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Zusammenfassung

Die Motivation der vorliegenden Arbeit bestand darin zu zeigen, dass die hochauflösende quantitative Flüssigkeits-NMR-Spektroskopie eine relative primäre Methode ist und als Referenzverfahren eingesetzt werden kann.

Es wurden für vier typische Anwendungen der quantitativen NMR (Bestimmung von Stoffmengenverhältnis und -anteil, Reinheits- und Gehaltsbestimmung) jeweils der Nachweis einer vollständigen Beschreibung der Methode bzw. des Verfahrens erbracht, die Messgleichung und das Unsicherheitsbudget in Termen von SI-Einheiten aufgestellt und die Messunsicherheit ermittelt. In letztere gingen generell die kombinierte Standardunsicherheit der Eingangsgrößen, die Unsicherheit des Referenzwertes und die Abweichung des Analy­senwertes vom Referenzwert ein.

Aufbauend auf der Validierung der 1H-SP-NMR-Methode (Bestimmung von Stoffmengen­verhältnissen und -anteilen) in der Diplomarbeit [14] wurde eine Arbeitsanweisung für die Aufnahme und Auswertung quantitativer 1H-SP-NMR-Spektren erarbeitet und schrittweise verbessert. Die entscheidenden Elemente dieser Arbeitsanweisung sind die folgenden: Zeitsequenz mindestens 7/3 mal der längsten T1 -Zeit aller auszuwertenden Signale, Anregung mit einem 30°-Impuls, Aufnahme der Spektren mit 32k Datenpunkte (bei guter Auflösung gegebenenfalls auf 64k erhöhen) bei einer Sweepweite von 16ppm und einer Filterweite von mindestens 30ppm, ein für alle auszuwertenden Signale erreichtes S/N > 150, Prozessierung mit vorheriger em-Multiplikation (lb = 0,3Hz) und Zero Filling auf 64k Spektrenpunkte, sorgfältige manuelle Korrektur der Grundlinie und Phasen im Spektrum, Integrationsgrenzen in Abhängigkeit von der Halbwertsbreite mit einem Faktor von 64 setzen, Integralzug gegebenenfalls mit BIAS und SLOPE zu geraden An- und Ausläufen korrigieren.

Aus den Ergebnissen der Validierungen der einzelnen Methoden und Verfahren sowie der Auswertungen der Ringversuche wurden folgende Erkenntnisse gewonnen:

  1. Die eindeutige qualitative Zuordnung der Signale, die Überprüfung der Stabilität und die Auswahl der auszuwertenden Signale (keine Deuterierungseffekte, keine Fremdsignale im Integrationsbereich, Integration mit einem Integrationsfaktor von mindestens 64 möglich) sind die Grundlage für eine quantitative Auswertung.
  2. Eine oberflächliche Korrektur der Grundlinie und der Phasen im Spektrum sowie die Nichteinhaltung eines konstanten Integrationsfaktors führt zu erheblichen systematischen Fehlern.
  3. Die automatischen Korrektur-Algorithmen der beiden Auswertungsprogramme XWinNMR und MestRe-C liefern unzureichend grundlinien- und phasenkorrigierte Spektren. Die Simulationen mit optimierten Lorentz-Gauß-Kurven (Software WinFit) geben die Signale im Spektrum nicht ausreichend genau wieder. [Seite 125↓]
  4. Die nicht vollständige Erfassung überlagerter Einzelsignale (hier ETS) mit einem Integral und anschließender Korrektur des Integralzuges bewirkt verfälschte Analysenergebnisse. Überlagerte Einzelsignale sind daher immer mit einem Integral vollständig zu erfassen. Gegebenenfalls ist dazu der Integrationsbereich zu erweitern.
  5. Aus den Punkten 1 bis 4 wird der enorme Einfluss des Operators auf die Messun­sicherheit des Verfahren deutlich. Es ist daher eine sorgfältige Arbeitsweise des Operators für quantitative Auswertungen bei folgenden Elemente nötig: Proben­präparation, Korrektur der Spektren bezüglich Grundlinie und Phasen, Auswahl der auszuwertenden Signale, Setzung der Integrationsbereiche (vollständige Erfassung überlagerter Einzelsignale).
  6. Bei NMR-Geräten mit Analogfilter-Technik werden Signale im Grenzbereich des Analog-Filters teilweise gesättigt. Die Filtergrenze sollte mindestens mit einem Ab­stand von 10 ppm zum nächsten Signal gesetzt werden. Bei NMR-Spektrometern mit Oversampling-Technik erübrigt sich dies, da deren Filterweite automatisch auf maximal mögliche Werte gesetzt werden.
  7. Die Unabhängigkeit der Messunsicherheit der Methode von der eingesetzten Magnetfeldstärke sowie die Allgemeingültigkeit der Messvorschrift konnte gezeigt und mit eigenen Vergleichsmessungen an verschiedenen NMR-Spektrometern (1H: 300 MHz, 400 MHz, 500 MHz, 600 MHz, 800 MHz) belegt werden.
  8. Der Einsatz von Messköpfen, die nicht speziell für die 1H-NMR vorgesehen sind, kann zu einer verfälschten Intensitätswiedergabe im Spektrum führen. Auf deren Einsatz für quantitative Messungen ist daher zu verzichten.
  9. Beim Einsatz modernster NMR-Technik (18,8T Höchstfeldgerät (1H: 800 MHz), Kryo-Messkopf) für quantitative Analysen wurde eine erheblich bessere Empfind­lichkeit erreicht, nicht jedoch eine bessere Auflösung. Es muss dabei mit starken Radiation Damping Effekten gerechnet werden.
  10. Radiation Damping Effekte wurden schon ab einer Magnetfeldstärke von 9,4 T nachgewiesen und führt generell zur Verbreiterung intensiver Signale. Die Richtigkeit der Intensitätswiedergabe im Spektrum wird davon nicht beeinflusst.
  11. Das Aufstellen der Unsicherheitsbudgets erfolgte nach dem vom ISO veröffent­lichten Leitfaden zur Ermittlung von Messunsicherheiten. Die kombinierte Standardunsicherheit des Analysenergebnisses umfasst bei der Bestimmung von Relativgrößen (Stoffmengenverhältnis, -anteil) nur den Unsicherheitsbeitrag der Integration (Intensitätsverhältnis Analyt zu Standard). Bei der Analyse von Absolutgrößen (Reinheit, Gehalt) gehen zusätzlich die Unsicherheitsbeiträge der beiden Einwaagen und Molmassen von Analyt und Standard sowie die Reinheit (Reinheitsgrad, Reinheitsfaktor) des Standards mit ein. Der Unsicherheitsbeitrag der Molmassen kann generell vernachlässigt werden. Die Unsicherheitsbeiträge [Seite 126↓]der Einwaagen und der Reinheit des Standards können bei entsprechender Wahl der Waage hinsichtlich der Einwaagemenge und des einzusetzenden Standards minimiert und gegebenenfalls vernachlässigt werden. Die Messunsicherheit des Verfahrens wurden aus der kombinierten Standardunsicherheit des Analysen­ergebnisses, der Unsicherheit des Referenzwertes und der systematischen Abweichung des Analysenwertes bezüglich des Referenzwertes berechnet.
  12. Die Auswertung der Spektren bei einem Signal-zu-Rausch-Verhältnis (S/N) > 150 mit einem Integrationsfaktor von 64 führt generell zu einer relativen Messunsicherheit der Methode bzw. der Verfahren (k=2; p=95%) von 1,5 %. Die Auswertung mit einem größeren Integrationsfaktor von 200 bei einem S/N > 7000 führte zur Verbesserung der relativen Messunsicherheit auf 1,0 %.

Im Rahmen der Arbeit wurden die folgenden Einsatzbereiche der quantitativen NMR bearbeitet. Hierzu wurden für spezielle Aufgabenbereiche Multipuls-Techniken validiert:

  1. Anhand einer Fünf-Komponentenlösung (Ethyl-4-toluolsulfonat, [2,2]-Paracyclo­phan, Durol, Cyclododekan und Oktamethylcyclotetrasiloxan) mit einem Stoff­mengenanteil von 94 % bzw. 97 % der Hauptkomponente Durol wurde die Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen untersucht. Die relative Messunsicherheit beider Methoden wurde jeweils – bezogen auf die gravimetri­schen Referenzwerte – zu 1,5 % bestimmt.
  2. Die Messunsicherheit bei der Bestimmung von verschiedenen Stoffmengenver­hältnissen überlagerter Signale wurde anhand von Zwei-Komponenten-Lösungen ermittelt. Stoffsysteme mit Überlagerung einiger Signale im Spektrum können über die Differenzbildung (Benzoesäure-Ethylbenzoat) mit einer relativen Messun­sicherheit von unter 1,5 % analysiert werden. Stoffsysteme mit Überlagerung aller Signale im Spektrum (unterschiedliche intramolekulare Protonenverhältnisse) können dagegen über ein Gleichungssystem (Ethylbenzoat-Phthalsäurediethyl­ester) mit einer relativen Messunsicherheit von unter 2 % ermittelt werden.
  3. Zur Rückführung von Absolutgrößen (Reinheit, Gehalt) auf SI-Einheiten wurde ein ZRM (Benzoesäure) eingesetzt und weitere Standards (Maleinsäure, Durol, 3-Trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsäure-Natriumsalz (TSP)-Lösung) als NMR-Referenzmaterialen auf dieses ZRM zurückgeführt. Alle vier Standards zeigten sich als interne Standards geeignet.
  4. Die Reinheitsanalyse mit der 1H-NMR wurde am System Maleinsäure mit ZRM Benzoesäure als internem Standard untersucht. Bei Anwendung eines Integra­tionsfaktors von 200 bei einem (S/N) > 12000 wurde eine relative Messunsicher­heit von 1,0 % erreicht.
  5. Für die Reinheitsbestimmung von Referenzmaterialien für den pharmazeutischen Bereich wurde eine Vorstudie durchgeführt. Das Zentralinstitut Arzneimittel­[Seite 127↓]forschung in Sinzig stellte hierfür drei mögliche Referenzmaterialien zur Verfügung (Spiraeosid, Thymol, Loganin). Mit ZRM Benzoesäure als internem Standard wurde die relative Messunsicherheit des erarbeiteten Verfahrens zu 1,5 % bestimmt. Ein Referenzwert lag nicht vor.
  6. Für die Reinheitsbestimmung mit der 13C-NMR von einem Gemisch der drei Stellungsisomeren Xylole (o-, m- und p-Xylol) einschließlich Ethylbenzol als Konstitutionsisomer sowie von Tributylzinnchlorid wurde die Inverse Gated 1H-Breitband-entkoppelte 13C-NMR validiert. Für intensitätsrichtige Signalwiedergabe im Spektrum ist die Aufnahmezeit (entspricht der Entkopplungsdauer) auf maximal 3 s zu begrenzen. Die relative Messunsicherheit des Verfahrens wurde anhand der Xylol-Lösung mit Durol als internem Standard bezogen auf die gravimetrischen Referenzwerte zu unter 2 % bestimmt. Die Reinheitsanalyse war mit der 1H-SP-NMR aufgrund überlagerter Signale nicht möglich.
  7. Mittels der TSP-Standardlösung und dem ZRM Benzoesäure als internem Standard wurde die Messunsicherheit der Gehaltsanalyse mit der 1H-SP-NMR bestimmt. Die Setzung der Integrationsbereiche entsprechend einem Integrations­faktor von 500 bei S/N > 7000 führte zu einer relativen Messunsicherheit des Verfahrens von 1,0 %.
  8. Für die Gehaltsbestimmung wässriger Ethanol-Lösungen mit einem relativen Gehalt von 0,1 % wurde erstmals die Güte der 1H-Wasserunterdrückung für quantitative NMR-Spektroskopie analysiert. Dazu wurden drei 1H-Wasserunterdrückungstechniken (Presaturation, Watergate, LC1WET) validiert und anhand von vier Kriterien (Grad der Wasserunterdrückung, Güte der Spektrenform, Profil der Unterdrückung, Richtigkeit) miteinander verglichen. Alle drei Unterdrückungstechniken können quantitativ eingesetzt werden, wobei bei Watergate und LC1WET eine Kalibrierung nötig ist. Von den drei Unterdrückungsmethoden kann nur Presaturation, da ohne Gradiententechnik, universell an jedem NMR-Spektrometer betrieben werden. Der Vorsättigungsimpuls ist dabei mit einer Impulslänge von maximal 1,5 s bei einer Impulsleistung, die einem Anregungsbereich von 20 Hz bis 30 Hz entspricht, einzustrahlen. Die Angabe der Impulsleistung als Grad der Dämpfung in dB ist zu vermeiden, da diese weder zwischen Geräten eines Herstellers (abhängig von der Gerätekonstellation) noch zwischen den Geräteherstellern (unterschiedliche dB-Skalierungen) übereinstimmt. Die relative Messunsicherheit des Verfahren bei Wasserunterdrückung mit der 1H-Presaturation-Technik wurde bezogen auf den gravimetrischen Referenzwert zu 1,5 % bestimmt


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Um die hier ermittelten Messunsicherheiten der quantitativen NMR-Verfahren mit denen anderen Verfahren zu vergleichen, wurden an nationalen und internationalen Ringversuchen teilgenommen und teilweise an der Organisation mitgearbeitet. Aus den Ergebnissen dieser Ringversuche wurden die folgenden Erkenntnisse gezogen:

  1. Der Einsatz einer Arbeitsanweisung zur Aufnahme und Auswertung von quantitati­ven 1H-SP-NMR-Messungen bei den Ringversuchen CCQM-P3 und NMR-2 führte im Vergleich zu den vorangegangenen Ringversuchen CCQM-4 und NMR-1 (Messung nach Laborroutine) zur deutlichen Verbesserung der Messunsicherheit bei der Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen. Anhand der noch auftretenden Abweichungen der Teilnehmerergebnisse konnten weitere Einflussgrößen ermittelt werden.
  2. Mittels des internationalen Ringversuchs CCQM-P20a zur Reinheitsbestimmung von Tributylzinnchlorid konnte gezeigt werden, dass die quantitative 1H-entkop­pelte 13C-NMR in der Richtigkeit mit den gängigen Analyseverfahren wie GC und DSC gleichwertig ist. Die Präzision war nur geringfügig niedriger.
  3. Beim Ringversuch CCQM-P35, Gehaltsbestimmung wässriger Ethanollösungen (0,1 % Ethanol in Wasser, Weißwein mit 10 % Ethanol) konnte beim Vergleich mit anerkannten analytischen Verfahren (GC, Titration) gezeigt werden, dass die quantitative NMR bei Einhaltung der validierten Arbeitsanweisung in der Richtigkeit mit den anderen beiden Verfahren gleichwertig ist, bei höheren Ethanolgehalten auch in der Präzision.

Die gewonnenen Erfahrungen und Erkenntnisse, die auf der Bearbeitung aller aufgetretenen Probleme beruhen, wurden an die Teilnehmer der internationalen Ringversuche auf den CCQM-Sitzungen und an die Teilnehmern der nationalen Ringversuche auf vom Labor I.31 (BAM) organisierten Workshops weitergegeben. Damit wurde der Multiplikatorfunktion der BAM zur Weitergabe von Prinzip und Prozedur der metrologischen Rückführung an NMR-Mess- und Forschungsinstitutionen nachgekommen.

Die Bewertung dieser vier quantitativen NMR-Anwendungen führte zu dem Ergebnis, dass die quantitativen NMR-Spektroskopie in den hier erarbeiteten Verfahren im wesentlichen der Definition einer relativen primären Methode entspricht.


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Die ausführliche Diskussion der in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse führte zur Verall­gemeinerung der Verfahren für komplexere Stoffsysteme als die hier bearbeiteten. Dazu waren Randbedingungen (Prüfbereich, Ergebnisunsicherheit, Einsatzgebiete) für die einzel­nen Verfahren festzulegen, um sie als Referenzverfahren einzusetzen. Die folgenden Referenzverfahren werden definiert:

  1. Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen in Mehrkomponentenge­mischen mittels 1H-NMR-Spektroskopie: Der Prüfbereich der zu analysierenden Stoffmengenverhältnisse wurde zu 0,004molmol-1 bis 0,999molmol-1 mit einer charakteristischen Ergebnisunsicherheit von 1,0% bis 1,5 % bestimmt.
  2. Reinheitsbestimmung von organischen Verbindungen mittels 1H- oder 13C-NMR-Spektroskopie: Der Prüfbereich für die Reinheitsanalyse einer Substanz wurde für die 1H-NMR mit einer Obergrenze von 99g/g% bei einer charakteristischen Ergebnisunsicherheit von 1,0% bis 1,5 % relativ und für die 13C-NMR mit einer Obergrenze von 98g/g% bei einer Ergebnisunsicherheit von 2% relativ bestimmt.
  3. Gehaltsbestimmung von organischen Verbindungen mittels 1H-NMR-Spektroskopie: Der Prüfbereich des zu analysierenden Mindestgehalts wurde zu 9mgg-1 bis
    990 mg g-1 mit einer charakteristischen Ergebnisunsicherheit von 1,0% bis 1,5 % bestimmt.
  4. Gehaltsbestimmung in wässriger Matrix mit der NMR-Spektroskopie unter Einsatz der Wasserunterdrückungstechnik (hier: Ethanol): Der Prüfbereich der zu analysierenden Ethanolgehalte wurde zu 0,1% bis 15% mit einer charakteristischen relativen Ergebnisunsicherheit von 1,0% bis 3% bestimmt.

Als Einsatzgebiete bieten sich für alle vier Referenzverfahren die Validierung anderer Ver­fahren sowie die Teilnahme an Zertifizierungen organischer Referenzmaterialien und Einträge in den CMC-Katalog des BIPM an.


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24.02.2005