen war dies auf den Phasenfehler φ beim Triplett-Signal des Ethanols. Bei bekannter Größe des Phasenfehlers φ kann die Intensität des Triplett-Signals folgendermaßen korrigiert werden:

.

 

(7.4)

Dieser wurde bereits im Kapitel 7.2.4.2 zu 19,7° bestimmt. Somit ergibt sich nach Gleichung (7.4) ein korrigierter Ethanol-Gehalt von 1,032mgg-1, der vom gravimetrischen Referenzwert als auch von den Ergebnissen der SP-90°-Technik und der Presaturation um weniger als
0,5 % abweicht.

Insgesamt konnte mit allen drei Unterdrückungsmethoden Abweichungen der Analysen­ergebnisse zum gravimetrischen Referenzwert von unter 0,5 % erreicht werden. Jedoch nur beim Presaturation ist keine Korrektur des Ergebnisses nötig.


[Seite 105↓]

7.2.5.5  Diskussion und Zusammenfassung

Aus der Validierung und dem Vergleichen der drei Unterdrückungsmethoden wurden folgenden Schlussfolgerungen gezogen:

Bei der Optimierung des Vorsättigungsimpulses der Presaturation-Methode wurden als optimale Parameterwerte eine Sättigungslänge von 1,5s bei einer Impulsleistung bestimmt, die einer Anregungsbreite von 20 Hz bis 30 Hz entspricht. Die mit diesen Parametern angewandte Presaturation-Technik bewirkte zwar die geringste Wasserunterdrückung der drei untersuchten Methoden, zeigte aber eine ausreichende Selektivität der Wasserunter­drückung – Signale des Ethanols und der beiden Standards wurden nicht beeinflusst – und lieferte Messergebnisse mit Abweichungen zum gravimetrischen Referenzwert von weniger als 0,5 %. Der von Mao et al. [73] diskutierte Vorteil der besseren Wasserunterdrückung bei Anwendung der pg-Presaturation (p1(x) p2(y)) gegenüber der herkömmlichen cw-Sättigung (p1(x) p2(x)) konnte nicht bestätigt werden. Viel mehr wurde durch den um 90° hinsichtlich des Anregungsimpulses versetzten Sättigungsimpulses ein immenser, die Auswertung erschwerender Phasenfehler des Restwassersignals aufgebaut. Die Anwendung der cw-Presaturation-Technik ist daher vorzuziehen.

Die LC1WET-Technik überzeugte beim Vergleich mit einer hervorragende Spektrenform (schmales Restwassersignal und gerade Grundlinie) und einer hohen Selektivität der Was­serunterdrückung. Andererseits wurde gezeigt, dass für quantitative Anwendungen eine Kalibrierung der Intensitätswiedergabe in Abhängigkeit vom Offset zur Einstrahlfrequenz nötig ist, um richtige Analysenergebnisse zu erhalten.

Die beste Wasserunterdrückung wurde mit der Watergate-Sequenz erzielt. Die dabei erreichte Spektrenform ist für die quantitative Auswertung ausreichend. Hingegen wurde bei der Watergate-Technik die geringste Selektivität der Wasserunterdrückung der drei untersuchten Methoden (größter Unterdrückungsbereich) ermittelt. So wurden bis zu einem Abstand von 800 Hz bezüglich der Einstrahlfrequenz signifikante Intensitätsverfälschungen durch partielle Unterdrückung bestimmt. Die durch Phasenfehler im Spektrum verfälschten Intensitäten von Multiplett-Signalen konnten aus den Werten der Sequenzlänge (zwischen 90°-Anregungsimpuls und Beginn der Aufnahme) und der Kopplungskonstante korrigiert werden.

Insgesamt sind alle drei Methoden für die Ethanol-Gehaltsbestimmung wässriger Lösungen (ca. 0,1 % Ethanol in H2O) anwendbar. Ferner lieferten alle drei Methoden richtige oder berechenbare Ergebnisse. Für die Auswahl der einzusetzenden Unterdrückungstechniken bei den Ringversuchen war die allgemeine (keine Gradiententechnik) und einfache Anwendbarkeit der Presaturation-Technik ausschlaggebend.


[Seite 106↓]

7.2.6  Erarbeitung eines Analysenverfahrens

Erstmalig wurde ein Analysenverfahren erarbeitet, mit dem wässrige Ethanol-Lösungen an jedem NMR-Spektrometer bei Anwendung der Presaturation zur Wassersättigung analysiert werden können. Diese Arbeitsanweisung baute auf den Erkenntnissen der in den vorange­gangenen Kapiteln 7.2.4 und 7.2.5 beschriebenen Validierung der Presaturation-Methode auf. Es erfolgte eine schrittweise Verbesserung dieser Arbeitsanweisung anhand der Erfahrungen, die bei der Auswertung der beiden Ringversuchen CCQM-P35 und NMR-3 (werden im Kapitel 7.3 beschrieben) gewonnenen wurden.

7.2.6.1  Probenpräparation

Generell ist die Probenpräparation ein wichtiger Arbeitsschritt der Analyse. Der hohe Dampf­druck des Ethanols macht hier eine besonders sorgfältige Arbeitsweise notwendig, wie eigene Experimente bestätigten. Als Probengefäß ist ein dicht schließendes Schraubglas mit Teflondichtung zu verwenden. Die Einwaage der Probenlösung und des internen Standards ist so zu berechnen, dass die Intensitäten der auszuwertenden Signale im Verhältnis von ungefähr 1:1 stehen und das Probengefäß fast vollständig befüllt wird (zur Minimierung des Verdampfens vom Ethanol aus der Lösung). Eine schnelle Prozedur des Einwägvorganges verhindert einen signifikanten Verlust an Ethanol. Das Probengefäß ist mit Parafilm zusätzlich abzudichten. Für eine ausreichende Homogenisierung der Lösung ist zu sorgen.

7.2.6.2 Spektrenaufnahme und -prozessierung

Die Aufnahme des Spektrums erfolgt mit Presaturation-Technik zur Sättigung des Was­sersignals. Dabei ist die Länge des Vorsättigungsimpuls auf 1,5 s einzustellen bei einer Sättigungsleistung, die einer Anregungsbreite von 20 Hz bis 30 Hz entspricht. Die weiteren Parameter zur Aufnahme und Prozessierung sind wie die in der Tabelle 5.1 aufgeführten Werte zu setzen (Ausnahme: Spektrenweite=16ppm; Filterweite>20ppm). Ferner sind der Receiver Gain zur optimalen Ausnutzung des dynamischen Bereiches anzupassen, das Relaxationsintervall (D1) auf 60s einzustellen und 32 Scans für ein ausreichendes S/N zu akkumulieren.

7.2.6.3 Auswertung

Die Auswertung des Spektrums erfolgt analog zu der im Kapitel 5.1.2 beschriebenen Ar­beitsanweisung. Wegen der breiten Flanken des Wassersignals sind die Phasen- sowie Grundlinienkorrekturen sehr sorgfältig zu handhaben. Ausgewertet wird beim Ethanol das [Seite 107↓]CH3-Signal bei 1,18 ppm aufgrund des größeren Abstandes zum Wassersignal. Zur besseren Anpassung der Grundlinienkorrektur bei gegenüber dem Wassersignal hochfeld­liegenden Signalen ist das Drehen des Spektrums (inverse x-Achsen-Skalierung) sinnvoll. Die Berechnung des Ethanol-Gehalts erfolgt nach Gleichung (3.14).

7.2.7 Unsicherheitsbudget

Das Unsicherheitsbudget der Ethanol-Gehaltsanalyse setzt sich aus den Unsicherheiten der Integration (Intensitätsverhältnis zwischen Analyt und Standard), der Einwaagen und Molmassen des Standards und der Probenlösung sowie des Reinheitsfaktors des internen Standards zusammen. Die Berechnung der erweiterten Unsicherheit des Analysenergeb­nisses erfolgt analog dem im Kapitel 7.1.3 beschriebenen allgemeinen Verfahren.

7.3  Internationaler Ringversuch CCQM-P35

Nicht nur in Deutschland, sondern weltweit werden forensische Ethanol-Referenzlösungen für die Alkoholbestimmung im Straßenverkehr eingesetzt. Es ist daher wichtig, dass über die Landesgrenzen hinweg reproduzier- und vergleichbare Ergebnisse hoher Präzision und Richtigkeit erhalten werden [102]. 1997 wurde dazu vom CITAC (Co-operation on Internatio­nal Tracebility in Analytical Chemistry [103]) ein internationaler Ringversuch durchgeführt. Obendrein ist Ethanol ein weltweit gehandelter Gebrauchsartikel. So sind z.B. für die interna­tional variierenden Verbrauchssteuern von Spirituosen weltweit reproduzier- und vergleich­bare Ergebnisse der Ethanol-Gehaltsbestimmung verschiedener Verfahren unentbehrlich [102]. Hinsichtlich dieser beiden Anwendungen wurde die BAM und das LGC vom CCQM mit der gemeinsamen Organisation eines internationalen Ringversuchs (CCQM-P35) beauftragt. Hierbei sollte der Ethanol-Gehalt einer forensischen und einer kommerziellen Probe (Wein mit einem relativen Ethanolgehalt von ca. 10 %), beide vom LGC zur Verfügung gestellt, bestimmt werden. Die Betreuung des Ringversuch – für alle Methoden offen – erfolgte für die NMR-Methoden durch das Labor I.31 der BAM und für alle anderen Methoden durch das LGC. Insgesamt nahmen zehn Nationale Metrologieinstitute (1: LNE (Frankreich) , 2: BAM (Deutschland), 3: VNIIM (Russland), 4: NRC (Kanada), 5: LGC (Großbritannien), 8: NMIJ (Japan), 9: KRISS (Korea), 10: NRCCRM (China), 11: NIST (USA), 12: DSM (Niederlande)) am Ringversuch teil. Es wird in dieser Arbeit jedoch nur auf die NMR-Analysenergebnisse eingegangen.

7.3.1 Messvorschrift

Jeder Ringversuchsteilnehmer erhielt zwei Vials pro Probe (forensisch, Wein). Nach der Versuchvorschrift waren von jedem Vial zwei Aliquots einzuwiegen, von denen wiederum je [Seite 108↓]zwei Messungen durchgeführt werden sollten. Aus diesen insgesamt acht Messergebnissen waren der Schätzwert sowie die kombinierte als auch die erweiterte Messunsicherheit nach GUM [11] zu berechnen. Zusätzlich zu dieser allgemeinen Vorschrift der Messprozedur erhielten die Teilnehmer mit NMR-Methoden eine NMR-spezifische Arbeitsanweisung sowie 4ml der im Kapitel 7.1 referenzierten TSP-Standardlösung zugesandt. Nach dieser Arbeits­anweisung waren zur Analyse der forensischen Probe ca. 125mg der TSP-Standardlösung und ca. 1000mg Analytlösung einzuwiegen; entsprechend für die Weinprobe 500mg der TSP-Standardlösung und 200mg der Weinprobe. Die Spektrenaufnahme sollte mit dem beigefügten Pulsprogramm (pg-Presaturation zur Wasserunterdrückung) und den in Tabelle 7.7 aufgeführten Parametern zur Aufnahme und Prozessierung erfolgen.

Tabelle 7.7: Vorgeschriebene Parameter zur Aufnahme und Prozessierung der Spektren beim internationalen Ringversuch CCQM-P35.

Parameter

Wert

Parameter

Wert

Anregungsimpulse

90°

Relaxationsintervall

60 s

Anzahl der Datenpunkte

32 k

Länge des Sättigungsimpulses

1,5 s

Spektrenweite

16 ppm

Filterweite

> 20 ppm

Anzahl der Spektrenpunkte

32 k

Line broadening

0,3 Hz

S/N

> 150

Integrationsfaktor

64

Die Phasen- und Grundlinienkorrekturen waren sorgfältig auszuführen und das CH3-Signal des Ethanols bei 1,18ppm gegen das des internen Standards TSP bei 0ppm auszuwerten. Zusätzlich mussten bei der Weinprobe die Intensitäten der im Integrationsbereich des Ethanols liegenden Fremdsignale bestimmt und von der Gesamtintensität des Ethanol­signals subtrahiert werden.

7.3.2 Auswertung

Die eigene Auswertung der beiden Analysenproben erfolgte entsprechend der Ringver­suchsmessvorschrift. Die Einwaagen wurde in einem 5 ml Stehkolben durchgeführt, der nur zur Hälfte gefüllt wurde. Gelegentliches Schwenken des Stehkolbens über einen Zeitraum von 90 min führte zur Homogenisierung der Lösungen.

7.3.2.1  Forensische Probe

Die eigenen Analysenergebnisse der acht Messungen sind in der Tabelle 7.8 aufgeführt. Der Schätzwert dieser acht Messungen gab den Ethanol-Gehalt der forensischen Probe mit 1,053mgg-1 und einer Standardunsicherheit von 0,004mgg-1 wieder.


[Seite 109↓]

Tabelle 7.8: Internationaler Ringversuch CCQM-P35, forensische Probe. Einwaagen und ermittelte Ethanol-Gehalte der eigenen Analyse.

  

Vial 1

Vial 2

  

Aliquot 11

Aliquot 12

Aliquot 21

Aliquot 22

  

Exp. 111

Exp. 112

Exp. 121

Exp. 122

Exp. 211

Exp. 212

Exp. 221

Exp. 222

mi
in mg

TSP

122,4

153,3

128,7

137,7

Probe

1001,4

990,3

1040,9

1024,7

Gehalt in mgg-1

1,053

1,054

1,058

1,055

1,038

1,034

1,066

1,063

In Tabelle 7.9 sind die nach dem im Kapitel 7.1.3 beschriebenen Verfahren der Unsicher­heitsberechnung ermittelten Unsicherheitsbeiträge und die daraus berechnete kombinierte Standardunsicherheit aufgeführt. Letztere wurde für das hier angewendete Analysen­verfahren zu uc(y) = ±0,005mgg-1 bestimmt. Die erweiterte Unsicherheit berechnete sich bei einem Konfidenzniveau von p=95% und einem Erweiterungsfaktor k=2 (feff = 17) zu
U= ± 0,010mgg-1.

Tabelle 7.9: Unsicherheitsbudget der Ethanol-Gehaltsbestimmung von der forensischen Probe des internationalen Ringversuchs CCQM-P35.

Unsicherheitsbeitrag

Integration

1,053

0,004

0,4 %

7

Molmasse Ethanol

46,0684gmol-1

0,0017gmol-1

0,004 %

50

Molmasse TSP

172,269gmol-1

0,005gmol-1

0,003 %

50

Einwaage forensische Probe

1001,4 mg

0,2 mg

0,02 %

1000

Einwaage TSP-Standardlösung

122,4 mg

0,2 mg

0,16 %

1000

TSP-Gehalt der Stammlösung

9,109 mg g-1

0,014 mg g-1

0,15 %

37

Komb. Standardunsicherheit uc(y)

 

0,005 mg g-1

0,5 %

17

In der Abbildung 7.12 sind die eingesandten Ergebnisse der Ringversuchsteilnehmer für die forensische Probe dargestellt. Die tabellarische Auflistung der Analysenergebnisse aller Teilnehmer erfolgt im Anhang, Tabelle 11.6. Zur deutlichen Unterscheidung wurden die Ana­lysenergebnisse der NMR-Methoden schwarz und die der anderen Methoden rot markiert. Der gravimetrische Referenzwert des Ethanol-Gehalts wurde vom LGC zu 1,072 mg g-1 mit einer erweiterten Unsicherheit (p = 95 %) von U = ± 0,006mgg-1 angegeben.


[Seite 110↓]

Abbildung 7.12: Internationaler Ringversuch CCQM-P35 (forensische Probe). Analysener­gebnisse der Teilnehmer (Unsicherheitsbalken geben die erweiterte Unsicherheiten wieder). Schwarz: Ergebnisse von NMR-Methoden; Rot: Ergebnisse anderer Methoden (Non-NMR).

Von den insgesamt acht eingesandten NMR-Ergebnissen zeigten drei signifikant positive Abweichungen (Institute 5, 10 und 12), die von der Versuchsvorschrift abweichend das Original-Bruker-Pulsprogramms einsetzten. Die Einstrahlung des Vorsättigungsimpulses über eine Dauer von 60s, wie im Bruker-Pulsprogramm bei D1=60s festgelegt, induziert einen positiven NOE-Effekt auf das auszuwertende CH3-Ethanolsignal (Kapitel 7.2.4.1.1) und führt somit zu einem zu großen Ethanol-Gehalt als Messergebnis. Das eigene Analysenergebnis (Institut 2) gab den Ethanol-Gehalt der Probe um 1,6 % relativ zu gering wieder, verursacht durch die Verdampfung des Ethanol während der Probenpräparation. Aufbauend auf den Erfahrungen der Fachgruppe I.2 beim Umgang mit wässrigen Ethanollösungen wurde eine Prozedur der Probenpräparation (schnelle Einwägprozedur, vollständig gefüllte und gut abgedichtete Probengefäße) erarbeitet (Arbeitsanweisung im Kapitel 7.2.6.1). Erneute Analysen nach dieser Arbeitsanweisung der Probenpräparation ergaben mit der TSP-Standardlösung (118,9 mg TSP-Standardlösung und 992,3 mg der forensischen Probe) ein Gehalt von 1,069 mg g-1 und mit Maleinsäure (Kapitel 6.1.1) als internem Standard (99,9 mg Maleinsäure und 25123,4 mg der forensischen Probe) ein Gehalt von 1,073 mg g-1. Beide Analysenwerte weichen vom gravimetrischen Referenzwert um weniger als 0,5 % ab. Die Richtigkeit der Analysenergebnisse der vier Institute 3, 4, 8 und 9 bezüglich des Referenzwerts lagen in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen der GC- und Titrationsmethoden.


[Seite 111↓]

7.3.2.2  Weinanalyse

Die eigene Auswertung der kommerziellen Probe (Weißwein) erfolgte in zwei Schritten. Zuerst wurde die Intensität des Ethanolsignals inklusive der Fremdsignale bestimmt. Anschließend erfolgte eine Grundlinienkorrektur zur Auswertung der signifikanten Fremd­signale. Die Differenz aus diesen beiden Intensitäten gab die Intensität des Ethanols wieder. Das so ausgewertete 1H-NMR-Spektrum ist in der Abbildung 7.13 dargestellt.

Abbildung 7.13: Internationaler Ringversuch CCQM-P35. 1H-NMR-Spektrum der Weinprobe. Auswertung des Ethanolsignals bei 1,18 ppm inkl. Fremdsignal. Anschließend Grundlinienkorrektur zur Auswertung der intensiven Fremdsignale. Differenz der beiden Intensitäten gibt die Intensität des Ethanols wieder.

Aus den acht Analysenergebnissen der eigenen Auswertung (Tabelle 7.10) wurde der Ethanol-Gehalt zu 96,2mgg-1 mit einer Standardunsicherheit von ± 0,4mgg-1 bestimmt.

Tabelle 7.10: Internationaler Ringversuch CCQM-P35, Weinprobe. Einwaagen und ermittelte Ethanol-Gehalte der eigenen Analyse.

  

Vial 1

Vial 2

  

Aliquot 11

Aliquot 12

Aliquot 21

Aliquot 22

  

Exp. 111

Exp. 112

Exp. 121

Exp. 122

Exp. 211

Exp. 212

Exp. 221

Exp. 222

mi in mg

TSP

510,8

526,4

509,9

587,7

Probe

194,4

206,5

203,1

199,4

Gehalt in mgg-1

97,36

97,32

96,84

97,13

95,70

95,76

94,95

94,64

Die kombinierten Standardunsicherheit berechnete sich nach dem im Kapitel 7.1.3 dar­gestellten Verfahren. Die einzelnen Unsicherheitsbeiträge und die daraus ermittelte kombinierte Standardunsicherheit von uc(y) = 0,5mgg-1 sind in der Tabelle 7.11 aufgeführt.


[Seite 112↓]

Tabelle 7.11: Unsicherheitsbudget der Ethanol-Gehaltsbestimmung von der Weinprobe des internationalen Ringversuchs CCQM-P35.

Unsicherheitsbeitrag

Integration

96,2

0,4

0,4 %

7

Molmasse Ethanol

46,0684gmol-1

0,0017gmol-1

0,004 %

50

Molmasse TSP

172,269gmol-1

0,005gmol-1

0,003 %

50

Einwaage Weinprobe

194,4 mg

0,2 mg

0,10 %

1000

Einwaage TSP-Standardlösung

510,8 mg

0,2 mg

0,04 %

1000

TSP-Gehalt der Stammlösung

9,109 mg g-1

0,014 mg g-1

0,15 %

37

Komb. Standardunsicherheit uc(y)

 

0,5 mg g-1

0,5 %

17

Mit einem Erweiterungsfaktor k=2, der bei einem effektiven Freiheitsgrad von feff=17 ein 95%igen Konfidenzintervall schätzt, wurde die erweiterte Unsicherheit zu U = 1,0mgg-1 berechnet.

Parallel zur Darstellung der forensischen Ringversuchsergebnisse (Abbildung 7.12) sind die Teilnehmerergebnisse der Weinanalyse (aufgeführt im Anhang, Tabelle 11.6) zur besseren Unterscheidung in der Abbildung 7.14 schwarz für die NMR-Methoden und rot für die der anderen Methoden (Non-NMR) dargestellt.

Abbildung 7.14: Internationalen Ringversuch CCQM-P35 (Weinprobe). Analysenergebnisse der Teilnehmer (Unsicherheitsbalken geben die erweiterte Unsicherheiten wieder). Schwarz: Ergebnisse von NMR-Methoden; Rot: Ergebnisse anderer Methoden (Non-NMR). Referenzwert entspricht dem Schätzwert der GC-Analysenergebnisse. Vertrauensbereich gibt die erweiterte Unsicherheit (k=2,16, p=95%) wieder (Werte von LGC).

Der in der Abbildung 7.14 dargestellte Referenzwert von (101,6 ± 2,2) mg g-1 gibt den Schätzwert der GC-Ergebnisse wieder. Dessen erweiterte Unsicherheit (k=2,16, p=95%) [Seite 113↓]repräsentiert den Vertrauensbereich (Angabe von LGC). Von den sieben Analysenergebnis­sen der NMR-Methoden (Institut 8 sandte kein Analysenergebnis des NMR-Verfahrens ein) lagen vier innerhalb des Vertrauensbereiches des Referenzwertes. Das von den Instituten 5 und 10 verwendete, für quantitative Analysen nicht geeignete Pulsprogramm bewirkte wie schon zuvor bei der forensischen Probe positive Abweichungen des Messergebnisses hinsichtlich des Referenzwertes. Die Ursache für den um 6 % relativ zu geringen eigenen Analysenwert (Institut 2) war offenbar analog zur forensischen Probe die Verdampfung des Ethanols während der Homogenisierungsphase (Probenpräparation). Eine erneute Messung (496,7 mg TSP-Standardlösung und 203,9 mg Wein) ergab bei sorgfältiger Probenpräpa­ration einen besser mit dem Referenzwert übereinstimmenden Gehalt von 99,3mgg-1. Die Analyse mit Maleinsäure als internem Standard war wegen Überlagerung mit Resonanz­linien des Weines nicht möglich.

Zusammenfassend erwies sich das aus der Validierung der Presaturation erarbeitete Analysenverfahren mit der quantitativen NMR bei Vorsättigung des Wassersignals im Vergleich mit dem GC-Verfahren bei beiden Proben in der Richtigkeit als gleichwertig. Während bei der Weinprobe beide Verfahren adäquate Präzisionen erreichten, war dagegen das GC-Verfahren bei der forensischen Probe eindeutig präziser. Für die NMR-Methode spricht jedoch die Schnelligkeit und Einfachheit des eingesetzten Verfahrens gegenüber dem GC-Verfahren, da bei letzterem ein hoher Zeit- und Materialaufwand für die erforderlichen Kalibrierungen eingesetzt werden muss [104]. Abweichungen von der Arbeitsanweisung führten zu ungenauen Ergebnissen. Eine Verbesserung der Arbeitsan­weisung hinsichtlich der Probenpräparation erwies sich als nötig.

7.3.3  Nationaler Ringversuch NMR-3

Mittels eines nationalen Ringversuches (NMR-3) sollte bei Beteiligung von NMR-Laboren aus Industrie, Hochschulen und Forschungsinstitutionen das hier erarbeitete Analysen­verfahren zur Bestimmung des Ethanol-Gehalts forensischer Proben zusätzlich bestätigt werden. Abweichend zur Durchführung des internationalen Ringversuches CCQM-P35a wurde zum Vergleich anstelle der TSP-Standardlösung die im Kapitel 6.1.1 referenzierte Maleinsäure als interner Standard verwendet. Ergänzend wurde zur Länge des Vorsätti­gungsimpulses (1,5 s) die Sättigungsleistung mit 66 dB vorgeschrieben. Dass die Vorgabe des Dämpfungsgrades in dB für die Leistung des Vorsättigungsimpulses keine allgemeingül­tige Größe ist, sondern von der Gerätekonstellation abhängt, war zum damaligen Zeitpunkt der vorliegenden Arbeit nicht bekannt. Die nicht eindeutige Vorgabe der Sättigungsleistung sowie die Verwendung der Maleinsäure als internem Standard führten zu einem komplexen Ergebnisbild des Ringversuches, bei dem Abweichungen der Teilnehmerergebnisse zum Referenzwert von bis zu 20% auftraten. Die Anwendung eines von der Vorschrift abwei­chenden geringeren Dämpfungsgrads des Vorsättigungsimpulses bei den teilnehmenden Laboratorien musste daher nicht prinzipiell zur partiellen Sättigung des Maleinsäuresignals [Seite 114↓]führen. Eine eindeutige Zuordnung der ermittelten Einflussgrößen (Verdampfung des Ethanols während der Probenpräparation, partielle Sättigung des Maleinsäuresignals bei zu hoher Sättigungsleistung, induzierte NOE-Effekte auf beide auszuwertenden Signale (CH3-Ethanol, Maleinsäure) bei zu langer Sättigungsdauer) zu den vom Referenzwert abweichenden Teilnehmerergebnissen war nicht immer möglich, da Informationen über die im Teilnehmerlabor durchgeführte Handhabung der Probenpräparation und der Auswertung der Spektren nicht vorlagen. Die in der Analysenvorschrift empfohlene Überprüfung des Analysenverfahrens anhand von Modellproben ist in den meisten Labors der Teilnehmer unterlassen worden. Zudem erschwerte die gegenseitige partielle Kompensation der Auswirkungen bei gleichzeitigem Auftreten mehrerer Einflussgrößen die Auswertung des Ringversuches. Als Fazit des Ringversuches blieben die Erkenntnisse, dass die TSP-Standardlösung der geeignetere interne Standard für dieses Analysenproblem und die Leistung des Sättigungsimpulses nicht als Dämpfungsgrad in dB, sondern als entsprechende Anregungsbreite in Hz vorzugeben ist. Dass die Verwendung von Maleinsäure als internem Standard möglich ist, bewiesen die eigenen Messungen. Die Analyse der NMR-3-Probe nach dem im Kapitel 7.2.6 erarbeiteten Verfahren führte zu einer relativen Abweichung des Analysenergebnisses vom Referenzwert von 0,3 % bei einer relativen Unsicherheit (k = 2; p=95%) von 0,5 %.

Die Validierungen der Wasserunterdrückungsmethoden sowie die hier dargestellten Probleme beim NMR-3-Ringversuch wurden auf einem vom Labor I.31 der BAM organisier­tem Workshop den Teilnehmern vorgetragen und anschließend gemeinsam diskutiert [105]].

7.3.4 Messunsicherheit des Analysenverfahrens

Die Messunsicherheit des Analysenverfahrens zur Ethanol-Gehaltsbestimmung wässriger Lösungen mit der 1H-NMR bei Anwendung der Presaturation-Technik soll anhand der eigenen Messungen bei den beiden Ringversuche (CCQM-P35, NMR-3) und der gemittelten NMR-Teilnehmerergebnisse des Ringversuchs CCQM-P35 bestimmt werden. Dabei wurden die eigenen Analysenwerte beim Ringversuch CCQM-P35 bei Beibehaltung der Unsicherheit wegen der fehlerhaften Probenpräparation durch die bei sorgfältiger Probenpräparation nachträglich aus je zwei Vergleichsmessungen ermittelten Gehalte ersetzt. Zusätzlich wurden bei der Mittlung der NMR-Analysenergebnisse des Ringversuchs CCQM-P35 die Werte der Institute 5, 10 und 12 wegen Anwendung eines nicht geeigneten Pulsprogramms (Abweichung von der Messvorschrift) ausgeschlossen. Die so aus den kombinierten Standardunsicherheiten, den Abweichungen zu den gravimetrischen Referenzwerten und deren Unsicherheiten nach Gleichung 4.15 berechneten relativen Messunsicherheiten (k = 2; p = 95 %) sind in der Tabellen 7.12 dargestellt.


[Seite 115↓]

Tabelle 7.12: Fehleranalyse und Bestimmung der relativen Messunsicherheit (k=2; p=95%) des Verfahrens der Gehaltsanalyse wässriger Ethanollösungen anhand der eigenen Ergeb­nisse (A) der Ringversuche CCQM-P35 und NMR-3 und der gemittelten Teilnehmerergeb­nisse (B) des Ringversuchs CCQM-P35 (Ausschluss der Institute 5,10 und 12).

Ringversuch

 

xRef

in mg g-1

in mg g-1


in mg g-1

|Δxi|

in mg g-1

2u(Δxi)

in mg g-1

rel. U in %

(k=2; p=95%)

CCQM-P35

forensisch

(A)

1,072 ± 0,006

1,0699 >

0,005

0,003

0,016

1,5

(B)

1,076

0,003

0,004

0,013

1,5

CCQM-P35

Weinprobe

(A)

101,6± 1,0

99,39

0,5

2,3

2,2

5

(B)

100,9

0,5

0,7

2,2

2,6

NMR-3

 

1,015± 0,005

1,018

0,002

0,003

0,011

1,2

Die Fehleranalyse der eigenen Analysenwerte als auch die der gemittelten CCQM-P35 NMR-Ergebnisse zeigten keine signifikanten Abweichungen bei der Gehaltsbestimmung wässriger Ethanollösungen bei einem Ethanolgehalt von um die 1 mg g-1 auf. Die relative Messunsicherheit des Verfahrens (k=2; p=95%) wurde jeweils zu 1,5 % bestimmt. Anders sieht es bei der Ethanol-Gehaltsbestimmung der Weinprobe (Ethanolgehalt von ungefähr 100 mg g-1) aus. Die Fehleranalyse der gemittelten CCQM-P35 NMR-Teilnehmerergebnisse lieferte nur eine geringfügige Abweichung zum gravimetrischen Referenzwert und die relative Messunsicherheit des Verfahrens wurde zu unter 3 % bestimmt. Dagegen wurde eine akzeptable Abweichung des eigenen, mit der verbesserten Arbeitsanweisung nach­gemessenen Analysenwerts ermittelt, der zu einer höheren Messunsicherheit von 5 % führte.

7.4 Zusammenfassung

Für die Gehaltsanalyse mit der 1H-SP-NMR wurde eine Arbeitsanweisung ausgearbeitet und an einer Modell-Lösung die Messunsicherheit dieses Verfahrens bestimmt. Ferner wurde erstmalig ein quantitatives Verfahren mit Wasserunterdrückung für die Gehaltsbestimmung wässriger Ethanol-Lösungen erarbeitet. Mittels eines internationalen Ringversuchs (CCQM-P35) wurde die Messunsicherheit des Verfahrens bestimmt und mit hierfür anerkannten Analysenverfahren verglichen. Folgende Erkenntnisse wurden dabei erlangt:


Fußnoten und Endnoten

9 Mit der verbesserten Arbeitsanweisung nachgemessener Analysenwert.

9 Mit der verbesserten Arbeitsanweisung nachgemessener Analysenwert.



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24.02.2005