Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. J. Mlynek
Im Zeitalter der immer weitergreifenden Globalisierung von Handel und Wirtschaft ist die gegenseitige Anerkennung von Analysenergebnissen von steigender Bedeutung [1]. Mit dem Inkrafttreten des „Mutual Recognition Arrangement of National Measurement Standards and of Calibration Certificates issued by National Metrology Institutes (CIPM-MRA)“ des Internationalen Komitees für Maß und Gewicht (Comité International des Poids et Mesures, CIPM) 1999 wurde dazu ein wichtiger Beitrag geleistet. Um die Nationalen Rückführungssysteme miteinander zu vergleichen und den Grad der Übereinstimmung zu bestimmen, werden hierzu in den einzelnen Fachgruppen des CIPM (für das Mol das Beratende Komitee für chemische Messungen (Comité Consultatif pour la Quantité de Matière, CCQM)) ausgewählte „Key Comparisons“ (Schlüsselvergleiche) durchgeführt [2]. Die nationalen Rückführungsaufgaben in Deutschland werden von der Physikalisch-Technischen Bundesanstalt (PTB) und der Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung (BAM) übernommen. Für die SI-Einheit die Stoffmenge – das Mol – hat die BAM in Zusammenarbeit mit der PTB die Zuständigkeit für nationale Normale erhalten. Für die Rückführungsaufgaben werden, wenn möglich, direkte Primärmethoden eingesetzt, da nur diese die direkte Verbindung zu den Si-Einheiten herstellen. Andernfalls werden zertifizierte Referenzmaterialien (ZRM) verwendet, die die Rückführung auf die SI-Einheiten und somit die Richtigkeit der Messgröße [3, 4, 5] gewährleisten. Alternativ stellen Parallelmessungen mit Referenzverfahren ebenfalls die Rückführung sicher [6]. Diese bieten gegenüber den Referenzmaterialien den Vorteil, dass Kalibrierungen an realen oder realitätsnahen Proben durchgeführt werden [7].
Die Kernresonanzspektroskopie (NMR) ist eine der wichtigsten und am weit verbreitetsten Methoden der Spektroskopie. Ihre ausgezeichneten selektiven Eigenschaften in der Strukturanalytik haben sie in fast jedem chemisch forschenden Labor unabkömmlich gemacht [8]. Darüber hinaus finden die hochauflösenden 1H- und 13C-NMR immer mehr Anwendung in der quantitativen Analytik. Es sollen daher in der vorliegenden Arbeit die folgenden vier, für die quantitative NMR einfachsten Anwendungsgebiete betrachtet werden: Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen in mol mol-1, Bestimmung von Stoffmengenanteilen in mol/mol %, Reinheitsanalyse in g/g % und Gehaltsanalyse in mg g-1. Dass die quantitative hochauflösende NMR-Spektroskopie das Potenzial zu einer relativen primären Methode hat, steht außer Frage [6, 9, 10]. Jedoch ist für die vier oben genannten Anwendungsgebiete bis heute die Messunsicherheit der NMR-Spektroskopie noch nicht mit einem vollständigen Unsicherheitsbudget belegt worden, so wie es vom Leitfaden der ISO (kurz GUM genannt) gefordert wird [11]. Es sollen daher, um für alle NMR-Spektrometer eine gültige Aussage über die erreichbare Messunsicherheit zu treffen, allgemeingültige Standardarbeitsanweisungen sowie nach GUM die vollständigen Unsicherheitsbudgets erarbeitet werden. Zudem sollen erstmals die Randbedingungen für den Einsatz der quantitativen NMR-Spektroskopie als Referenzverfahren untersucht und definiert werden.
Die vorliegende Arbeit wurde an der Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung (BAM) in der Abteilung I „Analytische Chemie; Referenzmaterialien“ im Labor I.31 „Magnetische Resonanzspektroskopie“ (Projekt 0103-I-0029) durchgeführt. Das Thema dieser Arbeit entspricht dem Kompetenzbereich der Abteilung „Entwicklung, Bereitstellung und Bewertung zuverlässiger Referenzmaterialien und -verfahren in der Analytischen Chemie“. Die BAM hat als ein Nationales Metrologieinstitut Deutschlands die Aufgabe, durch Beteiligung an internationalen Studien und „Key-Comparisons“ die internationale Vergleichbarkeit der nationalen Rückführungssysteme für die SI-Einheit in der Chemie (hier: das Mol) mit geeigneten Methoden oder Verfahren zu gewährleisten.
Die Arbeit verfolgt die beiden Ziele, die hochauflösende Flüssigkeits-NMR-Spektroskopie als eine relative primäre Methode zu etablieren, und darauf aufbauend, sie als Referenzverfahren zur Validierung anderer Methoden und zur Zertifizierung von Referenzmaterialien einzusetzen. Dafür werden zur optimalen Bearbeitung Stoffsysteme mit einfachen, linienarmen Spektren untersucht, die sich an den aktuellen Aufgaben des CCQM orientieren.
Entsprechend der für das CCQM formulierten Definition einer primären Methode [12] bilden
das Aufstellen von Messgleichungen,
das Beschreiben der Methode/Verfahren mit allen physikalischen Parametern entsprechend der Messgleichungen,
das Aufstellen von Unsicherheitsbudgets und
die Bestimmung der metrologischen Qualität
für vier zu betrachtende Anwendungen der quantitativen NMR (Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen sowie Reinheits- und Gehaltsanalyse) die Schwerpunkte dieser Arbeit. Der Begriff metrologische Qualität beschreibt die geringste erreichbare Messunsicherheit, ein dem Messergebnis zugeordneter Parameter, der die Streuung der Werte kennzeichnet, die vernünftigerweise der Messgröße zugeordnet werden könnte (Definition aus dem internationalen Wörterverzeichnis der Metrologie (VIM [13]).
Zur Bearbeitung der ersten beiden Schwerpunkte werden, bei der Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen mit der 1H-Single-Pulse-NMR beginnend, die Messgleichungen aufgestellt und – aufbauend auf der eigenen Diplomarbeit [14] – systematisch alle physikalischen Parameter und Einflussgrößen entsprechend der Messgleichung in weiten Bereichen variiert und ihre Auswirkungen sowie der Einfluss des Operators auf die Messunsicherheit quantifiziert. Diese Erkenntnisse werden für die Validierung der Verfahren zur Reinheits- und Gehaltsbestimmung übernommen und entsprechend der Messgleichung erweitert. Für die Absicherung der Analysenergebnisse sind qualitätssichernde Maßnahmen erforderlich. Es wird damit begonnen, ein System von NMR Referenzmaterialien (Standards) zu entwickeln, die der Forderung nach metrologischer Rückführung genügen. Um Spezial
Daran anschließend sollen erstmals für alle Anwendungen der quantitativen hochauflösenden Flüssigkeits-NMR entsprechend den Messgleichungen die vollständigen Unsicherheitsbudgets aufgestellt werden. Diese werden nach dem allgemeingültigen und weltweit anerkannten Leitfaden zur Ermittlung von Messunsicherheiten erarbeitet, der von der „International Organization for Standards (ISO)“ veröffentlicht wurde.
Mittels ausgearbeiteter und stufenweise verbesserten Arbeitsanweisungen werden nationale (Teilnehmer: Industrie, Hochschulen, Forschungsinstitute) und internationale Ringversuche (Teilnehmer: Nationale Metrologieinstitute) durchgeführt, um kompetente Aussagen für die Güte der in dieser Arbeit behandelten Verfahren (Stoffmengenverhältnisse und –anteile, Reinheitsbestimmung und Gehaltsbestimmung) zu treffen. Auf höchstem metrologischen Niveau wird durch die Beteilung an internationalen CCQM-Ringversuchen die Messunsicherheit der quantitativen NMR-Spektroskopie mit denen anderer analytischer Verfahren verglichen und bewertet.
Im Verlauf dieser Arbeit werden alle auftretenden Probleme untersucht und zu deren Lösung Arbeitsanweisungen für die praktische Laborarbeit erarbeitet. Damit soll, dem Multiplikator-Prinzip entsprechend, Prinzip und Prozedur metrologischer Rückführung an nationale und internationale NMR-Forschungsinstitutionen weitergegeben werden.
Ein weiterer Schwerpunkt liegt in der Verallgemeinerung der in der vorliegenden Arbeit erarbeiteten Verfahren mit der quantitativen NMR-Spektroskopie, um sie als Referenzverfahren zu etablieren. Dazu werden die gewonnenen Ergebnisse kritisch diskutiert und bewertet, um allgemeine Schlussfolgerungen zur Anwendbarkeit auch für komplexere Einsatzgebiete (Pharmazie, Biochemie, etc.) zu ziehen. Hierzu sind die Randbedingungen für die Prüfbereiche, die Ergebnisunsicherheiten in diesen Prüfbereichen und die genauen Einsatzgebiete zu diskutieren und festzulegen.
Es sollen hier nur die Grundlagen beschrieben werden, die in dieser Arbeit für die quantitative hochauflösende Flüssigkeits-NMR-Spektroskopie von Bedeutung sind. Die allgemeinen Grundlagen der NMR-Spektroskopie sind in Lehrbüchern von z.B. Derome [15], Günther [16], Friebolin [17] und Levitt [18] nachzulesen.
Die wichtigste Grundlage der quantitativen NMR-Spektroskopie ist die direkte Proportionalität von Intensität eines Signals Ix im Spektrum und der zur Resonanzlinie beitragenden Kernanzahl Nx
wobei kS hier als Spektrometerkonstante bezeichnet wird. Die Herleitung dieser Beziehung beruht auf der Beschreibung eines als Lorentzlinie dargestellten Signals S(ω) bei einer Frequenz ωim Frequenzspektrum durch folgende Gleichungen [19]:
mit
wobei
Die Integration dieser Gleichung von -∞ bis +∞ (Lorentzlinie) nach Δω gibt die Intensität des Signals wieder, die bei Heranziehen der Gleichung (3.3) proportional zu N ist:
Für die in dieser Arbeit betrachtete 1H- und 13C-Single-Pulse-NMR-Spektroskopie ist kS bei Einhaltung der optimalen Aufnahmeparameter innerhalb eines Spektrums konstant. Beim Bezug zweier Signale in einem Spektrum zueinander kürzt sich damit kS heraus.
Theoretisch ist es möglich, die Signalintensität aus den Naturkonstanten und den Parametern der Probe und des Empfängers von der folgenden Formel ausgehend herzuleiten [19]:
Damit ist die quantitative NMR-Spektroskopie eine Relativmethode und kann zur Analyse von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen bei Vielstoffgemischen eingesetzt werden. Bei Zuwaage eines Standards sind Reinheitsanalysen sowie Konzentrations- und Gehaltsbestimmungen durchführbar. Als Vorteil gegenüber anderen analytischen Verfahren wird in vielen Publikationen herausgestellt, dass NMR-Analysen einfach handhabbar, kalibrierfrei, zerstörungsfrei und schnell sind. Ferner ist allgemein keine Aufarbeitung oder Isolierung des Analyten nötig sowie wegen der ausgezeichneten Selektivität der NMR-Spektroskopie die gleichzeitige Analyse mehrerer Analyten in einem Gemisch möglich. Als Nachteile sind gegebenenfalls Sättigungs- und Überlauf-Probleme sowie relativ hohe Anschaffungs- und Betriebskosten zu erwähnen [20].
Um all die Messgrößen und -methoden, von denen es heute eine Vielzahl gibt, miteinander vergleichen zu können, ist es wichtig, sie auf Einheitsnormale zurückzuführen. Das Bureau International des Poids et Mesures (BIPM) führte dazu das Konzept der primären Methoden ein. Dieses wurde für das CCQM wie folgt definiert:
A primary method of measurement is a method having the highest metrological qualities, whose operation can be completely described and understood, for which a complete uncertainty statement can be written down in terms of SI units.
A primary direct method: measures the value of an unknown without reference to a standard of the same quantity.
A primary ratio method: measures the value of ratio of an unknown standard of the same quantity; its operation must be completely described by a measurement equation. (Milton und Quinn, S. 293 [12])
Bisher sind die Coulometrie, die Gravimetrie, die Titriemetrie und die kolligativen Methoden als direkte und die Isotopenverdünnungs-Massenspektroskopie als relative primäre Methoden vom CCQM anerkannt [21]. Ob eine Methode direkt oder relativ primär ist, wird einerseits entsprechend der Definition anhand der Notwendigkeit einer Referenzierung auf einen Standard entschieden. Ein weiteres, wichtiges Kriterium ist der Einfluss der empirischen Faktoren im Unsicherheitsbudget. Dominieren diese Faktoren, so handelt es sich nicht um eine direkte primäre Methode. Bei der Bestimmung von Relativgrößen (Stoffmengenverhältnis, -anteil) ist die NMR-Spektroskopie wegen ihrer metrologischen
Die Messunsicherheit der 1H-NMR-Spektroskopie für die Stoffmengenanteil-Analyse wurde in der eigenen Diplomarbeit [14] untersucht. Daran anknüpfend sollen hier
die Messgleichungen
die Unsicherheitsbudgets und
die metrologische Qualität mit Hilfe von Ringversuchen
für die verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten der quantitativen NMR bestimmt werden.
Das Single-Pulse (SP)-Experiment ist das einfachste anzuwendende NMR-Experiment, dessen zeitlicher Ablauf in der Abbildung 3.1 dargestellt ist.
Durch den Anregungsimpuls erfährt die Magnetisierung eine Auslenkung aus ihrer Ruhelage (z-Magnetisierung) in Richtung der x,y-Ebene. Die zeitliche Abnahme der y-Magnetisierung (transversale oder Quermagnetisierung) aufgrund derT1-Relaxation des Systems wird als Free Induction Decay (FID) bezeichnet und aufgenommen. Die Fourier-Transformation des FIDs liefert das auszuwertende Spektrum. Validierungen der 1H-SP-NMR zeigten [8, 14], dass die Methode gegenüber den meisten Parametern robust ist. Lediglich die Aufnahmezeit und das T2-Relaxationsintervall sind zu optimieren. Im Rahmen der eigenen Validierung der Methode zeigte sich, dass bei einem Signal-zu-Rausch-Verhältnis (S/N) von mindestens 150 eine relative Messunsicherheit von unter 1,5% erreichbar ist [14]. Eine Aufgabe dieser Arbeit ist es, dieses allgemein für alle quantitativen Anwendungen der NMR zu zeigen.
Für die Betrachtung weiterer quantitativer Anwendungen ist es nötig, den Einfluss aller Parameter auf die Ergebnisgenauigkeit zu untersuchen. Daher werden diese in den folgenden drei Kapiteln kurz erläutert.
Eine wichtige Voraussetzung für den Ablauf eines NMR-Experiments ist die gute Auflösung des Spektrometers, um schmale Signale zu erhalten. Das Homogenisieren des Magnetfeldes zur optimalen Auflösung nennt man Shimmen. Den Ablauf der Aufnahme des FIDs beeinflussen mehrere Parameter. Mit Hilfe des Parameters Receiver Gain (RG) wird die Auflösung des Analog-Digital-Wandlers (ADC) für die zu untersuchende Probe optimiert. Bei quantitativen Analysen von sehr großen Signalamplitudenunterschieden ist es wichtig, den dynamischen Bereich optimal auszunutzen [22]. Für die Anregung des Spektrums ist die Kenntnis der Parameter des 90°-Impulses (Impulsstärke und -länge) erforderlich. Diese über das Intensitätsmaximum bei 90° zu bestimmen, kann zu falschen Werten führen [23]. Genauer wird der 180°- oder 360°-Nulldurchgang festgelegt. Direkt nach der Anregung findet bereits Emission statt, die während der Aufnahmeverzögerung nicht detektiert wird. Dadurch wirken sich unterschiedlicheT2-Zeiten (Transversale Relaxation) der einzelnen Strukturgruppen auf die Richtigkeit Maß für die Abweichung des Analysenwertes vom (gravimetrischen) Referenzwert. Maß für die Streuung der Einzelwerte.
Um den Fehler der Intensitätswiedergabe durch Sättigung kleiner als 0,1 % relativ zu halten, ist bei Anregung mit einem 90°-Impuls eine Zeitsequenz von mindestens siebenmal der längsten T1-Zeit aller auszuwertenden Signale notwendig [26]. Dazu ist unter Berücksichtigung der Aufnahmezeit das Relaxationsintervall entsprechend lang zu setzen. Ein kleinerer
Bei NMR-Spektrometern sind zwei Arten von Filtern (Analog- und Digitalfilter) gängig, die den außerhalb der eingestellten Spektrenweite Wird auch als Spektral-Weite bezeichnet.
Die Konvertierung des analog aufgenommenen FIDs mit dem Analog-Digital-Wandler (ADC) in die digitale Form kann zu systematischen Fehlern bei der Intensitätswiedergabe führen, wenn der dynamische Bereich nicht für die Darstellung schwacher Signale neben intensiven Signalen ausreicht. Ausschlaggebend ist hierfür das letzte Bit, das zwischen Signal oder Rauschen entscheidet [29]. ADCs mit Wortlängen von 12 Bit, 16 Bit oder 18 Bit sind in der Lage, maximale Signalamplituden-Unterschiede von ungefähr 2.000, 30.000 bzw. 130.000 darzustellen [15].
Vor der Fourier-Transformation (FT) wird der FID mit einer Apodizationsfunktion sowie dem Auffüllen mit Nullen (Zero-Filling) zur Verbesserung der Darstellung des Frequenzspektrums mathematisch manipuliert. In der 1D-NMR-Spektroskopie wird routinemäßig als Apodizationsfunktion die exponentielle Multiplikation (em) der Form
zur Verbesserung des S/N auf Kosten der Auflösung (Signale werden breiter) eingesetzt. Der Faktor „a“ kann über das „line broadening (lb)“ variiert werden. Grundsätzlich hat die em keinen Einfluss auf die Intensitätswiedergabe im Spektrum, jedoch bei dicht beieinanderliegenden Signalen kann durch die Linienverbreiterung die Auswertung wegen Überlagerung unmöglich gemacht werden [14]. Ein lb-Faktor von 0,3 Hz erwies sich im Rahmen der eigenen Validierung als optimal. Die Anwendung der Gauß-Multiplikation als Apodizationsfunktion für die quantitative Auswertung verfälscht nach Herzog und Messerschmidt [30] die Intensitäten im Spektrum.
Um die Intensitäten der Signale im Spektrum richtig wiederzugeben, müssen diese mit mindestens fünf Punkten oberhalb der halben Amplitude dargestellt werden [31, 32]. Bei
Das Frequenzspektrum ist nach der Fourier-Transformation hinsichtlich Phase und Grundlinie zu korrigieren. Rabenstein [26] und Grivet [32] zeigten, dass eine ordentliche Korrektur des Spektrums und eine sorgfältige Integration Grundlagen für eine geringe Messunsicherheit der Methode sind. Hierzu ist zuerst das Spektrum in Phase zu bringen. Während gleichgroße frequenzunabhängige Phasenfehler keinen Einfluss auf das Verhältnis der Intensitäten in einem Spektrum ausüben, bewirkt ein frequenzabhängiger Phasenfehler von 5° einen Fehler von 1 % [26]. Die darauffolgende Korrektur der Grundlinie ist ausschlaggebend für richtige Ergebnisse. Abweichungen von einer idealen Grundlinie üben einen Einfluss auf die Richtigkeit der Integration aus. Die Bestimmung der integralen Signalintensitäten erfolgt routinemäßig mit der elektronischen Integration. Dabei ist die Setzung der Integralgrenzen von den Halbwertsbreiten der auszuwertenden Signale abhängig. Um 99 % der Gesamtintensität eines Signals mit einem Integral zu erfassen, müssen dessen Integrationsgrenzen 64 mal der Halbwertsbreite gesetzt werden; zur Erfassung von 99,9 % sogar 636 mal. Dieser Faktor ist innerhalb eines Spektrums konstant anzuwenden, um Intensitätsverhältnisse mit hoher Richtigkeit zu bestimmen. Er wird in dieser Arbeit als „Integrationsfaktor“ bezeichnet. Geringe Abweichungen von einer optimalen Phase oder Grundlinie – zu Erkennen an nicht geraden An- und Ausläufen der Integralzüge – können mit Hilfe der Korrekturfunktion BIAS und SLOPE am Integralzug ausgeglichen werden. Mit BIAS wird dabei die Grundlinie in der Vertikalen verändert und mit SLOPE die Steigung der Grundlinie beeinflusst. Integralzüge mit geradem An- und Auslauf geben die Intensität eines Signals richtig wieder.
Im Gegensatz zum SP-NMR-Experiment bestehen Multi-Pulse (MP)-Experimente aus mindestens zwei Impulsen. Bei den in dieser Arbeit betrachteten MP-Sequenzen wird der zweite Impuls bzw. mehrere Impulse entweder vor dem Anregungsimpuls (Presaturation, LC1WET), nach dem Anregungsimpuls (Watergate) oder auf einem zweiten Einstrahlkanal zeitgleich zum Anregungsimpuls (13C-NMR mit Entkopplung) eingesetzt.
Vor allem bei wässrigen Lösungen ist es oftmals der Fall, dass der dynamische Bereich zur Darstellung schwacher Signale neben dem intensiven Wassersignal nicht ausreicht. Für die
Die drei in dieser Arbeit untersuchten Unterdrückungsmethoden (Presaturation, Watergate, LC1WET) gehören zu den preacquisition methods, deren relevanten Grundlagen hier kurz beschrieben werden. Einen allgemeinen Überblick über Lösungsmittelunterdrückung und verschiedene Techniken dazu gibt die Arbeit von Gueron et al. [36] wieder.
Die Presaturation – Vorsättigen des Wassersignals - ist die einfachste Lösungsmittelunterdrückungs-Technik [19], deren zeitlicher Ablauf in Abbildung 3.2 dargestellt ist. Mit einem schwachen Radiofrequenzimpuls wird selektiv das Wassersignal direkt vor dem 90°-Anregungsimpuls gesättigt.
Um eine gute Wassersättigung zu erreichen, ist neben einer guten Auflösung des Spektrometers eine Sättigungsdauer von 2s bis 3s notwendig, um die Populationsdifferenz aufzuheben. Ferner kann mit der Impulsstärke des Sättigungsimpulses der Sättigungsbereich verändert werden. Eine höhere Impulsleistung führt zur besseren Sättigung aufgrund eines breiteren Sättigungsbereiches. Hingegen ist für eine hohe Selektivität ein minimaler Sättigungsbereich nötig. Folgerichtig muss ein Optimum zwischen Selektivität und Güte der Sättigung gefunden werden. In der Literatur sind hierfür als Richtwerte Sättigungsbreiten von 20Hz [15] bzw. 25Hz [37] angegeben.
Die Watergate-Sequenz zur Wasserunterdrückung gehört seit der routinemäßig eingesetzten Gradiententechnik mit zu den am meisten eingesetzten Methoden [19]. Die zwischen dem Anregungsimpuls und der Aufnahmezeit eingebettete Pulssequenz besteht, wie in Abbildung 3.3 dargestellt, aus zwei identischen Gradientenimpulsen (Gauß-Shape), die eine 180°-Spinecho-Sequenz aus drei Pulspaaren (3-9-19) umschließen.
Die durch den Anregungsimpuls aufgebaute transversale Magnetisierung wird durch den ersten Gradientenimpuls dispergiert und anschließend durch die kombinierten Effekte der Spinecho-Sequenz und des zweiten identischen Gradientenimpulses mit Ausnahme des Wassersignals refokussiert. Insgesamt wird durch die selektive Dephasierung des Wassersignals eine exzellente Wasserunterdrückung bewirkt [38]. Aufgrund der eingesetzten Binomial-Sequenz findet diese selektive Dephasierung zusätzlich in Abständen von 1/(2*d2) statt. Um richtige Intensitäten im Spektrum zu erhalten, ist die zeitliche Symmetrie zwischen den beiden Gradientenimpulsen aufgrund der Spin-Echo-Sequenz von großer Bedeutung. Nachteilig wirkt sich die Watergate-Sequenz auf in der Nähe des Wassersignals liegende Signale durch partielle Unterdrückung aus [39].
Die Sequenz besteht aus einer WET-Pulsfolge von Gauß-geshapten Anregungsimpulsen geringer Anregungsbreite und Anregungswinkeln von 81,4°, 101,4°, 69,3° und 161,0°. Dabei regt jeder Impuls selektiv das Wassersignal an, dessen aufgebaute transversale Magnetisierung durch den darauffolgenden Gradientenimpuls dispergiert wird. Durch die viermalige Anwendung wird eine gute Wasserunterdrückung erreicht. Dabei wird die Inhomogenität des B1-Magnetfeldes reduziert und wegen der unterschiedlichen Gradientenimpulsstärken von 8:4:2:1 ein Gradientenecho verhindert. Die darauffolgende Composite-Pulsfolge 90x, 90y, 90-x, 90-y trägt zu einer weiteren Unterdrückung des Wassersignals sowie ebenfalls zur Reduzierung der Inhomogenität des Magnet-Feldes bei [40].
13C-SP-NMR-Spektren zeigen neben 13C-13C-Kopplungen zusätzlich 13C-1H-Kopplungen, die das Spektrum komplex und linienreich machen. Obendrein werden die ohnehin schon schwachen Intensitäten (geringe natürliche Häufigkeit) durch Aufspaltung der Resonanzlinien in Multipletts um ein Vielfaches verringert. Mit der 1H-Breitband (BB)-Entkopplungstechnik werden die 1H-13C-Kopplungen aufgehoben. Hierbei wird mit Composite-Pulsen (WALTZ-16) über einen zweiten Sendekanal auf den gesamten Protonenfrequenzbereich kontinuierlich eingestrahlt. Man erhält somit ein 1H-entkoppeltes 13C-Spektrum, das generell schmale und intensive Singulett-Signale zeigt. Durch die Entkopplungs-Einstrahlung auf die Protonen wird außerdem ein NOE-Effekt erzeugt, der sich auf die zu messenden 13C-Spins als Intensitätsänderung auswirkt. Dieses führt dazu, dass im Gegensatz zur SP-NMR die Spektrometerkonstante kS bei der 1H-BB-entkoppelten 13C-NMR nicht mehr für alle Resonanzen konstant ist, sondern u.a. von T1 abhängig ist [41]:
Dabei ist k0 die nur von apparativen Faktoren abhängige Konstante und η der Kern-Overhauser-Verstärkungsfaktor. Die Größen η und Τ1 können je nach Bindungszustand und Molekülgröße für die einzelnen 13C-Kerne verschiedene Werte annehmen. Um innerhalb des Spektrums ein konstantes kS zu erhalten, müssen nach Gleichung (3.9) die folgenden drei Forderungen erfüllt werden: Erstens muss η (NOE-Effekt) vernachlässigbar gering werden, damit der Term (1+η) gleich eins wird. Dieses wird mit der Inverse Gated 1H-Decoupling-13C-NMR-Pulssequenz erreicht, bei der zur Minimierung des NOE-Effektes nur während der Anregungs- und Aufnahmezeit entkoppelt wird (die zeitliche Abfolge der Pulssequenz ist in Abbildung 3.5 dargestellt).
Je kürzer dabei die Einstrahldauer des Entkopplerpulses ist, umso geringer wird der auftretende NOE-Effekt. Dazu ist eine möglichst kurze Aufnahmezeit zu wählen. Zweitens ist ein möglichst großes Verhältnis zwischen der Zeitsequenz τ und den T1-Zeiten zu erreichen, damit die e-Funktionen gegen Null und der Quotient gegen eins streben. Bei schnell
Als Kern-Overhauser-Effekt (Nuclear Overhauser Effect, NOE) bezeichnet man die Intensitätsänderung eines beobachteten Signals bei Einstrahlung auf eine andere Resonanzlinie. Hierdurch können 13C-NMR-Signale bei der 1H-BB-Entkopplung bis zu 200% an Intensität gewinnen [17]. Der Grad der Intensitätsänderung wird mit dem Verstärkungsfaktor η charakterisiert, der wie folgt definiert ist [15]:
Dabei geben I bzw. I0 die Intensitäten mit und ohne Einstrahlung auf einen anderen Kern wieder. Veranschaulichen lässt sich die Wirkungsweise vom NOE-Effekt an einem heterogenen Zweispinsystem AX ohne Spin-Kopplung. Der auftretende NOE-Effekt ist nicht an skalare Kopplungen zwischen den Kernen A und X gebunden, sondern wirkt sich über den Raum aus, wobei die Effizienz der Übertragung zum Abstand zwischen eingestrahltem und beobachtetem Kern mit 1/r6 proportional ist [16].
Ausgehend vom Ausgangszustand eines AX-Spin-Systems, dargestellt in Abbildung 3.6A, wird bei Einstrahlung auf Kern A ein Zustand der Sättigung erreicht (Abbildung 3.6B). Durch die zeitgleich stattfindenden, bei Sättigung erlaubten Übergänge W0 (Nullquanten-Übergang) und W2 (Doppelquantenübergang) zusätzlich zu den Einquantenübergängen wird eine vom Gleichgewicht abweichende Besetzungsverteilung erreicht, die sich auf die Intensität des X-
Die Bestimmung von relativen Intensitätsverhältnissen innerhalb eines Spektrums mit der 1H-SP-NMR-Spektroskopie ist die einfachste quantitative Anwendung, da bis auf das Überführen ins NMR-Röhrchen und das Lösen bzw. Verdünnen des Analyten in einem geeigneten Lösungsmittel keine weitere Probenpräparation notwendig ist. Unter der Bedingung einer konstanten kS über die gesamte Spektrenweite kann nach Gleichung (3.1) aus dem Verhältnis der normierten Intensitäten je eines Signals von zwei Komponenten X und Y das Verhältnis der Stoffmengen der beiden Komponenten direkt berechnet werden:
Des Weiteren ist es möglich, den Stoffmengenanteil einer Komponente X in einer Mehrkomponentenlösung direkt aus den Intensitäten aller m Komponenten – ohne Betrachtung des Lösungsmittels – nach folgender Gleichung zu bestimmen:
Ein großer Vorteil der NMR-Spektrometrie besteht darin, dass von jeder zu bestimmenden Komponente nur ein eindeutig zugeordnetes Signal ausgewertet werden muss.
Da die NMR-Spektroskopie eine Relativmethode ist, muss ein Standard bekannter Reinheit dazugewogen werden, um durch den Bezug auf diesen eine absolute Messgröße wie den Gehalt oder die Konzentration berechnen zu können. Hierbei handelt es sich nach DKD-4 [45] um eine Ein-Punkt-Kalibrierung. Um die metrologische Qualität des Ergebnisses des Analysenverfahrens zu bestätigen, spielen hier zertifizierte Referenzmaterialien (ZRM) eine große Rolle [3]. Nur durch diese ist eine Rückführung auf die SI-Einheiten und somit der
In der Literatur finden sich eine Anzahl von Standards, die zu quantitativen NMR-Analysen eingesetzt wurden. Damit eine Substanz sich als Standard für die quantitative NMR-Spektroskopie eignet, sollte sie nach Wells und Cheung [47] folgende Eigenschaften haben: leichte Verfügbarkeit in reiner Form, billig, stabil, löslich sowohl in organischen als auch wässrigen Lösungsmitteln, nicht-hygroskopisch, chemisch inert, geringer Dampfdruck und möglichst wenig Resonanzlinien. Letzteres wird auch von Griffiths und Irving [48] für einen idealen Standard gefordert. Larive [49] diskutierte den großen Vorteil der quantitativen NMR gegenüber vielen anderen spektroskopischen Methoden, der darin besteht, dass zur Quantifizierung kein Standard mit hohem Reinheitsgrad benötigt wird. Jeder primäre analytische Standard könne eingesetzt werden, sofern seine Reinheit bekannt ist und seine Verunreinigungen die Analyse nicht behindern. Als optimal für eine hohe Richtigkeit ist ein Intensitätsverhältnis von ungefähr eins im Spektrum zwischen den auszuwertenden Signalen von Analyt und Standard [22].
Bei der Verwendung von Standards unterscheidet man zwischen internen Standards, die der Lösung direkt beigewogen werden, und externen Standards. Letzteres kann entweder mit einem zweiten NMR-Röhrchen, nacheinander im selben NMR-Röhrchen oder aber mit einer im Mess-Röhrchen befindlichen Kapillare gemeinsam erfolgen. Während interne Standards eine einfachere Handhabung des Verfahrens und der Berechung aufweisen, wird beim zweiten Verfahren die Kontamination der Analytlösung mit dem Standard vermieden. In dieser Arbeit wird wegen der einfacheren Handhabung und daraus resultierend dem einfacheren Unsicherheitsbudget nur mit internen Standards verfahren.
Eine weitere Möglichkeit von Standards zeigten Akoka et al. [50] und Silvestre et al.[51] mit der ERETIC-Methode (Electronic REference To access In vivo Concentrations). Hierbei wird als Standard ein künstlich erzeugter pseudo-FID über eine zweite Senderspule elektronisch zum FID eingespeist. Der Vorteil dieser Methode ist, dass das Signal an jede beliebige Stelle im Spektrum hingesetzt werden kann. Nachteilig wirkt sich die schlechte Präzision aus. Über einen Zeitraum von einem Monat betrug die Streuung der Kalibrierungen 3%.
Generell existieren zwei Möglichkeiten der Reinheitsanalyse, die der direkten Analyse über die Hauptkomponente und die der indirekten Analyse über die Verunreinigungen.
Bei der direkten NMR-Analyse wird die Hauptkomponente gegen einen internen Standard ausgewertet. Der Vorteil dieser Methode ist, dass nur die eindeutige Zuordnung eines opti
Im Gegensatz zur direkten Analyse sind bei der indirekten alle Verunreinigungen zu identifizieren, deren Signale im Spektrum qualitativ zuzuordnen und quantitativ gegen einen Standard auszuwerten. Die Berechnung des Reinheitsgrades des Analyten erfolgt dabei als Differenz zu 100%. Das Problem dabei ist, dass nicht detektierbare Verunreinigungen (z.B. anorganische Salze für 1H- und 13C-NMR) bei der Berechnung des Reinheitsgrades nicht erfasst werden.
Für eine Analyse mit hoher Richtigkeit ist bei nicht genauer Kenntnis der enthaltenen Verunreinigungen die direkte Methode über die Hauptkomponente die bessere Wahl und wird deswegen in dieser Arbeit verwendet. Nur wenn die qualitative Zusammensetzung der Substanz bekannt ist, führt der zweite Weg ebenfalls zu einem richtigen Ergebnis. Die Obergrenze für einen bestimmbaren Gehalt des Hauptbestandteils ist von der Unsicherheit der Methode abhängig [52].
Bei der Gehaltsanalyse wird der Gehalt eines Analyten in einer Matrix bestimmt. Hierfür ist bei der NMR-Spektroskopie die Analyse auf einen Standard mit bekanntem Reinheitsfaktor zurückzuführen. Die Vorgehensweise entspricht dem der direkten Reinheitsbestimmung mit einer ähnlichen Messgleichung, die wie folgt aussieht:
wobei mMatrix die Einwaage der Analytlösung (Matrix) und fStd den Reinheitsfaktor des Standards wiedergibt.
Die ISO/IEC 17025 [53] schreibt vor, Analysenergebnisse mit einer Messunsicherheit anzugeben. Ferner wird durch die Definition einer primären Methode ein vollständiges Unsicherheitsbudget zur Angabe der Messunsicherheit gefordert. Es sollen daher die Unsicherheitsbudgets für die vier in den vorangegangenen Kapiteln beschriebenen quantitativen Anwendungsmöglichkeiten der NMR-Spektroskopie dargestellt werden. Zugrunde gelegt werden dazu die Leitfäden von ISO [11], der sogenannte GUM, und EURACHEM [55].
Die Messunsicherheit eines Verfahrens oder einer Methode setzt sich aus den Standardunsicherheiten der Eingangsgrößen x1, x2, ..., xn zusammen, die in der kombinierten Standardunsicherheit uc(y) einer Messgröße in Abhängigkeit von den Eingangsgrößen
y(x1,x2, ..., xn) erfasst und schließlich als erweiterte Messunsicherheit U mit dem betrachteten Grad des Vertrauens p und dem Erweiterungsfaktor k angegeben werden.
Bei der Betrachtung der Standardunsicherheiten von Eingangsgrößen unterscheidet GUM nach solchen, deren Werte statistisch ermittelt wurden (Typ A), und solchen, die nicht aus mehrmaligen Beobachtungen gewonnen wurden (Typ B).
Für die Berechnung der Standardunsicherheit u(xi) nach Typ A gilt, dass sie gleich der Standardabweichung
Die Anzahl der Freiheitsgrade fi von u(xi) ist bei n Messungen gleich n-1.
Standardunsicherheiten vom Typ B können z.B. aus den Angaben der Hersteller, Daten von Zertifikaten oder Kalibrierscheinen übernommen werden. Ist diese dabei als ein Vielfaches einer Standardabweichung bzw. als erweiterte Messunsicherheit angeben, so errechnet sich die Standardunsicherheit als Quotient aus dem angegebenen Wert und dem Multiplikationsfaktor.
Die kombinierte Standardunsicherheit uc(y) einer Messgröße y(x1,x2, ..., xn) in Abhängigkeit von den Eingangsgrößen xi berechnet sich im Falle unkorrelierter Eingangsgrößenals positive Quadratwurzel aus der Quadratsumme aller Unsicherheitsbeiträge u(y,xi)=ci ∙ u(xi) der n Eingangsgrößen [11]:
Dabei beschreiben die ci
, gegeben durch die partiellen Ableitungen ∂y(x1, x2, ...,xn)/ ∂xi, die Variation des Ausgangsgrößenwertes y bei Veränderung der Werte für die Eingangsgrößen x1,x2, ..., xn
und werden als Empfindlichkeitskoeffizienten bezeichnet [11]. Für den Fall, dass die Eingangsgrößen nur als Produkte oder Quotienten in der Messgleichung auftreten (z.B.
wobei u(xi)/xidie relativen Unsicherheiten der Eingangsgrößen x1, x2, ..., xn beschreiben. Nach der Empfehlung des GUM (genauer: nach der dort zitierten Empfehlung INC-1 (1980), Absatz 5 einer internationalen Arbeitsgruppe zur Angabe von Unsicherheiten) ist die Messunsicherheit mit einem Grad des Vertrauens p anzugeben, der den Bereich um das Messergebnis angibt, mit dem ein p-entsprechender Anteil der Verteilung der Werte umfasst wird, die der gemessenen Größe sinnvollerweise zugeordnet werden können [11]. Dieses zusätzliche Maß der Unsicherheit wird als erweiterte Unsicherheit U bezeichnet. Durch Multiplikation der kombinierten Standardunsicherheit mit einem Erweiterungsfaktor k erhält man die erweiterte Unsicherheit:
Als Erweiterungsfaktoren werden Faktoren von k=2 oder k=3 allgemein verwendet, die als Schätzwert ein Konfidenzniveau von p=95% bzw. p=99% angeben. Diese Schätzung gilt jedoch nur für eine große Anzahl von Mehrfachmessungen. Ist diese Anzahl n kleiner als 10 [54], so ist der effektive Freiheitsgrad feff einer kombinierten Standardunsicherheit nach der Welch-Satterthwaite-Formel zu berechnen:
Der Erweiterungsfaktor k wird dann in Abhängigkeit vom effektiven Freiheitsgrad feff und dem beabsichtigten Grad des Vertrauens p (Konfidenzintervall) aus GUM [11, Tabelle G.2] entnommen.
Die Vorgehensweise zur Berechnung der Messunsicherheit eines Analysenergebnisses lässt sich in die folgenden vier Schritte aufgliedern [55]:
Spezifikation der Messgröße
Identifizierung der Unsicherheitsquellen
Quantifizierung der Unsicherheitskomponenten
Berechnung der gesamten Unsicherheit.
Der erste Schritt, die Spezifikation der Messgröße in Abhängigkeit der Eingangsgrößen, erfolgte bereits für die vier Anwendungsgebiete der quantitativen NMR im Kapitel 3. Für den zweiten Schritt, der Identifizierung der Unsicherheitsquellen, ist es sinnvoll, in einem Ursachen-Wirkungs-Diagramm die Eingangsgrößen und deren Einflussgrößen gemäß der Gleichung der Messgröße darzustellen. Die Vorgehensweise zum Aufstellen eines solchen Diagramms beschreiben Ellison und Barwick [56] in Übereinstimmung mit der ISO 9004-4 [57]. Für die vier Anwendungen der quantitativen NMR-Spektroskopie erfolgt dies in der Abbildung 4.1.
Die einzelnen Unsicherheitsbeiträge der Eingangsgrößen Intensitätsverhältnis (Integration), Anzahl der zur Resonanzlinie beitragenden Kerne Ni , Molmasse Mi, Einwaage mi sowie Reinheitsgrad PStd bzw. -faktor fStd sollen nun näher betrachtet werden.
Generell kann aus einem NMR-Spektrum nur die Information über das Intensitätsverhältnis erhalten werden, dessen Präzision nach Typ A durch Mehrfachmessungen zu ermitteln ist. Werden die Messungen direkt nacheinander durchgeführt, so erhält man die Wiederholpräzision. Dagegen spricht man von der Vergleichspräzision, wenn die Messungen z.B. zeitlich versetzt mit jeweiligen Shimmen des Systems ausgeführt werden. Die in dieser Arbeit aufgeführten Standardunsicherheiten der Integration geben die Vergleichspräzision wider (Kriterium: unterschiedliche Shim-Zustände). Die Berechnung der Unsicherheit des Intensitätsverhältnisses erfolgt nach Gleichung (4.1), in der nicht nur die Unsicherheit der Integration, sondern die des gesamten Systems der Spektrenaufnahme (Shimmen, Aufnahme, Prozessierung, Spektrenkorrekturen und Integration) berücksichtigt.
Die Anzahl von Kernen, die zu einer Resonanzlinie beitragen, sind gemäß der Summenformel einer Substanz eine Integergröße, sofern keine Reaktion stattfindet (z.B. Deuterierung von Protonen durch Lösungsmittel in der 1H-NMR). Generell ist für quantitative Analyse mit der NMR-Spektroskopie die Stabilität der auszuwertenden Signale Voraussetzung und mittels Stabilitätsuntersuchungen zu belegen. Eine Unsicherheit ist daher nicht zu betrachten.
Die Standardunsicherheit der Molmasse u(Mi) wird nach Typ B ermittelt und setzt sich aus den Unsicherheiten der Atommasse gemäß der Summenformel der betrachteten Komponente zusammen. In der Zeitschrift „Pure and Applied Chemistry“ wird von der IUPAC regelmäßig eine Tabelle mit den relativen Atommassen aller Elemente und deren Unsicherheiten veröffentlicht. Da sich die Molmasse als Summe unabhängiger Eingangsgrößen berechnet, wird die Standardunsicherheit der Molmasse nach GUM [55, Kapitel 8.2.6, Regel 1] wie folgt berechnet [58]:
Die Standardunsicherheit einer Einwaage u(mi) wird vor allem durch die Unsicherheiten der Wiederholbarkeit uW(mi) und die der Nichtlinearität uNichtlinearität(mi) ermittelt, die aus den Herstellerangaben der Waage nach Typ B herangezogen werden können.
Die Unsicherheit der Wiederholbarkeit kann direkt aus dem Datenblatt entnommen werden. Darin ist die Unsicherheit der Ablesegenauigkeit enthalten. Will man die Unsicherheit nach Typ A ermitteln, so ist eine Messreihe von n Wägungen durchzuführen und die Wiederholpräzision zu berechnen, die als Standardunsicherheit folgendermaßen angegeben wird:
Die Linearitätsabweichung wird allgemein als maximale Abweichung Δm vom wahren Wert im Datenblatt angegeben. In der Annahme einer gleichmäßigen Verteilung (Rechteckverteilung) wird somit die Unsicherheit der Nichtlinearität wie folgt berechnet:
Der Vorgang einer Einwaage besteht aus zwei Wägvorgängen (Tara- und Bruttoeinwaage), wodurch die Nichtlinearität zweimal zu berücksichtigen ist. Da diese beiden Ablesungen voneinander unabhängig sind, geht die Standardunsicherheit der Nichtlinearität zweimal ein. Die kombinierte Unsicherheit berechnet sich daher aufgrund unabhängigen Eingangsgrößen wie folgt:
Will man die Unsicherheit der Nichtlinearität nach Typ A bestimmen, so ist die maximale Differenz aller ermittelten Messwerte, das Intervall
Die in dieser Arbeit ausgeführten Wägungen erfolgten mit einer Ablesegenauigkeit von
0,1mg auf einer Sartorius BP 121 S und mit einer Ablesegenauigkeit von 0,01mg auf einer
Im Rahmen der routinemäßig durchgeführten Überprüfungen der Waagen wurde durch den DKD eine Kalibrierung der Sartorius BP 121 S vorgenommen. Hierzu wurden mit einem Eichgewicht von 100g sechs Messungen ausgeführt, deren Standardabweichung zu 0,05mg bestimmt wurde. Die maximale Abweichung von 0,1mg (
Die Standardunsicherheit des Reinheitsgrades bzw. des Reinheitsfaktors eines Standards kann bei einem ZRM direkt aus dem Zertifizierungsschein nach Typ B übernommen werden. Ist dabei ein Erweiterungsfaktor angegeben worden, so ist die angegebene Unsicherheit durch diesen Faktor zu dividieren. Liegt bei Einsatz eines anderen Standards keine Angabe über die Unsicherheit des Reinheitsgrades vor, so ist die Reinheit experimentell zu ermitteln und mit der Unsicherheit des eingesetzten Verfahrens zu belegen.
Zusammengefasst ergeben sich somit die nach Gleichung (4.3) aufgestellten kombinierten Messunsicherheiten für Stoffmengenverhältnis und -anteil zu
und für die Gehaltsanalyse zu
Die im Kapitel 4.2 beschriebene Messunsicherheit für quantitative NMR-Messungen berücksichtigt nur zufällige Abweichungen der Eingangsgrößen im Unsicherheitsbudget. Um die Messunsicherheit eines Analysenverfahrens vollständig zu beschreiben, ist zusätzlich die Ermittlung systematischer Abweichungen nötig. Hierzu wird ein Soll-Ist-Vergleich des Mittelwertes der Analysenergebnisse
beschreibt die systematische Abweichung des Analysenwertes vom Referenzwert, deren Standardunsicherheit u(ΔAnl) wie folgt berechnet wird:
Über das Ausmaß der systematischen Abweichung gibt das folgende Kriterium Auskunft [7]:
Bei Nichterfüllung dieser Gleichung liegt eine signifikante systematische Abweichung vor, die entweder zu eliminieren (Analysenverfahren verbessern) oder rechnerisch zu korrigieren ist (Korrekturterm). Kann davon ausgegangen werden, dass diese systematische Abweichung nicht konstant auftritt, so ist sie als Unsicherheitsbeitrag direkt im Unsicherheitsbudget zu berücksichtigen. Allgemein wird bei Erfüllung dieses Kriteriums (Gleichung 4.16) die systematische Abweichung als nicht signifikant eingestuft und daher vernachlässigt [7]. Diese Vorgehensweise hat zur Folge, dass zwar für ΔAnl ≤ u(ΔAnl) (Fall 1) der Analysenwert einschließlich der kombinierten Unsicherheit in der erweiterten Messunsicherheit des Verfahrens vollständig erfasst wird, bei u(ΔAnl)<ΔAnl ≤ 2u(ΔAnl) (Fall 2) jedoch nicht (Abbildung 4.2, schwarze Linien).
In der vorliegenden Arbeit soll die Messunsicherheit eines Analysenverfahrens entsprechend der Anlage 1 zum QMH-I-5 der BAM, dem Konzept zur Ermittlung und Angabe von Messunsicherheiten der Abteilung I [59], berechnet werden. Hiernach werden auch geringfügige Abweichungen, die obiges Kriterium erfüllen (Gleichung 4.16), im Unsicherheitsbudget eingerechnet. Die im Kapitel 4.2 aufgestellten Unsicherheitsbudgets für die vier Anwendungsgebiete (Gleichungen 4.11, 4.12 und 4.13), hier als uc(xAnl) bezeichnet, müssen zur Betrachtung der Messunsicherheit des Analysenverfahrens um die Beiträge der systematischen Abweichung ΔAnl und der Unsicherheit des Referenzwertes u(xRef) erweitert werden. Man erhält somit für die Messunsicherheit eines Analysenverfahrens die folgende kombinierte Unsicherheit:
Hierbei wird auch der Fall 2 der Abbildung 4.2 mit der so berechneten Messunsicherheit des Verfahrens (rote Linie) vollständig miterfasst.
Zu den Aufgaben des CCQM gehört es, Messunsicherheiten chemisch-analytischer Messmethoden zu beschreiben und die Richtigkeit zu verbessern. Das Labor I.31 der BAM wurde vom CCQM mit der Organisation von internationalen Ringversuchen zur Ermittlung der Leistungsfähigkeit der quantitative NMR-Spektroskopie beauftragt. Die Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen mit der 1H-SP-Technik ist – wie in den Kapiteln 3.2 und 3.5 beschrieben – die einfachste Anwendung der quantitativen NMR-Spektroskopie und eignet sich daher ideal zur Ermittlung der metrologischen Qualität der Methode (Spektrenaufnahme, -prozessierung und -auswertung).
Die Bestimmung der Messunsicherheit einer Methode erfordert neben der Evaluierung und Validierung die Durchführung von Ringversuchen zur Ermittlung der Vergleichspräzision. Während die ersten beiden Punkte schon ausführlich bearbeitet wurden [14, 8], sind die bisher in der Literatur in geringer Zahl veröffentlichten Ringversuche entweder nur mit einer kleinen Teilnehmeranzahl [60] oder mit einem spezifizierten Gerät [61] organisiert worden. Es ist jedoch wichtig, eine allgemeingültige Aussage über die Leistungsfähigkeit der NMR-Spektroskopie unabhängig vom Hersteller oder der Magnetfeldstärke zu treffen, die auf einer großen Anzahl von Teilnehmerdaten beruht. Daher wurden parallel zu den internationalen Ringversuchen, an denen sich nur Nationale Metrologieinstitute bzw. von diesen beauftragte Labore beteiligten, entsprechende Ringversuche auf nationaler Ebene mit Teilnehmern aus Industrie, Forschung und Hochschulen ausgerichtet.
Die Messunsicherheit der Methode sollte unter optimalen Bedingungen bestimmt werden. Hierzu gehört die unproblematische Auswertung des 1H-Spektrums einer zu analysierenden Modell-Lösung. Dafür wurden folgende Ansprüche an eine ideale Modell-Lösung gestellt:
Die Substanzen sollten möglichst schmale Singulett-Signale im Spektrum aufweisen.
Der Abstand zwischen den einzelnen Signalen sollte im Spektrum so groß sein, dass die 13C-Satelliten der Protonensignale sich nicht überlagern. Somit ist eine problemlose Integration aller Signale sichergestellt, d.h. keine Überlagerung der Signale und der Integrationsbereiche.
In den jeweils zu integrierenden Bereichen sollten keine signifikanten Fremdsignale
(z. B. vom Lösungsmittel) vorliegen.
Die eingesetzten Substanzen sollten einen Reinheitsgrad ≥99% besitzen.
Die Modell-Lösung sollte stabil sein.
Die Notwendigkeit einer Arbeitsanweisung für die Aufnahme und Auswertung quantitativer 1H-SP-NMR-Spektren zum Erhalt von Messergebnissen mit hoher Richtigkeit und Präzision wurde aus den ersten beiden von der BAM organisierten Ringversuchen NMR-1 und CCQM-4 deutlich [62, 63]. Hierbei zeigten die unter Laborroutine aufgenommenen und ausgewerteten Spektren gravierende Abweichungen sowohl zum gravimetrischen Referenzwert (bis 100 % relativ) als auch zwischen den einzelnen Teilnehmern, die auf falsche Parameterwerte, auf unzureichende Spektrenkorrekturen (Phase und Grundlinie) und die Handhabung der Integration zurückzuführen waren. Andererseits wurde bei der Validierung der Methode bei sorgfältiger Arbeitsweise laborintern eine relative Messunsicherheit von unter 1,5 % erreicht [14]. Aufbauend auf dieser Validierung wurde die folgende Arbeitsanweisung zur Aufnahme, Prozessierung und Auswertung quantitativer SP-NMR-Spektren erarbeitet.
Die Aufnahme und Prozessierung der Spektren erfolgt mit den in Tabelle 5.1 aufgeführten validierten Werten für die wichtigsten Parameter. Geräte- und probenspezifische Parametergrößen wie die Impuls-Stärke und -Länge des 90°-Anregungsimpulses, der Receiver Gain (RG) sowie die längste T1
-Zeit der auszuwertenden Signale zur Setzung des Relaxationsintervalls (D1) sind vor der Messung zu bestimmen. Bei einer guten Auflösung des Spektrums kann es notwendig sein, die Anzahl der Datenpunkte (TD) zu verdoppeln und
Nach der Fourier-Transformation mit vorheriger exponentieller Multiplikation des FIDs sind Phasen und Grundlinie im Spektrum sorgfältig zu korrigieren. Die Integrationsgrenzen sind in Abhängigkeit von den Halbwertsbreiten der auszuwertenden Signale mit einem konstanten Integrationsfaktor multipliziert zu setzten. Dabei ist die Erfassung der 13C-Satelliten aus der 1J(CH)-Kopplung bei allen Signalen gleich zu handhaben. Die partielle Mitintegration dieser 13C-Satelliten ist bei der Auswertung zu berücksichtigen (Korrektur der Intensität entsprechend je 13C-Satellit um 0,55%). Die 13C-Satelliten aus den 2J(CH)-Kopplungen liegen bei einem Integrationsfaktor von 64 bei Halbwertsbreiten von generell >0,6Hz immer im Integrationsbereich. Anschließend sind die gesetzten Integrale einzeln auf maximale Darstellung auf dem Monitor zu vergrößern und gegebenenfalls mit BIAS und SLOPE (Bruker-Nomenklatur) auf geraden Integralzuganlauf und -auslauf zu korrigieren. Die Berechnung von Stoffmengenverhältnissen aus den Intensitätswerten des Spektrums erfolgt nach Gleichung (3.11), die von Stoffmengenanteilen nach Gleichung (3.12).
Ziel des zweiten vom CCQM beauftragten internationalen Ringversuchs CCQM-P3 sowie des parallel verlaufenden nationalen Ringversuches NMR-2 war die Bestimmung der Messunsicherheit von quantitativen Aussagen der 1H-NMR an einer Modell-Lösung, deren Spektren nach einer Arbeitsanweisung aufgenommen und ausgewertet werden sollten.
Die Darstellung der Ergebnisse der beiden Ringversuche erfolgte in Diagrammen, die tabellarische Wiedergabe der Teilnehmerwerte befindet sich im Anhang (Kapitel 9). Die erweiterte Unsicherheit für ein 95%iges Konfidenzintervall wurde aus den Angaben der Teilnehmer nach den Gleichungen (4.1) und (4.4) mit n=5 und k=2,8 berechnet. Zusätzlich zur Angabe der Absolutwerte sind die Abweichungen der Messwerte von den gravimetrischen Referenzwerten entsprechend Gleichung 4.14 und deren erweiterte Unsicherheiten berechnet worden und zur besseren Ablesbarkeit der Richtigkeit der Teilnehmerdaten als zweite Ordinate in den Diagrammen mit dargestellt. Ein Erwartungsbereich von ±2% relativer Abweichung sowie der gravimetrische Referenzwert werden durch Hilfslinien in den Diagrammen wiedergegeben.
Die Einhaltung der im Kapitel 5.1.1 aufgeführten Forderungen bei der Auswahl der Substanzen und des Lösungsmittels erwies sich als schwierig. Viele der mit dem geforderten Reinheitsgrad von ≥99% infrage kommenden Substanzen waren entweder nicht stabil, zeigten keine Singuletts oder überlagerten sich mit anderen Signalen im Spektrum. Ferner enthalten
Deuteriertes Chloroform (CDCl3) reagierte mehrfach mit den ausgewählten Substanzen (speziell mit substituierten Benzol-Systemen). Nach wenigen Tagen konnten, wie in der Abbildung 5.2 erkennbar, Fremdsignale mit einer relativen Intensität von ca. 0,5% und mehr nachgewiesen werden.
Indessen erwies sich deuteriertes Benzol (C6D6) als ein chemisch inertes und somit geeignetes Lösungsmittel. Somit wurden aus den fünf in Tabelle 5.2 aufgeführten, in C6D6 gelösten kommerziellen Produkten mit einer vom Hersteller angegebenen Reinheit von jeweils >99% (Ausnahme: D4 >98%) Modell-Lösungen für die beiden Ringversuche hergestellt.
Lediglich beim ETS konnte der angegebene Reinheitsgrad nicht bestätigt werden. Das 1H-NMR-Spektrum enthielt intensive Signale der o-isomeren Verbindung, deren relativer Stoffmengenanteil, wie in Abbildung 5.3 dargestellt, zu 2% bestimmt wurde. Die Integration des ETS-Signals inklusive der o-isomeren Verbindung gibt die der Einwaage entsprechende Intensität richtig wieder.
Die molare Zusammensetzung der für den internationalen Ringversuch zu analysierenden Modell-Lösung wurde vom CCQM vorgegeben. Diese sollte aus einer Haupt- und vier Nebenkomponenten mit je einem relativen Stoffmengenanteil im Bereich von 1% bis 2% bestehen. Für den nationalen Ringversuch NMR-2 wurde der Stoffmengenanteil der Nebenkomponenten auf jeweils ca. 1% zur Hauptkomponente verringert. Die daraus resultierenden Einwaagen und molaren Zusammensetzungen der beiden Ringlösungen CCQM-P3 und NMR-2 sind den Tabellen 5.3 und 5.4 zu entnehmen.
Die Abbildung 5.4 gibt das 1H-NMR-Spektrum der auszuwertenden Signale im aliphatischen Bereich der beiden Ringlösungen sowie deren Zuordnung zu den Substanzen wieder. Um die Stabilität der Lösungen zu kontrollieren, wurden vor Versenden der Probe – und bis zu einem Jahr später – mehrfach Spektren aufgenommen sowie die Lösungen einer thermischen Belastung (drei Wochen bei 44°C) ausgesetzt. Die Auswertungen der Spektren bestätigten die Stabilität der Lösungen.
Die Teilnehmer der Ringversuche erhielten je eine Ampulle mit 1,2ml Ringlösung (ausreichend zur Befüllung eines 5mm NMR-Probenröhrchens), die Arbeitsanweisung sowie ein Mess- und Ergebnisprotokoll. Zur Bestimmung der Vergleichspräzision war die Probe mit den validierten Standardparametern (Tabelle 5.1) an fünf verschiedenen Tagen je einmal zu messen. Das Relaxationsintervall (D1) war entsprechend der längsten T1-Zeit aller auszuwertenden Signalen – hier 4,0s für ETS – auf 15 s einzustellen. Die Akkumulation von 128 Scans sollte generell bei allen NMR-Spektrometern zu einem ausreichenden S/N (>150) führen. Die Auswertung der Spektren hatte nach dem im Kapitel 5.1.2 beschriebenen Verfahren zu erfolgen, wobei bei der Setzung der Integrale ein Integrationsfaktor von 64 anzuwenden war, um mindestens 99% der Gesamtintensität jedes Signals mit dem Integral zu erfassen. Alle verwendeten Parameter sowie die chemischen Verschiebungen, Halbwertsbreiten, Integrationsbereiche und die Intensitäten eines jeden Signals waren ins Messprotokoll aufzunehmen. Ferner sollten Abweichungen von der Arbeitsanweisung – auch gerätespezifische (z.B. Parameter für den 90°-Impuls) – im Messprotokoll dokumentiert werden. Im Ergebnisbericht waren die Stoffmengenverhältnisse bezogen auf D4 – nach Gleichung 3.11 berechnet – sowie die Schätzwerte und deren Standardabweichungen anzugeben. Die Analyse sollte in zwei Monaten durchgeführt und anschließend das Mess- und Ergebnisprotokoll inklusive eines Spektrums zurückgesendet werden.
Zehn Nationale Metrologieinstitute – in Tabelle 5.5 aufgelistet – nahmen am internationalen Ringversuch CCQM-P3 teil. Dabei lieferte die BAM zwei voneinander unabhängige Messergebnisse ab, so dass insgesamt elf Teilnehmerergebnisse vorlagen. Die eingesandten Analysenergebnisse der Teilnehmer sind der Tabelle 11.1 zu entnehmen und wurden in der Abbildung 5.5 als Diagramme graphisch dargestellt.
Um die Messunsicherheit der Methode zu bestimmen, wurden die Teilnehmerergebnisse jeder Komponente gemittelt, die Abweichungen zu den gravimetrischen Referenzwerten und deren Unsicherheiten entsprechend den Gleichungen 4.14 und 4.15 berechnet und in Tabelle 5.6 zusammengefasst.
Gemäß der Gleichung 4.16 stellten sich bei den beiden Komponenten Par und Cy12 die Abweichungen der gemittelten Analysenergebnisse zu den gravimetrischen Referenzwerten als signifikant heraus. Eine Analyse der hierfür verantwortlichen Einflussgrößen war daher notwendig und wird im Kapitel 5.3 beschrieben. Die relative Messunsicherheit (k = 2,
p=95%) der Methode wurde entsprechend Gleichung 4.17 beim ETS zu 2,2%, beim Dur und Cy12 zu 4% und beim Par zu 6% bestimmt.
Aus den Intensitätswerten der Einzelmessungen wurden analog zum CCQM-4 nach Gleichung (3.12) die Stoffmengenanteile berechnet (Tabelle 11.2). Die graphische Darstellung dieser Werte zeigt in Abbildung 5.6 ein ähnliches Bild wie die Darstellung der Stoffmengenverhältnisse in Abbildung 5.5. Auch hier weichen allgemein die Messergebnisse der Institute KRISS, NIMC und SMU um mehr als 2 % von den gravimetrischen Referenzwerten ab. Beim Dur hingegen liegen die Analysenwerte aller Teilnehmern innerhalb eines Bereiches von ±1 % relativer Abweichung zum Referenzwert, was jedoch auf den hohen Stoffmengenanteil von 94,2% dieser Komponente zurückzuführen war.
Die Mittlung der Teilnehmerergebnisse zeigte bei den Komponenten Par, Dur, Cy12 und D4 geringfügige Abweichungen der Mittelwerte von den gravimetrischen Referenzwerten, (Tabelle 5.7). Lediglich die Komponente ETS wies hier eine signifikante Abweichung auf. Anhand dieses Ringversuches konnte die relative Messunsicherheit (k=2; p=95%) der Methode zur Bestimmung von Stoffmengenanteilen für die Hauptkomponente Dur zu unter 0,2% und für die Nebenkomponenten für Cy12 zu 1,2%, Par zu 2,5%, für D4 zu 3,3% und für ETS zu 5 % berechnet werden.
Zusammenfassend konnte aus dem Vergleich der Ergebnisse dieses Ringversuches mit denen des vorangegangenen (CCQM-4) generell eine Verbesserung der Messunsicherheit der Methode durch den Einsatz einer Arbeitsanweisung festgestellt werden. Die Fehleranalyse der gemittelten Analysenergebnisse der Teilnehmer bezogen auf die gravimetrischen Referenzwerte ergab bei beiden Auswertungsarten erhebliche systematische Abweichungen. Zur Verbesserung der Messunsicherheit sind daher weitere Einflussgrößen zu ermitteln. Dieses wird im Kapitel 5.3 behandelt.
Die Auswertung des nationalen Ringversuches NMR-2 erfolgte analog zu der des CCQM-P3, jedoch unter anonymer Darstellung der Ergebnisse. Von den insgesamt 39 Analysenergebnissen der 33 teilnehmenden Laboratorien (Teilnehmerliste in Tabelle 11.7) wurden 38 in die Auswertung mit einbezogen, da aufgrund eines offensichtlichen Fehlers (ungeeigneter Messkopf) die Werte eines Teilnehmers – mit seinem Einverständnis – nicht berücksichtigt werden konnten. Die BAM gab zwei von einander unabhängige Analysenergebnisse mit den Labor-Identifizierungsnummern 12 und 14 ab. Am Ringversuch waren Teilnehmer mit NMR-Spektrometern der drei Herstellerfirmen Bruker, Varian und Jeol vertreten, wobei die Vielfalt der eingesetzten Gerätetypen von 4,7 T (200 MHz) bis 14,1 T (600 MHz) reichte. Hierbei handelte es sich sowohl um mit Analog- als auch mit Digital-Filter (mit und ohne Oversampling-Technik) ausgestattete NMR-Spektrometer.
Die zugesandten Schätzwerte und deren erweiterte Messunsicherheiten für die Stoffmengenverhältnisse (bezogen auf D4) sind in Tabelle 11.3 aufgelistet.
Die Fehler-Analyse der gemittelten Teilnehmerwerte bezüglich der gravimetrischen Referenzwerte zeigte beim Par eine erhebliche Abweichung, während die Abweichungen der anderen drei Komponenten geringfügig sind (Tabelle 5.8).
Aus den Ringversuchsergebnisses wurde die relative Messunsicherheit der Methode (k=2,
p=95%) für ETS zu 2,5%, für Par zu 5%, für Dur zu 7% und für Cy12 zu 1,9% bestimmt.
Analog zum Ringversuch CCQM-P3 wurden aus den Intensitätswerten der Einzelmessungen die relativen Stoffmengenanteile nach Gleichung 3.12 berechnet (Tabelle 11.4). Die graphische Darstellung der Stoffmengenanteile in der Abbildung 5.8 zeigt, dass bei der Komponente Dur die Analysenwerte aller Teilnehmern um weniger als 1% vom Referenzwert abweichen und bei den beiden Komponenten Par und Cy12 die Abweichungen der Analysenergebnissen vieler Teilnehmer weniger als 2 % betragen.
Die relative Messunsicherheit (k=2; p=95%) der Methode wurde hier für die Hauptkomponente Dur zu 0,12% und für die Nebenkomponenten ETS zu 7%, für Par zu 2,1%, für Cy12 zu 2,4% und für D4 zu 5% ermittelt. Nichtsdestoweniger war gegenüber dem ersten nationalen Ringversuch NMR-1 trotz eines größeren Verhältnisses zwischen der Haupt- und den Nebenkomponenten eine Verbesserung der Messunsicherheit der Methode erzielt worden, wie in der Abbildung 5.9 zu ersehen.
Die Auswertungen der beiden Ringversuche CCQM-P3 und NMR-2 zeigten ein ähnliches Bild. Die Analysen nach der Arbeitsanweisung führten zu einer deutlichen Verbesserung der Genauigkeit der Methode. Dabei wurden bei beiden Auswertungsarten (Stoffmengenverhältnisse und -anteile) die Komponenten von den meisten Teilnehmern mit einer Richtigkeit von besser als 98 % analysiert. Aus der Mittlung aller Teilnehmerdaten mit Bezug auf die gravimetrischen Referenzwerte wurden für die Analysen von Stoffmengenverhältnisse und -anteilen die relativen Messunsicherheiten (k=2; p=95%) zu zwischen 1,2 % und 7 % bestimmt. Lediglich bei der Analyse von Stoffmengenanteilen für die Hauptkomponente wurde eine relative Messunsicherheit von weniger als 0,2 % erzielt. Die Fehler-Analysen der Ergebnisse der Ringversuche zeigten jedoch erhebliche systematische Abweichungen. So traten bei beiden Ringversuchen die folgenden gleichartigen Probleme auf:
zu große Analysenwerte bei den drei Komponenten Par, Dur und Cy12 bei der Auswertung als Stoffmengenverhältnisse bezogen auf D4,
zu kleine Analysenwerte des D4 bei der Auswertung als Stoffmengenanteile und
zu geringe ETS-Analysenwerte bei beiden Auswertungsarten.
Um die Messunsicherheit dieser beiden Methoden zu verbessern, war die Klärung dieser Effekte nötig. Die Ergebnisse wurden den Teilnehmern der beiden Ringversuche mitgeteilt, wobei zur Vereinfachung nur die Standardunsicherheiten betrachtet wurden [64, 65].
Die im Kapitel 5.2 beschriebenen Abweichungen der Teilnehmerergebnisse von den gravimetrischen Referenzwerten machten die Ermittlung weiterer Einflussgrößen notwendig. Deren Auswirkungen auf die Messunsicherheit der Methode werden wegen der größeren Anzahl an Datenwerten an den Teilnehmerergebnissen des nationalen Ringversuchs NMR-2 diskutiert. Diese gelten adäquat für den internationalen Ringversuch CCQM-P3.
Die Auswertung der Messprotokolle und der eingesandten Spektren legte bei den Instituten 10, 24, 28, 35, 36 und 37 dar, dass die Spektrenkorrekturen (Grundlinie und Phase) nicht sorgfältig und die Integration entgegen der Messvorschrift durchgeführt wurden. Die bei den Laboratorien 24 und 37 um 1,1 % relativ zu großen Analysenwerte des Durols sind auf die Miterfassung der 13C-Satelliten bei dessen Intensitätsermittlung ohne Berücksichtung bei der Auswertung zurückzuführen. Die Spektren von Labor 10 enthielten bei 1,10 ppm ein Triplett, bei dem es sich um eine vom Teilnehmer zugeführte Verunreinigung sekundärer Art handelte. Die Miterfassung dieses Signals bei der Auswertung des ETS-Signals bei zwei der
Neben einer schlechten Auflösung (zu breite Signale) weisen diese Spektren signifikante frequenzabhängige Phasenfehler auf, wodurch die Intensitätswerte verfälscht im Spektrum wiedergegeben werden (s. Kapitel 3.2.3). Zudem wurden die Integrationsgrenzen beliebig und von Spektrum zu Spektrum unterschiedlich gesetzt (die Integrationsfaktoren streuen zwischen 5 und 92). Dies bewirkte innerhalb eines Spektrums eine geringe Richtigkeit der wiedergegebenen Intensitäten, wie das Intensitätsverhältnis der beiden ETS-Signale bei ca. 1100 Hz (Quartett) und ca. 200 Hz (Triplett) von 0,05 : 0,18 (Abweichung von ca. 200 % zum natürlichen Verhältnis von 2 : 3) in der Abbildung 5.10 belegt, und zwischen den Spektren eine große Streuung der Analysenergebnisse. Eine derartige Auswertungsroutine muss zwangsläufig zu ungenauen Ergebnissen führen.
Insgesamt führte die nicht sorgfältige Auswertung der Spektren durch den Operator zu ungenauen Ergebnissen und somit zu einer höheren Messunsicherheit der Methode.
Die große Anzahl an Teilnehmer-Werten bei der Komponente ETS im Bereich -2 % bis -6 % relativer Abweichung zum Referenzwert bei beiden Auswertungsarten deuteten auf ein Problem bei der Auswertung dieser Komponente hin. Aus den Angaben der Integrations
Auch hier zeigte sich, dass bei der Setzung der Integralgrenzen Anforderungen an den Operator zu stellen sind, um richtige Analysenergebnisse zu erzielen. So ist der entsprechend dem Integrationsfaktor berechnete Integrationsbereich auf Signale zu untersuchen, bei denen zur vollständigen Erfassung der Integrationsbereich gegenüber dem Integrationsfaktor zu vergrößern ist.
Verallgemeinernd ist daher zu sagen, dass überlagernde Einzelsignale (hier o- und p-ETS) mit einem Integralzug vollständig zu erfassen sind.
Die generell zu großen Teilnehmerwerte der 15 Laboratorien (1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 24, 25, 27, 28, 34 und 35) bei der Auswertung als Stoffmengenverhältnisse und zugleich zu geringe D4-Stoffmengenanteile deuteten auf einen systematischen Fehler bei der Intensitätswiedergabe des D4 hin.
Die in den letzten drei Kapiteln diskutierten Einflussgrößen (sorgfältige Korrektur der Spektren, Integration und Filterweiten) erklären den größten Teil der signifikant abweichenden Teilnehmerergebnisse. Schließt man daher bei der Mittelwertbildung die beiden Institute 35 und 36 aufgrund der flüchtigen Auswertung der Spektren (signifikante Nichteinhaltung der Arbeitsanweisung) aus und berechnet die Stoffmengenverhältnisse auf Cy12, so betragen die daraus ermittelten relativen Messunsicherheiten (k=2; p=95%) beider Methoden (Stoffmengenverhältnisse und -anteile) für die Komponenten Par, Dur und Cy12 zu unter 1,5% (Tabellen 5.10 und 5.5.11). Die hohe relative Messunsicherheit bei der Komponente ETS von 6% ist auf den systematischen Fehler der nicht vollständigen Integration des o-Isomeren zurückzuführen (Kapitel 5.3.2). Schließt man die Institute, die mit Analogfiltertechnik ausgestatteten NMR-Spektrometern arbeiteten (Institute 1 bis 11 und 34), bei der Komponente D4 ebenfalls aus, so liegt die relative Messunsicherheit hier ebenfalls unter
1,5%. Die bei Dur und D4 noch auftretenden signifikanten Abweichungen von unter 1% sind akzeptabel und sollen daher nicht weiter betrachtet werden.
Zur Bewertung des Einflusses des Operators und der unterschiedlichen Gerätetypen wurden die Teilnehmer des NMR-2 Ringversuches um die Zusendung ihrer FIDs (im JCAMP-DX-Format) gebeten. Die von 16 Instituten zur Verfügung gestellten FIDs wurden unter XWinNMR in das Bruker-Format konvertiert und eigenhändig nach Arbeitsanweisung prozessiert, korrigiert und integriert. Dabei sandten die Labor 23 und 32 nur jeweils ein FID zu, so dass hier keine Unsicherheiten berechnet werden konnten. Die Gegenüberstellung der eigenen Analysenergebnisse – Stoffmengenanteile bezogen auf Cy12 zur Vermeidung der Analog-Filter-Problematik (Tabelle 11.5) – gegen die Originaldaten der Teilnehmer in Abbildung 5.5.13 verdeutlichten den Einfluss des Operators auf die Messunsicherheit bei Betrachtung derselben Institutsnummer. Besonders beim Labor 28 war der Einfluss des Operators auf die Richtigkeit sowie bei den Laboren 3 und 10 auf die Präzision der Mess
Zur weiteren Überprüfung des Einflusses vom eingesetzten NMR-Spektrometer auf die Genauigkeit der Methode wurden eigene Vergleichsmessungen bei der Firma Bruker mit einem 500 MHz und einem 800 MHz NMR-Spektrometer (NMR-2 Lösung) und an der HUB mit einem 300 MHz und einem 600 MHz NMR-Spektrometer (CCQM-P3-Lösung) nach Arbeitsanweisung (Ausnahme 600 MHz NMR-Spektrometer: Spektren- und Filterweite aufgrund Analog-Filter auf 15 ppm bzw. 33 ppm heraufgesetzt) durchgeführt. Die Auswertungen dieser Vergleichsmessungen dokumentierten die Unabhängigkeit der Methode vom eingesetzten Gerät (Tabelle 5.13).
Als weitere mögliche Einflussgröße bezüglich der Messunsicherheit der Methode kommt die verwendete Software zur Auswertung der Spektren in Frage. Neben den von den Herstellern mitgelieferten Auswertungsprogrammen sind kommerzielle (Origin, Nuts, AMIX, etc.) sowie frei im Internet zugängliche Software-Programme (z. B. MestRe-C http://qobrue.usc.es/jsgroup/MestRe-C/MestRe-C.html
Die Software MestRe-C erwies sich für die quantitative Auswertung als ungeeignet. Das Ergebnis der Korrektur-Algorithmen waren Spektren mit eindeutigen Phasen- und Grundlinienfehlern, deren Auswertung zwangsläufig zu ungenauen Ergebnissen (rel. Abweichungen bis zu –22 % und Streuung der Einzelwerte bis zu 11 %) führen musste (MR-3). Ferner blieben bei der manuellen Phasenkorrektur mittels der dafür vorgesehenen Drehscheibe (auf 1° genau) Phasenfehler in den Spektren bestehen (MR-2). Erst bei der manuellen Eingabe der Werte für die Phasenkorrektur auf 0,1° genau (MR-1) waren die Phasenfehler zu korrigieren, worauf richtige und präzise Analysenergebnisse erhalten wurden. Aufgrund der schwierigen Handhabung der Korrektur der Integralzüge wurde bei der Auswertung darauf verzichtet. Die Auswertung mittels WinFit wurde mit einer optimierten Lorentz-Gauß-Linie im Verhältnis 9:1 vorgenommen, die jedoch ebenfalls zu signifikanten Abweichungen der Ergebnisse von den gravimetrischen Referenzwerten führte (relative Abweichungen bis zu
–9 %). Ursache hierfür ist die nicht einwandfreie Lorentz-Linienform – bedingt durch Shim-Fehler und B1-Feldinhomogenitäten – der gemessenen Signale, die nicht durch Lorentz-Gauß-Linien simuliert werden können.
Die Spektrenaufnahme nach Maniara [8], Signale nacheinander mit identischen Parametern in ein Spektrum aufzunehmen, erwies sich aufgrund des schlechteren S/N als nachteilig. Ebenso lieferte die Auswertung mit der Software NMRQuant signifikant abweichende Messergebnisse [14]. Augner diskutierte die nicht ausreichende Genauigkeit der Simulation von Spektren mit WIN-DAISY [67].
Der Ausschluss eines Teilnehmers beim NMR-2 Ringversuch aufgrund eines nicht geeigneten Messkopfes war ausschlaggebend für die Experimente zur Bestimmung des Einflusses vom verwendeten Messkopf auf die Intensitätswiedergabe im Spektrum. Hierzu wurden anhand der NMR-2 Lösung nach Arbeitsanweisung laborintern vier verschiedene Messköpfe (QNP, TXI, 10mm HR, Si-spezial) sowie bei Bruker am 500 MHz Spektrometer ein TXI-Kryo-Messkopf auf ihre quantitativen NMR-Eigenschaften ausgetestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5.16 als Stoffmengenverhältnisse bezogen auf D4 dargestellt.
Es zeigte sich, dass die für 1H-NMR-Messungen nicht vorgesehene Messköpfe (10 mm HR und Si-spezial) bei der Aufnahme derartiger Spektren die Intensitäten im Spektrum falsch wiedergeben (relative Abweichungen zu den Referenzwerten von bis zu 9 %). Indessen wurden bei den Messungen mit dem QNP-Messkopf als auch mit den beiden TXI-Messköpfen die Stoffmengenverhältnisse der vier Komponenten durchgängig mit einer Richtigkeit von besser als 99 % wiedergegeben. Lediglich der Analysenwert für das Dur wurde beim TXI-Kryo-Messkopf mit einer relativen Abweichung von –1,4 % ermittelt. Dieses ist jedoch nicht auf die Aufnahme des Spektrums, sondern auf dessen Auswertung
Insgesamt wurden mit für die 1H-NMR-Spektroskopie konstruierten Messköpfen bei quantitativen Messungen die Intensitäten im Spektrum richtig wiedergegeben. Jedoch ist beim Einsatz eines Kryo-Messkopfes mit einem starken Radiation-Damping-Effekt zu rechnen, der die Auswertung intensiver Signale aufgrund der Signalverbreiterung erschwert. Bei Messköpfen, die nicht speziell für 1H-NMR-Messungen vorgesehen sind, können die Intensitäten im Spektrum verfälscht wiedergegeben werden.
Der im Kapitel 5.3.6 erwähnte Effekt des Radiation Dampings wurde erstmals 1954 [68] in der Literatur erwähnt. Es beschreibt einen zusätzlichen Relaxations-Mechanismus T rd beruhend auf der Wechselwirkung zwischen der transversalen Magnetisierung der Messprobe und der RF-Spule. Hierbei wird T rd durch die folgende Gleichung definiert:
wobei fden Füllfaktor und Q den Qualitätsfaktor des Probenkopfes wiedergibt [69]. Das dabei erzeugte entgegenwirkende Magnetfeld Brd wird durch die Gleichung
in Abhängigkeit vom Anregungswinkel und T rd beschrieben. Detaillierte Informationen über das Radiation Damping sind dargestellt in [70, 71, 72].
Für die meisten Proben und Kernarten ist das Radiation Damping ein schwacher, gegenüber den anderen Relaxations-Mechanismen (T1 undT1) zu vernachlässigender Effekt. In den letzten Jahren wurde es jedoch aufgrund der immer stärker werdenden Magnetfeldern sowie der empfindlicheren Messköpfe zu einem bei der 1H-NMR nicht mehr zu vernachlässigenden
Beim Vergleich der Messköpfe im Kapitel 5.3.6 stellte sich heraus, dass die Halbwertsbreite des intensivsten Signals (Dur) – dargestellt als Verhältnis der Halbwertsbreiten zwischen Dur und D4 – mit der Empfindlichkeit des Messkopfes von 1,7:1 beim QNP- über 2,1:1 beim TXI- bis 8:1 beim TXI-Kryo-Messkopf zunahm. Dasselbe Verhalten zeigte sich mit der Zunahme der Magnetfeldstärke (Kapitel 5.3.4) von 2,1:1 bei 9,4 T über 2,4:1 bei 11,7 T bis zu 3,2:1 bei 18,8 T. Die Ergebnisse in den Kapiteln 5.3.4 und 5.3.6 zeigen, dass das Radiation Damping eine Verbreiterung intensiver Signale, jedoch keine Verfälschung von deren Intensitäten im Spektrum bewirkt.
Aufgrund bei der Fehleranalyse der Ringversuchsergebnisse festgestellten erheblichen systematischen Abweichungen bezüglich der gravimetrischen Referenzwerte wurden folgende Einflussgrößen umfangreich untersucht:
Analogfilter sättigen partiell in der Nähe der Filtergrenzen liegende Signale (hier D4). Eigene Messungen zeigten, dass bei einem Signalabstand von mindestens 10 ppm zur Filtergrenze die Intensitäten im Spektrum richtig wiedergegeben werden.
Der Einfluss des Operators bei der Auswertung der Spektrum auf die Messunsicherheit ist enorm. Mangelhafte Korrekturen der Grundlinie und Phasen sowie die Nichteinhaltung eines konstanten Integrationsfaktor (hier 64) innerhalb eines Spektrums führten zu relativen Abweichungen der Analysenergebnisse von bis zu 55 %. Ferner wurden bei nichtvollständiger Integration des o-Isomeren beim ETS und anschließender Korrektur des Integralzuges zu geringe Intensitätswerte ermittelt.
Die automatischen Korrekturalgorithmen (Grundlinie, Phase) der Programme XWinNMR und MestRe-C sind für quantitative Zwecke nicht ausreichend und führten zu einer erhöhten Messunsicherheit der Methode. Ebenso lieferte das Anfitten mit simulierten Lorentz-Gauß-Kurven mittels WinFit von den gravimetrischen Referenzwerten erheblich abweichende Analysenergebnisse.
Die untersuchten Messköpfe, die nicht speziell für 1H-NMR-Messungen vorgesehen sind, gaben die Signalintensitäten im Spektrum verfälscht wieder.
Der Einsatz von modernen NMR-Spektrometern und Kryo-Messköpfen führte zu Radiation Damping-Effekten (Linienverbreiterung) bei intensiven Signalen. Ein Einfluss auf die Signalintensität konnte nicht festgestellt werden. Allgemein wurde die Unabhängigkeit der Messunsicherheit von der Magnetfeldstärke des eingesetzten NMR-Spektrometers gezeigt.
Anhand der ermittelten Einflussgrößen wurden zur Berechnung der Messunsicherheit der Methoden (Stoffmengenverhältnis, -anteile) Institute, die bei der Auswertung der Spektren
Die Erkenntnisse aus diesen Untersuchungen wurden den Teilnehmern auf einem vom Labor I.31 der BAM veranstalteten Workshop vorgestellt und gemeinsam diskutiert [74].
Die bisher in den Kapiteln 5.2 und 5.3 betrachteten Modell-Lösungen enthielten jeweils einzeln integrierbare Signale im Spektrum. Oftmals weisen die Spektren realer Proben überlagerte Signale auf, deren Auswertungsweise und die dabei erreichbare Genauigkeit in diesem Kapitel ermittelt werden soll.
Zuerst sollte ein System untersucht werden, bei dem sich die Signale der einen Komponente mit einigen, nicht allen Signalen der anderen Komponente überlagern.
Demzufolge berechnet sich das Stoffmengenverhältnis entsprechend nach Gleichung (3.11):
Zur Bestimmung der metrologischen Qualität dieser Auswertungsweise wurden fünf sich im Stoffmengenverhältnis unterscheidende Modell-Lösungen (10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10) in deuteriertem DMSO-d6 angesetzt und je viermal mit dem Standardparameter-Satz (Tabelle 5.1, D1= 30 s; ns= 16) gemessen und nach Arbeitsanweisung ausgewertet (Integrationsfaktor: 400). Die Fehleranalyse der Analysenergebnisse bezüglich der gravimetrischen Referenzwerte (Gleichung 4.16) zeigte bei drei Lösungen (2, 4 und 5) akzeptable Abweichungen (< 1% relativ), die anderen beiden sind im Vergleich zur Standardunsicherheit unerheblich (Tabelle 5.17).
Anhand von Ethylbenzoat und Phthalsäurediethylester soll ein System betrachtet werden, bei dem nur überlagerte Signale auftreten, die intramolekularen Protonenverhältnisse der Signale der beiden Komponenten sich aber voneinander unterscheiden (Abbildung 5.15).
Die Intensität des Integrals der aromatischen Protonensignale I arom setzt sich entsprechend den jeweiligen Stoffmengen gewichtet aus den vier aromatischen Protonen des Phthalsäurediethylesters und den fünf aromatischen Protonen des Ethylbenzoats zusammen. Folgerichtig ergeben die drei aliphatischen CH3-Protonen des Ethylbenzoats und die sechs aliphatischen CH3-Protonen die Intensität der aliphatischen CH3-Signale I aliph (Abbildung 5.16).
Als Lösung dieses Gleichungssystems erhält man:
Das Stoffmengenverhältnis berechnet sich dann demzufolge:
Entsprechend dem Vorgehen in Kapitel 5.4.1 wurden fünf Lösungen mit äquivalenten Stoffmengenverhältnissen in DMSO-d6 angesetzt und ausgewertet. Die Fehleranalyse der Analysenergebnisse bezüglich der gravimetrischen Referenzwerte (Gleichung 4.16) zeigte generell akzeptable Abweichungen (≤ 1% relativ) (Tabelle 5.18).
Nach Gleichung 4.17 ergab sich somit aus den Standardunsicherheiten der Analysen- und Referenzwerte sowie den Abweichungen der Analysenwerte von den Referenzwerten generell eine relative Messunsicherheit (k=2; p=95%) dieses Verfahrens von zu 2 %. Diese gegenüber den einfachen Verfahren von der Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen leicht erhöhte Messunsicherheit war auf die umfangreichere Messgleichung zurückzuführen, in der die Intensitätswerte mehrfach eingehen.
Der schwierigste anzunehmende Fall ist die Auswertung eines Spektrums, bei dem nur überlagerte Signale auftreten und deren Komponenten sich nicht im intramolekularen Protonenverhältnis der Signalgruppen unterscheiden. Als Modell-System ist hier eine Lösung bestehend aus den drei Stellungsisomeren o-, m- und p-Xylol unter Zusatz des Konstitutionsisomeren Ethylbenzol untersucht worden (Abbildung 5.17).
Die Abbildung 5.18 zeigt das 1H-NMR-Spektrum einer Lösung, die 61,2 mg Ethylbenzol, 148,0 mg p-Xylol, 92,6 mg m-Xylol und 65,6 mg o-Xylol enthält. Während die aliphatischen Signale des Ethylbenzols einzeln ausgewertet werden können, ist dies bei den übrigen Signalen wegen der Überlagerung der aromatischen Signale aller vier Komponenten und der aliphatischen Signale der drei Xylole (die eindeutige qualitative Zuordnung der Signale erfolgte mittels Handversuchen) nicht möglich.
Aufgrund der identischen Verhältnisse zwischen aromatischer und aliphatischer Protonenanzahl der drei Xylole ist die Bestimmung mittels Gleichungssystems hier nicht möglich. Die Auswertung der aliphatischen CH3-Signale mittels WinFit lieferte erheblich abweichende Analysenwerte (relative Abweichungen von bis zu 4 % hinsichtlich der gravimetrischen Referenzwerten). In den folgenden drei Kapiteln werden Versuche zur Trennung der aliphatischen Signale mittels Lösungsmittelwechsel, Verschiebungsreagenz und größerem Magnetfeld diskutiert.
Wechselwirkungen zwischen Lösungsmittel und gelösten Molekülen führen häufig zu Signalverschiebungen im Spektrum [16]. Zum Erhalt möglichst extremer Lösungsmitteleffekte wurde die Xylol-Ethylbenzol-Lösung mit unpolaren (CCl4 und CDCl3) sowie mit einem Lösungsmittel (C6D6) verdünnt, das einen starken Anisotropie-Effekt bewirkt. Die in der Tabelle 5.19 dargestellten Signal-Lagen der aliphatischen Signale zeigen zwischen den beiden unpolaren Lösungsmitteln zu vernachlässigende Unterschiede auf. Hingegen veränderte sich beim Benzol-d6 neben der absoluten Lage aller Signale um ca. 0,2 ppm Richtung Tieffeld auch signifikant die Signalabstände untereinander, so dass hier eine vollständige Überlagerung der m- und p-Xylol-Signale auftrat.
Der Wechsel von einem unpolaren zu einem Lösungsmittel, welches einen starken Anisotropie-Effekt bewirkte, führte zur einer insgesamt schlechteren Konstellation der Signal-Lagen im Spektrum.
Die Anwendung von Verschiebungsreagenzien (Lanthaniden-Komplexe) ist in der qualitativen NMR-Spektroskopie ein gängiges Verfahren zur Vereinfachung von Spektren mit überlagerten Signalen und geht auf Hinckley [75] zurück. Das Fehlen von Donor-Atomen wie z.B. Sauerstoff oder Stickstoff bei dem hier betrachteten Modell-System verhindert die Bildung des notwendigen Komplexes.
Pr(fod)3 erwies sich hierbei als das bessere Verschiebungsreagenz. Die größten Signalabstände wurden bei einem molaren Verhältnis zwischen 1:1 und 2:1 (Shiftreagenz zu Xylol) erreicht. Dies widerspricht der Arbeit von Dambska und Janowski [78], die ein Stoffmengenverhältnis von 0,2 bis 0,25zu1 (Eu(fod)3 zu Xylol ) als optimal zur Trennung der aliphatischen CH3-Signale von m- und p-Xylol beschrieben. Die erreichten Abstände sind für qualitative Unterscheidung ausreichend, nicht jedoch für quantitative Analysen, da bei einer Halbwertsbreite von ca. 1,3Hz der aliphatischen Signale ein Integrationsfaktor von 64 nicht zur einzelnen Auswertung der Signale eingesetzt werden kann. Des Weiteren wäre der Einfluss der aufwendigen Probenpräparation (Filtration) auf die Messunsicherheit des Verfahrens festzustellen.
Eine weitere Möglichkeit, die Abstände (in Hz) zwischen zwei Signalen zu vergrößern, ist die Messung bei höherem Magnetfeld. Hierzu wurde bei der Firma Bruker die Xylol-Lösung in CDCl3 an einem 18,8 T NMR-Spektrometer (1H: 800 MHz) aufgenommen. Der erwartete Vorteil durch die größeren Abstände der Signale (in Hz) wegen der doppelten Messfrequenz wurde angesichts der schlechteren Auflösung (doppelt so breite Signale) kompensiert (Tabelle 5.21).
Insgesamt stellte sich bei den Untersuchungen heraus, dass mit der 1H-SP-NMR eine quantitative Auswertung der drei Xylol-Isomere unter den in dieser Arbeit geforderten Auswertebedingungen (Integrationsfaktor von 64) nicht möglich ist. Auf den Einsatz der 13C-NMR zur Bestimmung der Reinheit von Xylolen wird in Kapitel 6.2.1 eingegangen.
Das Unsicherheitsbudget enthält bei der Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen wegen der einfachen Probenpräparation nur einen Unsicherheitsbeitrag, das Verhältnis der beiden Intensitätswerte, dessen Unsicherheit sich aus den Einzelmessungen nach Gleichung (4.1) ableitet. Anders sieht es bei der Analyse von Stoffmengenanteile von mindestens drei Komponenten aus. Hierbei gehen nach Gleichung (3.12) die Intensitätswerte aller auszuwertenden Substanzen in das Analysenergebnis einer Komponente ein. Die Korrelation zwischen diesen Ausgangsgrößen wurde bereits im Rahmen des nationalen Ringversuches NMR-1 nachgewiesen [14]. Der GUM schreibt bei korrelierenden Ausgangsgrößen vor, zusätzlich zum Ergebnis die Kovarianzmatrix oder die Matrix der Korrelationskoeffizienten mitanzugeben [11, Kapitel 7.2.5]. Letztere wird für m Komponenten in folgender Form angegeben:
Hierbei gibt ri,j
die Korrelation zwischen der Komponente i und der Komponente j wieder. Berechnet werden diese, indem die Kovarianz
Die Kovarianz wiederum berechnet sich wie folgt:
Der Korrelationskoeffizient ist dimensionslos und nimmt nur Werte zwischen +1 und -1 an. Hierbei gibt ein Betrag von eins eine streng lineare Abhängigkeit an. Bei positiven Werten liegt eine gleichgesinnte, bei negativen eine entgegengesinnte Korrelation vor. Im Falle von |ri,j | < 0,1 kann die Korrelation zwischen den beiden Komponenten vernachlässigt werden. Dies bedeutet aber nicht, dass sie voneinander unabhängig sind. Als Beispiel wurde aus den eigenen Messdaten von NMR-2 die Korrelationsmatrix berechnet:
Aus dieser Korrelationsmatrix können die Korrelation zwischen den einzelnen Komponenten in ihrer Richtung und Stärke entnommen werden. So zeigte sich, dass Dur zu allen anderen Komponenten stark und entgegengesetzt korreliert. Dagegen treten beim ETS zu Par und D4 nur sehr schwache, gleichgerichtete Korrelationen auf.
Anhand von Modell-Lösungen wurde systematisch die Messunsicherheit der Analyse von Stoffmengengemischen (Stoffmengenverhältnis, -anteil) für mögliche Konstellationen von einzelnen und überlagerten Analytensignale im Spektrum untersucht.
Analogfilter geben in der Nähe der Filtergrenze liegende Signale (hier D4) mit einer zu geringen Intensität im Spektrum wieder. Ein Abstand der auszuwertenden Signale von mindestens 10 ppm zu den Filtergrenzen lieferte bei NMR-Spektrometern mit Analogfilter-Technik richtige Analysenergebnisse.
Der erhebliche Einfluss des Operators auf die Messunsicherheit bei der Korrektur und Auswertung der Spektren konnte mehrfach gezeigt werden. Nachlässige Grundlinien und Phasenkorrekturen, die Nichteinhaltung von konstanten Integrationsfaktoren sowie die nicht-vollständige Erfassung von überlagerten Einzelsignalen führten zu erheblichen Abweichungen der Analysenergebnisse.
Um den Einfluss des Operators bei der Auswertung zu vermeiden, wurden im Labor vorhandene Korrektur-Algorithmen zur Automatisierung der Spektrenauswertung (XWinNMR und MestRe-C) untersucht. Die dabei verbliebenen Grundlinien- und Phasenfehler führten zu einer höheren Messunsicherheit der Methode.
Die Auswertung der Spektren mittels simulierter Lorentz-Gauß-Kurven lieferte ebenfalls stark abweichende Analysenergebnisse.
Ferner kann die Verwendung von nicht speziell für die 1H-NMR vorgesehenen Messköpfen zu abweichenden Analysenergebnissen führen.
Allgemein wurde die Unabhängigkeit der Messunsicherheit der Methoden vom eingesetzten NMR-Spektrometer dargestellt.
Der Einsatz modernster NMR-Technik (18,8 T, Kryo-Messkopf) führte zu einer besseren Empfindlichkeit, jedoch nicht zu einer besseren Auflösung. Dabei ist mit starken Radiation Damping Effekten zu rechnen, die sich auf die Signalform intensiver Signale im Spektrum (Linienverbreiterung) auswirken.
Zusammenfassend sind daher folgende wichtige Bedingungen zur Aufnahme und Auswertung quantitativer 1H-SP-NMR-Spektren einzuhalten, um eine geringe Messunsicherheit zu erzielen: Messungen sind nur mit Probenköpfen durchzuführen, die auch für die 1H-NMR geeignet sind. Die Zeitsequenz bei der Datenakkumulation sollte mindestens 7/3 mal der längsten T1
-Zeit aller auszuwertenden Signale bei Anregung mit einem 30° Impuls betragen, und die Anzahl der Datenakkumulationen sollte ausreichend sein, um für alle auszuwertende Signale ein S/N ≥ 150 zu erreichen. Die Filtergrenze ist dabei großzügig zu wählen (30 ppm und mehr stellen heute kein Problem für NMR-Spektrometer dar). Der aufgenommene FID
Bei Einhaltung dieser Arbeitsanweisung wurde die relative Messunsicherheit (k=2; p=95%) für die beiden hier untersuchten Auswertungsmethoden (Stoffmengenverhältnisse, -anteile) anhand der Teilnehmerergebnisse des nationalen Ringversuchs NMR-2 und eigener Messungen an verschiedenen NMR-Spektrometern zu unter 1,5% bestimmt. Die hierbei zu analysierende minimale Stoffmengenkonzentration betrug 0,3 mmol l-1 (D4 bei NMR-2).
Die Messunsicherheit (k=2, p=95%) der Methode bei Auswertung von Spektren mit überlagerten Signale wurden nach der obigen Arbeitsanweisung an Modell-Lösungen untersucht.
Stoffgemische, bei denen sich nicht alle auszuwertenden Signale überlagern (Benzoesäure - Ethylbenzoat), können durch Differenzbildung quantitativ mit einer relativen Messunsicherheit von unter 1,5 % ausgewertet werden.
Stoffgemischen, deren Signale sich alle überlagern, sich aber im intramolekularen Protonenverhältnis unterscheiden (Ethylbenzoat - Phthalsäurediethylester), können quantitativ mit einem Gleichungssystem analysiert werden. Hierbei wurde eine relative Messunsicherheit der Methode von 2 % ermittelt.
Lediglich Substanzgemische mit überlagerten Signalen und identischen Protonenverhältnissen zwischen den intramolekularen Signalgruppen (Xylol-Isomere) können mit der 1H-SP-NMR nicht quantifiziert werden. Die Trennung der aliphatischen CH3-Signale der Xylole durch Verschiebungsreagenzien (Eu(fod)3 und Pr(fod)3) war für quantitative Analysen nicht ausreichend. Auch die Messung am Höchstfeld-NMR-Gerät (18,8 T) blieb aufgrund der schlechteren Auflösung erfolglos.
Die hierbei gewonnenen Erkenntnisse sind generell auf Stoffsysteme mit ähnlichen Spektrenbildern übertragbar.
Ein dritter Aufgabenbereich der Analytik ist die Bestimmung der Reinheiten von Substanzen, z.B. zur Zertifizierung von Referenzmaterialien. Publikationen zur Reinheitsanalyse mit der quantitativen NMR belegen z.B. in der Pharmazie [79, 80, 81, 82], in der Agrartechnik [47, 83] und im militärischen Bereich [84] ihre Anwendbarkeit. Allerdings enthalten diese Arbeiten generell keine ausführliche Unsicherheitsbetrachtung und nur in wenigen wurde eine Standardabweichung angegeben. Es sollte daher das vollständige Unsicherheitsbudget aufgestellt und an ausgesuchten, an CCQM-Aufgaben orientierten Systemen die Messunsicherheit des Verfahrens der Reinheitsanalyse mittels NMR-Spektroskopie ermittelt werden. Die Reinheitsanalyse wurde, wie im Kapitel 3.6.2 beschrieben, über die Hauptkomponentenbestimmung mit Bezug auf einen internen Standard durchgeführt. Um dabei den Anspruch einer relativen primären Methode zu gewährleisten (Rückführung des Analysenergebnisses auf SI-Einheiten), war die Verwendung eines ZRM als Standard bzw. eines auf ein ZRM zurückgeführten Standards notwendig. Hierzu wurde folgendes ZRM des NIST eingesetzt: Benzoesäure (SRM 350a) mit einer Reinheit von (99,9958 ± 0,0027) g/g%, deren erweiterte Unsicherheit ein Konfidenzintervall von 95 % bei elf Freiheitsgraden repräsentiert)
Die Reinheitsanalyse mit der 1H-SP-NMR ist das einfachste Verfahren der NMR-Spektroskopie. Es basiert auf der Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen zwischen Analyt und Standard. Somit sind im Kapitel 5 gewonnenen Erkenntnis hierauf übertragbar.
Larive [49] beschreibt Maleinsäure als einen gut für die quantitative 1H-NMR-Spektroskopie geeigneten Standard. Um hierbei die Rückführung der Analysenergebnisse auf die SI-Einheiten bei der Verwendung von Maleinsäure (Merck KG, Reinheit > 99 %) als internem Standard zu gewährleisten, war dessen Reinheit auf das ZRM Benzoesäure zurückzuführen. Mit diesem System sollte gleichzeitig die Messunsicherheit des Verfahrens der Reinheitsanalyse bestimmt werden.
Die allgemeine Probenpräparation zur Reinheitsanalyse besteht aus den Einwaagen des Analyten und des internen Standards derart, dass die Intensitäten der auszuwertenden Signale im Spektrum ungefähr im Verhältnis 1:1 stehen. Daraufhin wird das Einwaagegut in deuteriertem Lösungsmittel gelöst und nach Homogenisierung anschließend ins NMR-Messröhrchen überführt.
Das Spektrum der Lösung, dargestellt in Abbildung 6.1, zeigt bei 6,44 ppm (H2) das olefinische Signal der Maleinsäure sowie bei 7,58 ppm (H2), 7,70 ppm (H) und 8,14 ppm (H2) die drei aromatischen Signale der Benzoesäure.
Die Signale der beiden Substanzen liegen im Spektrum für eine getrennte Auswertung weit genug auseinander, wobei die drei Signale der Benzoesäure aufgrund der überlagerten 13C-Satelliten mit einem Integral erfasst wurden. Die Prozessierung und Auswertung der Spektren erfolgte nach der im Kapitel 5.1.2 beschriebenen Arbeitsanweisung, jedoch mit einem Integrationsfaktor von 200. Die ermittelten Reinheitsgrade der Maleinsäure der Einzelmessungen, berechnet aus den auf ein Proton normierten Intensitätswerten, Einwaagen und Molmassen der beiden Substanzen (MMaleinsäure=146,07 g mol-1, MBenzoesäure=122,12 g mol-1)
Aus diesen zwölf Ergebnissen wurde der Reinheitsgrad der Maleinsäure zu 99,91 g/g % mit einer Standardunsicherheit von ± 0,05 g/g % ermittelt. Die dabei erreichte geringe relative Standardunsicherheit von 0,05 % war auf das S/N von ca. 12000 und auf die großen Integrationsbereiche zurückzuführen.
6,45 ppm stammt von den olefinischen Protonen des Maleinsäureester.
Die Verwendung von Methanol als Lösungsmittel führte zur partiellen Veresterung beider Substanzen, die sich jedoch nicht signifikant auf die auszuwertenden Protonensignale auswirkte. Das zusätzliche Signal mit geringer Intensität des Maleinsäureesters bei 6,45 ppm – Tieffeld-Verschiebung um 0,01 ppm (Abbildung 6.2) bezüglich der Maleinsäure – und ebenso die Signale des Benzoesäureesters wurden bei der Integration miterfasst und gaben somit die Intensitäten der eingewogenen Stoffmengen beider Substanzen richtig wieder.
Für das Verfahren der Reinheitsbestimmung sind im Unsicherheitsbudget generell die Unsicherheiten der Intensitätsverhältnisse (Integration), der Molmassen und Einwaagen beider Substanzen und des Reinheitsgrads des Standards zu berücksichtigen.
Die Standardunsicherheit der Integration u(IAnl/IStd) wurde nach Gleichung (4.1) aus den zwölf unabhängigen Messungen zu ± 0,05 (Typ A) bestimmt. Ferner wurden die Standardunsicherheiten der Molmasse von Maleinsäure (C4H4O4) zu u(MAnl)= ± 0,006 g mol-1 und die von Benzoesäure (C7H6O2) zu u(MStd)= ± 0,004 g mol-1 nach Gleichung (4.6) aus den Unsicherheiten der Atommassen (entnommen aus IUPAC [85] und in Tabelle 6.3 aufgeführt) ermittelt (Typ B).
Bei der hier eingesetzten Waage, einer Mettler AT 261 Delta Range, beträgt die Gesamtunsicherheit einer Einwaage u(mAnl) = u(mStd) = ± 0,03 mg (Tabelle 4.1). Die Unsicherheit des Reinheitsgrades des ZRMs u(fStd) wurde in der Zertifizierungsurkunde mit ± 0,0012 g/g % angegeben. Aus diesen Unsicherheitsbeiträgen, aufgelistet in Tabelle 6.4, wurde nach Gleichung (4.12) die kombinierte Standardunsicherheit zu ± 0,14 g/g % berechnet.
Die Unsicherheitsbeiträge der Molmassen und ebenso die des Reinheitsgrades vom Standard stellten sich im Vergleich zu denen der Integration und der Einwaage als vernachlässig
Die im Kapitel 6.1.1.3 berechnete kombinierte Standardunsicherheit berücksichtigt nur die zufälligen Unsicherheiten der Eingangsgrößen und gibt die Unsicherheit des Analysenergebnisses wieder. Um die Messunsicherheit des Analysenverfahrens zu berechnen, ist die Abweichungen des Analysenergebnisses vom Referenzwert zu ermitteln und diese sowie die Unsicherheit des Referenzwertes entsprechend Gleichung 4.17 im Unsicherheitsbudget einzuberechnen. Der Reinheitsgrad der Maleinsäure wurde vom Hersteller mit > 99 g/g % angegeben. Unter Annahme einer Rechteckverteilung (alle Werte sind gleichwahrscheinlich) ergibt sich somit als Referenzwert ein Reinheitsgrad PMaleinsäure= (99,5 ± 0,3) g/g %, dessen Unsicherheit sich entsprechend Gleichung 4.10 berechnete. Die Fehleranalyse des Verfahrens klassifizierte die Abweichung des Analysenergebnisses als geringfügig (Tabelle 6.5).
Aus der kombinierten Unsicherheit des Analysenergebnisses, der Abweichung zum Referenzwert und der Unsicherheit des Referenzwertes ergab sich nach Gleichung 4.17 eine relative Messunsicherheit des Verfahrens (k=2; p=95%) zu 1%. Diese wurde hauptsächlich durch die Reinheitsangabe des Herstellers (Referenzwert) beeinflusst.
Da das Analysenergebnis nur von Einwaagen (primäre Methode), Naturkonstanten (Molmassen) und der Reinheit des ZRM abhing, war die Rückführung auf die SI-Einheiten gegeben. Die Maleinsäure konnte von jetzt an für weitere Analysen als ein auf ein ZRM zurückgeführter Standard eingesetzt werden.
Die Verwendung pflanzlicher Arzneimittel („Phytopharmaka“) ist sowohl national als auch international von großem Interesse. Hierbei ist eine definierte und konstante Zusammensetzung eine der wichtigsten Voraussetzungen für den Einsatz solcher Phytopharmaka. Die Überprüfung der gleichbleibenden Arzneizusammensetzung ist schwierig, da es sich um komplexe Vielstoffgemische handelt. Hierzu werden pflanzliche Referenzsubstanzen zur Validierung und Kalibrierung der eingesetzten Mess- und Prüfverfahren eingesetzt [86]. Das Zentralinstitut Arzneimittelforschung GmbH in Sinzig (ZA-Sinzig) arbeitet u.a. auf dem Gebiet der Herstellung und Zertifizierung von solchen Referenzmaterialien. Die dabei hauptsächlich eingesetzten chromatographischen Methoden zu deren Reinheitsbestimmung können häufig Verunreinigungen mit sehr ähnlichen Strukturen nicht vom Analyten trennen. Die Selektivität der zur Reinheitsbestimmung verwendeten Methode bekommt daher bei Referenzsubstanzen, die aus natürlichen Quellen isoliert werden, eine zentrale Bedeutung. Ein solches hochselektives Verfahren ist die quantitative NMR-Spektroskopie, die zudem schnell ist und eine geringe Probenpräparation erfordert. Obendrein wird durch ihren Charakter einer relativen primären Messmethode [87] die Rückführung der Analysenergebnisse auf die SI-Einheiten garantiert. Es wurde daher mit dieser Arbeit eine Vorstudie zu einem zukünftigen Projekt zur Reinheitsbestimmung von RM mittels NMR-Spektroskopie bearbeitet, deren Reinheiten überwiegend im technischen Bereich liegen sollen.
Das ZA-Sinzig setzt zur Reinheitsanalyse mittels NMR-Spektroskopie ein Verfahren mit gleichzeitigem Einsatz eines internen und externen Standards ein [88]. Hierbei werden der Analyt und Etacrynsäure (externer Standard) in je ein NMR-Röhrchen eingewogen und mit exakt einheitlichen Volumina des Lösungsmittels gelöst, welches Dimethylformamid als internen Standard enthält. Man erhält somit zwei Spektren, bei deren Auswertung das Intensitätsverhältnis zwischen dem Analyten und dem externen Standard (Etacrynsäure) über das Referenzieren der beiden Spektren auf die Intensität des internen Standards (Dimethylformamid) verläuft, die in beide Spektren gleich gesetzt wird. Dieses Verfahren weist gegenüber einem einfacheren mit nur einem internen Standard mehr Unsicherheitsbeiträge auf. So sind drei Intensitätsverhältnisse zu berücksichtigen (Analyt/interner Standard(1), interner Standard(1)/interner Standard(2), externer Standard/interner Standard(2)), die zudem untereinander korrelieren. Ferner muss die Unsicherheit des Messvolumens beider NMR-Röhrchen berücksichtigt werden, da herstellungsbedingt die Innendurchmesser der NMR-Röhrchen eine Toleranz von bis zu 1,2 % relativ je nach Qualität aufweisen [89].
Es sollte daher untersucht werden, ob diese Reinheitsanalysen auch mit nur einem internen Standard ausgeführt werden könnten. Zu diesem Zweck wurden drei potentielle Referenzmaterialien (Spiraeosid, Thymol und Loganin) vom ZA-Sinzig bereitgestellt. Für die ersten beiden Substanzen wurde 3-Trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsäure-Natriumsalz (TSP) als interner Standard verwendet, beim Loganin das ZRM Benzoesäure.
Die Probenpräparation erfolgte analog zu dem im Kapitel 6.1.1.1 vorgestellten allgemeinen Verfahren. Als Lösungsmittel wurde für alle drei Proben deuteriertes Methanol-d4 (vom ZA-Sinzig vorgegeben) verwendet. Die Aufnahmen der Spektren erfolgten mit den Standardparametern aus Kapitel 5.1.2 (Tabelle 5.1, D1 = 60 s (Loganin: D1 = 20 s), ns = 64, TD = 64 k).
Ziel der Reinheitsanalyse vom Spiraeosid (Abbildung 6.3) war das Austesten des Verfahrens. Die Übersichtsspektren zur qualitativen Auswertung – Zuordnung der Signale war zuvor vom ZA-Sinzig geleistet worden – bestätigten eine generelle Stabilität der Substanz. Somit wurden zur quantitativen Auswertung 27,20 mg Spiraeosid (MSpiraeosid = 500,4 g mol-1) und 10,40 mg TSP (MTSP=172,27 g mol-1) eingewogen. Das quantitative 1H-NMR-Spektrum in Abbildung 6.4 gibt die Signallagen des Spiraeosid wieder. Zur Auswertung des Spiraeosids wurden die beiden Signale bei 7,68 ppm (H-6’) und 7,74 ppm (H-2’) herangezogen. Die Signale bei 6,34 ppm (H-8) und 6,15 ppm (H-6) zeigten Deuterierungserscheinungen, die bei 7,26 ppm (H-5’), 3,94 ppm (H-6’’a) und 3,51 ppm (H-2’’, H-3’’, H-4’’,H-5’’) wiesen Fremdsignale im Integrationsbereich auf und das Signal bei 3,75 ppm (H-6’’b) lag zu nahe bei den benachbarten Signalen.
Nach Gleichung (3.13) ergibt sich aus den Intensitätswerten des Spiraeosids und des TSP ein Reinheitsgrad von
wobei P Std =100 % angenommen wurde.
Ebenso wie beim Spiraeosid war beim Thymol (Abbildung 6.5) vordergründig die Durchführbarkeit der Analyse Gegenstand der Untersuchung und nicht die Ermittlung der Messunsicherheit des Verfahrens. Nachdem die qualitative Zuordnung anhand der Daten vom ZA-Sinzig erfolgt und die Stabilität der Substanz gezeigt war, wurden zur quantitativen Analyse 45,98 mg Thymol (MThymol=150,22 g mol-1) und 18,35 mg TSP (interner Standard) eingewogen. Zur Auswertung wurden beim Thymol nur die Signale bei 6,96 ppm (H-3) und 6,57 ppm (H-4 und H-6) herangezogen, da die Signale bei 2,20 ppm (H3-7) und 3,20 ppm (H-8) Fremdsignale aufwiesen. Das Signal bei 1,17 ppm (H3-9 und H3-10) wurde als
Nach Gleichung (3.13) wurde aus diesen Intensitätswerten ein Reinheitsgrad von
ermittelt. Zur Überprüfung dieses Ergebnisses wurde eine zweite Analyse mit einer Einwaage von 45,05 mg Thymol und 18,74 mg TSP durchgeführt. Der dabei bestimmte Reinheitsgrad von 101,5 % entsprach dem der ersten Messung. Wegen der hygroskopischen Eigenschaft des TSP kann dessen angenommener Reinheitsgrad aber signifikant kleiner sein, so dass die ermittelte Reinheit des Thymols von über 100 % darauf zurückzuführen ist. Für eine genaue Analyse muss daher eine geeignete zertifizierte Lösung von TSP in D2O als Standard eingesetzt werden.
Nachdem die Analysen des Spiraeosids und des Thymols die Durchführbarkeit des Verfahrens der Reinheitsanalyse zeigten, sollte die Reinheitsbestimmung des Loganins (Abbildung 6.7) unter metrologischen Gesichtspunkten mit dem ZRM Benzoesäure als internem Standard erfolgen. Das ZA-Sinzig stellte hierfür zwei Loganin-Proben unterschiedlicher Chargen zur Verfügung. Die qualitative Zuordnung der Signale im Spektrum wurde durch Spektrensimulation mit der Software „ACD HNMR“ getätigt. Von jeder Charge wurde eine Lösung eingewogen (Charge 1056: 9,52 mg Loganin und 10,71 mg ZRM; Charge 48942772:
4,44 mg Loganin und 7,32 mg ZRM) und diese jeweils viermal gemessen.
Die Prozessierung und Auswertung der Spektren erfolgte nach der Arbeitsanweisung im Kapitel 5.1.2 mit einem Integrationsfaktor von 64. Von den Signalen des Loganins im 1H-NMR-Spektrum (Abbildung 6.8) wurde das Signal bei 1,66 ppm als zur Auswertung optimal bewertet. Die übrigen Signale zeigten entweder Fremdsignale oder waren aufgrund der Nähe zu benachbarten Signalen nicht optimal auswertbar. Als Referenzsignal des Standards wurde das Signal bei 8,07 ppm ausgewertet.
Die nach Gleichung (3.13) mit MLoganin= 390,4 g mol-1 berechneten Reinheitsgrade der acht Experimente sind in der Tabelle 6.6 zusammengestellt. Ebenso sind in dieser Tabelle die Schätzwerte der Reinheitsanalyse und deren Standardunsicherheit dargestellt, die mit (91,38 ± 0,09) g/g % für Charge 1056 und (91,23 ± 0,15) g/g % für Charge 48942772 ähnlich sind.
Bei den Reinheitsanalysen vom Spiraeosid und dem Thymol soll die Betrachtung der kombinierten Standardunsicherheit wegen des unbekannten Reinheitsgrades des Standards (TSP) nicht weiter verfolgt werden, zudem diese hauptsächlich zur Austestung der Durchführbarkeit der Analyse dienten. Nichtsdestoweniger könnte die kombinierte Standardunsicherheit durch Abschätzungen der unbekannten Größen u(IAnl /IStd ) und u(fStd ) berechnet werden.
Für die Analyse der Reinheit des Loganins war das Unsicherheitsbudget analog zu dem im Kapitel 6.1.1.3 beschriebenen aufzustellen und zu berechnen. Die in die kombinierte Standardunsicherheit eingehenden Unsicherheitsbeiträge sind in der Tabelle 6.7 am Beispiel des Loganin Charge 48942772 zusammengefasst.
Für die Charge 48942772 wurde die kombinierte Standardunsicherheit zu uc(y)= ± 0,7g/g% berechnet. Entsprechend ergab sich für die Charge 1056 eine kombinierte Standardunsicherheit von uc(y) = ± 0,4 g/g %. Bei beiden übte die Einwaagenunsicherheit aufgrund der geringen Probenmengen den stärksten Einfluss auf die Gesamtunsicherheit aus, gefolgt von der Unsicherheit der Integration. Die Unsicherheiten der Molmassen und des Reinheitsgrades des Standards fielen dagegen vernachlässigbar gering aus, wie die Berechnung
Insgesamt konnten die Reinheitsgrade der beiden Loganin-Chargen mit der 1H-NMR-Spektroskopie unter Berücksichtigung der erweiterten Unsicherheit (k = 2; p = 95 %) zu
(91,4 ± 0,8) g/g % (Charge 1056) und (91,2 ± 1,4) g/g % (Charge 48942772) bestimmt werden.
Die Reinheitsbestimmung mit der 1H-SP-NMR-Spektroskopie wurde über die Hauptkomponentenanalyse untersucht. Mit einem Stoffsystem, bestehend aus Maleinsäure und ZRM Benzoesäure als internem Standard, wurde die Messunsicherheit des Analysenverfahrens ermittelt. Hierzu musste entsprechend der Messgleichung ein Unsicherheitsbudget erstellt werden, dass sich aus den Unsicherheitsbeiträgen der folgenden Eingangsgrößen zusammensetzt: Intensitätsverhältnis (Analyt : Standard), Einwaagen und Molmassen von Analyt und Standard sowie dem Reinheitsgrad des Standards. Anhand von Vergleichsmessungen zeigte sich, dass mit einem besseren S/N (S/N > 10000) und einem größeren Integrationsfaktor von 200 die Unsicherheit des Analysenergebnisses deutlich zu verbessern ist. So wurde hier die erweiterte relative Unsicherheit (k = 2; p = 95 %) zu 0,3 % bestimmt im Vergleich zu 1,5 % bei einem S/N > 150 und einem Integrationsfaktor von 64. Die relative Messunsicherheit (k = 2; p = 95 %) des Verfahrens wurde durch Bezug auf die Reinheitsangabe des Herstellers zu 1 % ermittelt, wobei die Abweichung des Analysenergebnisses sich als geringfügig darstellte. Die ungenaue Angabe des Reinheitsgrades von > 99% führte zu dieser gegenüber der Unsicherheit des Analysenergebnisses erhöhten Messunsicherheit des Verfahrens. Einen genaueren Referenzwert von anderen anerkannten analytischen Methoden (HPLC, GC, MS) zu erhalten, scheiterte an der Unkenntnis der möglichen Verunreinigungen. Hier drin besteht der wesentliche Vorteil der NMR-Spektroskopie. Aufgrund der ausgezeichneten selektiven und spezifischen Eigenschaften können die Resonanzlinien detektierbarer Verunreinigungen generell von denen der Hauptkomponente im Spektrum unterschieden werden. Dazu kommt die Analyse über die Hauptkomponente, bei der nur der Analyt selber, nicht aber die Verunreinigungen zum Ergebnis beitragen. Die Analyse von Reinstsubstanzen mit einem Reinheitsgrad von 99,9 g/g % und mehr ist dagegen mit diesem Verfahren wegen der ermittelten Messunsicherheiten des Analysenergebnisses als auch des Verfahrens nicht machbar. Hierzu könnte die Reinheitsbestimmung über die Verunreinigungen mit der 1H-NMR eingesetzt werden, bei der alle Verunreinigungen zu qualifizieren und quantifizieren sind. Dieses war jedoch nicht Bestandteil dieser Arbeit. Als interessante Anwendungsgebiete kommen Reinsubstanzen mit Reinheiten im technischen Bereich in Frage. Genau aus diesem Grunde wurde im Rahmen einer Vorstudie die quantitative 1H-NMR-Spektroskopie mit der Hauptkomponentenanalyse als Verfahren zur Reinheitsanalyse von Referenzmaterialien für die Pharmazie ausgetestet.
Aufgrund der geringen natürlichen Häufigkeit des 13C-Isotops ist bei der 13C-NMR im Vergleich zur 1H-NMR mit konzentrierten Lösungen und einem größeren Zeitaufwand zu messen. Nichtsdestoweniger gehört in der organischen Chemie die 13C-NMR zu den meist angewendeten NMR-Methoden.
In Anbetracht des vom CCQM geplanten internationalen Ringversuchs CCQM-P20b zur Reinheitsanalyse eines Xylol-Isomeren wurden Voruntersuchungen zur Analyse mit der NMR-Spektroskopie durchgeführt. Wie im Kapitel 5.4.3 gezeigt wurde, war mit der 1H-SP-NMR dieses quantitative Problem nicht lösbar. Daher sollten die Möglichkeiten der 13C-NMR mit Durol als internem Standard untersucht und die Messunsicherheit des Verfahrens der Reinheitsbestimmung mit der quantitativen 13C-NMR ermittelt werden.
Für die Reinheitsanalyse der drei Xylol-Isomeren und zusätzlich des ETB wurde eine Lösung mit Durol als internem Standard so eingewogen, dass alle auszuwertenden Signale in einem Intensitätsverhältnis von ungefähr 1:1 standen. Damit wurden die Analysenbedingungen
Die Einwaagen von 104,9 mg o-Xylol, 171,5 mg m-Xylol, 119,5 mg p-Xylol und 209,1 mg ETB erfolgten direkt in ein 10 mm NMR-Messröhrchen. Dazu wurden 67,8 mg Durol als interner Standard eingewogen und 2 ml deuteriertes Chloroform (CDCl3) zur geringfügigen Verdünnung (konzentrierte Lösung) zugegeben. Zur Aufnahme quantitativer 1H-entkoppelter 13C-NMR-Spektren war die im Kapitel 3.3.2 beschriebene „Inverse Gated decoupling“ Technik (Pulsprogramm „zgig“) verwendet worden. Da es sich hierbei um eine MP-Sequenz handelte, waren die Standardparameter der SP-Technik (Tabelle 5.1) nicht mehr generell übertragbar. Um NOE-Effekte zu vermeiden, wurde die Aufnahmezeit tAq– entspricht der Einstrahldauer des Entkoppler-Impulses – auf 2,8 s begrenzt. Messungen mit längeren Aufnahmezeiten (tAq = 6 s) führten zu Intensitätsverfälschungen im Spektrum, verursacht durch NOE-Effekte. Entsprechend der längsten T1-Zeit von 21 s wurde D1= 180 s > 7 x 21 s gesetzt, womit der Bedingung zum vollständigen Abbau evtl. aufgebauter NOE-Effekte ebenfalls nachgekommen wurde. Die Spektrenaufnahmen (fünf Messungen) erfolgten am 10mm HR-Messkopf. Die Akkumulation von 256 Scans führten zu einem S/N von 650.
Das Aufstellen des Unsicherheitsbudgets und die Berechnungen der erweiterten Unsicherheiten erfolgten analog zu dem im Kapitel 6.1.1.3 beschriebenen Verfahren. Die Einwaagen erfolgten auf der Sartorius BP121S mit einer Einwaageunsicherheit von u(m)=±0,2mg (Tabelle 4.1). In Tabelle 6.9 sind die berechneten kombinierten und erweiterten Unsicherheiten bei Betrachtung eines 95%igen Konfidenzintervalls sowie die effektiven Freiheitsgrade (berechnet nach Gleichung 4.5) dargelegt. Die in dieser Tabelle aufgeführten Erweiterungsfaktoren wurden für effektive Freiheitsgrade feff < 10 dem GUM [11] entnommen. Andernfalls wurde ein Konfidenzniveau von 95 % mit k = 2 geschätzt.
Um den Einfluss systematischer Abweichungen zu ermitteln, wurden die Analysenergebnisse mit den Reinheitsangaben des Herstellers (Reinheit > 99 %) verglichen. Entsprechend der im Kapitel 6.1.1.4 beschriebenen Vorgehensweise zur Festlegung des Referenzwertes (Rechteckverteilung) ergaben sich als Referenzwerte für alle vier Komponenten Reinheitsgrade von (99,5 ± 0,3) g/g %. Die Abweichungen der Analysenergebnisse von den Referenzwerten wurden bei der Fehleranalyse durchgängig als geringfügig eingestuft. Die relative Messunsicherheit des Verfahrens (k=2; p=95%) wurde zu 2 % bestimmt.
Nachdem im Kapitel 6.2.1 ein Messverfahren erarbeitet und die Messunsicherheit des Verfahrens laborintern bestimmt wurde, sollte mit der Teilnahme an einem internationalen Ringversuchs des CCQMs ein Vergleich mit anderen Methoden erfolgen. Das Ziel des Pilot-Ringversuches CCQM-P20a, organisiert vom NARL, war die Reinheitsbestimmung von Tri(nbutyl)zinnchlorid (TBT-Cl), das u.a. Isomere und Homologe als Verunreinigungen enthielt. Voruntersuchungen vom NARL [90] mit der 1D-NMR-Spektroskopie zeigten, dass die 1H-NMR aufgrund überlagerter Signale sowie eines komplexen Spektrums (homonukleare Kopplungen von 1H mit 1H und heteronukleare von 1H mit 13C und 115,117,119Sn) diese Aufgabenstellung nicht bewältigen kann. Ferner ist die 119Sn-NMR wegen fehlender geeigneter interner Standards, keiner homogenen Anregung über die gesamte Spektrenweite, Liganden-Austausch und breiter Signale (erschwert die Identifizierung von geringen Verunreinigungen) nicht einsetzbar. Die Reinheitsanalyse mit der 1H-entkoppelten 13C-NMR ist hingegen ein einsetzbares, hierfür noch nicht weiter untersuchtes Verfahren. Es wurde daher versucht, mit der 13C-NMR-Technik an diesem CCQM-Ringversuch teilnehmend dieses Problem zu lösen. Als interner Standard wurde das ZRM Benzoesäure eingesetzt.
Zur quantitativen Auswertung wurden zwei Aliquots (A: 120,8 mg TBT-Cl und 228,9 mg ZRM; B: 122,0 mg TBT-Cl und 205,0 mg ZRM) eingewogen und in einem Lösungsmittelgemisch, bestehend aus DMSO-d6 und CDCl3 im Verhältnis 1:1, gelöst und verdünnt. Die 1H-entkoppelten 13C-Spektren wurden am QNP-Messkopf mit der „Inverse Gated decoupling“-Technik unter Setzung der Entkopplungszeit auf tAq= 3 s (zur Minimierung der NOE-Entwicklung) und demzufolge einem Relaxationsdelay von D1= 150 s (> 7 x T1) aufgenommen. Die T1-Relaxationszeiten wurden für die Signale der Benzoesäure zu < 10 s und für die des TBT-Cl zu < 6 s bestimmt. Insgesamt wurden nach Ringversuchsanweisung vier Messungen pro Aliquot ausgeführt. Die Akkumulation von 128 Scans (entspricht einer Gesamtaufnahmezeit von 6h pro Spektrum) führte zu einem ausreichendem S/N von 200.
Gemäß der im Kapitel 5.1.2 beschriebenen Arbeitsanweisung wurden die Spektren prozessiert, korrigiert und integriert. Das in der Abbildung 6.10 gezeigte 1H-entkoppelte 13C-Spektrum gibt bei 12 ppm, 19 ppm, 25 ppm und 27 ppm die vier Signale des TBT-Cl und bei 127 ppm, 129 ppm, 130 ppm, 132 ppm und 167 ppm die fünf Signale der Benzoesäure wieder.
Diese Signale wurden jeweils einzeln integriert, wobei die Sn-Satelliten der TBT-Cl-Signale miterfasst wurden, nicht aber im Spektrum erkennbare Signale von Verunreinigungen. Die Einhaltung eines konstanten Integrationsfaktors war daher nicht möglich. Auffällig waren bei
Im Gegensatz dazu streuen die aus jeder möglichen Kombination je eines Signals pro Substanz berechneten und in Matrizen dargestellten Reinheitsgrade innerhalb eines Spektrums bis zu 5 % relativ (Gleichung 4.7). Die Tabelle 6.12 gibt beispielhaft die Matrix des Spektrums in der Abbildung 6.10 wieder.
Um diesen Effekt näher zu untersuchen, wurde eine Messung am 10mm HR-Messkopf mit einer größeren Einwaage (542,4mg TBT-Cl und 232,2mg ZRM Benzoesäure in 2ml DMSO-d6 + CDCl3 (1:1) gelöst) und einer längeren Messzeit von 66h ausgeführt. Das hierbei erreichte S/N von 550 gab die Signale der Verunreinigungen im Spektrum gut erkennbar wieder; im Integrationsbereich liegende Fremdsignale waren von geringer Intensität. Die Auswertung ergab hier einen mit dem QNP-Messkopf vergleichbaren Reinheitsgrad von 97,4%. Jedoch wichen auch hier die integrierten Intensitätsverhältnisse der Benzoesäure-Signale vom natürlichen Verhältnis um bis zu 5 % relativ ab. Ursache hierfür war der geringe Abstand zwischen den Signalen, wodurch die Signale nicht die Grundlinie erreichen, wie in der Abbildung 6.11 dargestellt.
Der dabei auftretende Fehler der Intensitätswiedergabe bei der Korrektur des Integralzuges zu geraden An- und Ausläufen wurde bereits in Kapitel 5.3.2 beschrieben. Daraufhin wurde eine zweite Auswertungsart untersucht. Entsprechend der aufgestellten Forderung zur Auswertung teilweiser überlagerter Einzelsignale (Kapitel 5.3.2) wurden diese vier Signale mit einem einzigen Integralzug erfasst, dargestellt in Abbildung 6.12.
Das dabei erhaltende Verhältnis der Intensitätswerte dieses Integrals zu dem des Signals bei 166ppm war dem natürlichen Verhältnis von 6:1 sehr nahe. Der berechnete Reinheitsgrad aus diesen Integralwerten ergab 95,8 %, einen um ca. 2 % relativ kleineren Wert als bei der vorherigen Auswertungsart. Dementsprechend wurden bei den acht Spektren des Ringversuchs am QNP-Messkopf die vier Einzelintegrale der aromatischen Benzoesäure-
Zur Überprüfung, ob bei dieser Entkopplungsdauer signifikante NOE-Effekte auftraten, wurden Messungen mit einer kürzeren Aufnahmezeit (tAq =1,5 s) sowie mit einem Relaxationsreagenz (Cr(acac)3) durchgeführt, die vergleichbare Resultate lieferten. Damit konnte gezeigt werden, dass bei einer Entkopplungsdauer von 3 s die Intensitäten im Spektrum richtig wiedergegeben werden.
Das hier zu betrachtende Unsicherheitsbudget entspricht dem im Kapitel 6.1.1.3 aufgeführten, wobei die Einwaagen auf der Sartorius BP121S-Waage durchgeführt wurden, deren Einwaageunsicherheit nach Kapitel 6.2.1.2 u(m)= ± 0,2 mg beträgt. Die darin eingehenden Unsicherheitsbeiträge sind in der Tabelle 6.13 für die Auswertung der acht Ringversuchsmessungen mit der Integration aller Einzelsignale aufgeführt.
Hieraus ergab sich eine hauptsächlich durch die Unsicherheit der Integration beeinflusste kombinierte Unsicherheit von ± 0,4 g/g %. Als erweiterte Unsicherheit konnte bei einem 95%igen Konfidenzintervall mit einem k-Faktor von 2,4 (entspricht feff = 7) ein Wert von
±1,0 g/g % ermittelt werden. Analog dazu wurde bei der zweiten vorgestellten Auswertungsmethode der Reinheitsgrad des TBT-Cl zu (95,8±1,3)g/g% (k=2,36; p=95%) korrigiert.
Innerhalb des Bearbeitungszeitraumes für den Ringversuch wurde das Ergebnis der Reinheitsanalyse mit Einzelintegration der Benzoesäure-Signale abgegeben. Nach Abschluss des Ringversuches, aber noch vor Bekanntgabe der Ergebnisse, wurde das korrigierte Analysenergebnis dem Veranstalter mitgeteilt.
Aus der vom Veranstalter ausgefertigten Darstellung der Ringergebnisse in Abbildung 6.13ist zu erkennen, dass das korrigierte Analysenergebnis (BAM-NMR 28-Feb-2002) recht gut mit denen der anderen Methoden und anderer Institute übereinstimmt.
Bei Messungen bei der Firma Bruker sollte an einem Höchstfeld-NMR-Spektrometer (18,8T; 800 MHz) untersucht werden, ob bei höherem Feld eine Verbesserung der Auswertung mit der 13C-NMR und der 1H-NMR möglich ist. Aufgrund der schlechteren Auflösung (breitere Linien) wurde der Vorteil der doppelten Messfrequenz kompensiert, wie auch schon im Kapitel 5.3.4 diskutiert. Jedoch führt die bei weitem höhere Empfindlichkeit zu einer kürzeren Messzeit. Das 1H-NMR-Spektrum am 800 MHz Spektrometer aufgenommen zeigt in der Abbildung 6.14 die gut voneinander getrennten Protonen-Signale des TBT-Cl. Eine quantitative Auswertung zur Reinheitsbestimmung war aufgrund der auf den Flanken der Hauptsignale liegenden Protonensignale der Verunreinigungen nicht möglich.
An Stoffsystemen, die mit der 1H-SP-NMR nicht quantitativ auswertbar sind (Xylol-Isomere, TBT-Cl), wurde der Einsatz der quantitativen 13C-NMR ausgetestet. Zur Vereinfachung der Spektren wurde hierzu die 1H-entkoppelte-BB-13C-NMR-Technik verwendet, bei der es sich jedoch um eine MP-Methode handelt. Demzufolge musste die Aufnahmezeit, während der entkoppelt wird, optimiert werden, um Intensitätsveränderungen durch NOE-Effekte zu vermeiden. Eine Aufnahmezeit von 3s zeigte im Vergleich zu einer kürzeren Aufnahmezeit von 1,5s (kürzere Einstrahldauer der Entkopplerleistung) sowie zum Einsatz von Relaxationsreagenzien keinen Einfluss auf die Intensitäten im Spektren, während eine längere Aufnahmezeit von 6s die Intensitäten signifikant verfälschte.
Am System der Xylol-Reinheitsbestimmung wurde die Messunsicherheit des Verfahrens der Reinheitsbestimmung mit der quantitativen 13C-MP-NMR ermittelt. Hierzu wurde eine Xylol-Lösung hergestellt, die o-, m- und p-Xylol sowie ETB in ungefähr gleichen Intensitätsverhältnissen enthielt. Durol, dessen Reinheit auf ZRM Benzoesäure rückgeführt wurde, diente als interner Standard. Bei einem 95%igen Konfidenzintervall wurde generell sowohl die relative erweiterte Unsicherheit des Analysenergebnisses als auch die relative Messunsicherheit des Verfahrens (Referenzwert: Herstellerangabe) für die Reinheitsanalyse für jede der vier Komponenten zu unter 2 % bestimmt. Die Abweichungen der Analysenwerte zu den Referenzwerten stellten sich als geringfügig heraus. Diese an der hier untersuchten Modell-Lösung erarbeiteten Erkenntnisse sind auf jede reale Xylol-Probe übertragbar, da deren Spektren aufgrund der geringeren Signalintensitäten der enthaltenden Verunreinigungen gegenüber dem hier betrachteten Modell-System einfacher auswertbar sind. Wie auch bei dem Verfahren der Reinheitsbestimmung mit der 1H-NMR dominierten hier die Unsicherheitsbeiträge der Integration (Auswertung) und der beiden Einwaagen (Analyt, Standard) im Unsicherheitsbudget. Die weiteren Unsicherheitsbeiträge der Molmassen von Analyt und Standard sowie des Reinheitsgrades vom Standard sind vernachlässigbar gering.
Es wurden Arbeitsanweisungen zur Reinheitsbestimmung über die Hauptkomponentenanalyse mit der 1H-SP-NMR und der 13C-MP-NMR ausgearbeitet und an Modell-Systemen die Messunsicherheiten der Verfahren bestimmt. An realen Proben wurden die erarbeiteten Arbeitsanweisungen ausgetestet und mittels eines internationalen Ringversuchs mit anerkannten Analyseverfahren verglichen. Folgende Erkenntnisse wurden dabei gewonnen:
Für die Reinheitsbestimmung mit der 1H-SP-NMR konnte die zur Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen bewährte Arbeitsanweisung übernommen werden. Sie wurde lediglich um die Probenpräparation (Einwaage von Analyt und Standard in einem Intensitätsverhältnis der auszuwertenden Signale von ungefähr 1:1) erweitert.
Bei der Wahl des internen Standards ist darauf zu achten, dass es zu keiner Überlagerungen der auszuwertenden Signale kommt und ein Integrationsfaktor von mindestens 64 angesetzt werden kann. Ferner sollte der Reinheitsgrad des Standards nur eine geringe Unsicherheit aufweisen, um im Unsicherheitsbudget vernachlässigt werden zu können.
Bei der Reinheitsbestimmung des Modell-Systems von Maleinsäure mit ZRM Benzoesäure führte die Auswertung mit einem größeren Integrationsfaktor von 200 (anstelle von 64) bei einem besseren S/N von größer als 10000 (anstatt größer 150) zu einer geringeren relativen Messunsicherheit des Verfahrens (k=2; p=95%) von 1,0 % (1,5 % bei S/N > 150, Integrationsfaktor 64).
Anhand der Reinheitsbestimmung einer Modell-Lösung von Xylol-Isomeren (o-, m- und p-Xylol sowie ETB) mit Duren als einen auf ZRM Benzoesäure zurückgeführten internen Standard wurde der Einsatz der quantitativen 13C-NMR untersucht, wenn die quantitative 1H-NMR nicht anwendbar ist. Dabei ist die Aufnahmezeit (und damit verbunden die Entkopplungsdauer) entgegen der Arbeitsanweisung zur Aufnahme von SP-Experimenten auf 3 s zu begrenzen. Längere Aufnahmezeiten führten zu NOE-Effekten, und somit zur Intensitätsverfälschung in den Spektren. Die relative Messunsicherheit
(k=2; p=95%) bei einem S/N > 150 und einem Integrationsfaktor von mindestens 64 wurde zu 2 % bestimmt, also nur geringfügig höher als mit der 1H-SP-NMR unter identischen Bedingungen (1,5 %). Jedoch ist der Zeitaufwand für eine quantitative 13C-NMR-Messung aufgrund der geringeren natürlichen Häufigkeit des 13C-Isotops (1,1 %) um ein Vielfaches größer.
Der Vergleich mit anderen Analysenverfahren bei der Reinheitsbestimmung von TBT-Cl (internationaler Ringversuch CCQM-P20a) zeigte, dass die quantitativen 13C-NMR (hier mit ZRM Benzoesäure als internem Standard) mit einer relativen Messunsicherheit
(k=2; p=95%) von 2% eine Alternative ist.
In das Unsicherheitsbudget gehen die Standardunsicherheiten der Integration, der beiden Einwaagen und Molmassen des Analyten und des Standards sowie des Reinheitsgrades vom Standard ein. Dabei sind die Unsicherheitsbeiträge der Molmassen und – bei geeigneter Wahl des Standards – der Unsicherheitsbeitrag des Reinheitsgrades vom Standard vernachlässigbar gering.
Aufgrund der ermittelten Messunsicherheiten ist die Reinheitsbestimmung von Reinstsubstanzen (Reinheitsgrad ≥ 99,9 g/g %) mit der quantitativen NMR-Spektroskopie mittels der Hauptkomponentenanalyse nicht möglich.
Die Bestimmung des Gehaltes oder der Konzentration einer Komponente in einer Matrix gehört ebenso zu den Schwerpunkten der Analytik wie die Reinheitsbestimmung. Publikationen aus Bereichen wie z.B. der Pharmazie [51, 92, 93, 94, 39], der Agrar- [95, 96] und der Werkstofftechnik [97] zeigen, dass die quantitative NMR-Spektroskopie auch hier als analytisches Verfahren eingesetzt werden kann. Die in diesen Arbeiten angegebenen Präzisionen beruhen ausschließlich auf den experimentell ermittelten Standardabweichungen. Es sollte daher an Modell- und Referenzlösungen im Hinblick auf den internationalen Ringversuch CCQM-P35 ein Verfahren zur Gehaltsanalyse mit der NMR-Spektroskopie unter Berücksichtigung eines aufzustellenden Unsicherheitsbudgets erarbeitet werden
3-Trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsäure-Natriumsalz (TSP) (Abbildung 7.1) ist in der qualitativen 1H-NMR-Spektroskopie ein gängiger Verschiebungsstandard in wässrigen Lösungen [16]. In mehreren Publikationen [93, 94, 39, 98] wurde es angesichts seiner optimalen Lage im Spektrum (0ppm) und seines schmalen Singulett-Signals für quantitative Analysen als ein geeigneter Standard beschrieben. Wegen seiner hygroskopischen Eigenschaft kann es jedoch nur als Standardlösung eingesetzt werden. Daher wurde für die Ethanol-Gehaltsanalyse im folgenden Kapitel 7.2 eine Standardlösung mit einem Gehalt von (9,125 ± 0,038) mg g-1 TSP (Fa. Merck AG, Reinheitsgrad >99%) D2O angesetzt, deren genauer TSP-Gehalt zur weiteren Verwendung als internem Standard auf das ZRM Benzoesäure zurückgeführt werden sollte.
Die allgemeine Probenpräparation des Verfahrens der Gehaltsanalyse mit der NMR-Spektroskopie entspricht dem im Kapitel 6.1.1.1 beschriebenen allgemeinen Präparationsverfahren der Reinheitsbestimmung, wobei anstelle des Analyten die zu analysierende Matrix eingewogen wird. Die Spektrenaufnahme erfolgte mit den in der Tabelle 5.1 optimierten Parametern zur quantitativen Analyse. Zur Gehaltsanalyse des TSP wurden drei Aliquots, bestehend aus der TSP-Lösung und dem ZRM Benzoesäure als internem Standard, eingewogen (Tabelle 7.1) und 0,4ml DMSO-d6 zum vollständigen Lösen der Benzoesäure hinzugegeben. Die Spektrenaufnahme erfolgte entsprechend den bestimmten T1-Relaxationszeiten
Die Prozessierung und Auswertung der Spektren erfolgte nach der im Kapitel 5.1.2 beschriebenen Arbeitsanweisung. Das in Abbildung 7.2 dargestellte 1H-NMR-Spektrum gibt bei
0 ppm das Signal vom TSP sowie bei 7,54ppm (H2), 7,65ppm (H) und 7,99ppm (H2) die aromatischen Protonensignale der Benzoesäure wieder.
Die Auswertungen der Spektren (mit einem Integrationsfaktor von 500 bei Erfassung der drei Signale der Benzoesäure mit einem Integral) lieferten die in der Tabelle 7.2 aufgeführten, nach Gleichung (3.14) berechneten TSP-Gehalte.
Die von Larive beschriebene zeitliche Konzentrationsabnahme vom TSP im wässrigen Medium durch Adsorption an den Glaswänden einer Kapillare [49] konnte nur partiell bestätigt werden. In den NMR-Messröhrchen wurden nach fünf Wochen beim Aliquot A der TSP-Gehalt mit einer Richtigkeit von besser als 99% wiedergegeben, hingegen beim Aliquot C ein um 2 % relativ und beim Aliquot B ein um 6% relativ geringerer TSP-Gehalt bestimmt. Der in der Stammlösung (aufbewahrt in einer 200ml Schliffflasche) bei einer erneuten Einwaage von 31,79mg ZRM und 1010,4mg der TSP-Lösung ermittelte TSP-Gehalt von 9,17mgg-1 bestätigte die Stabilität der Stammlösung über einen Zeitraum von zwei Monaten. Ursache für die partiell auftretenden zeitlichen Konzentrationsabnahmen des TSP ist das Verhältnis vom Volumen der Lösung zur benetzten Glasoberfläche. Je kleiner dieses Verhältnis ist (z.B. in der Kapillare), umso mehr TSP kann prozentual aus der Lösung adsorbiert werden. Zur Aufbewahrung einer TSP-Standardlösung ist daher auf ein großes Lösungsvolumen bei gleichzeitiger geringer Benetzung der Glasoberfläche zu achten.
In das allgemeine Unsicherheitsbudget für die Gehaltsanalyse mit der NMR-Spektroskopie gehen gemäß der Messgleichung (3.14) die Unsicherheit der Integration (Intensitätsverhältnis) nach Gleichung (4.1), die Unsicherheiten der Molmassen (Gleichung (4.6)) und Einwaagen (Gleichung (4.9)) von Analyt und Standard sowie die Unsicherheit des Reinheitsfaktors des Standards ein. Die kombinierte Unsicherheit berechnet sich demzufolge als Wurzel aus der Quadratsumme der Einzelunsicherheitsbeiträge nach Gleichung (4.13). In der Tabelle 7.3 wurden die einzelnen Unsicherheitsbeiträge sowie die daraus berechnete kombinierte Messunsicherheit für die Gehaltsanalyse der TSP-Standardlösung aufgeführt.
Aufgrund der Rückführung des Ergebnisses von der Gehaltsanalyse auf ein ZRM (äquivalent zur Reinheitsbestimmung der Maleinsäure im Kapitel 6.1.1) kann die TSP-Standardlösung für weitere quantitative Analysen als ein auf ein ZRM zurückgeführter Standard eingesetzt werden. Diese Standardlösung wurde den Teilnehmern des Ringversuches CCQM-P35 (Kapitel 7.3) als internem Standard zur Rückführung des Messwertes zugestellt.
Zur Bestimmung der Messunsicherheit des Verfahrens wurde der Analysenwert auf den eingewogenen TSP-Gehalt referenziert. Der Analysenwert und dessen kombinierte Unsicherheit, die Abweichung zum Referenzwert, deren Unsicherheit sowie die nach Gleichung 4.15 daraus berechnete relative Messunsicherheit (k=2; p=95%) von 1,0 % sind in Tabelle 7.4 dargestellt. Die Abweichung des Analysenwertes vom Referenzwert erwies sich als geringfügig.
Zusammenfassend wurde am Modell-System einer wässrigen TSP-Lösung (TSP in D2O) mit Benzoesäure als internem Standard die Messunsicherheit des Verfahrens der Gehaltsbestimmung untersucht. Der zu analysierende Stoffmengengehalt lag bei ungefähr 50 µmol g-1. Wie auch bereits im Kapitel 6.1.1 führte die Auswertung der Spektren bei einem S/N von über 7000 und einem Integrationsfaktor von 500 zu einer relativen Messunsicherheit des Verfahrens (k=2; p=95%) von 1 %. TSP ist aufgrund seiner Lage im Spektrum und seines schmalen Singulett-Signals ein geeigneter interner Standard, sofern er als eine Lösung bekannten Gehalts eingesetzt wird. Die Stabilität dieser Lösung kann über einen längeren Zeitraum gesichert werden, wenn bei der Aufbewahrung auf ein großes Verhältnis zwischen Volumen und benetzter Glasoberfläche geachtet wird. Durch die Rückführung mittel des ZRM Benzoesäure steht er somit als ein auf ein ZRM zurückgeführter Standard zur Verfügung.
Seit 2001 werden an der BAM in der Fachgruppe I.2 forensische Ethanol-Referenzlösungen (Ethanol-Gehalt um die 0,1%) für Atemalkohol-Messungen hergestellt und mit einem Referenzverfahren unter Einsatz der Gas-Chromatographie (GC) kontrolliert [99].
Die NMR-Spektroskopie sollte vom Prinzip her die Analyse der Ethanol-Gehaltsbestimmung solcher Referenzlösungen schnell und einfach lösen können. Da in der Literatur bisher kein solches Analysenverfahren mit der quantitativen NMR-Spektroskopie beschrieben wurde, sollte erstmals ein Verfahren entwickelt werden. So war für die Vorbereitung von Ringversuchen auf nationaler (NMR-3) und internationaler Ebene (CCQM-P35) für die Ermittlung der metrologischen Güte des Verfahrens (vom Labor I.31 organisiert) eine Arbeitsanweisung zu erarbeiten, nach der an jedem NMR-Spektrometer die Gehaltsanalysen solcher Referenzlösungen mit einem auf SI-Einheiten zurückgeführten Unsicherheitsbudget bearbeitet werden können. Bei einer ausreichenden Messunsicherheit dieses Verfahrens könnte die quantitative NMR in dieses Referenzverfahren eingegliedert werden.
Die in dieser Arbeit dargestellte Reihenfolge der Ergebnisse entspricht nicht dem zeitlichen Ablauf. Erfahrungen mit dem Umgang von wässrigen Ethanollösungen sowie mit NMR-Wasserunterdrückungstechniken waren im Labor nicht vorhanden und mussten schrittweise erworben werden.
In dem speziellen Fall, dass die zu untersuchende Lösung aus genau zwei Komponenten besteht, kann der Gehalt direkt aus dem Verhältnis der Intensitäten der beiden auszuwertenden Signalen berechnet werden.
wobei der Term
Wie die Analyse im Kapitel 7.2.1 zeigte, war eine genaue Gehaltsbestimmung ohne Standard nicht möglich. Es sollte daher der Ethanol-Gehalt über die Rückführung auf einen internen Standard ermittelt werden. Die beiden folgenden Standards wurden ausgewählt:
3-Trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsäure-Natriumsalz: Das Protonensignal des TSP war im Spektrum mit einer Lage bei 0 ppm weit genug entfernt vom Wassersignal. Die in geringer Intensität vorhandenen undeuterierten CH2-Signale bei 1,21ppm und 1,84ppm behinderten die Auswertung des Ethanols nicht. Ferner war hinsichtlich der Verwendung einer Standardlösung, deren Gehaltsbestimmung im Kapitel 7.1 beschrieben wurde, eine größere Einwaage möglich, die zu einer geringeren Einwaageunsicherheit führte. Insgesamt erschien daher die TSP-Standardlösung als ein idealer Standard für dieses quantitative Problem.
Maleinsäure: Bei der Maleinsäure lag das Protonensignal (6,44 ppm) näher am Wassersignal als das des TSP, jedoch für die Analyse ausreichend entfernt. Für die Maleinsäure spricht die Stabilität des Reinheitsgrads, der keiner zeitlichen Veränderung unterliegt, wie er beim Gehalt der TSP-Standardlösung beobachtet wurde.
Zur Analyse des Ethanol-Gehalts über einen internen Standard wurden 153,9 mg TSP-Standardlösung zu 1038,5mg einer Ethanol-Referenzlösung eingewogen. Die quantitative Aufnahme und Auswertung erfolgte wie bereits im Kapitel 7.2 beschrieben, jedoch mit einer Akkumulation von 128 Scans. Das so erhaltene Spektrum erwies sich als auswertbar und der ermittelte Ethanol-Gehalt von 1,026mgg-1 wich vom gravimetrischen Referenzwert von (1,032±0,001)mgg-1 um weniger als 1% ab. Aufgrund des großen Signalhöhen-Unterschieds zwischen dem Wassersignal und den Signalen des Ethanols und des TSP kommt es zu einer schlechten Ausnutzung des dynamischen Bereiches für die auszuwertenden Signale. Somit könnten NMR-Geräte mit einer geringen Wortlänge des ADCs (z.B. 8 Bit) Probleme bei der Intensitätswiedergabe dieser Signale haben. Es wurden daher Methoden zur Verbesserung des dynamischen Bereiches untersucht.
Um die vertikale Auflösung der auszuwertenden Signale zu verbessern, war die Reduzierung des Wassersignal notwendig. Hierzu wurden drei ausgewählte Unterdrückungs-Sequenzen, deren Grundlagen bereits im Kapitel 3.3 beschrieben wurden,
Presaturation (einfachste Unterdrückungsmethode)
Watergate (am weitverbreitetste Unterdrückungsmethode [39])
LC1WET (unabhängig von B1-Feldimhomogenitäten)
auf ihre quantitativen Eigenschaften hin untersucht und miteinander verglichen.
Die Vorsättigungstechnik (Presaturation) enthält von den drei ausgewählten Unterdrückungsmethoden die einfachste Multi-Pulse (MP)-Sequenz, die im Vergleich zur SP-Technik nur einen weiteren Impuls, den der Vorsättigung, enthält. Aufbauend auf der Validierung der SP-Methode war dieser Vorsättigungsimpuls zu optimieren.
Die Optimierung des Sättigungsimpulses erfolgte an zwei Modell-Lösungen, bestehend aus Ethanol in D2O mit TSP als Referenzsignal. Hierbei wurden die Sättigungsstärke und -länge jeweils einzeln variiert. Die Aufnahme und Auswertung der Spektren erfolgte nach der Arbeitsanweisung im Kapitel 5.1.2 (D1=60s, ns=32, Integrationsfaktor=200).
Zur Optimierung der Sättigungsstärke wurde diese ausgehend von einer Dämpfung von
66 dB in 6 dB Schritten bis 42 dB variiert. Die Sättigungsdauer von 1,5 s wurde dabei konstant gehalten. Die aus jeweils fünf Messungen ermittelten Schätzwerte der Intensitätsverhältnisse zwischen CH2-Ethanol- und TSP-Signal bzw. CH3-Ethanol- und TSP-Signal sowie deren Standardunsicherheiten sind für die entsprechenden Leistungen des Sättigungsimpulses in der Tabelle 7.5 aufgelistet.
Aus dieser Tabelle ist deutlich die mit zunehmender Sättigungsleistung stärker werdende Teilsättigung des CH2-Ethanolsignals erkennbar. Dass die Angabe der Impulsleistung in dB weder zwischen Bruker-Spektrometern (abhängig von der Gerätekonstellation) einheitlich noch zu NMR-Spektrometern der Hersteller Varian und Jeol eindeutig ist, war zu diesem Zeitpunkt der Arbeit im Labor nicht bekannt. Erst im Verlaufe der Auswertung des nationalen
Zur Verdeutlichung des Einflusses der Sättigungsstärke auf die Intensitäten der Ethanolsignale wurden die ermittelten Intensitätsverhältnisse der jeweiligen Sättigungsleistung auf die der SP-90°-Messung referenziert und in Abbildung 7.4 dargestellt.
Dieses Diagramm gibt die partielle Intensitätssättigung des CH2- bzw. CH3-Ethanolsignals in Abhängigkeit von der Sättigungsstärke wieder. Die dabei eingezeichneten kombinierten Messunsicherheiten berechneten sich aus den Unsicherheitsbeiträgen der Referenzmessung (SP-90) u(xSP) und des Messwertes u(xi) nach folgender Gleichung:
Mit zunehmender Impulsleistung des Sättigungsimpulses stellte sich eine Verbreiterung des Sättigungsbereiches ein. Bereits ab einer Impulsstärke von 60 dB (49 Hz Anregungsbreite) wird das näher am Wassersignal liegende CH2-Ethanolsignal (Abstand von ca. 450 Hz) signifikant mitgesättigt. Das CH3-Signal erfährt aufgrund des größeren Abstands zum Wassersignal (ca. 1440 Hz) erst bei einer Sättigungsstärke von 42 dB (426 Hz Anregungsbreite) eine signifikante Mitsättigung. Die Intensität des CH2-Ethanolsignals wird bei dieser Leistung des Sättigungsimpulses bereits um fast 50 % reduziert.
Als optimaler Parameterwert für die Sättigungsstärke am 400MHz-Spektrometer (TXI-Messkopf) erwies sich eine Dämpfung von 66 dB, die einer Anregungsbreite des
Der zweite Parameter, die Sättigungsdauer, wurde bei einer Pulsstärke variiert, die einer Anregungsbreite von 40 Hz entspricht. Hier wurden dem SP-90°-Experiment – als Referenzspektrum – Presaturation-Experimente mit Sättigungsimpulslängen von 1,5s, 5s, 10s und 60s gegenübergestellt. Zusätzlich wurde das Bruker-Presaturation-Pulsprogramm zgpr ausgetestet, bei dem zeitgleich zum Relaxationsintervall (D1 = 60 s) die Sättigung des Wassersignals erfolgt. Die Spektren wurden analog zur Optimierung der Impulsstärke aufgenommen und ausgewertet. In der Tabelle 7.6 sind die auf das TSP-Signal normierten Intensitäten des CH3-Ethanolsignals aufgeführt.
Die Darstellung in Abbildung 7.5, welche die relativen Signalintensitätsveränderung des beobachteten CH3-Ethanolsignals bezogen auf das SP-90°-Experiment wiedergibt, verdeutlicht die Abhängigkeit von der Sättigungsdauer.
Zusammenfassend ist als optimaler Parameter für die Sättigungslänge zur quantitativen Anwendung der 1H-Presaturation-Technik wurden bei der Optimierung des Vorsättigungsimpulses eine Dauer von 1,5 s bestimmt. Ferner ist die Sättigungsleistung so zu setzen, dass eine Anregungsbreite des Sättigungsimpulses von 20Hz bis 30Hz erreicht wird. Mit diesen Parametern sollten generell an jedem NMR-Spektrometer die Intensitäten des Ethanols und der beiden hier betrachteten Standards bei quantitativ aufgenommenen
1H-NMR-Spektren mit Presaturation des Wassersignals mit einer Richtigkeit von besser als 99 % wiedergeben werden. Stärkere und längere Sättigungsimpulse führten zur besseren Sättigung des Wassersignals, verfälschten aber die Intensitätswiedergabe der Ethanolsignale im Spektrum.
Während die Presaturation-Technik an jeder NMR-Gerätekonstellation eingesetzt werden kann, benötigt die Watergate-Sequenz Gradiententechnik (z-Gradientenverstärker, Messkopf mit z-Gradient). Der in dieser Arbeit verwendete z-Gradientenverstärker leistete anstelle der üblichen 10A eine Leistung von 40A. Dadurch mussten die Gradientenstärken im Pulsprogramm („p3919gp“) von 20 % auf 5 % herabgesetzt werden. Als Messkopf wurde der 5 mm TXI mit z-Gradient verwendet. Die Messparameter wurden entsprechend den Vorgaben des Pulsprogramms gesetzt; unter Berücksichtigung der Parameter aus Tabelle 5.1 zur quantitativen Aufnahme (D1=60s und ns=32). Das so aufgenommene 1H-NMR-Spektrum der Modell-Lösung zeigte ein Restwassersignal geringer Intensität. Dabei wurden die Multiplett-Signale des Ethanols im Gegensatz zum Singulett-Signal des TSP mit Phasenfehler dargestellt (Abbildung 7.6). Ursache für diese Phasenfehler ist die zeitliche Weiterentwicklung der Spin-Spin-Kopplungen, die nicht durch die Spin-Echo-Sequenz beeinflusst werden. Dabei wird die Mitte eines Multipletts phasenrichtig wiedergegeben und mit größer werdenden Abstand zur Multiplett-Mitte ein wachsender Phasenfehler aufgebaut.
Entsprechend dieser Gleichung wurde für die hier eingesetzte Watergate-Sequenz mit einer Sequenzlänge von τ=7,8ms und der Kopplungskonstante des ausgewerteten Signals von
J=7Hz ein Phasenfehler von 19,7° berechnet.
Nach den Vorgaben von Bruker sollen im Pulsprogramm zwei Gradientenpulse gleicher Stärke verwendet werden. Mittels des Gradienten-Echo-Tests (Experiment 11.3 aus [37]) wurde das Verhältnis der beiden Gradientenstärken zu 5%:4,7% (maximale Intensitätswiedergabe) optimiert. Ein Einfluss auf das Analysenergebnis wurde dabei nicht festgestellt, da alle Signale in der gleichen Art und Weise davon betroffen waren.
Liu et al. [100] beschreibt den Einsatz zweier modifizierter Watergate-Sequenzen (W4 und W5), die im Vergleich zur ursprünglichen Watergate-Sequenz eine bessere Selektivität der Wasserunterdrückung aufweisen. Bei diesen beiden Sequenzen wird die aus drei Impuls-Paaren aufgebaute Spin-Echo-Sequenz durch Sequenzen mit vier (W4: 10,4°, 29,4°, 60,5° und 132,8°) bzw. fünf (W5: 7,8°, 18,5°, 37,2°, 70,4° und 134,2°) symmetrisch aufgebauten Impuls-Paaren ersetzt. Die demzufolge längeren Sequenzlängen τ (zwischen 90°-Anregungsimpuls und Beginn der Aufnahme) von 8,4ms bei der W4-Sequenz und 9,0ms bei der W5-Sequenz führten zu größeren Phasenfehlern φ bei den Multiplett-Signalen (21,2° bzw.
Beim Exciting Sculpting, einer weiteren Modifikation der Watergate-Technik, wird die Watergate-Sequenz zweimal hintereinander mit unterschiedlichen Gradientenstärken
(10:1,75) eingesetzt (Experiment 11.14 nach [37]). Wegen der nun deutlich längeren Sequenzlänge τ von 15,6 ms werden die Multiplett-Signale des Ethanols mit einem nach Gleichung (7.3) berechneten Phasenfehler von 39° im Spektrum wiedergegeben. Wie in der Abbildung 7.8 dargestellt, ist die Triplett-Form des auszuwertenden CH3-Ethanolsignals aufgrund des Phasenfehlers nicht mehr eindeutig erkennbar.
Angesichts der größer werdenden Phasenfehler wurden die modifizierten Watergate-Sequenzen für die Anwendung zur quantitativen Auswertung nicht weiter betrachtet .
Die LC1WET-Technik setzt ebenso wie die Watergate-Sequenz Gradiententechnik voraus. Analog zur Untersuchung der Watergate-Sequenz wurden hier die im Pulsprogramm vorgeschriebenen Parametern (Gradientenstärken im Pulsprogramm durch vier dividiert) unter Berücksichtigung der Parameter zur quantitativen Aufnahme von NMR-Spektren aus
1H-NMR-Spektrum zeigte ein schmales Restwassersignal mit geringer Intensität und gut auswertbaren Signalen des Ethanols und des Standards.
In diesem Kapitel sollen die drei Wasserunterdrückungsmethoden anhand von vier Kriterien (Unterdrückung, Spektrenform, Anregungsprofil, Richtigkeit) unter Verwendung der im Kapitel 7.2.4.1.1 optimierten Parameter für die Presaturation-Technik mit einander verglichen werden. Die Experimente wurden, sofern nicht anders erwähnt, an einer Lösung bestehend aus 153,9 mg TSP-Standardlösung in 1038,5 mg einer forensischen Ethanol-Referenzlösung durchgeführt. Um unter identische Bedingungen den Vergleich durchzuführen, wurden die Spektren generell mit einem Relaxationsintervall von 60 s und einer Scananzahl von 32 aufgenommen.
Zum Vergleich des Grades der erreichten Dämpfung des Wassersignals (Unterdrückung) wurden die Spektren der drei Wasserunterdrückungstechniken dem SP-90°-Experiments gegenübergestellt (Abbildung 7.9).
Beim Vergleich der Spektrenformen wurde die Güte der Auswertbarkeit des Spektrums (Grundlinie und Form des Restwassersignals) beurteilt. In Abbildung 7.10 sind die Spektren der Wasserunterdrückung – nach manueller Phasenkorrektur – wiedergegeben.
Die LC1WET-Technik zeigte beim Vergleich der vier Unterdrückungstechniken die beste Spektrenform. Sie weist eine gerade Grundlinie und – aufgrund der Unabhängigkeit der Methode von B1-Feldinhomogenitäten – ein sehr schmales Restwassersignal auf. Auch das Spektrum der Watergate-Sequenz gab eine gute Grundlinie wieder, hingegen enthält es ein dispersives und breites Restwassersignal. Das Spektrum der cw-Presaturation entsprach von der Form her dem der Watergate-Sequenz. Die schlechteste Spektrenform wurde bei der pg-Presaturation erhalten. Bedingt durch die um 90° versetzte Sättigungseinstrahlung baute sich während der Akkumulation ein immenser Phasenfehler des Restwassersignals auf. Dieser führte zu einer gekrümmte Grundlinie über den gesamten Spektrenbereich.
Der Vergleich der Profile der Unterdrückungsmethoden erfolgte an einer Modell-Lösung, bestehend aus Maleinsäure in D2O, da bei Anwendung der Watergate-Methode im Gegensatz zum Triplett-Ethanolsignal kein Phasenfehler bei dem Singulett-Signal der Maleinsäure entsteht. Ausgehend von der Lage des Maleinsäuresignals (o1 = 6,4 ppm) wurde o1 schrittweise um je 100 Hz Richtung Tieffeld versetzt und das Maleinsäure-Signal ausgewertet. Die Intensität des Maleinsäuresignal beim maximalen Offset von 1900 Hz wurde zur Referenzierung gleich eins gesetzt. Der Bezug der Intensitätswerte der übrigen Spektren auf diesen Referenzwert gibt das Profil und somit den Grad der Signalunterdrückung in Abhängigkeit vom Offset zur Einstrahlfrequenz der drei getesteten Methoden wieder.
Aus der graphischen Darstellung der Ergebnisse in Abbildung 7.11 geht hervor, dass von den drei untersuchten Unterdrückungsmethoden die LC1WET-Methode den schmalsten Unterdrückungsbereich, also die höchste Selektivität aufweist. Mit zunehmendem Offset von der Einstrahlfrequenz wurde dabei eine kontinuierliche Abnahme der Intensitätswiedergabe im Spektrum (über 1900Hz 2% relativ) beobachtet. Dieser Effekt ist nach Zhang et al. [40,
Das wichtigste Vergleichskriterium war die richtige Intensitätswiedergabe der Signale von Ethanol und Standard im Spektrum. Der gravimetrische Referenzwert des Ethanol-Gehalts der eingesetzten Referenzlösung betrug (1,032±0,001)mgg-1. Mit der SP-90°-Technik wurde der Ethanol-Gehalt anhand einer Einzelmessung zu 1,026mgg-1 und mit der pg-Presaturation-Methode zu 1,028mgg-1 ermittelt. Anhand einer weiteren Modell-Lösung wurde gezeigt, dass zwischen pg- und cw-Presaturation kein signifikanter Unterschied in der Richtigkeit vorlag. Der Ethanol-Gehalt der Referenzlösung wurde mit der LC1WET-Technik zu 1,037mgg-1 bestimmt, zum Referenzwert also nur +0,5% relativ abweichend, jedoch ungefähr 1% relativ höher als mit dem SP- und dem Presaturation-Verfahren. Dies entspricht dem im Kapitel 7.2.5.3 beschriebenen Anregungsprofil der LC1WET-Technik. Der ermittelte Ethanol-Gehalt bei der Watergate-Sequenz wich mit 1,002mgg-1 um 3% relativ sowohl vom Referenzwert als auch vom Ergebnis der Presaturation ab. Zurückzuführen war dies auf den Phasenfehler φ beim Triplett-Signal des Ethanols. Bei bekannter Größe des Phasenfehlers φ kann die Intensität des Triplett-Signals folgendermaßen korrigiert werden:
Dieser wurde bereits im Kapitel 7.2.4.2 zu 19,7° bestimmt. Somit ergibt sich nach Gleichung (7.4) ein korrigierter Ethanol-Gehalt von 1,032mgg-1, der vom gravimetrischen Referenzwert als auch von den Ergebnissen der SP-90°-Technik und der Presaturation um weniger als
0,5 % abweicht.
Insgesamt konnte mit allen drei Unterdrückungsmethoden Abweichungen der Analysenergebnisse zum gravimetrischen Referenzwert von unter 0,5 % erreicht werden. Jedoch nur beim Presaturation ist keine Korrektur des Ergebnisses nötig.
Aus der Validierung und dem Vergleichen der drei Unterdrückungsmethoden wurden folgenden Schlussfolgerungen gezogen:
Bei der Optimierung des Vorsättigungsimpulses der Presaturation-Methode wurden als optimale Parameterwerte eine Sättigungslänge von 1,5s bei einer Impulsleistung bestimmt, die einer Anregungsbreite von 20 Hz bis 30 Hz entspricht. Die mit diesen Parametern angewandte Presaturation-Technik bewirkte zwar die geringste Wasserunterdrückung der drei untersuchten Methoden, zeigte aber eine ausreichende Selektivität der Wasserunterdrückung – Signale des Ethanols und der beiden Standards wurden nicht beeinflusst – und lieferte Messergebnisse mit Abweichungen zum gravimetrischen Referenzwert von weniger als 0,5 %. Der von Mao et al. [73] diskutierte Vorteil der besseren Wasserunterdrückung bei Anwendung der pg-Presaturation (p1(x) p2(y)) gegenüber der herkömmlichen cw-Sättigung (p1(x) p2(x)) konnte nicht bestätigt werden. Viel mehr wurde durch den um 90° hinsichtlich des Anregungsimpulses versetzten Sättigungsimpulses ein immenser, die Auswertung erschwerender Phasenfehler des Restwassersignals aufgebaut. Die Anwendung der cw-Presaturation-Technik ist daher vorzuziehen.
Die LC1WET-Technik überzeugte beim Vergleich mit einer hervorragende Spektrenform (schmales Restwassersignal und gerade Grundlinie) und einer hohen Selektivität der Wasserunterdrückung. Andererseits wurde gezeigt, dass für quantitative Anwendungen eine Kalibrierung der Intensitätswiedergabe in Abhängigkeit vom Offset zur Einstrahlfrequenz nötig ist, um richtige Analysenergebnisse zu erhalten.
Die beste Wasserunterdrückung wurde mit der Watergate-Sequenz erzielt. Die dabei erreichte Spektrenform ist für die quantitative Auswertung ausreichend. Hingegen wurde bei der Watergate-Technik die geringste Selektivität der Wasserunterdrückung der drei untersuchten Methoden (größter Unterdrückungsbereich) ermittelt. So wurden bis zu einem Abstand von 800 Hz bezüglich der Einstrahlfrequenz signifikante Intensitätsverfälschungen durch partielle Unterdrückung bestimmt. Die durch Phasenfehler im Spektrum verfälschten Intensitäten von Multiplett-Signalen konnten aus den Werten der Sequenzlänge (zwischen 90°-Anregungsimpuls und Beginn der Aufnahme) und der Kopplungskonstante korrigiert werden.
Insgesamt sind alle drei Methoden für die Ethanol-Gehaltsbestimmung wässriger Lösungen (ca. 0,1 % Ethanol in H2O) anwendbar. Ferner lieferten alle drei Methoden richtige oder berechenbare Ergebnisse. Für die Auswahl der einzusetzenden Unterdrückungstechniken bei den Ringversuchen war die allgemeine (keine Gradiententechnik) und einfache Anwendbarkeit der Presaturation-Technik ausschlaggebend.
Erstmalig wurde ein Analysenverfahren erarbeitet, mit dem wässrige Ethanol-Lösungen an jedem NMR-Spektrometer bei Anwendung der Presaturation zur Wassersättigung analysiert werden können. Diese Arbeitsanweisung baute auf den Erkenntnissen der in den vorangegangenen Kapiteln 7.2.4 und 7.2.5 beschriebenen Validierung der Presaturation-Methode auf. Es erfolgte eine schrittweise Verbesserung dieser Arbeitsanweisung anhand der Erfahrungen, die bei der Auswertung der beiden Ringversuchen CCQM-P35 und NMR-3 (werden im Kapitel 7.3 beschrieben) gewonnenen wurden.
Generell ist die Probenpräparation ein wichtiger Arbeitsschritt der Analyse. Der hohe Dampfdruck des Ethanols macht hier eine besonders sorgfältige Arbeitsweise notwendig, wie eigene Experimente bestätigten. Als Probengefäß ist ein dicht schließendes Schraubglas mit Teflondichtung zu verwenden. Die Einwaage der Probenlösung und des internen Standards ist so zu berechnen, dass die Intensitäten der auszuwertenden Signale im Verhältnis von ungefähr 1:1 stehen und das Probengefäß fast vollständig befüllt wird (zur Minimierung des Verdampfens vom Ethanol aus der Lösung). Eine schnelle Prozedur des Einwägvorganges verhindert einen signifikanten Verlust an Ethanol. Das Probengefäß ist mit Parafilm zusätzlich abzudichten. Für eine ausreichende Homogenisierung der Lösung ist zu sorgen.
Die Aufnahme des Spektrums erfolgt mit Presaturation-Technik zur Sättigung des Wassersignals. Dabei ist die Länge des Vorsättigungsimpuls auf 1,5 s einzustellen bei einer Sättigungsleistung, die einer Anregungsbreite von 20 Hz bis 30 Hz entspricht. Die weiteren Parameter zur Aufnahme und Prozessierung sind wie die in der Tabelle 5.1 aufgeführten Werte zu setzen (Ausnahme: Spektrenweite=16ppm; Filterweite>20ppm). Ferner sind der Receiver Gain zur optimalen Ausnutzung des dynamischen Bereiches anzupassen, das Relaxationsintervall (D1) auf 60s einzustellen und 32 Scans für ein ausreichendes S/N zu akkumulieren.
Die Auswertung des Spektrums erfolgt analog zu der im Kapitel 5.1.2 beschriebenen Arbeitsanweisung. Wegen der breiten Flanken des Wassersignals sind die Phasen- sowie Grundlinienkorrekturen sehr sorgfältig zu handhaben. Ausgewertet wird beim Ethanol das
Das Unsicherheitsbudget der Ethanol-Gehaltsanalyse setzt sich aus den Unsicherheiten der Integration (Intensitätsverhältnis zwischen Analyt und Standard), der Einwaagen und Molmassen des Standards und der Probenlösung sowie des Reinheitsfaktors des internen Standards zusammen. Die Berechnung der erweiterten Unsicherheit des Analysenergebnisses erfolgt analog dem im Kapitel 7.1.3 beschriebenen allgemeinen Verfahren.
Nicht nur in Deutschland, sondern weltweit werden forensische Ethanol-Referenzlösungen für die Alkoholbestimmung im Straßenverkehr eingesetzt. Es ist daher wichtig, dass über die Landesgrenzen hinweg reproduzier- und vergleichbare Ergebnisse hoher Präzision und Richtigkeit erhalten werden [102]. 1997 wurde dazu vom CITAC (Co-operation on International Tracebility in Analytical Chemistry [103]) ein internationaler Ringversuch durchgeführt. Obendrein ist Ethanol ein weltweit gehandelter Gebrauchsartikel. So sind z.B. für die international variierenden Verbrauchssteuern von Spirituosen weltweit reproduzier- und vergleichbare Ergebnisse der Ethanol-Gehaltsbestimmung verschiedener Verfahren unentbehrlich [102]. Hinsichtlich dieser beiden Anwendungen wurde die BAM und das LGC vom CCQM mit der gemeinsamen Organisation eines internationalen Ringversuchs (CCQM-P35) beauftragt. Hierbei sollte der Ethanol-Gehalt einer forensischen und einer kommerziellen Probe (Wein mit einem relativen Ethanolgehalt von ca. 10 %), beide vom LGC zur Verfügung gestellt, bestimmt werden. Die Betreuung des Ringversuch – für alle Methoden offen – erfolgte für die NMR-Methoden durch das Labor I.31 der BAM und für alle anderen Methoden durch das LGC. Insgesamt nahmen zehn Nationale Metrologieinstitute (1: LNE (Frankreich) , 2: BAM (Deutschland), 3: VNIIM (Russland), 4: NRC (Kanada), 5: LGC (Großbritannien), 8: NMIJ (Japan), 9: KRISS (Korea), 10: NRCCRM (China), 11: NIST (USA), 12: DSM (Niederlande)) am Ringversuch teil. Es wird in dieser Arbeit jedoch nur auf die NMR-Analysenergebnisse eingegangen.
Jeder Ringversuchsteilnehmer erhielt zwei Vials pro Probe (forensisch, Wein). Nach der Versuchvorschrift waren von jedem Vial zwei Aliquots einzuwiegen, von denen wiederum je
Die Phasen- und Grundlinienkorrekturen waren sorgfältig auszuführen und das CH3-Signal des Ethanols bei 1,18ppm gegen das des internen Standards TSP bei 0ppm auszuwerten. Zusätzlich mussten bei der Weinprobe die Intensitäten der im Integrationsbereich des Ethanols liegenden Fremdsignale bestimmt und von der Gesamtintensität des Ethanolsignals subtrahiert werden.
Die eigene Auswertung der beiden Analysenproben erfolgte entsprechend der Ringversuchsmessvorschrift. Die Einwaagen wurde in einem 5 ml Stehkolben durchgeführt, der nur zur Hälfte gefüllt wurde. Gelegentliches Schwenken des Stehkolbens über einen Zeitraum von 90 min führte zur Homogenisierung der Lösungen.
Die eigenen Analysenergebnisse der acht Messungen sind in der Tabelle 7.8 aufgeführt. Der Schätzwert dieser acht Messungen gab den Ethanol-Gehalt der forensischen Probe mit 1,053mgg-1 und einer Standardunsicherheit von 0,004mgg-1 wieder.
In Tabelle 7.9 sind die nach dem im Kapitel 7.1.3 beschriebenen Verfahren der Unsicherheitsberechnung ermittelten Unsicherheitsbeiträge und die daraus berechnete kombinierte Standardunsicherheit aufgeführt. Letztere wurde für das hier angewendete Analysenverfahren zu uc(y) = ±0,005mgg-1 bestimmt. Die erweiterte Unsicherheit berechnete sich bei einem Konfidenzniveau von p=95% und einem Erweiterungsfaktor k=2 (feff
= 17) zu
U= ± 0,010mgg-1.
In der Abbildung 7.12 sind die eingesandten Ergebnisse der Ringversuchsteilnehmer für die forensische Probe dargestellt. Die tabellarische Auflistung der Analysenergebnisse aller Teilnehmer erfolgt im Anhang, Tabelle 11.6. Zur deutlichen Unterscheidung wurden die Analysenergebnisse der NMR-Methoden schwarz und die der anderen Methoden rot markiert. Der gravimetrische Referenzwert des Ethanol-Gehalts wurde vom LGC zu 1,072 mg g-1 mit einer erweiterten Unsicherheit (p = 95 %) von U = ± 0,006mgg-1 angegeben.
Von den insgesamt acht eingesandten NMR-Ergebnissen zeigten drei signifikant positive Abweichungen (Institute 5, 10 und 12), die von der Versuchsvorschrift abweichend das Original-Bruker-Pulsprogramms einsetzten. Die Einstrahlung des Vorsättigungsimpulses über eine Dauer von 60s, wie im Bruker-Pulsprogramm bei D1=60s festgelegt, induziert einen positiven NOE-Effekt auf das auszuwertende CH3-Ethanolsignal (Kapitel 7.2.4.1.1) und führt somit zu einem zu großen Ethanol-Gehalt als Messergebnis. Das eigene Analysenergebnis (Institut 2) gab den Ethanol-Gehalt der Probe um 1,6 % relativ zu gering wieder, verursacht durch die Verdampfung des Ethanol während der Probenpräparation. Aufbauend auf den Erfahrungen der Fachgruppe I.2 beim Umgang mit wässrigen Ethanollösungen wurde eine Prozedur der Probenpräparation (schnelle Einwägprozedur, vollständig gefüllte und gut abgedichtete Probengefäße) erarbeitet (Arbeitsanweisung im Kapitel 7.2.6.1). Erneute Analysen nach dieser Arbeitsanweisung der Probenpräparation ergaben mit der TSP-Standardlösung (118,9 mg TSP-Standardlösung und 992,3 mg der forensischen Probe) ein Gehalt von 1,069 mg g-1 und mit Maleinsäure (Kapitel 6.1.1) als internem Standard (99,9 mg Maleinsäure und 25123,4 mg der forensischen Probe) ein Gehalt von 1,073 mg g-1. Beide Analysenwerte weichen vom gravimetrischen Referenzwert um weniger als 0,5 % ab. Die Richtigkeit der Analysenergebnisse der vier Institute 3, 4, 8 und 9 bezüglich des Referenzwerts lagen in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen der GC- und Titrationsmethoden.
Die eigene Auswertung der kommerziellen Probe (Weißwein) erfolgte in zwei Schritten. Zuerst wurde die Intensität des Ethanolsignals inklusive der Fremdsignale bestimmt. Anschließend erfolgte eine Grundlinienkorrektur zur Auswertung der signifikanten Fremdsignale. Die Differenz aus diesen beiden Intensitäten gab die Intensität des Ethanols wieder. Das so ausgewertete 1H-NMR-Spektrum ist in der Abbildung 7.13 dargestellt.
Aus den acht Analysenergebnissen der eigenen Auswertung (Tabelle 7.10) wurde der Ethanol-Gehalt zu 96,2mgg-1 mit einer Standardunsicherheit von ± 0,4mgg-1 bestimmt.
Die kombinierten Standardunsicherheit berechnete sich nach dem im Kapitel 7.1.3 dargestellten Verfahren. Die einzelnen Unsicherheitsbeiträge und die daraus ermittelte kombinierte Standardunsicherheit von uc(y) = 0,5mgg-1 sind in der Tabelle 7.11 aufgeführt.
Mit einem Erweiterungsfaktor k=2, der bei einem effektiven Freiheitsgrad von feff=17 ein 95%igen Konfidenzintervall schätzt, wurde die erweiterte Unsicherheit zu U = 1,0mgg-1 berechnet.
Parallel zur Darstellung der forensischen Ringversuchsergebnisse (Abbildung 7.12) sind die Teilnehmerergebnisse der Weinanalyse (aufgeführt im Anhang, Tabelle 11.6) zur besseren Unterscheidung in der Abbildung 7.14 schwarz für die NMR-Methoden und rot für die der anderen Methoden (Non-NMR) dargestellt.
Der in der Abbildung 7.14 dargestellte Referenzwert von (101,6 ± 2,2) mg g-1 gibt den Schätzwert der GC-Ergebnisse wieder. Dessen erweiterte Unsicherheit (k=2,16, p=95%)
Zusammenfassend erwies sich das aus der Validierung der Presaturation erarbeitete Analysenverfahren mit der quantitativen NMR bei Vorsättigung des Wassersignals im Vergleich mit dem GC-Verfahren bei beiden Proben in der Richtigkeit als gleichwertig. Während bei der Weinprobe beide Verfahren adäquate Präzisionen erreichten, war dagegen das GC-Verfahren bei der forensischen Probe eindeutig präziser. Für die NMR-Methode spricht jedoch die Schnelligkeit und Einfachheit des eingesetzten Verfahrens gegenüber dem GC-Verfahren, da bei letzterem ein hoher Zeit- und Materialaufwand für die erforderlichen Kalibrierungen eingesetzt werden muss [104]. Abweichungen von der Arbeitsanweisung führten zu ungenauen Ergebnissen. Eine Verbesserung der Arbeitsanweisung hinsichtlich der Probenpräparation erwies sich als nötig.
Mittels eines nationalen Ringversuches (NMR-3) sollte bei Beteiligung von NMR-Laboren aus Industrie, Hochschulen und Forschungsinstitutionen das hier erarbeitete Analysenverfahren zur Bestimmung des Ethanol-Gehalts forensischer Proben zusätzlich bestätigt werden. Abweichend zur Durchführung des internationalen Ringversuches CCQM-P35a wurde zum Vergleich anstelle der TSP-Standardlösung die im Kapitel 6.1.1 referenzierte Maleinsäure als interner Standard verwendet. Ergänzend wurde zur Länge des Vorsättigungsimpulses (1,5 s) die Sättigungsleistung mit 66 dB vorgeschrieben. Dass die Vorgabe des Dämpfungsgrades in dB für die Leistung des Vorsättigungsimpulses keine allgemeingültige Größe ist, sondern von der Gerätekonstellation abhängt, war zum damaligen Zeitpunkt der vorliegenden Arbeit nicht bekannt. Die nicht eindeutige Vorgabe der Sättigungsleistung sowie die Verwendung der Maleinsäure als internem Standard führten zu einem komplexen Ergebnisbild des Ringversuches, bei dem Abweichungen der Teilnehmerergebnisse zum Referenzwert von bis zu 20% auftraten. Die Anwendung eines von der Vorschrift abweichenden geringeren Dämpfungsgrads des Vorsättigungsimpulses bei den teilnehmenden Laboratorien musste daher nicht prinzipiell zur partiellen Sättigung des Maleinsäuresignals
Die Validierungen der Wasserunterdrückungsmethoden sowie die hier dargestellten Probleme beim NMR-3-Ringversuch wurden auf einem vom Labor I.31 der BAM organisiertem Workshop den Teilnehmern vorgetragen und anschließend gemeinsam diskutiert [105]].
Die Messunsicherheit des Analysenverfahrens zur Ethanol-Gehaltsbestimmung wässriger Lösungen mit der 1H-NMR bei Anwendung der Presaturation-Technik soll anhand der eigenen Messungen bei den beiden Ringversuche (CCQM-P35, NMR-3) und der gemittelten NMR-Teilnehmerergebnisse des Ringversuchs CCQM-P35 bestimmt werden. Dabei wurden die eigenen Analysenwerte beim Ringversuch CCQM-P35 bei Beibehaltung der Unsicherheit wegen der fehlerhaften Probenpräparation durch die bei sorgfältiger Probenpräparation nachträglich aus je zwei Vergleichsmessungen ermittelten Gehalte ersetzt. Zusätzlich wurden bei der Mittlung der NMR-Analysenergebnisse des Ringversuchs CCQM-P35 die Werte der Institute 5, 10 und 12 wegen Anwendung eines nicht geeigneten Pulsprogramms (Abweichung von der Messvorschrift) ausgeschlossen. Die so aus den kombinierten Standardunsicherheiten, den Abweichungen zu den gravimetrischen Referenzwerten und deren Unsicherheiten nach Gleichung 4.15 berechneten relativen Messunsicherheiten (k = 2; p = 95 %) sind in der Tabellen 7.12 dargestellt.
Die Fehleranalyse der eigenen Analysenwerte als auch die der gemittelten CCQM-P35 NMR-Ergebnisse zeigten keine signifikanten Abweichungen bei der Gehaltsbestimmung wässriger Ethanollösungen bei einem Ethanolgehalt von um die 1 mg g-1 auf. Die relative Messunsicherheit des Verfahrens (k=2; p=95%) wurde jeweils zu 1,5 % bestimmt. Anders sieht es bei der Ethanol-Gehaltsbestimmung der Weinprobe (Ethanolgehalt von ungefähr 100 mg g-1) aus. Die Fehleranalyse der gemittelten CCQM-P35 NMR-Teilnehmerergebnisse lieferte nur eine geringfügige Abweichung zum gravimetrischen Referenzwert und die relative Messunsicherheit des Verfahrens wurde zu unter 3 % bestimmt. Dagegen wurde eine akzeptable Abweichung des eigenen, mit der verbesserten Arbeitsanweisung nachgemessenen Analysenwerts ermittelt, der zu einer höheren Messunsicherheit von 5 % führte.
Für die Gehaltsanalyse mit der 1H-SP-NMR wurde eine Arbeitsanweisung ausgearbeitet und an einer Modell-Lösung die Messunsicherheit dieses Verfahrens bestimmt. Ferner wurde erstmalig ein quantitatives Verfahren mit Wasserunterdrückung für die Gehaltsbestimmung wässriger Ethanol-Lösungen erarbeitet. Mittels eines internationalen Ringversuchs (CCQM-P35) wurde die Messunsicherheit des Verfahrens bestimmt und mit hierfür anerkannten Analysenverfahren verglichen. Folgende Erkenntnisse wurden dabei erlangt:
Für die Gehaltsbestimmung mit der 1H-SP-NMR konnte die bei der quantitativen Analyse von Stoffmengenverhältnissen bewährte Arbeitsanweisung übernommen werden. Diese wurde lediglich um die Probenpräparation (Einwaage von zu analysierende Matrix und Standard) erweitert.
Für die Gehaltsanalyse wässriger Ethanollösungen (0,1 % Ethanol in Wasser) wurden erstmals drei Wasserunterdrückungstechniken (Presaturation, Watergate; LC1WET) bezüglich dem Grad der Wasserunterdrückung, der Güte der Spektrenform, des Unterdrückungsprofils und der Richtigkeit der Intensitätswiedergabe im Spektrum validiert. Alle drei Techniken könne für diese quantitative Aufgabenstellung eingesetzt werden, jedoch eignet sich für den allgemeinen Einsatz die Presaturation-NMR am besten, da sie weder Gradiententechnik noch Kalibrierungen benötigt.
Die Validierung des Vorsättigungsimpulses der Presaturation-Technik erbrachte als optimale Parameter eine maximale Sättigungsdauer von 1,5 s bei einer Sättigungsleistung, die einer Anregungsbreite des entsprechenden 90°-Impulses von 20 Hz bis 30 Hz entspricht. Längere und stärkere Sättigungsimpulse führen zur besseren Unterdrückung des Wassersignals, verfälschen aber die Intensitäten der auszuwertenden Signale durch partielle Mitsättigung bzw. induzierte NOE-Effekte. Die Angabe der Leistung des Sättigungsimpulses als Dämpfungsgrad in dB ist zu vermeiden, da diese von der Gerätekonstellation und der Skalierung des entsprechenden Geräteherstellers abhängig ist.
Die relative Messunsicherheit (k=2; p=95%) des Verfahrens der Gehaltsbestimmung bei Anwendung von Wasserunterdrückung mit 1H-Presaturation wurde mittels der Teilnehmerergebnisse des Ringversuchs CCQM-P35 und eigener Messungen für wässrige Ethanollösungen mit einem relativen Gehalt von ungefähr 0,1% (unabhängig vom eingesetzten internen Standard) zu 1,5% bestimmt (S/N > 150, Integrationsfaktor: 64) und für wässrige Ethanollösungen mit einem relativen Gehalt von ungefähr 10 % (Weinprobe) zu unter 3%.
Der enorme Einfluss des Operators auf die Messunsicherheit zeigte sich bei der Probenpräparation. Nur eine sorgfältige Probenpräparation führte zu richtigen Analysenwerten.
Der Vergleich der NMR-Analysenergebnisse beim internationalen Ringversuch CCQM-P35 mit den Verfahren der GC- und Titration (direkte primäre Methode) zeigte, dass bei beiden Proben das NMR-Verfahren in der Richtigkeit mit den anderen beiden Verfahren gleichwertig ist, bei der Weinprobe auch in der Präzision mit dem GC-Verfahren.
Entsprechend der Messgleichung gehen in das Unsicherheitsbudget die Unsicherheitsbeiträge der Integration, der beiden Einwaagen der Matrix und des Standards, die Molmassen des Analyten und des Standards und der Reinheitsfaktor des Standards ein.
Die Motivation dieser Arbeit war, für den Bereich der organischen Analyse den Einsatz der hochauflösenden Flüssigkeits-NMR in Referenzverfahren für verschiedene Aufgabenbereiche zu untersuchen.
Für den Begriff „Referenzverfahren“ ist in der Literatur keine einheitliche Definition zu finden. Von der Arbeitsgruppe „Referenzverfahren“ in der BAM wurde er wie folgt definiert [106, S. 8]:
Referenzverfahren: Eingehend charakterisiertes und nachweislich beherrschtes Prüf-, Mess- oder Analysenverfahren zur
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(a)
Qualitätsbewertung anderer Verfahren für vergleichbare Aufgaben oder
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(b)
Charakterisierung von Referenzmaterialien einschließlich Referenzobjekte oder
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(c)
Bestimmung von Referenzwerten.
Die Ergebnisunsicherheit eines Referenzverfahrens muss angemessen abgeschätzt und dem Verwendungszweck entsprechend beschaffen sein.
Referenzverfahren werden benötigt, um andere Verfahren zu validieren und Referenzmaterialien zu charakterisieren. Des Weiteren werden sie z.B. bei Gutachten als Grundlage von Prüfungen, Messungen und Analysen eingesetzt. Ein Referenzverfahren qualifiziert sich dadurch, dass es für einen festgelegten Zweck eine ausreichende Ergebnisunsicherheit – ist gleich der Messunsicherheit – aufweist, die nach GUM [11] als Richtigkeit und Präzision angegeben wird. Diese sollten auf das Internationale Einheitensystem (SI) zurückgeführt werden können. Zudem muss das Referenzverfahren von der Zielgruppe akzeptiert werden (siehe auch primäre Methoden, Kapitel 3.1).
Die BAM veröffentlichte 2001 einen Katalog über dort vorhandenen Referenzverfahren [106]. In diesem sind 61 Referenzverfahren für die Prüftechnik und chemische Analytik enthalten. Für organische Analysen werden darin sieben Referenzverfahren aufgezählt, darunter die quantitative 1H-SP-NMR-Spektroskopie zur relativen Konzentrationsbestimmung von strukturbekannten Gemischen in Lösung.
In der vorliegenden Arbeit wurden vier Anwendungsbereiche der quantitativen NMR-Spektroskopie (Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen, Reinheits- und Gehaltsbestimmung) bearbeitet, bei denen insgesamt drei verschiedene NMR-Techniken (1H-SP-NMR, 1H-Wasserunterdrückung (Presaturation), Inverse Gated 1H-BB-entkoppelte 13C-NMR) eingesetzt wurden. Es wurden dazu systematisch alle physikalischen Parameter sowie entsprechend der aufgestellten Messgleichungen alle Eingangsgrößen auf ihren Einfluss auf die Messunsicherheit untersucht und optimiert. Von der Gerätekonstellation unabhängige Arbeitsanweisungen wurden aufgestellt und schrittweise verbessert. Die
der Nachweis für vollständige Beschreibung erbracht,
die Messgleichung in Termen von SI-Einheiten aufgestellt,
das Unsicherheitsbudget in Termen von SI-Einheiten aufgestellt und
die metrologische Qualität mit einer relativen Messunsicherheit (k=2; p=95%) von 1,5% (S/N > 150, Integrationsfaktor: 64) bzw. 1,0 % (S/N > 7000, Integrationsfaktor: 200) für die 1H-NMR und von 2 % für die 13C-NMR beschrieben werden.
Die Rückführung absoluter Analysenergebnisse erfolgte mittels eines ZRMs. Damit wurde allen bis auf einer in der Definition für das CCQM aufgeführten Anforderungen einer primären relativen Methode entsprochen [12]. Die „[...] highest metrological qualities [...]“ ([12], S. 293) konnte der quantitativen NMR-Spektroskopie beim Vergleich mit anderen Methoden (GC, Titration, DSC) mittels internationaler Ringversuche des CCQMs (CCQM-P20a, CCQM-P35) nicht zugeordnet werden. Zwar konnte die NMR in der Richtigkeit mit den anderen Analyseverfahren mithalten, wies aber generell eine geringere Präzision auf. Eine Möglichkeit, die quantitative NMR-Spektroskopie mit der in dieser Arbeit bestimmten Messunsicherheit als relative primäre Methode zu etablieren, besteht in der Analyse von Stoffsystemen, deren Zusammensetzung nur mit den hervorragenden qualitativen Eigenschaften der hochauflösenden NMR-Spektroskopie (Selektivität, Spezifität) voneinander zu unterscheiden sind. Genau hierauf zielt das zukünftige Projekt zur Bestimmung der Reinheitsgrade von Referenzmaterialien im pharmazeutischen Bereich, für das in dieser Arbeit eine Vorstudie durchgeführt wurde (Kapitel 6.1.2)
Ein essentieller Vorteil der NMR-Spektroskopie besteht darin, dass zur Auswertung eines Analyten nur eine eindeutig ihm zugeordnete Resonanzlinie nötig ist. Somit lassen sich auch Stoffsysteme mit komplexeren als den hier betrachteten Spektren quantitativ analysieren, wenn
diese sich in einem geeigneten Lösungsmittel lösen bzw. verdünnen lassen,
es sich dabei um strukturbekannte Verbindungen handelt,
deren Resonanzlinien im Spektrum sich eindeutig zuordnen lassen,
die Substanzen über den Zeitraum der Analyse sich als stabil erweisen,
von jeder zu analysierenden Substanz sich mindestens eine Resonanzlinie optimal auswerten (integrieren) lässt und
für die Reinheits- oder Gehaltsbestimmung ein geeigneter interner Standard (ZRM bzw. auf ein ZRM zurückgeführter Standard) eingesetzt werden kann.
Entsprechend der Definition sind Referenzverfahren in ihrem Prüfbereich, ihrer Messunsicherheit und des Einsatzgebietes zu beschreiben. Die untersuchten NMR-Verfahren können in vier verschieden Referenzverfahren gegliedert werden, die nun diskutiert werden.
Speziell in der Stereo- und Synthesechemie ist es oftmals wichtig, das Verhältnis zweier Stereoisomere oder den Anteil verschiedener Komponenten in einem Gemisch zu kennen. Wegen der hervorragenden selektiven Eigenschaften der NMR-Spektroskopie eignet sich gerade die quantitative NMR dazu, hier als Referenzverfahren eingesetzt zu werden. Anhand der im Kapitel 5 beschriebenen Untersuchungen konnte mit der im Kapitel 5.1.2 erarbeiteten Arbeitsanweisung für die quantitative 1H-SP-NMR bei der Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen bzw. -anteilen der enthaltenden Komponenten einer Fünf-Komponentenlösung eine relative Messunsicherheit von 1,5% erreicht werden. Der Prüfbereich lag dabei zwischen 0,004molmol-1 und 0,999molmol-1. Lediglich bei NMR-Geräten, die mit Analogfiltern arbeiteten, ist abweichend von den Parametern in Tabelle 5.1 die Spektrenweite auf mindestens 15ppm und die Filterweite auf mindestens 30 ppm zu setzen. Entsprechend der Messgleichung wird die Unsicherheit des Analysenwertes nur durch die Standardunsicherheit der Integration dargestellt, da keine aufwendige Probenpräparation nötig ist. In das Unsicherheitsbudget der Messunsicherheit vom Verfahren werden zusätzlich die Abweichung und die Unsicherheit des Referenzwertes eingerechnet Diese Erkenntnisse sind auf beliebige Mehrkomponentengemische in flüssiger Phase übertragbar, sofern diese die oben genannten Bedingungen erfüllen. Als Einsatzgebiete bieten sich die Validierung anderer Messverfahren zur Bestimmung von Mehrkomponentengemischen und die Zertifizierung von Referenzmaterialien für die organische Analyse an.
Die Reinheitsbestimmung von Referenzmaterialien spielt u.a. im pharmazeutischen Bereich eine große Rolle (Kapitel 6.1.2). Zur Rückführung der Ergebnisse auf die SI-Einheiten wurde ein ZRM als interner Standard eingesetzt. Die mit der 1H-SP-NMR erfolgten Reinheitsbestimmungen wurden nach der im Kapitel 6.1.1.1 erarbeiteten Arbeitsanweisung durchgeführt. Die einzelnen Unsicherheitsbeiträge und deren Einfluss auf die Messunsicherheit des Verfahrens sind in der Tabelle 8.1 aufgelistet.
Aus dieser Tabelle ist deutlich zu entnehmen, dass die Unsicherheit des Analysenergebnisses (kombinierte Standardunsicherheit) im wesentlichen nur durch die Unsicherheitsbeiträge der Integration (Auswertung) und der beiden Einwaagen von Analyt und Standard geprägt wird. Bei einer der Einwaagemenge angepassten Waage mit geringer Einwaageunsicherheit kann der Einfluss der beiden Einwaagen-Unsicherheitsbeiträge im Unsicherheitsbudget verringert werden. Als hauptsächlich sich auswirkende Unsicherheitsgröße fällt dann nur noch die der Integration an. Bei der Berechnung der Messunsicherheit des Verfahrens zeigten die Unsicherheit des Referenzwertes und die Abweichung des Analysenwertes vom Referenzwert einen beachtlichen Einfluss. Ein genauerer Referenzwert würde hier zur Verbesserung der Messunsicherheit des Verfahrens beitragen. Dieser war im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht zu erhalten.
Die Gehaltsbestimmung ist im gesamten analytischen Bereich von großer Bedeutung. Vor allem zur Charakterisierung von Referenzmaterialien ist die Kenntnis über die genaue Zusammensetzung wichtig. Bei der Gehaltsanalyse von TSP in D2O mit ZRM Benzoesäure als internem Standard konnte bei einem Integrationsfaktor von 500 eine relative Messunsicherheit des Verfahrens (k=2; p=95%) von 1,0 % erreicht werden. Aus der Auftragung der einzelnen Unsicherheitsbeiträge ins Unsicherheitsbudget der Gehaltsbestimmung in der Tabelle 8.2 ist ersichtlich, dass die Unsicherheitsbeiträge der Molmassen (Analyt, Standard) und des Reinheitsfaktors vom Standards im Vergleich zu denen der anderen Einflussgrößen vernachlässigbar gering sind. Bezugnehmend auf die Erkenntnisse aus den Kapiteln 5 (Stoffmengenverhältnisse) und 6.1.2 (Reinheitsbestimmung von Loganin) ist bei Auswertung mit einem Integrationsfaktor von 64 mit einer relativen Messunsicherheit von 1,5 % zu rechnen. Der Gehalt des untersuchten Systems lag bei ungefähr 9mg g-1 und soll als untere Grenze des Prüfbereiches festgelegt werden. Höhere Gehalte sollten aufgrund der Vereinfachung des Analysensystems sich nicht negativ auf die Messunsicherheit auswirken. Die Obergrenze des Prüfbereiches wird durch die Messunsicherheit des Verfahrens festgelegt [52]. Somit wurde der Prüfbereich zu 9mgg-1 bis 990mgg-1 definiert.
Grundsätzlich kann hier die quantitative 1H-SP-NMR-Spektroskopie zur Validierung anderer Verfahren und zur Referenzierung von ZRM eingesetzt werden.
Speziell im Bereich der Umweltanalytik und der Medizin liegen oftmals wässrige Proben vor, in denen ein Analyt mit geringem Gehalt zu analysieren ist. Es zeigte sich, dass aufgrund des intensiven und breiten Wassersignals im NMR-Spektrum eine quantitative Auswertung mit der einfachen 1H-SP-NMR-Technik nicht mit einer geringen Messunsicherheit machbar ist. Generell stehen hierfür eine Vielzahl an Wasserunterdrückungstechniken zur Verfügung, deren quantitativer Einsatz jedoch kaum in der Literatur beschrieben wird, schon gar nicht mit der hier geforderten metrologischen Qualität. Am Beispiel der Gehaltsbestimmung wässriger Ethanollösungen für die forensische Chemie (relativer Gehalt von ca. 0,1 %) wurde eine Arbeitsvorschrift für die NMR-Presaturation-Technik (selektive Vorsättigung des Wassersignals) entwickelt. Die Darstellung des Einflusses der einzelnen Unsicherheitsbeiträge in die Messunsicherheit des Verfahren in Tabelle 8.3 zeigt, dass auch hier überwiegend die Beiträge der Integration, des Referenzwertes und der Abweichung des Analysenwertes die Gesamtunsicherheit prägen. Die Unsicherheiten der beiden Einwaagen und des Standards zeigen nur einen mittleren und die der Molmassen einen zu vernachlässigen Einfluss.
Der Prüfbereich ist aufgrund der untersuchten Ethanolgehalte auf Gehalte im Bereich von 1,0 mg g-1 bis 150 mg g-1 festzulegen, und die relative Messunsicherheit dementsprechend auf 1,5 % bis 2,6 %. Die hierbei erhaltenden Erkenntnisse sind grundsätzlich auch auf andere wässrige Systeme übertragbar. Dabei ist zu beachten, dass die auszuwertenden Signale nicht zu nahe am Wassersignal liegen und somit partiell mitgesättigt werden.
An der BAM existiert bereits ein Referenzverfahren zur Präzisionsbestimmung des Ethanolgehaltes in Wasser. Eine Eingliederung in dieses Referenzverfahren wäre vorstellbar. Als Verwendungszweck sind auch hier Validierung von anderen Methoden sowie Teilnahme an Zertifizierungen von Referenzmaterialien realisierbar.
Zusammenfassend wurden bei allen vier hier diskutierten Referenzverfahren die Prüfbereiche, deren Ergebnisgenauigkeit sowie die Einsatzgebiete dargestellt. Somit steht einer Aufnahme dieser vier Referenzverfahren in den BAM-Katalog sowie in den CMC-Katalog des BIPM nichts entgegen.
Die Motivation der vorliegenden Arbeit bestand darin zu zeigen, dass die hochauflösende quantitative Flüssigkeits-NMR-Spektroskopie eine relative primäre Methode ist und als Referenzverfahren eingesetzt werden kann.
Es wurden für vier typische Anwendungen der quantitativen NMR (Bestimmung von Stoffmengenverhältnis und -anteil, Reinheits- und Gehaltsbestimmung) jeweils der Nachweis einer vollständigen Beschreibung der Methode bzw. des Verfahrens erbracht, die Messgleichung und das Unsicherheitsbudget in Termen von SI-Einheiten aufgestellt und die Messunsicherheit ermittelt. In letztere gingen generell die kombinierte Standardunsicherheit der Eingangsgrößen, die Unsicherheit des Referenzwertes und die Abweichung des Analysenwertes vom Referenzwert ein.
Aufbauend auf der Validierung der 1H-SP-NMR-Methode (Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen) in der Diplomarbeit [14] wurde eine Arbeitsanweisung für die Aufnahme und Auswertung quantitativer 1H-SP-NMR-Spektren erarbeitet und schrittweise verbessert. Die entscheidenden Elemente dieser Arbeitsanweisung sind die folgenden: Zeitsequenz mindestens 7/3 mal der längsten T1 -Zeit aller auszuwertenden Signale, Anregung mit einem 30°-Impuls, Aufnahme der Spektren mit 32k Datenpunkte (bei guter Auflösung gegebenenfalls auf 64k erhöhen) bei einer Sweepweite von 16ppm und einer Filterweite von mindestens 30ppm, ein für alle auszuwertenden Signale erreichtes S/N > 150, Prozessierung mit vorheriger em-Multiplikation (lb = 0,3Hz) und Zero Filling auf 64k Spektrenpunkte, sorgfältige manuelle Korrektur der Grundlinie und Phasen im Spektrum, Integrationsgrenzen in Abhängigkeit von der Halbwertsbreite mit einem Faktor von 64 setzen, Integralzug gegebenenfalls mit BIAS und SLOPE zu geraden An- und Ausläufen korrigieren.
Aus den Ergebnissen der Validierungen der einzelnen Methoden und Verfahren sowie der Auswertungen der Ringversuche wurden folgende Erkenntnisse gewonnen:
Die eindeutige qualitative Zuordnung der Signale, die Überprüfung der Stabilität und die Auswahl der auszuwertenden Signale (keine Deuterierungseffekte, keine Fremdsignale im Integrationsbereich, Integration mit einem Integrationsfaktor von mindestens 64 möglich) sind die Grundlage für eine quantitative Auswertung.
Eine oberflächliche Korrektur der Grundlinie und der Phasen im Spektrum sowie die Nichteinhaltung eines konstanten Integrationsfaktors führt zu erheblichen systematischen Fehlern.
Die automatischen Korrektur-Algorithmen der beiden Auswertungsprogramme XWinNMR und MestRe-C liefern unzureichend grundlinien- und phasenkorrigierte Spektren. Die Simulationen mit optimierten Lorentz-Gauß-Kurven (Software WinFit) geben die Signale im Spektrum nicht ausreichend genau wieder.
Aus den Punkten 1 bis 4 wird der enorme Einfluss des Operators auf die Messunsicherheit des Verfahren deutlich. Es ist daher eine sorgfältige Arbeitsweise des Operators für quantitative Auswertungen bei folgenden Elemente nötig: Probenpräparation, Korrektur der Spektren bezüglich Grundlinie und Phasen, Auswahl der auszuwertenden Signale, Setzung der Integrationsbereiche (vollständige Erfassung überlagerter Einzelsignale).
Bei NMR-Geräten mit Analogfilter-Technik werden Signale im Grenzbereich des Analog-Filters teilweise gesättigt. Die Filtergrenze sollte mindestens mit einem Abstand von 10 ppm zum nächsten Signal gesetzt werden. Bei NMR-Spektrometern mit Oversampling-Technik erübrigt sich dies, da deren Filterweite automatisch auf maximal mögliche Werte gesetzt werden.
Die Unabhängigkeit der Messunsicherheit der Methode von der eingesetzten Magnetfeldstärke sowie die Allgemeingültigkeit der Messvorschrift konnte gezeigt und mit eigenen Vergleichsmessungen an verschiedenen NMR-Spektrometern (1H: 300 MHz, 400 MHz, 500 MHz, 600 MHz, 800 MHz) belegt werden.
Der Einsatz von Messköpfen, die nicht speziell für die 1H-NMR vorgesehen sind, kann zu einer verfälschten Intensitätswiedergabe im Spektrum führen. Auf deren Einsatz für quantitative Messungen ist daher zu verzichten.
Beim Einsatz modernster NMR-Technik (18,8T Höchstfeldgerät (1H: 800 MHz), Kryo-Messkopf) für quantitative Analysen wurde eine erheblich bessere Empfindlichkeit erreicht, nicht jedoch eine bessere Auflösung. Es muss dabei mit starken Radiation Damping Effekten gerechnet werden.
Radiation Damping Effekte wurden schon ab einer Magnetfeldstärke von 9,4 T nachgewiesen und führt generell zur Verbreiterung intensiver Signale. Die Richtigkeit der Intensitätswiedergabe im Spektrum wird davon nicht beeinflusst.
Das Aufstellen der Unsicherheitsbudgets erfolgte nach dem vom ISO veröffentlichten Leitfaden zur Ermittlung von Messunsicherheiten. Die kombinierte Standardunsicherheit des Analysenergebnisses umfasst bei der Bestimmung von Relativgrößen (Stoffmengenverhältnis, -anteil) nur den Unsicherheitsbeitrag der Integration (Intensitätsverhältnis Analyt zu Standard). Bei der Analyse von Absolutgrößen (Reinheit, Gehalt) gehen zusätzlich die Unsicherheitsbeiträge der beiden Einwaagen und Molmassen von Analyt und Standard sowie die Reinheit (Reinheitsgrad, Reinheitsfaktor) des Standards mit ein. Der Unsicherheitsbeitrag der Molmassen kann generell vernachlässigt werden. Die Unsicherheitsbeiträge
Die Auswertung der Spektren bei einem Signal-zu-Rausch-Verhältnis (S/N) > 150 mit einem Integrationsfaktor von 64 führt generell zu einer relativen Messunsicherheit der Methode bzw. der Verfahren (k=2; p=95%) von 1,5 %. Die Auswertung mit einem größeren Integrationsfaktor von 200 bei einem S/N > 7000 führte zur Verbesserung der relativen Messunsicherheit auf 1,0 %.
Im Rahmen der Arbeit wurden die folgenden Einsatzbereiche der quantitativen NMR bearbeitet. Hierzu wurden für spezielle Aufgabenbereiche Multipuls-Techniken validiert:
Anhand einer Fünf-Komponentenlösung (Ethyl-4-toluolsulfonat, [2,2]-Paracyclophan, Durol, Cyclododekan und Oktamethylcyclotetrasiloxan) mit einem Stoffmengenanteil von 94 % bzw. 97 % der Hauptkomponente Durol wurde die Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen untersucht. Die relative Messunsicherheit beider Methoden wurde jeweils – bezogen auf die gravimetrischen Referenzwerte – zu 1,5 % bestimmt.
Die Messunsicherheit bei der Bestimmung von verschiedenen Stoffmengenverhältnissen überlagerter Signale wurde anhand von Zwei-Komponenten-Lösungen ermittelt. Stoffsysteme mit Überlagerung einiger Signale im Spektrum können über die Differenzbildung (Benzoesäure-Ethylbenzoat) mit einer relativen Messunsicherheit von unter 1,5 % analysiert werden. Stoffsysteme mit Überlagerung aller Signale im Spektrum (unterschiedliche intramolekulare Protonenverhältnisse) können dagegen über ein Gleichungssystem (Ethylbenzoat-Phthalsäurediethylester) mit einer relativen Messunsicherheit von unter 2 % ermittelt werden.
Zur Rückführung von Absolutgrößen (Reinheit, Gehalt) auf SI-Einheiten wurde ein ZRM (Benzoesäure) eingesetzt und weitere Standards (Maleinsäure, Durol, 3-Trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsäure-Natriumsalz (TSP)-Lösung) als NMR-Referenzmaterialen auf dieses ZRM zurückgeführt. Alle vier Standards zeigten sich als interne Standards geeignet.
Die Reinheitsanalyse mit der 1H-NMR wurde am System Maleinsäure mit ZRM Benzoesäure als internem Standard untersucht. Bei Anwendung eines Integrationsfaktors von 200 bei einem (S/N) > 12000 wurde eine relative Messunsicherheit von 1,0 % erreicht.
Für die Reinheitsbestimmung von Referenzmaterialien für den pharmazeutischen Bereich wurde eine Vorstudie durchgeführt. Das Zentralinstitut Arzneimittel
Für die Reinheitsbestimmung mit der 13C-NMR von einem Gemisch der drei Stellungsisomeren Xylole (o-, m- und p-Xylol) einschließlich Ethylbenzol als Konstitutionsisomer sowie von Tributylzinnchlorid wurde die Inverse Gated 1H-Breitband-entkoppelte 13C-NMR validiert. Für intensitätsrichtige Signalwiedergabe im Spektrum ist die Aufnahmezeit (entspricht der Entkopplungsdauer) auf maximal 3 s zu begrenzen. Die relative Messunsicherheit des Verfahrens wurde anhand der Xylol-Lösung mit Durol als internem Standard bezogen auf die gravimetrischen Referenzwerte zu unter 2 % bestimmt. Die Reinheitsanalyse war mit der 1H-SP-NMR aufgrund überlagerter Signale nicht möglich.
Mittels der TSP-Standardlösung und dem ZRM Benzoesäure als internem Standard wurde die Messunsicherheit der Gehaltsanalyse mit der 1H-SP-NMR bestimmt. Die Setzung der Integrationsbereiche entsprechend einem Integrationsfaktor von 500 bei S/N > 7000 führte zu einer relativen Messunsicherheit des Verfahrens von 1,0 %.
Für die Gehaltsbestimmung wässriger Ethanol-Lösungen mit einem relativen Gehalt von 0,1 % wurde erstmals die Güte der 1H-Wasserunterdrückung für quantitative NMR-Spektroskopie analysiert. Dazu wurden drei 1H-Wasserunterdrückungstechniken (Presaturation, Watergate, LC1WET) validiert und anhand von vier Kriterien (Grad der Wasserunterdrückung, Güte der Spektrenform, Profil der Unterdrückung, Richtigkeit) miteinander verglichen. Alle drei Unterdrückungstechniken können quantitativ eingesetzt werden, wobei bei Watergate und LC1WET eine Kalibrierung nötig ist. Von den drei Unterdrückungsmethoden kann nur Presaturation, da ohne Gradiententechnik, universell an jedem NMR-Spektrometer betrieben werden. Der Vorsättigungsimpuls ist dabei mit einer Impulslänge von maximal 1,5 s bei einer Impulsleistung, die einem Anregungsbereich von 20 Hz bis 30 Hz entspricht, einzustrahlen. Die Angabe der Impulsleistung als Grad der Dämpfung in dB ist zu vermeiden, da diese weder zwischen Geräten eines Herstellers (abhängig von der Gerätekonstellation) noch zwischen den Geräteherstellern (unterschiedliche dB-Skalierungen) übereinstimmt. Die relative Messunsicherheit des Verfahren bei Wasserunterdrückung mit der 1H-Presaturation-Technik wurde bezogen auf den gravimetrischen Referenzwert zu 1,5 % bestimmt
Der Einsatz einer Arbeitsanweisung zur Aufnahme und Auswertung von quantitativen 1H-SP-NMR-Messungen bei den Ringversuchen CCQM-P3 und NMR-2 führte im Vergleich zu den vorangegangenen Ringversuchen CCQM-4 und NMR-1 (Messung nach Laborroutine) zur deutlichen Verbesserung der Messunsicherheit bei der Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen. Anhand der noch auftretenden Abweichungen der Teilnehmerergebnisse konnten weitere Einflussgrößen ermittelt werden.
Mittels des internationalen Ringversuchs CCQM-P20a zur Reinheitsbestimmung von Tributylzinnchlorid konnte gezeigt werden, dass die quantitative 1H-entkoppelte 13C-NMR in der Richtigkeit mit den gängigen Analyseverfahren wie GC und DSC gleichwertig ist. Die Präzision war nur geringfügig niedriger.
Beim Ringversuch CCQM-P35, Gehaltsbestimmung wässriger Ethanollösungen (0,1 % Ethanol in Wasser, Weißwein mit 10 % Ethanol) konnte beim Vergleich mit anerkannten analytischen Verfahren (GC, Titration) gezeigt werden, dass die quantitative NMR bei Einhaltung der validierten Arbeitsanweisung in der Richtigkeit mit den anderen beiden Verfahren gleichwertig ist, bei höheren Ethanolgehalten auch in der Präzision.
Die gewonnenen Erfahrungen und Erkenntnisse, die auf der Bearbeitung aller aufgetretenen Probleme beruhen, wurden an die Teilnehmer der internationalen Ringversuche auf den CCQM-Sitzungen und an die Teilnehmern der nationalen Ringversuche auf vom Labor I.31 (BAM) organisierten Workshops weitergegeben. Damit wurde der Multiplikatorfunktion der BAM zur Weitergabe von Prinzip und Prozedur der metrologischen Rückführung an NMR-Mess- und Forschungsinstitutionen nachgekommen.
Die Bewertung dieser vier quantitativen NMR-Anwendungen führte zu dem Ergebnis, dass die quantitativen NMR-Spektroskopie in den hier erarbeiteten Verfahren im wesentlichen der Definition einer relativen primären Methode entspricht.
Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen in Mehrkomponentengemischen mittels 1H-NMR-Spektroskopie: Der Prüfbereich der zu analysierenden Stoffmengenverhältnisse wurde zu 0,004molmol-1 bis 0,999molmol-1 mit einer charakteristischen Ergebnisunsicherheit von 1,0% bis 1,5 % bestimmt.
Reinheitsbestimmung von organischen Verbindungen mittels 1H- oder 13C-NMR-Spektroskopie: Der Prüfbereich für die Reinheitsanalyse einer Substanz wurde für die 1H-NMR mit einer Obergrenze von 99g/g% bei einer charakteristischen Ergebnisunsicherheit von 1,0% bis 1,5 % relativ und für die 13C-NMR mit einer Obergrenze von 98g/g% bei einer Ergebnisunsicherheit von 2% relativ bestimmt.
Gehaltsbestimmung von organischen Verbindungen mittels 1H-NMR-Spektroskopie: Der Prüfbereich des zu analysierenden Mindestgehalts wurde zu 9mgg-1 bis
990 mg g-1 mit einer charakteristischen Ergebnisunsicherheit von 1,0% bis 1,5 % bestimmt.
Gehaltsbestimmung in wässriger Matrix mit der NMR-Spektroskopie unter Einsatz der Wasserunterdrückungstechnik (hier: Ethanol): Der Prüfbereich der zu analysierenden Ethanolgehalte wurde zu 0,1% bis 15% mit einer charakteristischen relativen Ergebnisunsicherheit von 1,0% bis 3% bestimmt.
Als Einsatzgebiete bieten sich für alle vier Referenzverfahren die Validierung anderer Verfahren sowie die Teilnahme an Zertifizierungen organischer Referenzmaterialien und Einträge in den CMC-Katalog des BIPM an.
BAM
Humboldt-Universität
Bruker BioSpin GmbH
Benzoesäure SRM 350a ( zertifizierte Reinheit von (99,9958 ± 0,0027) g/g %) NIST, 1,2,4,5-Tetramethylbenzol (>99%) Fa. Merck, Maleinsäure (>99%) Fa. Merck, 3-Trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsäure-Natriumsalz (>99%) Fa. Merck
Substanzen (Reinheitsgrad)
Cyclododecan (>99%) Fa. Merck, Ethanol (>99,8%) Fa. Merck, Ethylbenzol (>99%)
Fa. Merck, Ethyl-p-toluolsulfonat (>99%) Fa. Merck, Ethylbenzoat (>98%) Fa. Merck, Oktamethylcyclotetrasiloxan (>98%) Fa. Acros, [2,2]-Paracyclophan (>99%) Fa. Acros, Phthalsäurediethylester (>99%) Fa. Merck, Silbertrifluoracetat (>98%) Fa. Merck, Tris-[1,1,1,2,2,3,3-heptafluoro-7,7-dimethyl-4,6-oktandionat]-Europium (keine Angabe) Fa. Norell Chemical Co., m-Xylol (>99%) Fa. Merck, o-Xylol (>99%) Fa. Merck, p-Xylol (>99%) Fa. Merck
Deuterierte Lösungsmittel (Deuterierungsgrad)
Benzol-d6 (>99,5%) Fa. Merck, (>99,5%) Akademie der Wissenschaften, Chloroform-d1
(>99,6%) Fa. Acros, (>99,8%) Fa. Merck, Deuteriumoxid-d2 (>99,5%) VEB Berlin Chemie, Dimethylsulfoxid-d6 (>99,6%) Fa. Chemotrade, Methanol-d4 (>99,96%) Fa. Euriso-top, Tetrachlorkohlenstoff (entfällt) VEB Berlin Chemie
Original Bruker-Pulsprogramm “zgpr”:
Modifizierte cw-Presaturation „zgpr.fm“:
Modifizierte pg-Presaturation „zgpr.jp“:
Symbole
Abkürzungen
Die vorliegende Arbeit wurde an der Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung im Labor I.31 „Magnetische Resonanzspektroskopie angefertigt. Für die Möglichkeit der Durchführung und die Bereitstellung der Arbeitsmittel möchte ich mich herzlich bedanken.
Herrn Prof. Dr. A. Zschunke gilt mein besonderer Dank für die interessante Themenstellung sowie für die wissenschaftliche Betreuung und Begutachtung dieser Arbeit.
Herrn Prof. Dr. P. Reich und Herrn Prof. Dr. M. Linscheid danke ich für die Übernahme der Koreferate.
Bei Herrn Dr. H. Jancke möchte ich mich besonders für die intensive Betreuung im Labor und für die Unterstützung bei der Durchführung und Anfertigung dieser Arbeit bedanken. Ferner danke ich allen Mitarbeitern/in des Labors I.31 für ihre stete Hilfsbereitschaft und das kollegiale Arbeitsklima. Ein besonderer Dank gilt hierbei Herrn Prof. Dr. R. Radeglia und dem Fond der chemischen Industrie für die zur Verfügung gestellten Lehrbücher sowie für die interessanten Gespräche, in denen er mir auf einfache Weise komplizierte Grundlagen verständlich machte, und ebenso Herrn Dipl.-Ing. (Fh) W. Altenburg für die stets hervorragend eingeshimmten Messköpfe, die zur optimalen Auflösungen der Spektren wesentlich beigetragen haben.
Den Herren Dr. W. Hässelbarth und Dr. W. Bremser (beide I.01) danke ich für die Unterstützung bei der Unsicherheitsbetrachtung und beim Aufstellen der Unsicherheitsbudgets.
Bei Frau Prof. Dr. I. Nehls und den Mitarbeitern der Fachgruppe I.2 möchte ich mich bedanken für die Herstellung von forensischen Ethanol-Referenzlösungen sowie für die Hilfestellungen bei allen Fragen bezüglich der Ethanol-in-Wasser-Problematik. Mein besonderer Dank gilt hierbei Frau Dr. R. Philipp und den Herren Dr. T. Win und Dr. M. Koch, alle drei von der Laborgruppe I.22.
Den Herren Dr. C. Mügge und Dipl.-Ing. W.-D. Bloedorn (beide HUB) danke ich für die Möglichkeit, an den NMR-Spektrometern der HUB Vergleichsmessungen durchzuführen, und die mir dabei zugekommene Unterstützung.
Den Herren Dr. M. Engelhard, Dr. S. Cunskis und Dr. R. Kerssebaum von der Firma Bruker BioSpin GmbH danke ich für die Hilfsbereitschaft bei der Klärung NMR-spezifischer Fragen. Insbesondere möchte ich mich bei Herrn D. R. Kerssebaum dafür bedanken, dass er es mir ermöglicht hat, an modernsten NMR-Geräten zu messen.
Für die rege und gewissenhafte Beteiligung an den nationalen und internationalen Ringversuche danke ich allen Teilnehmern.
Meiner Schwägerin Frau S. Telschow-Malz gilt mein Dank für das sorgfältige Korrekturlesen.
Persönliche Daten:
Schulausbildung:
Studium:
Berufstätigkeit:
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Diese Arbeit wurde von Frank Malz im Zeitraum von September 1999 bis Dezember 2002 an der Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung selbstständig angefertigt. Es wurden keine anderen als die aufgeführten Quellen und Hilfsmittel verwendet.