Reinheitsbestimmung

Ein dritter Aufgabenbereich der Analytik ist die Bestimmung der Reinheiten von Substanzen, z.B. zur Zertifizierung von Referenzmaterialien. Publikationen zur Reinheitsanalyse mit der quantitativen NMR belegen z.B. in der Pharmazie [79, 80, 81, 82], in der Agrartechnik [47, 83] und im militärischen Bereich [84] ihre Anwendbarkeit. Allerdings enthalten diese Arbeiten generell keine ausführliche Unsicherheitsbetrachtung und nur in wenigen wurde eine Standardabweichung angegeben. Es sollte daher das vollständige Unsicherheitsbudget aufgestellt und an ausgesuchten, an CCQM-Aufgaben orientierten Systemen die Messunsicherheit des Verfahrens der Reinheitsanalyse mittels NMR-Spektroskopie ermittelt werden. Die Reinheitsanalyse wurde, wie im Kapitel 3.6.2 beschrieben, über die Hauptkomponentenbestimmung mit Bezug auf einen internen Standard durchgeführt. Um dabei den Anspruch einer relativen primären Methode zu gewährleisten (Rückführung des Analysenergebnisses auf SI-Einheiten), war die Verwendung eines ZRM als Standard bzw. eines auf ein ZRM zurückgeführten Standards notwendig. Hierzu wurde folgendes ZRM des NIST eingesetzt: Benzoesäure (SRM 350a) mit einer Reinheit von (99,9958 ± 0,0027) g/g%, deren erweiterte Unsicherheit ein Konfidenzintervall von 95 % bei elf Freiheitsgraden repräsentiert)

Reinheitsbestimmung mit der ¹H-NMR

Die Reinheitsanalyse mit der ¹H-SP-NMR ist das einfachste Verfahren der NMR-Spektroskopie. Es basiert auf der Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen zwischen Analyt und Standard. Somit sind im Kapitel 5 gewonnenen Erkenntnis hierauf übertragbar.

Maleinsäure

Larive [49] beschreibt Maleinsäure als einen gut für die quantitative ¹H-NMR-Spektroskopie geeigneten Standard. Um hierbei die Rückführung der Analysenergebnisse auf die SI-Einheiten bei der Verwendung von Maleinsäure (Merck KG, Reinheit > 99 %) als internem Standard zu gewährleisten, war dessen Reinheit auf das ZRM Benzoesäure zurückzuführen. Mit diesem System sollte gleichzeitig die Messunsicherheit des Verfahrens der Reinheitsanalyse bestimmt werden.

Probenpräparation und Spektrenaufnahme

Die allgemeine Probenpräparation zur Reinheitsanalyse besteht aus den Einwaagen des Analyten und des internen Standards derart, dass die Intensitäten der auszuwertenden Signale im Spektrum ungefähr im Verhältnis 1:1 stehen. Daraufhin wird das Einwaagegut in deuteriertem Lösungsmittel gelöst und nach Homogenisierung anschließend ins NMR-Messröhrchen überführt.

Zur quantitativen Analyse der Maleinsäure mit dem ZRM Benzoesäure als internem Standard wurden drei Aliquots eingewogen (Tabelle 6.1) und in Methanol-d₄ gelöst. Die Homogenisierung dieser Lösungen erfolgte über Nacht. Anschließend wurden von jedem Aliquot vier Proben entnommen (Überprüfung der Homogenität innerhalb eines Aliquots) und mit den im Kapitel 5 bewährten Standardparametern (Tabelle 5.1, mit ns=32, TD=64k und D1=30s entsprechend der T₁ -Zeiten (Maleinsäure < 5s, Benzoesäure <3s)) gemessen.

Aliquot A

Aliquot B

Aliquot C

m_Maleinsäure in mg

32,21

32,54

32,03

m_Benzoesäure in mg

34,59

34,96

33,24

Tabelle 6.1: Einwaagen von Maleinsäure und ZRM Benzoesäure zur Bestimmung des Reinheitsgrades der Maleinsäure.

Auswertung

Das Spektrum der Lösung, dargestellt in Abbildung 6.1, zeigt bei 6,44 ppm (H₂) das olefinische Signal der Maleinsäure sowie bei 7,58 ppm (H₂), 7,70 ppm (H) und 8,14 ppm (H₂) die drei aromatischen Signale der Benzoesäure.

Abbildung 6.1: ¹H-NMR-Spektrum der Lösung Maleinsäure und ZRM Benzoesäure in Methanol-d₄.

Die Signale der beiden Substanzen liegen im Spektrum für eine getrennte Auswertung weit genug auseinander, wobei die drei Signale der Benzoesäure aufgrund der überlagerten ¹³C-Satelliten mit einem Integral erfasst wurden. Die Prozessierung und Auswertung der Spektren erfolgte nach der im Kapitel 5.1.2 beschriebenen Arbeitsanweisung, jedoch mit einem Integrationsfaktor von 200. Die ermittelten Reinheitsgrade der Maleinsäure der Einzelmessungen, berechnet aus den auf ein Proton normierten Intensitätswerten, Einwaagen und Molmassen der beiden Substanzen (M_Maleinsäure=146,07 g mol^-1, M_Benzoesäure=122,12 g mol^-1) und dem in der Zertifizierungsurkunde angegebenen Reinheitsgrad des ZRM nach Gleichung (3.13), sind in der Tabelle 6.2 dargestellt.

Reinheitsgrad P in g/g %

Messung 1

Messung 2

Messung 3

Messung 4

Aliquot A

99,79

99,84

99,71

99,91

Aliquot B

99,85

99,85

99,72

99,84

Aliquot C

100,19

100,18

99,95

100,05

Tabelle 6.2: Analysenergebnisse der Reinheitsbestimmung von Maleinsäure.

Aus diesen zwölf Ergebnissen wurde der Reinheitsgrad der Maleinsäure zu 99,91 g/g % mit einer Standardunsicherheit von ± 0,05 g/g % ermittelt. Die dabei erreichte geringe relative Standardunsicherheit von 0,05 % war auf das S/N von ca. 12000 und auf die großen Integrationsbereiche zurückzuführen.

Abbildung 6.2: Teilweise Veresterung der Maleinsäure. Das zusätzliche Signal bei
6,45 ppm stammt von den olefinischen Protonen des Maleinsäureester.

Die Verwendung von Methanol als Lösungsmittel führte zur partiellen Veresterung beider Substanzen, die sich jedoch nicht signifikant auf die auszuwertenden Protonensignale auswirkte. Das zusätzliche Signal mit geringer Intensität des Maleinsäureesters bei 6,45 ppm – Tieffeld-Verschiebung um 0,01 ppm (Abbildung 6.2) bezüglich der Maleinsäure – und ebenso die Signale des Benzoesäureesters wurden bei der Integration miterfasst und gaben somit die Intensitäten der eingewogenen Stoffmengen beider Substanzen richtig wieder.

Unsicherheitsbudget

Für das Verfahren der Reinheitsbestimmung sind im Unsicherheitsbudget generell die Unsicherheiten der Intensitätsverhältnisse (Integration), der Molmassen und Einwaagen beider Substanzen und des Reinheitsgrads des Standards zu berücksichtigen.

Die Standardunsicherheit der Integration u(I_Anl/I_Std) wurde nach Gleichung (4.1) aus den zwölf unabhängigen Messungen zu ± 0,05 (Typ A) bestimmt. Ferner wurden die Standardunsicherheiten der Molmasse von Maleinsäure (C₄H₄O₄) zu u(M_Anl)= ± 0,006 g mol^-1 und die von Benzoesäure (C₇H₆O₂) zu u(M_Std)= ± 0,004 g mol^-1 nach Gleichung (4.6) aus den Unsicherheiten der Atommassen (entnommen aus IUPAC [85] und in Tabelle 6.3 aufgeführt) ermittelt (Typ B).

Element

Atommasse in g mol^-1

Standardunsicherheit in g mol^-1

H

1,00794

± 0,00007

C

12,0107

± 0,0008

O

15,9994

± 0,0003

Tabelle 6.3: Atommassen und deren Unsicherheiten für H, C und O, entnommen aus IUPAC [85].

Bei der hier eingesetzten Waage, einer Mettler AT 261 Delta Range, beträgt die Gesamtunsicherheit einer Einwaage u(mAnl) = u(m_Std) = ± 0,03 mg (Tabelle 4.1). Die Unsicherheit des Reinheitsgrades des ZRMs u(f_Std) wurde in der Zertifizierungsurkunde mit ± 0,0012 g/g % angegeben. Aus diesen Unsicherheitsbeiträgen, aufgelistet in Tabelle 6.4, wurde nach Gleichung (4.12) die kombinierte Standardunsicherheit zu ± 0,14 g/g % berechnet.

Unsicherheitsbeitrag

Integration

99,91

0,05

0,05 %

11

Molmasse Benzoesäure

122,121 g mol^-1

0,006 g mol^-1

0,005 %

50

Molmasse Maleinsäure

116,072 g mol^-1

0,004 g mol^-1

0,003 %

50

Einwaage Benzoesäure

34,59 mg

0,03 mg

0,09 %

1000

Einwaage Maleinsäure

32,21 mg

0,03 mg

0,09 %

1000

Reinheitsgrad Benzoesäure

99,9958 g/g %

0,0012 g/g %

0,0012 %

11

Komb. Standardunsicherheit u_c(y)

0,14g/g %

0,14 %

549

Tabelle 6.4: Unsicherheitsbeiträge zum Unsicherheitsbudget der Reinheitsbestimmung von Maleinsäure mit der ¹H-SP-NMR-Spektroskopie ( fi : Freiheitsgrad).

Die Unsicherheitsbeiträge der Molmassen und ebenso die des Reinheitsgrades vom Standard stellten sich im Vergleich zu denen der Integration und der Einwaage als vernachlässigbar gering heraus. Dieses widerspricht der Publikation von Wells [83], bei dem die Unsicherheit des Reinheitsgrades des Standards den größten Beitrag lieferte. Es ist daher bei der Wahl des Standards darauf zu achten, dass sich dessen Unsicherheit nicht bedeutend auf die Gesamtunsicherheit des Ergebnisses auswirkt. Der effektive Freiheitsgrad f_eff von 549 wurde nach der Welch-Satterthwaite-Formel (Gleichung (4.5)) ermittelt. Somit kann ein Konfidenzniveau von p=95% mit einem Erweiterungsfaktor k=2 geschätzt werden. Infolgedessen betrug nach Gleichung (4.4) die erweiterte Unsicherheit des Analysenergebnisses U = ± 0,27g/g%.

Messunsicherheit des Analysenverfahrens

Die im Kapitel 6.1.1.3 berechnete kombinierte Standardunsicherheit berücksichtigt nur die zufälligen Unsicherheiten der Eingangsgrößen und gibt die Unsicherheit des Analysenergebnisses wieder. Um die Messunsicherheit des Analysenverfahrens zu berechnen, ist die Abweichungen des Analysenergebnisses vom Referenzwert zu ermitteln und diese sowie die Unsicherheit des Referenzwertes entsprechend Gleichung 4.17 im Unsicherheitsbudget einzuberechnen. Der Reinheitsgrad der Maleinsäure wurde vom Hersteller mit > 99 g/g % angegeben. Unter Annahme einer Rechteckverteilung (alle Werte sind gleichwahrscheinlich) ergibt sich somit als Referenzwert ein Reinheitsgrad P_Maleinsäure= (99,5 ± 0,3) g/g %, dessen Unsicherheit sich entsprechend Gleichung 4.10 berechnete. Die Fehleranalyse des Verfahrens klassifizierte die Abweichung des Analysenergebnisses als geringfügig (Tabelle 6.5).

x_Ref

in g/g %

in g/g %

in g/g %

|Δx_i|

in g/g %

2u(Δx_i)

in g/g %

rel. U in %

(k = 2; p = 95 %)

99,5 ± 0,3

99,91

0,14

0,4

0,7

1,0

Tabelle 6.5: Fehleranalyse und Bestimmung der relativen Messunsicherheit (k=2; p=95%) des Verfahrens der Reinheitsanalyse mit der ¹H-NMR am Beispiel Maleinsäure mit ZRM Benzoesäure als internem Standard.

Aus der kombinierten Unsicherheit des Analysenergebnisses, der Abweichung zum Referenzwert und der Unsicherheit des Referenzwertes ergab sich nach Gleichung 4.17 eine relative Messunsicherheit des Verfahrens (k=2; p=95%) zu 1%. Diese wurde hauptsächlich durch die Reinheitsangabe des Herstellers (Referenzwert) beeinflusst.

Da das Analysenergebnis nur von Einwaagen (primäre Methode), Naturkonstanten (Molmassen) und der Reinheit des ZRM abhing, war die Rückführung auf die SI-Einheiten gegeben. Die Maleinsäure konnte von jetzt an für weitere Analysen als ein auf ein ZRM zurückgeführter Standard eingesetzt werden.

Referenzmaterialien im pharmazeutischen Bereich

Die Verwendung pflanzlicher Arzneimittel („Phytopharmaka“) ist sowohl national als auch international von großem Interesse. Hierbei ist eine definierte und konstante Zusammensetzung eine der wichtigsten Voraussetzungen für den Einsatz solcher Phytopharmaka. Die Überprüfung der gleichbleibenden Arzneizusammensetzung ist schwierig, da es sich um komplexe Vielstoffgemische handelt. Hierzu werden pflanzliche Referenzsubstanzen zur Validierung und Kalibrierung der eingesetzten Mess- und Prüfverfahren eingesetzt [86]. Das Zentralinstitut Arzneimittelforschung GmbH in Sinzig (ZA-Sinzig) arbeitet u.a. auf dem Gebiet der Herstellung und Zertifizierung von solchen Referenzmaterialien. Die dabei hauptsächlich eingesetzten chromatographischen Methoden zu deren Reinheitsbestimmung können häufig Verunreinigungen mit sehr ähnlichen Strukturen nicht vom Analyten trennen. Die Selektivität der zur Reinheitsbestimmung verwendeten Methode bekommt daher bei Referenzsubstanzen, die aus natürlichen Quellen isoliert werden, eine zentrale Bedeutung. Ein solches hochselektives Verfahren ist die quantitative NMR-Spektroskopie, die zudem schnell ist und eine geringe Probenpräparation erfordert. Obendrein wird durch ihren Charakter einer relativen primären Messmethode [87] die Rückführung der Analysenergebnisse auf die SI-Einheiten garantiert. Es wurde daher mit dieser Arbeit eine Vorstudie zu einem zukünftigen Projekt zur Reinheitsbestimmung von RM mittels NMR-Spektroskopie bearbeitet, deren Reinheiten überwiegend im technischen Bereich liegen sollen.

Analysenverfahren des ZA-Sinzig

Das ZA-Sinzig setzt zur Reinheitsanalyse mittels NMR-Spektroskopie ein Verfahren mit gleichzeitigem Einsatz eines internen und externen Standards ein [88]. Hierbei werden der Analyt und Etacrynsäure (externer Standard) in je ein NMR-Röhrchen eingewogen und mit exakt einheitlichen Volumina des Lösungsmittels gelöst, welches Dimethylformamid als internen Standard enthält. Man erhält somit zwei Spektren, bei deren Auswertung das Intensitätsverhältnis zwischen dem Analyten und dem externen Standard (Etacrynsäure) über das Referenzieren der beiden Spektren auf die Intensität des internen Standards (Dimethylformamid) verläuft, die in beide Spektren gleich gesetzt wird. Dieses Verfahren weist gegenüber einem einfacheren mit nur einem internen Standard mehr Unsicherheitsbeiträge auf. So sind drei Intensitätsverhältnisse zu berücksichtigen (Analyt/interner Standard(1), interner Standard(1)/interner Standard(2), externer Standard/interner Standard(2)), die zudem untereinander korrelieren. Ferner muss die Unsicherheit des Messvolumens beider NMR-Röhrchen berücksichtigt werden, da herstellungsbedingt die Innendurchmesser der NMR-Röhrchen eine Toleranz von bis zu 1,2 % relativ je nach Qualität aufweisen [89].

Erarbeitung eines Analysenverfahrens

Es sollte daher untersucht werden, ob diese Reinheitsanalysen auch mit nur einem internen Standard ausgeführt werden könnten. Zu diesem Zweck wurden drei potentielle Referenzmaterialien (Spiraeosid, Thymol und Loganin) vom ZA-Sinzig bereitgestellt. Für die ersten beiden Substanzen wurde 3-Trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsäure-Natriumsalz (TSP) als interner Standard verwendet, beim Loganin das ZRM Benzoesäure.

Probenpräparation und Spektrenaufnahme

Die Probenpräparation erfolgte analog zu dem im Kapitel 6.1.1.1 vorgestellten allgemeinen Verfahren. Als Lösungsmittel wurde für alle drei Proben deuteriertes Methanol-d₄ (vom ZA-Sinzig vorgegeben) verwendet. Die Aufnahmen der Spektren erfolgten mit den Standardparametern aus Kapitel 5.1.2 (Tabelle 5.1, D1 = 60 s (Loganin: D1 = 20 s), ns = 64, TD = 64 k).

Auswertung: Spiraeosid

Abbildung 6.3: Struktur des Spiraeosids. Nummerierung erfolgte nach Vorgaben vom ZA-Sinzig.

Ziel der Reinheitsanalyse vom Spiraeosid (Abbildung 6.3) war das Austesten des Verfahrens. Die Übersichtsspektren zur qualitativen Auswertung – Zuordnung der Signale war zuvor vom ZA-Sinzig geleistet worden – bestätigten eine generelle Stabilität der Substanz. Somit wurden zur quantitativen Auswertung 27,20 mg Spiraeosid (M_Spiraeosid = 500,4 g mol^-1) und 10,40 mg TSP (M_TSP=172,27 g mol^-1) eingewogen. Das quantitative ¹H-NMR-Spektrum in Abbildung 6.4 gibt die Signallagen des Spiraeosid wieder. Zur Auswertung des Spiraeosids wurden die beiden Signale bei 7,68 ppm (H-6’) und 7,74 ppm (H-2’) herangezogen. Die Signale bei 6,34 ppm (H-8) und 6,15 ppm (H-6) zeigten Deuterierungserscheinungen, die bei 7,26 ppm (H-5’), 3,94 ppm (H-6’’a) und 3,51 ppm (H-2’’, H-3’’, H-4’’,H-5’’) wiesen Fremdsignale im Integrationsbereich auf und das Signal bei 3,75 ppm (H-6’’b) lag zu nahe bei den benachbarten Signalen.

Abbildung 6.4: ¹H-NMR-Spektrum vom Spiraeosid mit TSP (0 ppm) als internem Standard.

Nach Gleichung (3.13) ergibt sich aus den Intensitätswerten des Spiraeosids und des TSP ein Reinheitsgrad von

,

(6.1)

wobei P Std =100 % angenommen wurde.

Auswertung: Thymol

Abbildung 6.5: Struktur des Thymols. Nummerierung erfolgte nach Vorgaben vom ZA-Sinzig.

Ebenso wie beim Spiraeosid war beim Thymol (Abbildung 6.5) vordergründig die Durchführbarkeit der Analyse Gegenstand der Untersuchung und nicht die Ermittlung der Messunsicherheit des Verfahrens. Nachdem die qualitative Zuordnung anhand der Daten vom ZA-Sinzig erfolgt und die Stabilität der Substanz gezeigt war, wurden zur quantitativen Analyse 45,98 mg Thymol (M_Thymol=150,22 g mol^-1) und 18,35 mg TSP (interner Standard) eingewogen. Zur Auswertung wurden beim Thymol nur die Signale bei 6,96 ppm (H-3) und 6,57 ppm (H-4 und H-6) herangezogen, da die Signale bei 2,20 ppm (H₃-7) und 3,20 ppm (H-8) Fremdsignale aufwiesen. Das Signal bei 1,17 ppm (H₃-9 und H₃-10) wurde als Kontrolle der Intensitätswiedergabe im Spektrum verwendet, jedoch nicht bei der Auswertung berücksichtigt. Das quantitative Spektrum ist in der Abbildung 6.6 dargestellt.

Abbildung 6.6: ¹H-NMR-Spektrum vom Thymol mit TSP (0ppm) als internem Standard.

Nach Gleichung (3.13) wurde aus diesen Intensitätswerten ein Reinheitsgrad von

.

(6.2)

ermittelt. Zur Überprüfung dieses Ergebnisses wurde eine zweite Analyse mit einer Einwaage von 45,05 mg Thymol und 18,74 mg TSP durchgeführt. Der dabei bestimmte Reinheitsgrad von 101,5 % entsprach dem der ersten Messung. Wegen der hygroskopischen Eigenschaft des TSP kann dessen angenommener Reinheitsgrad aber signifikant kleiner sein, so dass die ermittelte Reinheit des Thymols von über 100 % darauf zurückzuführen ist. Für eine genaue Analyse muss daher eine geeignete zertifizierte Lösung von TSP in D₂O als Standard eingesetzt werden.

Auswertung: Loganin

Nachdem die Analysen des Spiraeosids und des Thymols die Durchführbarkeit des Verfahrens der Reinheitsanalyse zeigten, sollte die Reinheitsbestimmung des Loganins (Abbildung 6.7) unter metrologischen Gesichtspunkten mit dem ZRM Benzoesäure als internem Standard erfolgen. Das ZA-Sinzig stellte hierfür zwei Loganin-Proben unterschiedlicher Chargen zur Verfügung. Die qualitative Zuordnung der Signale im Spektrum wurde durch Spektrensimulation mit der Software „ACD HNMR“ getätigt. Von jeder Charge wurde eine Lösung eingewogen (Charge 1056: 9,52 mg Loganin und 10,71 mg ZRM; Charge 48942772:
4,44 mg Loganin und 7,32 mg ZRM) und diese jeweils viermal gemessen.

Abbildung 6.7: Struktur des Loganin.

Die Prozessierung und Auswertung der Spektren erfolgte nach der Arbeitsanweisung im Kapitel 5.1.2 mit einem Integrationsfaktor von 64. Von den Signalen des Loganins im ¹H-NMR-Spektrum (Abbildung 6.8) wurde das Signal bei 1,66 ppm als zur Auswertung optimal bewertet. Die übrigen Signale zeigten entweder Fremdsignale oder waren aufgrund der Nähe zu benachbarten Signalen nicht optimal auswertbar. Als Referenzsignal des Standards wurde das Signal bei 8,07 ppm ausgewertet.

Abbildung 6.8: ¹H-NMR-Spektrum des Loganins mit ZRM Benzoesäure als internem Standard.

Die nach Gleichung (3.13) mit M_Loganin= 390,4 g mol^-1 berechneten Reinheitsgrade der acht Experimente sind in der Tabelle 6.6 zusammengestellt. Ebenso sind in dieser Tabelle die Schätzwerte der Reinheitsanalyse und deren Standardunsicherheit dargestellt, die mit (91,38 ± 0,09) g/g % für Charge 1056 und (91,23 ± 0,15) g/g % für Charge 48942772 ähnlich sind.

Reinheitsgrad P in g/g %

Messung 1

Messung 2

Messung 3

Messung 4

Schätzwert

u(x)

Loganin, Charge: 1056

91,42

91,13

91,49

91,49

91,38

0,17

Loganin, Charge: 48942772

91,12

91,54

90,86

91,39

91,23

0,30

Tabelle 6.6: Experimentelle Ergebnisse der Reinheitsanalyse der zwei Loganin-Proben sowie deren Schätzwerte und Standardunsicherheiten.

Unsicherheitsbudget

Bei den Reinheitsanalysen vom Spiraeosid und dem Thymol soll die Betrachtung der kombinierten Standardunsicherheit wegen des unbekannten Reinheitsgrades des Standards (TSP) nicht weiter verfolgt werden, zudem diese hauptsächlich zur Austestung der Durchführbarkeit der Analyse dienten. Nichtsdestoweniger könnte die kombinierte Standardunsicherheit durch Abschätzungen der unbekannten Größen u(I_Anl /I_Std ) und u(f_Std ) berechnet werden.

Für die Analyse der Reinheit des Loganins war das Unsicherheitsbudget analog zu dem im Kapitel 6.1.1.3 beschriebenen aufzustellen und zu berechnen. Die in die kombinierte Standardunsicherheit eingehenden Unsicherheitsbeiträge sind in der Tabelle 6.7 am Beispiel des Loganin Charge 48942772 zusammengefasst.

Unsicherheitsbeitrag

Integration

91,23

0,15

0,16 %

3

Molmasse Benzoesäure

122,121 g mol^-1

0,006 g mol^-1

0,005 %

50

Molmasse Loganin

390,382 g mol^-1

0,014 g mol^-1

0,004 %

50

Einwaage Benzoesäure

7,32 mg

0,03 mg

0,4 %

1000

Einwaage Loganin

4,44 mg

0,03 mg

0,7 %

1000

Reinheitsgrad Benzoesäure

99,9958 g/g %

0,0012 g/g %

0,0012 %

11

Komb. Standardunsicherheit u_c(y)

0,7 g/g %

0,8 %

846

Tabelle 6.7: Unsicherheitsbeiträge des Unsicherheitsbudgets zur Reinheitsbestimmung von Loganin Charge 48942772.

Für die Charge 48942772 wurde die kombinierte Standardunsicherheit zu u_c(y)= ± 0,7g/g% berechnet. Entsprechend ergab sich für die Charge 1056 eine kombinierte Standardunsicherheit von u_c(y) = ± 0,4 g/g %. Bei beiden übte die Einwaagenunsicherheit aufgrund der geringen Probenmengen den stärksten Einfluss auf die Gesamtunsicherheit aus, gefolgt von der Unsicherheit der Integration. Die Unsicherheiten der Molmassen und des Reinheitsgrades des Standards fielen dagegen vernachlässigbar gering aus, wie die Berechnung mittels Spreadsheet bestätigte. Die effektiven Freiheitsgrade für beide Chargen wurden zu 846 bzw. 538 bestimmt. Demzufolge ist für die Angabe der erweiterten Unsicherheit ein Erweiterungsfaktor von k = 2 für ein Konfidenzniveau von p=95% anzusetzen.

Insgesamt konnten die Reinheitsgrade der beiden Loganin-Chargen mit der ¹H-NMR-Spektroskopie unter Berücksichtigung der erweiterten Unsicherheit (k = 2; p = 95 %) zu
(91,4 ± 0,8) g/g % (Charge 1056) und (91,2 ± 1,4) g/g % (Charge 48942772) bestimmt werden.

Diskussion und Zusammenfassung

Die Reinheitsbestimmung mit der ¹H-SP-NMR-Spektroskopie wurde über die Hauptkomponentenanalyse untersucht. Mit einem Stoffsystem, bestehend aus Maleinsäure und ZRM Benzoesäure als internem Standard, wurde die Messunsicherheit des Analysenverfahrens ermittelt. Hierzu musste entsprechend der Messgleichung ein Unsicherheitsbudget erstellt werden, dass sich aus den Unsicherheitsbeiträgen der folgenden Eingangsgrößen zusammensetzt: Intensitätsverhältnis (Analyt : Standard), Einwaagen und Molmassen von Analyt und Standard sowie dem Reinheitsgrad des Standards. Anhand von Vergleichsmessungen zeigte sich, dass mit einem besseren S/N (S/N > 10000) und einem größeren Integrationsfaktor von 200 die Unsicherheit des Analysenergebnisses deutlich zu verbessern ist. So wurde hier die erweiterte relative Unsicherheit (k = 2; p = 95 %) zu 0,3 % bestimmt im Vergleich zu 1,5 % bei einem S/N > 150 und einem Integrationsfaktor von 64. Die relative Messunsicherheit (k = 2; p = 95 %) des Verfahrens wurde durch Bezug auf die Reinheitsangabe des Herstellers zu 1 % ermittelt, wobei die Abweichung des Analysenergebnisses sich als geringfügig darstellte. Die ungenaue Angabe des Reinheitsgrades von > 99% führte zu dieser gegenüber der Unsicherheit des Analysenergebnisses erhöhten Messunsicherheit des Verfahrens. Einen genaueren Referenzwert von anderen anerkannten analytischen Methoden (HPLC, GC, MS) zu erhalten, scheiterte an der Unkenntnis der möglichen Verunreinigungen. Hier drin besteht der wesentliche Vorteil der NMR-Spektroskopie. Aufgrund der ausgezeichneten selektiven und spezifischen Eigenschaften können die Resonanzlinien detektierbarer Verunreinigungen generell von denen der Hauptkomponente im Spektrum unterschieden werden. Dazu kommt die Analyse über die Hauptkomponente, bei der nur der Analyt selber, nicht aber die Verunreinigungen zum Ergebnis beitragen. Die Analyse von Reinstsubstanzen mit einem Reinheitsgrad von 99,9 g/g % und mehr ist dagegen mit diesem Verfahren wegen der ermittelten Messunsicherheiten des Analysenergebnisses als auch des Verfahrens nicht machbar. Hierzu könnte die Reinheitsbestimmung über die Verunreinigungen mit der ¹H-NMR eingesetzt werden, bei der alle Verunreinigungen zu qualifizieren und quantifizieren sind. Dieses war jedoch nicht Bestandteil dieser Arbeit. Als interessante Anwendungsgebiete kommen Reinsubstanzen mit Reinheiten im technischen Bereich in Frage. Genau aus diesem Grunde wurde im Rahmen einer Vorstudie die quantitative ¹H-NMR-Spektroskopie mit der Hauptkomponentenanalyse als Verfahren zur Reinheitsanalyse von Referenzmaterialien für die Pharmazie ausgetestet. Hierzu wurden vom ZA-Sinzig drei Substanzen (Spiraeosid, Thymol, Loganin) zur Verfügung gestellt. Als wichtige Grundlage für die quantitative Auswertung sind die Stabilität des Analyten zu zeigen und die Signale eindeutig qualitativ zuzuordnen. Verunreinigungen wurden in den Spektren erkannt, nicht aber qualitativ zugeordnet (Bestandteil des zukünftigen Projekts). Bei der Betrachtung der Spektren zeigte sich, dass die auszuwertenden Signale genau auszuwählen sind, um systematische Fehler zu vermeiden. Signale, die der zeitlichen Deuterierung unterliegen, die Fremdsignale im Integrationsbereich enthalten oder die mit einem Integrationsfaktor von mindestens 64 nicht ausgewertet werden können, dürfen zur Auswertung nicht herangezogen werden. Am Loganin wurde mit dem ZRM Benzoesäure die Messunsicherheit des Analysenverfahrens ausgetestet. Die Spektren wurden mit der im Kapitel 5 bewährten Arbeitsanweisung aufgenommen und ausgewertet. Die ermittelte relative Messunsicherheit des Verfahrens (k = 2; p = 95 %) von 0,9 % bzw. 1,5 % beruhte auf der kombinierten Standardunsicherheit der Eingangsgrößen. Dabei sind im Unsicherheitsbudget die Unsicherheitsbeiträge der beiden Einwaagen und der Integration (Auswertung) dominant, während die Unsicherheiten der Molmassen und des Reinheitsgrades dagegen vernachlässigbar gering ausfallen. Die erhöhte relative Messunsicherheit von 1,5 % ist auf die geringe zur Verfügung gestellte Substanzmenge des Analyten zurückzuführen. Die Berücksichtigung systematischer Abweichung bezogen auf Referenzwerte soll erst im zukünftigen Projekt erfolgen.

Reinheitsbestimmung mit der ¹³C-NMR

Aufgrund der geringen natürlichen Häufigkeit des ¹³C-Isotops ist bei der ¹³C-NMR im Vergleich zur ¹H-NMR mit konzentrierten Lösungen und einem größeren Zeitaufwand zu messen. Nichtsdestoweniger gehört in der organischen Chemie die ¹³C-NMR zu den meist angewendeten NMR-Methoden.

Xylole (Vorbereitung CCQM-P20b)

In Anbetracht des vom CCQM geplanten internationalen Ringversuchs CCQM-P20b zur Reinheitsanalyse eines Xylol-Isomeren wurden Voruntersuchungen zur Analyse mit der NMR-Spektroskopie durchgeführt. Wie im Kapitel 5.4.3 gezeigt wurde, war mit der ¹H-SP-NMR dieses quantitative Problem nicht lösbar. Daher sollten die Möglichkeiten der ¹³C-NMR mit Durol als internem Standard untersucht und die Messunsicherheit des Verfahrens der Reinheitsbestimmung mit der quantitativen ¹³C-NMR ermittelt werden.

Probenpräparation und Spektrenaufnahme

Für die Reinheitsanalyse der drei Xylol-Isomeren und zusätzlich des ETB wurde eine Lösung mit Durol als internem Standard so eingewogen, dass alle auszuwertenden Signale in einem Intensitätsverhältnis von ungefähr 1:1 standen. Damit wurden die Analysenbedingungen wegen der ähnlichen Signalintensitäten zwischen Analyt und den in dieser Arbeit betrachteten Verunreinigungen gegenüber jeder möglichen realen Probe erschwert. Ferner konnte anhand einer Modell-Lösung die Reinheitsbestimmung der vier Isomere gleichzeitig durchgeführt werden, wenn bei der Auswertung nur die Einwaagen des zu bestimmenden Analyten und des Standards berücksichtigt wurden.

Die Einwaagen von 104,9 mg o-Xylol, 171,5 mg m-Xylol, 119,5 mg p-Xylol und 209,1 mg ETB erfolgten direkt in ein 10 mm NMR-Messröhrchen. Dazu wurden 67,8 mg Durol als interner Standard eingewogen und 2 ml deuteriertes Chloroform (CDCl₃) zur geringfügigen Verdünnung (konzentrierte Lösung) zugegeben. Zur Aufnahme quantitativer ¹H-entkoppelter ¹³C-NMR-Spektren war die im Kapitel 3.3.2 beschriebene „Inverse Gated decoupling“ Technik (Pulsprogramm „zgig“) verwendet worden. Da es sich hierbei um eine MP-Sequenz handelte, waren die Standardparameter der SP-Technik (Tabelle 5.1) nicht mehr generell übertragbar. Um NOE-Effekte zu vermeiden, wurde die Aufnahmezeit t_Aq– entspricht der Einstrahldauer des Entkoppler-Impulses – auf 2,8 s begrenzt. Messungen mit längeren Aufnahmezeiten (t_Aq = 6 s) führten zu Intensitätsverfälschungen im Spektrum, verursacht durch NOE-Effekte. Entsprechend der längsten T₁-Zeit von 21 s wurde D1= 180 s > 7 x 21 s gesetzt, womit der Bedingung zum vollständigen Abbau evtl. aufgebauter NOE-Effekte ebenfalls nachgekommen wurde. Die Spektrenaufnahmen (fünf Messungen) erfolgten am 10mm HR-Messkopf. Die Akkumulation von 256 Scans führten zu einem S/N von 650.

Auswertung

Abbildung 6.9: ¹³C-NMR-Spektrum der quartären C-Atome der Xylol-Lösung. 143,9 ppm ETB; 137,4 ppm m-Xylol; 136,1 ppm o-Xylol; 134,3 ppm p-Xylol und 133,3 ppm Durol (interner Standard) in CDCl₃.

Die Prozessierung und Korrekturen der Spektren erfolgten nach der im Kapitel 5.1.2 beschriebenen Arbeitsanweisung. Für die Auswertung des ¹³C-NMR-Spektrums eigneten sich angesichts der großen Signalabstände die quartären C-Atom-Signale bei 144 ppm (ETB, C), 137 ppm (m-Xylol, C2), 136 ppm (o-Xylol, C2), 134 ppm (p-Xylol, C2) und 133 ppm (Durol, C₄), wie in der Abbildung 6.9 gezeigt. Zur Berechnung des Reinheitsgrades eines Xylol-Isomeren wurde die Anwesenheit der anderen drei Isomere nicht berücksichtigt. In die Gleichung (3.13) gingen somit nur die Einwaagen des Standards und des zu bestimmenden Analyten ein. Der Reinheitsgrad des Standards (Durol) wurde laborintern auf das ZRM Benzoesäure zurückgeführt und zu (99,59 ± 0,12) g/g % bestimmt. Die Ergebnisse der fünf Messungen, der daraus berechneten Schätzwerte und deren Standardunsicherheiten sind in Tabelle 6.8 aufgelistet.

Reinheitsgrad Pin g/g %

Messung 1

Messung 2

Messung 3

Messung 4

Messung 5

o-Xylol

99,3

97,9

99,9

99,0

99,3

99,1

0,4

m-Xylol

100,7

99,9

99,9

100,0

100,5

100,2

0,2

p-Xylol

99,2

97,5

100,1

98,5

99,8

99,1

0,5

ETB

101,3

99,1

98,6

96,6

100,4

99,2

0,8

Tabelle 6.8: Analysenergebnisse der Reinheitsbestimmungen von Xylolen und ETB mit Durol als internem Standard.

Das Aufstellen des Unsicherheitsbudgets und die Berechnungen der erweiterten Unsicherheiten erfolgten analog zu dem im Kapitel 6.1.1.3 beschriebenen Verfahren. Die Einwaagen erfolgten auf der Sartorius BP121S mit einer Einwaageunsicherheit von u(m)=±0,2mg (Tabelle 4.1). In Tabelle 6.9 sind die berechneten kombinierten und erweiterten Unsicherheiten bei Betrachtung eines 95%igen Konfidenzintervalls sowie die effektiven Freiheitsgrade (berechnet nach Gleichung 4.5) dargelegt. Die in dieser Tabelle aufgeführten Erweiterungsfaktoren wurden für effektive Freiheitsgrade f_eff < 10 dem GUM [11] entnommen. Andernfalls wurde ein Konfidenzniveau von 95 % mit k = 2 geschätzt.

u_c(y)

f_eff

k (p = 95 %)

U

o-Xylol

± 0,5 g/g %

7

2,4

± 1,2 g/g %

m-Xylol

± 0,3 g/g %

12

2

± 0,6 g/g %

p-Xylol

± 0,6 g/g %

6

2,5

± 1,5 g/g %

ETB

± 0,9 g/g %

5

2,8

± 2,5 g/g %

Tabelle 6.9: Kombinierte und erweiterte Unsicherheit bei einem 95%igen Konfidenzintervall der Reinheitsanalyse von Xylolen und ETB.

Messunsicherheit des Analysenverfahrens

Um den Einfluss systematischer Abweichungen zu ermitteln, wurden die Analysenergebnisse mit den Reinheitsangaben des Herstellers (Reinheit > 99 %) verglichen. Entsprechend der im Kapitel 6.1.1.4 beschriebenen Vorgehensweise zur Festlegung des Referenzwertes (Rechteckverteilung) ergaben sich als Referenzwerte für alle vier Komponenten Reinheitsgrade von (99,5 ± 0,3) g/g %. Die Abweichungen der Analysenergebnisse von den Referenzwerten wurden bei der Fehleranalyse durchgängig als geringfügig eingestuft. Die relative Messunsicherheit des Verfahrens (k=2; p=95%) wurde zu 2 % bestimmt.

Komponente

x_Ref

in g/g %

in g/g %

in g/g %

|Δx_i|

in g/g %

2u(Δx_i)

in g/g %

rel. U in %

(k=2; p=95%)

o-Xylol

99,5 ± 0,3

99,1

0,5

0,4

1,0

1,4

m-Xylol

99,5 ± 0,3

100,2

0,3

0,7

0,7

1,6

p-Xylol

99,5 ± 0,3

99,1

0,6

0,4

1,2

1,6

ETS

99,5 ± 0,3

99,2

0,9

0,3

1,8

2,0

Tabelle 6.10: Fehleranalyse und Bestimmung der relativen Messunsicherheit (k=2; p=95%) des Verfahrens der Reinheitsanalyse mit der ¹³C-NMR am Beispiel der Xylole mit Durol als auf ZRM Benzoesäure zurückgeführten internen Standard.

Internationaler Ringversuch CCQM-P20a
Nachdem im Kapitel 6.2.1 ein Messverfahren erarbeitet und die Messunsicherheit des Verfahrens laborintern bestimmt wurde, sollte mit der Teilnahme an einem internationalen Ringversuchs des CCQMs ein Vergleich mit anderen Methoden erfolgen. Das Ziel des Pilot-Ringversuches CCQM-P20a, organisiert vom NARL, war die Reinheitsbestimmung von Tri(ⁿbutyl)zinnchlorid (TBT-Cl), das u.a. Isomere und Homologe als Verunreinigungen enthielt. Voruntersuchungen vom NARL [90] mit der 1D-NMR-Spektroskopie zeigten, dass die ¹H-NMR aufgrund überlagerter Signale sowie eines komplexen Spektrums (homonukleare Kopplungen von ¹H mit ¹H und heteronukleare von ¹H mit ¹³C und ^115,117,119Sn) diese Aufgabenstellung nicht bewältigen kann. Ferner ist die ¹¹⁹Sn-NMR wegen fehlender geeigneter interner Standards, keiner homogenen Anregung über die gesamte Spektrenweite, Liganden-Austausch und breiter Signale (erschwert die Identifizierung von geringen Verunreinigungen) nicht einsetzbar. Die Reinheitsanalyse mit der ¹H-entkoppelten ¹³C-NMR ist hingegen ein einsetzbares, hierfür noch nicht weiter untersuchtes Verfahren. Es wurde daher versucht, mit der ¹³C-NMR-Technik an diesem CCQM-Ringversuch teilnehmend dieses Problem zu lösen. Als interner Standard wurde das ZRM Benzoesäure eingesetzt.
Probenpräparation und Spektrenaufnahme
Zur quantitativen Auswertung wurden zwei Aliquots (A: 120,8 mg TBT-Cl und 228,9 mg ZRM; B: 122,0 mg TBT-Cl und 205,0 mg ZRM) eingewogen und in einem Lösungsmittelgemisch, bestehend aus DMSO-d₆ und CDCl₃ im Verhältnis 1:1, gelöst und verdünnt. Die ¹H-entkoppelten ¹³C-Spektren wurden am QNP-Messkopf mit der „Inverse Gated decoupling“-Technik unter Setzung der Entkopplungszeit auf t_Aq= 3 s (zur Minimierung der NOE-Entwicklung) und demzufolge einem Relaxationsdelay von D1= 150 s (> 7 x T₁) aufgenommen. Die T₁-Relaxationszeiten wurden für die Signale der Benzoesäure zu < 10 s und für die des TBT-Cl zu < 6 s bestimmt. Insgesamt wurden nach Ringversuchsanweisung vier Messungen pro Aliquot ausgeführt. Die Akkumulation von 128 Scans (entspricht einer Gesamtaufnahmezeit von 6h pro Spektrum) führte zu einem ausreichendem S/N von 200.
Auswertung
Gemäß der im Kapitel 5.1.2 beschriebenen Arbeitsanweisung wurden die Spektren prozessiert, korrigiert und integriert. Das in der Abbildung 6.10 gezeigte ¹H-entkoppelte ¹³C-Spektrum gibt bei 12 ppm, 19 ppm, 25 ppm und 27 ppm die vier Signale des TBT-Cl und bei 127 ppm, 129 ppm, 130 ppm, 132 ppm und 167 ppm die fünf Signale der Benzoesäure wieder.

Abbildung 6.10: Internationaler Ringversuch CCQM-P20a. Messung mit dem QNP-Messkopf. Ausschnitte des ¹³C-NMR-Spektrums: Benzoesäure-Signale im aromatischen Bereich; TBT-Cl-Signale im aliphatischen Bereich.

Diese Signale wurden jeweils einzeln integriert, wobei die Sn-Satelliten der TBT-Cl-Signale miterfasst wurden, nicht aber im Spektrum erkennbare Signale von Verunreinigungen. Die Einhaltung eines konstanten Integrationsfaktors war daher nicht möglich. Auffällig waren bei allen acht Spektren die vom natürlichen Verhältnis um bis zu 6 % relativ abweichenden, im Spektrum wiedergegebenen intramolekularen Intensitätsverhältnisse, besonders bei der Benzoesäure, wie in der Abbildung 6.10 erkennbar. Zur Berechnung der Reinheit vom TBT-Cl wurden die Summe der fünf Intensitätswerte der Benzoesäure und die Summe der vier Intensitätswerte des TBT-Cl in Gleichung (3.13) eingesetzt. Diese so berechneten, in Tabelle 6.11 aufgelisteten acht Analysenergebnisse gaben die Reinheit des TBT-Cl mit einem Schätzwert von 97,4 g/g % und einer Standardunsicherheit von ± 0,4 g/g % wieder.

Reinheitsgrad P in g/g %

Messung 1

Messung 2

Messung 3

Messung 4

Schätzwert

Aliquot A

98,5

97,2

98,1

97,7

97,9

Aliquot B

98,4

96,3

95,6

97,6

97,0

Tabelle 6.11: Internationaler Ringversuch CCQM-P20a. Analysenergebnisse der Reinheitsanalyse vom TBT-Cl.

Im Gegensatz dazu streuen die aus jeder möglichen Kombination je eines Signals pro Substanz berechneten und in Matrizen dargestellten Reinheitsgrade innerhalb eines Spektrums bis zu 5 % relativ (Gleichung 4.7). Die Tabelle 6.12 gibt beispielhaft die Matrix des Spektrums in der Abbildung 6.10 wieder.

127 ppm

129 ppm

130 ppm

132 ppm

167 ppm

12 ppm

93,9 g/g %

101,8 g/g %

95,9 g/g %

100,9 g/g %

99,3 g/g %

19 ppm

95,9 g/g %

103,9 g/g %

97,8 g/g %

103,0 g/g %

101,3 g/g %

25 ppm

91,2 g/g %

98,9 g/g %

93,0 g/g %

98,0 g/g %

96,3 g/g %

27 ppm

90,8 g/g %

98,4 g/g %

92,6 g/g %

97,5 g/g %

95,9 g/g %

Tabelle 6.12: Matrix der aus je einem Signal pro Substanz berechneten Reinheitsgrade. Die Standardunsicherheit (Gleichung 4.7) innerhalb dieser Matrix beträgt 4 % relativ.

Um diesen Effekt näher zu untersuchen, wurde eine Messung am 10mm HR-Messkopf mit einer größeren Einwaage (542,4mg TBT-Cl und 232,2mg ZRM Benzoesäure in 2ml DMSO-d₆ + CDCl₃ (1:1) gelöst) und einer längeren Messzeit von 66h ausgeführt. Das hierbei erreichte S/N von 550 gab die Signale der Verunreinigungen im Spektrum gut erkennbar wieder; im Integrationsbereich liegende Fremdsignale waren von geringer Intensität. Die Auswertung ergab hier einen mit dem QNP-Messkopf vergleichbaren Reinheitsgrad von 97,4%. Jedoch wichen auch hier die integrierten Intensitätsverhältnisse der Benzoesäure-Signale vom natürlichen Verhältnis um bis zu 5 % relativ ab. Ursache hierfür war der geringe Abstand zwischen den Signalen, wodurch die Signale nicht die Grundlinie erreichen, wie in der Abbildung 6.11 dargestellt.

Abbildung 6.11: ¹³C-NMR-Spektrum der aromatischen Signale der Benzoesäure. Zwischen den Signalen wird die Grundlinie nicht erreicht.

Der dabei auftretende Fehler der Intensitätswiedergabe bei der Korrektur des Integralzuges zu geraden An- und Ausläufen wurde bereits in Kapitel 5.3.2 beschrieben. Daraufhin wurde eine zweite Auswertungsart untersucht. Entsprechend der aufgestellten Forderung zur Auswertung teilweiser überlagerter Einzelsignale (Kapitel 5.3.2) wurden diese vier Signale mit einem einzigen Integralzug erfasst, dargestellt in Abbildung 6.12.

Abbildung 6.12: ¹³C-NMR-Spektrum. Erfassung der aromatischen C-Signale der Benzoesäure mit einem Integral.

Das dabei erhaltende Verhältnis der Intensitätswerte dieses Integrals zu dem des Signals bei 166ppm war dem natürlichen Verhältnis von 6:1 sehr nahe. Der berechnete Reinheitsgrad aus diesen Integralwerten ergab 95,8 %, einen um ca. 2 % relativ kleineren Wert als bei der vorherigen Auswertungsart. Dementsprechend wurden bei den acht Spektren des Ringversuchs am QNP-Messkopf die vier Einzelintegrale der aromatischen Benzoesäure-Signale durch einen Integralzug ersetzt und der Reinheitsgrad neu berechnet. Als Analysenergebnis aus dieser Auswertung wurde der Reinheitsgrad des TBT-Cl zu 95,8 % mit einer Standardabweichung von 1,5 % bestimmt.

Zur Überprüfung, ob bei dieser Entkopplungsdauer signifikante NOE-Effekte auftraten, wurden Messungen mit einer kürzeren Aufnahmezeit (t_Aq =1,5 s) sowie mit einem Relaxationsreagenz (Cr(acac)₃) durchgeführt, die vergleichbare Resultate lieferten. Damit konnte gezeigt werden, dass bei einer Entkopplungsdauer von 3 s die Intensitäten im Spektrum richtig wiedergegeben werden.
Unsicherheitsbudget
Das hier zu betrachtende Unsicherheitsbudget entspricht dem im Kapitel 6.1.1.3 aufgeführten, wobei die Einwaagen auf der Sartorius BP121S-Waage durchgeführt wurden, deren Einwaageunsicherheit nach Kapitel 6.2.1.2 u(m)= ± 0,2 mg beträgt. Die darin eingehenden Unsicherheitsbeiträge sind in der Tabelle 6.13 für die Auswertung der acht Ringversuchsmessungen mit der Integration aller Einzelsignale aufgeführt.

Unsicherheitsbeitrag

Integration

97,4

0,4

0,4 %

7

Molmasse Benzoesäure

122,121 g mol^-1

0,006 g mol^-1

0,005 %

50

Molmasse TBT-Cl

325,49 g mol^-1

0,012 g mol^-1

0,004 %

50

Einwaage Benzoesäure

120,8 mg

0,2 mg

0,16 %

1000

Einwaage TBT-Cl

228,9mg

0,2 mg

0,09 %

1000

Reinheitsgrad Benzoesäure

99,9958 g/g %

0,0012 g/g %

0,0012 %

11

Komb. Standardunsicherheit u_c(y)

0,4 g/g %

0,4 %

7

Tabelle 6.13: Unsicherheitsbeiträge zum Unsicherheitsbudget der Reinheitsbestimmung des TBT-Cl.

Hieraus ergab sich eine hauptsächlich durch die Unsicherheit der Integration beeinflusste kombinierte Unsicherheit von ± 0,4 g/g %. Als erweiterte Unsicherheit konnte bei einem 95%igen Konfidenzintervall mit einem k-Faktor von 2,4 (entspricht f_eff = 7) ein Wert von
±1,0 g/g % ermittelt werden. Analog dazu wurde bei der zweiten vorgestellten Auswertungsmethode der Reinheitsgrad des TBT-Cl zu (95,8±1,3)g/g% (k=2,36; p=95%) korrigiert.
Ergebnisse des Ringversuches CCQM-P20a
Innerhalb des Bearbeitungszeitraumes für den Ringversuch wurde das Ergebnis der Reinheitsanalyse mit Einzelintegration der Benzoesäure-Signale abgegeben. Nach Abschluss des Ringversuches, aber noch vor Bekanntgabe der Ergebnisse, wurde das korrigierte Analysenergebnis dem Veranstalter mitgeteilt.

Abbildung 6.13: Internationaler Ringversuch CCQM-P20a. Analysenergebnisse der Teilnehmer zur Reinheitsbestimmung des TBT-Cl (entnommen aus [91]).

Aus der vom Veranstalter ausgefertigten Darstellung der Ringergebnisse in Abbildung 6.13ist zu erkennen, dass das korrigierte Analysenergebnis (BAM-NMR 28-Feb-2002) recht gut mit denen der anderen Methoden und anderer Institute übereinstimmt.
Messung am 800 MHz-Spektrometer
Bei Messungen bei der Firma Bruker sollte an einem Höchstfeld-NMR-Spektrometer (18,8T; 800 MHz) untersucht werden, ob bei höherem Feld eine Verbesserung der Auswertung mit der ¹³C-NMR und der ¹H-NMR möglich ist. Aufgrund der schlechteren Auflösung (breitere Linien) wurde der Vorteil der doppelten Messfrequenz kompensiert, wie auch schon im Kapitel 5.3.4 diskutiert. Jedoch führt die bei weitem höhere Empfindlichkeit zu einer kürzeren Messzeit. Das ¹H-NMR-Spektrum am 800 MHz Spektrometer aufgenommen zeigt in der Abbildung 6.14 die gut voneinander getrennten Protonen-Signale des TBT-Cl. Eine quantitative Auswertung zur Reinheitsbestimmung war aufgrund der auf den Flanken der Hauptsignale liegenden Protonensignale der Verunreinigungen nicht möglich.

Abbildung 6.14: ¹H-NMR-Spektrum des TBT-Cl an einem 800 MHZ Spektrometer.
Diskussion und Zusammenfassung
An Stoffsystemen, die mit der ¹H-SP-NMR nicht quantitativ auswertbar sind (Xylol-Isomere, TBT-Cl), wurde der Einsatz der quantitativen ¹³C-NMR ausgetestet. Zur Vereinfachung der Spektren wurde hierzu die ¹H-entkoppelte-BB-¹³C-NMR-Technik verwendet, bei der es sich jedoch um eine MP-Methode handelt. Demzufolge musste die Aufnahmezeit, während der entkoppelt wird, optimiert werden, um Intensitätsveränderungen durch NOE-Effekte zu vermeiden. Eine Aufnahmezeit von 3s zeigte im Vergleich zu einer kürzeren Aufnahmezeit von 1,5s (kürzere Einstrahldauer der Entkopplerleistung) sowie zum Einsatz von Relaxationsreagenzien keinen Einfluss auf die Intensitäten im Spektren, während eine längere Aufnahmezeit von 6s die Intensitäten signifikant verfälschte.

Am System der Xylol-Reinheitsbestimmung wurde die Messunsicherheit des Verfahrens der Reinheitsbestimmung mit der quantitativen ¹³C-MP-NMR ermittelt. Hierzu wurde eine Xylol-Lösung hergestellt, die o-, m- und p-Xylol sowie ETB in ungefähr gleichen Intensitätsverhältnissen enthielt. Durol, dessen Reinheit auf ZRM Benzoesäure rückgeführt wurde, diente als interner Standard. Bei einem 95%igen Konfidenzintervall wurde generell sowohl die relative erweiterte Unsicherheit des Analysenergebnisses als auch die relative Messunsicherheit des Verfahrens (Referenzwert: Herstellerangabe) für die Reinheitsanalyse für jede der vier Komponenten zu unter 2 % bestimmt. Die Abweichungen der Analysenwerte zu den Referenzwerten stellten sich als geringfügig heraus. Diese an der hier untersuchten Modell-Lösung erarbeiteten Erkenntnisse sind auf jede reale Xylol-Probe übertragbar, da deren Spektren aufgrund der geringeren Signalintensitäten der enthaltenden Verunreinigungen gegenüber dem hier betrachteten Modell-System einfacher auswertbar sind. Wie auch bei dem Verfahren der Reinheitsbestimmung mit der ¹H-NMR dominierten hier die Unsicherheitsbeiträge der Integration (Auswertung) und der beiden Einwaagen (Analyt, Standard) im Unsicherheitsbudget. Die weiteren Unsicherheitsbeiträge der Molmassen von Analyt und Standard sowie des Reinheitsgrades vom Standard sind vernachlässigbar gering.

Anhand des internationalen Ringversuch CCQM-P20a (Reinheitsbestimmung von TBT-Cl) wurde die Messunsicherheit des NMR-Verfahrens mit der anderer Verfahren verglichen. Als interner Standard kam hier das ZRM Benzoesäure zum Einsatz. Es zeigte sich jedoch, dass die von der ¹H-SP-NMR bewährten Vorgaben zur Auswertung (S/N > 150, Integrationsfaktor von 64) hier zu erheblichen Abweichungen führten. Bei einem S/N von ungefähr 280 und einem Integrationsfaktor von 64 wichen die Intensitäten der fünf einzeln integrierten ¹³C-Signale der Benzoesäure intramolekular um bis zu 5 % voneinander ab. Erst bei einem S/N > 500 war deutlich die Überlagerung der vier aromatischen C-Signale der Benzoesäure zu erkennen. Die Erfassung dieser vier Signale mit einem Integralzug (Auswertung überlagerter Einzelsignale, Kapitel 5.3.2) war der Erfolg für ein gut mit den der anderen Methoden übereinstimmendes Analysenergebnis von (95,8 ± 1,3) g/g % für die Reinheit des TBT-Cl. Die hierbei angegebene erweiterte Unsicherheit (k=2; p=95%) wurde hauptsächliche durch den Unsicherheitsbeitrag der Integration bestimmt. Im Vergleich zur relativen Messunsicherheit der ¹H-SP-NMR von 1,5% liegt die der ¹³C-MP-NMR unter denselben Bedingungen (S/N > 150, Integrationsfaktor: 64) nur geringfügig höher (2%).

Zusammenfassung
Es wurden Arbeitsanweisungen zur Reinheitsbestimmung über die Hauptkomponentenanalyse mit der ¹H-SP-NMR und der ¹³C-MP-NMR ausgearbeitet und an Modell-Systemen die Messunsicherheiten der Verfahren bestimmt. An realen Proben wurden die erarbeiteten Arbeitsanweisungen ausgetestet und mittels eines internationalen Ringversuchs mit anerkannten Analyseverfahren verglichen. Folgende Erkenntnisse wurden dabei gewonnen:

Für die Reinheitsbestimmung mit der ¹H-SP-NMR konnte die zur Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen bewährte Arbeitsanweisung übernommen werden. Sie wurde lediglich um die Probenpräparation (Einwaage von Analyt und Standard in einem Intensitätsverhältnis der auszuwertenden Signale von ungefähr 1:1) erweitert.

Bei der Wahl des internen Standards ist darauf zu achten, dass es zu keiner Überlagerungen der auszuwertenden Signale kommt und ein Integrationsfaktor von mindestens 64 angesetzt werden kann. Ferner sollte der Reinheitsgrad des Standards nur eine geringe Unsicherheit aufweisen, um im Unsicherheitsbudget vernachlässigt werden zu können.

Bei der Reinheitsbestimmung des Modell-Systems von Maleinsäure mit ZRM Benzoesäure führte die Auswertung mit einem größeren Integrationsfaktor von 200 (anstelle von 64) bei einem besseren S/N von größer als 10000 (anstatt größer 150) zu einer geringeren relativen Messunsicherheit des Verfahrens (k=2; p=95%) von 1,0 % (1,5 % bei S/N > 150, Integrationsfaktor 64).

Die Reinheitsanalyse mit der ¹H-SP-NMR von realen Proben (Spiraeosid, Thymol, Loganin) im Rahmen einer Vorstudie (Reinheitsbestimmung von pharmazeutischen Referenzmaterialien mit der quantitativen NMR-Spektroskopie) zeigte die wichtigen Vorarbeiten des Operators zur quantitativen Auswertung. Die eindeutige qualitative Zuordnung der Signale, die Überprüfung der Stabilität der Lösung und die Auswahl der Analytensignale, die zur Auswertung geeignet sind (keine Deuterierung, keine Fremdsignale im Integrationsbereich, Integrationsfaktor von mindestens 64 anwendbar), tragen zur Vermeidung systematischer Fehler und somit zu einer geringeren Messunsicherheit bei. Die relative Messunsicherheit (k=2; p=95%) wurde bei einem S/N > 150 und einem Integrationsfaktor von 64 zu unter 1,5 % berechnet. Diese wurde hauptsächlich durch die Unsicherheitsbeiträge der beiden Einwaagen (zu geringe zur Verfügung gestellte Substanzmenge) beeinflusst.

Anhand der Reinheitsbestimmung einer Modell-Lösung von Xylol-Isomeren (o-, m- und p-Xylol sowie ETB) mit Duren als einen auf ZRM Benzoesäure zurückgeführten internen Standard wurde der Einsatz der quantitativen ¹³C-NMR untersucht, wenn die quantitative ¹H-NMR nicht anwendbar ist. Dabei ist die Aufnahmezeit (und damit verbunden die Entkopplungsdauer) entgegen der Arbeitsanweisung zur Aufnahme von SP-Experimenten auf 3 s zu begrenzen. Längere Aufnahmezeiten führten zu NOE-Effekten, und somit zur Intensitätsverfälschung in den Spektren. Die relative Messunsicherheit
(k=2; p=95%) bei einem S/N > 150 und einem Integrationsfaktor von mindestens 64 wurde zu 2 % bestimmt, also nur geringfügig höher als mit der ¹H-SP-NMR unter identischen Bedingungen (1,5 %). Jedoch ist der Zeitaufwand für eine quantitative ¹³C-NMR-Messung aufgrund der geringeren natürlichen Häufigkeit des ¹³C-Isotops (1,1 %) um ein Vielfaches größer.

Der Vergleich mit anderen Analysenverfahren bei der Reinheitsbestimmung von TBT-Cl (internationaler Ringversuch CCQM-P20a) zeigte, dass die quantitativen ¹³C-NMR (hier mit ZRM Benzoesäure als internem Standard) mit einer relativen Messunsicherheit
(k=2; p=95%) von 2% eine Alternative ist.

In das Unsicherheitsbudget gehen die Standardunsicherheiten der Integration, der beiden Einwaagen und Molmassen des Analyten und des Standards sowie des Reinheitsgrades vom Standard ein. Dabei sind die Unsicherheitsbeiträge der Molmassen und – bei geeigneter Wahl des Standards – der Unsicherheitsbeitrag des Reinheitsgrades vom Standard vernachlässigbar gering.

Aufgrund der ermittelten Messunsicherheiten ist die Reinheitsbestimmung von Reinstsubstanzen (Reinheitsgrad ≥ 99,9 g/g %) mit der quantitativen NMR-Spektroskopie mittels der Hauptkomponentenanalyse nicht möglich.