Die quantitative NMR als Referenzverfahren

Die Motivation dieser Arbeit war, für den Bereich der organischen Analyse den Einsatz der hochauflösenden Flüssigkeits-NMR in Referenzverfahren für verschiedene Aufgabenbereiche zu untersuchen.

Für den Begriff „Referenzverfahren“ ist in der Literatur keine einheitliche Definition zu finden. Von der Arbeitsgruppe „Referenzverfahren“ in der BAM wurde er wie folgt definiert [106, S. 8]:

Referenzverfahren: Eingehend charakterisiertes und nachweislich beherrschtes Prüf-, Mess- oder Analysenverfahren zur

(a)

Qualitätsbewertung anderer Verfahren für vergleichbare Aufgaben oder

(b)

Charakterisierung von Referenzmaterialien einschließlich Referenzobjekte oder

(c)

Bestimmung von Referenzwerten.

Die Ergebnisunsicherheit eines Referenzverfahrens muss angemessen abgeschätzt und dem Verwendungszweck entsprechend beschaffen sein.

Referenzverfahren werden benötigt, um andere Verfahren zu validieren und Referenzmaterialien zu charakterisieren. Des Weiteren werden sie z.B. bei Gutachten als Grundlage von Prüfungen, Messungen und Analysen eingesetzt. Ein Referenzverfahren qualifiziert sich dadurch, dass es für einen festgelegten Zweck eine ausreichende Ergebnisunsicherheit – ist gleich der Messunsicherheit – aufweist, die nach GUM [11] als Richtigkeit und Präzision angegeben wird. Diese sollten auf das Internationale Einheitensystem (SI) zurückgeführt werden können. Zudem muss das Referenzverfahren von der Zielgruppe akzeptiert werden (siehe auch primäre Methoden, Kapitel 3.1).

Die BAM veröffentlichte 2001 einen Katalog über dort vorhandenen Referenzverfahren [106]. In diesem sind 61 Referenzverfahren für die Prüftechnik und chemische Analytik enthalten. Für organische Analysen werden darin sieben Referenzverfahren aufgezählt, darunter die quantitative ¹H-SP-NMR-Spektroskopie zur relativen Konzentrationsbestimmung von strukturbekannten Gemischen in Lösung.

In der vorliegenden Arbeit wurden vier Anwendungsbereiche der quantitativen NMR-Spektroskopie (Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen, Reinheits- und Gehaltsbestimmung) bearbeitet, bei denen insgesamt drei verschiedene NMR-Techniken (¹H-SP-NMR, ¹H-Wasserunterdrückung (Presaturation), Inverse Gated ¹H-BB-entkoppelte ¹³C-NMR) eingesetzt wurden. Es wurden dazu systematisch alle physikalischen Parameter sowie entsprechend der aufgestellten Messgleichungen alle Eingangsgrößen auf ihren Einfluss auf die Messunsicherheit untersucht und optimiert. Von der Gerätekonstellation unabhängige Arbeitsanweisungen wurden aufgestellt und schrittweise verbessert. Die Messunsicherheit der quantitativen NMR wurde für die vier oben genannten Anwendungsbereiche an einfachen, an den Aufgabengebieten des CCQMs orientierten Stoffsystemen ermittelt und mittels nationaler und internationaler Ringversuchen bestätigt. Insgesamt konnte für jedes hier betrachtete Verfahren unter Berücksichtigung der jeweils eingesetzten NMR-Technik

der Nachweis für vollständige Beschreibung erbracht,
die Messgleichung in Termen von SI-Einheiten aufgestellt,
das Unsicherheitsbudget in Termen von SI-Einheiten aufgestellt und
die metrologische Qualität mit einer relativen Messunsicherheit (k=2; p=95%) von 1,5% (S/N > 150, Integrationsfaktor: 64) bzw. 1,0 % (S/N > 7000, Integrationsfaktor: 200) für die ¹H-NMR und von 2 % für die ¹³C-NMR beschrieben werden.

Die Rückführung absoluter Analysenergebnisse erfolgte mittels eines ZRMs. Damit wurde allen bis auf einer in der Definition für das CCQM aufgeführten Anforderungen einer primären relativen Methode entsprochen [12]. Die „[...] highest metrological qualities [...]“ ([12], S. 293) konnte der quantitativen NMR-Spektroskopie beim Vergleich mit anderen Methoden (GC, Titration, DSC) mittels internationaler Ringversuche des CCQMs (CCQM-P20a, CCQM-P35) nicht zugeordnet werden. Zwar konnte die NMR in der Richtigkeit mit den anderen Analyseverfahren mithalten, wies aber generell eine geringere Präzision auf. Eine Möglichkeit, die quantitative NMR-Spektroskopie mit der in dieser Arbeit bestimmten Messunsicherheit als relative primäre Methode zu etablieren, besteht in der Analyse von Stoffsystemen, deren Zusammensetzung nur mit den hervorragenden qualitativen Eigenschaften der hochauflösenden NMR-Spektroskopie (Selektivität, Spezifität) voneinander zu unterscheiden sind. Genau hierauf zielt das zukünftige Projekt zur Bestimmung der Reinheitsgrade von Referenzmaterialien im pharmazeutischen Bereich, für das in dieser Arbeit eine Vorstudie durchgeführt wurde (Kapitel 6.1.2)

Ein essentieller Vorteil der NMR-Spektroskopie besteht darin, dass zur Auswertung eines Analyten nur eine eindeutig ihm zugeordnete Resonanzlinie nötig ist. Somit lassen sich auch Stoffsysteme mit komplexeren als den hier betrachteten Spektren quantitativ analysieren, wenn

diese sich in einem geeigneten Lösungsmittel lösen bzw. verdünnen lassen,
es sich dabei um strukturbekannte Verbindungen handelt,
deren Resonanzlinien im Spektrum sich eindeutig zuordnen lassen,
die Substanzen über den Zeitraum der Analyse sich als stabil erweisen,
von jeder zu analysierenden Substanz sich mindestens eine Resonanzlinie optimal auswerten (integrieren) lässt und
für die Reinheits- oder Gehaltsbestimmung ein geeigneter interner Standard (ZRM bzw. auf ein ZRM zurückgeführter Standard) eingesetzt werden kann.

Die in dieser Arbeit erarbeiteten Arbeitsanweisungen und substanzspezifischen Aussagen hinsichtlich der Metrologie können daher generell auf alle Substanzen und Mehrkomponentengemische verallgemeinert werden, sofern obige Bedingungen für die Auswertung eingehalten werden. Sollte die Auswertung mit der quantitativen ¹H-NMR nicht möglich sein, so kann die quantitative Inverse Gated ¹H-BB-entkoppelte ¹³C-NMR eingesetzt werden, jedoch mit einer geringeren Messunsicherheit des Analysenverfahrens. Somit ist die quantitative NMR-Spektroskopie wegen ihrer generellen Eigenschaften einer primären relativen Methode, des allgemeinen Einsatzbereiches unter oben genannten Bedingungen und ihrer herausragenden qualitativen Eigenschaften betreffs Selektivität und Spezifität als Referenzverfahren in der organischen Analyse prädestiniert.

Entsprechend der Definition sind Referenzverfahren in ihrem Prüfbereich, ihrer Messunsicherheit und des Einsatzgebietes zu beschreiben. Die untersuchten NMR-Verfahren können in vier verschieden Referenzverfahren gegliedert werden, die nun diskutiert werden.

Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen und -anteilen in Mehrkomponentengemischen mittels ¹H-NMR-Spektroskopie

Speziell in der Stereo- und Synthesechemie ist es oftmals wichtig, das Verhältnis zweier Stereoisomere oder den Anteil verschiedener Komponenten in einem Gemisch zu kennen. Wegen der hervorragenden selektiven Eigenschaften der NMR-Spektroskopie eignet sich gerade die quantitative NMR dazu, hier als Referenzverfahren eingesetzt zu werden. Anhand der im Kapitel 5 beschriebenen Untersuchungen konnte mit der im Kapitel 5.1.2 erarbeiteten Arbeitsanweisung für die quantitative ¹H-SP-NMR bei der Bestimmung von Stoffmengenverhältnissen bzw. -anteilen der enthaltenden Komponenten einer Fünf-Komponentenlösung eine relative Messunsicherheit von 1,5% erreicht werden. Der Prüfbereich lag dabei zwischen 0,004molmol^-1 und 0,999molmol^-1. Lediglich bei NMR-Geräten, die mit Analogfiltern arbeiteten, ist abweichend von den Parametern in Tabelle 5.1 die Spektrenweite auf mindestens 15ppm und die Filterweite auf mindestens 30 ppm zu setzen. Entsprechend der Messgleichung wird die Unsicherheit des Analysenwertes nur durch die Standardunsicherheit der Integration dargestellt, da keine aufwendige Probenpräparation nötig ist. In das Unsicherheitsbudget der Messunsicherheit vom Verfahren werden zusätzlich die Abweichung und die Unsicherheit des Referenzwertes eingerechnet Diese Erkenntnisse sind auf beliebige Mehrkomponentengemische in flüssiger Phase übertragbar, sofern diese die oben genannten Bedingungen erfüllen. Als Einsatzgebiete bieten sich die Validierung anderer Messverfahren zur Bestimmung von Mehrkomponentengemischen und die Zertifizierung von Referenzmaterialien für die organische Analyse an.

Reinheitsbestimmung von organischen Verbindungen mittels ¹H- oder ¹³C-NMR-Spektroskopie

Die Reinheitsbestimmung von Referenzmaterialien spielt u.a. im pharmazeutischen Bereich eine große Rolle (Kapitel 6.1.2). Zur Rückführung der Ergebnisse auf die SI-Einheiten wurde ein ZRM als interner Standard eingesetzt. Die mit der ¹H-SP-NMR erfolgten Reinheitsbestimmungen wurden nach der im Kapitel 6.1.1.1 erarbeiteten Arbeitsanweisung durchgeführt. Die einzelnen Unsicherheitsbeiträge und deren Einfluss auf die Messunsicherheit des Verfahrens sind in der Tabelle 8.1 aufgelistet.

Rel. Unsicherheit in %

¹H-NMR

¹³C-NMR
(o-Xylol)

Grad des Einflusses

Integrationsfaktor von

64 (Loganin)

200 (Maleinsäure)

Integration

0,16

0,05

0,4

hoch

Molmasse Analyt

0,004

0,003

0,006

gering

Molmasse Standard

0,005

0,005

0,006

gering

Einwaage Analyt

0,4

0,09

0,29

hoch

Einwaage Standard

0,7

0,09

0,4

hoch

Reinheitsgrad

0,0012

0,0012

0,12

gering

Komb. Standardunsicherheit

0,8

0,14

0,5

Abweichung (Analyse - Referenz)

--

0,4

0,4

hoch

Referenzwert

--

0,3

0,3

hoch

Messunsicherheit (k=2; p=95%)

1,6

1,0

1,3

Tabelle 8.1: Unsicherheitsbeiträge und deren Einfluss auf die Messunsicherheit des Verfahrens zur Reinheitsbestimmung mit der quantitativen ¹H- und ¹³C-NMR (--: nicht bekannt).

Aus dieser Tabelle ist deutlich zu entnehmen, dass die Unsicherheit des Analysenergebnisses (kombinierte Standardunsicherheit) im wesentlichen nur durch die Unsicherheitsbeiträge der Integration (Auswertung) und der beiden Einwaagen von Analyt und Standard geprägt wird. Bei einer der Einwaagemenge angepassten Waage mit geringer Einwaageunsicherheit kann der Einfluss der beiden Einwaagen-Unsicherheitsbeiträge im Unsicherheitsbudget verringert werden. Als hauptsächlich sich auswirkende Unsicherheitsgröße fällt dann nur noch die der Integration an. Bei der Berechnung der Messunsicherheit des Verfahrens zeigten die Unsicherheit des Referenzwertes und die Abweichung des Analysenwertes vom Referenzwert einen beachtlichen Einfluss. Ein genauerer Referenzwert würde hier zur Verbesserung der Messunsicherheit des Verfahrens beitragen. Dieser war im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht zu erhalten.

Wie bei der Reinheitsanalyse des Loganins (Kapitel 6.1.2) gezeigt, kann mit der quantitativen ¹H-NMR bei sorgfältiger Spektrenkorrektur und Integration mit einem Integrationsfaktor von 64 eine relative Messunsicherheit (k=2; p=95%) zwischen 0,8 % und 1,6% (zu geringe Substanzmenge) erreicht werden. Am System der Reinheitsbestimmung von der Maleinsäure (Kapitel 6.1.1) wurde bei der Auswertung mit einem Integrationsfaktor von 200 eine geringere relative Messunsicherheit (k=2; p=95%) von 1,0 % erhalten. Für Stoffsysteme, die mit der ¹H-NMR nicht zu analysieren waren, wurde die Reinheitsbestimmung mit der ¹³C-NMR nach der im Kapitel 6.2.2.1 erarbeiteten Arbeitsanweisung durchgeführt. Dabei konnten relative Messunsicherheiten im Bereich von 1,3 % (TBT-Cl im Rahmen des CCQM-P20a) bis 2% (Xylole) ermittelt werden. Die Obergrenze des Prüfbereiches der Reinheitsanalyse wird durch dessen Messunsicherheit bestimmt [52]. So können mit der ¹H-NMR grundsätzlich Substanzen mit einem Reinheitsgrad von bis zu 99g/g% und mit der ¹³C-NMR bis 98g/g% analysiert werden. Wichtig ist dabei die Rückführung des Ergebnisses auf die SI-Einheiten, die nur über ein ZRM bzw. einen auf ein ZRM zurückgeführten Standard erfolgen kann. Als Einsatzgebiete kommen die Validierung anderer Verfahren sowie die Zertifizierung von Referenzmaterialien für den gesamten organischen Bereich in Frage, speziell bei Substanzen mit Reinheitsgraden im technischen Bereich. Für die Analyse von Reinstsubstanzen mit Reinheitsgraden größer 99,9 % kann dieses Verfahren nicht als Referenzverfahren eingesetzt werden.

Gehaltsbestimmung von organischen Verbindungen mittels ¹H-NMR-Spektroskopie

Die Gehaltsbestimmung ist im gesamten analytischen Bereich von großer Bedeutung. Vor allem zur Charakterisierung von Referenzmaterialien ist die Kenntnis über die genaue Zusammensetzung wichtig. Bei der Gehaltsanalyse von TSP in D₂O mit ZRM Benzoesäure als internem Standard konnte bei einem Integrationsfaktor von 500 eine relative Messunsicherheit des Verfahrens (k=2; p=95%) von 1,0 % erreicht werden. Aus der Auftragung der einzelnen Unsicherheitsbeiträge ins Unsicherheitsbudget der Gehaltsbestimmung in der Tabelle 8.2 ist ersichtlich, dass die Unsicherheitsbeiträge der Molmassen (Analyt, Standard) und des Reinheitsfaktors vom Standards im Vergleich zu denen der anderen Einflussgrößen vernachlässigbar gering sind. Bezugnehmend auf die Erkenntnisse aus den Kapiteln 5 (Stoffmengenverhältnisse) und 6.1.2 (Reinheitsbestimmung von Loganin) ist bei Auswertung mit einem Integrationsfaktor von 64 mit einer relativen Messunsicherheit von 1,5 % zu rechnen. Der Gehalt des untersuchten Systems lag bei ungefähr 9mg g^-1 und soll als untere Grenze des Prüfbereiches festgelegt werden. Höhere Gehalte sollten aufgrund der Vereinfachung des Analysensystems sich nicht negativ auf die Messunsicherheit auswirken. Die Obergrenze des Prüfbereiches wird durch die Messunsicherheit des Verfahrens festgelegt [52]. Somit wurde der Prüfbereich zu 9mgg^-1 bis 990mgg^-1 definiert.

Rel. Unsicherheit in %

Grad des

Einflusses

Integrationsfaktor von 500 (TSP)

Integration

0,11

hoch

Molmasse Analyt

0,003

gering

Molmasse Standard

0,005

gering

Einwaage Analyt

0,02

mittel

Einwaage Standard

0,10

hoch

Reinheitsgrad

0,0012

gering

Komb. Standardunsicherheit

0,15

Abweichung (Analyse - Referenz)

0,18

hoch

Referenzwert

0,4

hoch

Messunsicherheit (k=2; p=95%)

1,0

Tabelle 8.2: Unsicherheitsbeiträge und deren Einfluss auf die Messunsicherheit des Verfahrens zur Gehaltsbestimmung mit der quantitativen ¹H-NMR.

Grundsätzlich kann hier die quantitative ¹H-SP-NMR-Spektroskopie zur Validierung anderer Verfahren und zur Referenzierung von ZRM eingesetzt werden.

Gehaltsbestimmung in wässriger Matrix mit der NMR-Spektroskopie unter Einsatz der Wasserunterdrückungstechnik (hier: Ethanol)

Speziell im Bereich der Umweltanalytik und der Medizin liegen oftmals wässrige Proben vor, in denen ein Analyt mit geringem Gehalt zu analysieren ist. Es zeigte sich, dass aufgrund des intensiven und breiten Wassersignals im NMR-Spektrum eine quantitative Auswertung mit der einfachen ¹H-SP-NMR-Technik nicht mit einer geringen Messunsicherheit machbar ist. Generell stehen hierfür eine Vielzahl an Wasserunterdrückungstechniken zur Verfügung, deren quantitativer Einsatz jedoch kaum in der Literatur beschrieben wird, schon gar nicht mit der hier geforderten metrologischen Qualität. Am Beispiel der Gehaltsbestimmung wässriger Ethanollösungen für die forensische Chemie (relativer Gehalt von ca. 0,1 %) wurde eine Arbeitsvorschrift für die NMR-Presaturation-Technik (selektive Vorsättigung des Wassersignals) entwickelt. Die Darstellung des Einflusses der einzelnen Unsicherheitsbeiträge in die Messunsicherheit des Verfahren in Tabelle 8.3 zeigt, dass auch hier überwiegend die Beiträge der Integration, des Referenzwertes und der Abweichung des Analysenwertes die Gesamtunsicherheit prägen. Die Unsicherheiten der beiden Einwaagen und des Standards zeigen nur einen mittleren und die der Molmassen einen zu vernachlässigen Einfluss.

Rel. Unsicherheit in %

Grad des

Einflusses

0,1 % Ethanol

10 % Ethanol

Integration

0,4

0,4

hoch

Molmasse Analyt

0,004

0,004

gering

Molmasse Standard

0,003

0,003

gering

Einwaage Analyt

0,02

0,1

mittel

Einwaage Standard

0,16

0,04

mittel

Gehalt des Standards

0,15

0,15

mittel

Komb. Standardunsicherheit

0,5

0,5

Abweichung (Analyse - Referenz)

0,3

0,7

hoch

Referenzwert

0,6

1,0

hoch

Messunsicherheit (k=2; p=95%)

1,5

2,6

Tabelle 8.3: Unsicherheitsbeiträge und deren Einfluss auf die Messunsicherheit des Verfahrens zur Gehaltsbestimmung mit der quantitativen ¹H- NMR.

Der Prüfbereich ist aufgrund der untersuchten Ethanolgehalte auf Gehalte im Bereich von 1,0 mg g^-1 bis 150 mg g^-1 festzulegen, und die relative Messunsicherheit dementsprechend auf 1,5 % bis 2,6 %. Die hierbei erhaltenden Erkenntnisse sind grundsätzlich auch auf andere wässrige Systeme übertragbar. Dabei ist zu beachten, dass die auszuwertenden Signale nicht zu nahe am Wassersignal liegen und somit partiell mitgesättigt werden.

An der BAM existiert bereits ein Referenzverfahren zur Präzisionsbestimmung des Ethanolgehaltes in Wasser. Eine Eingliederung in dieses Referenzverfahren wäre vorstellbar. Als Verwendungszweck sind auch hier Validierung von anderen Methoden sowie Teilnahme an Zertifizierungen von Referenzmaterialien realisierbar.

Zusammenfassend wurden bei allen vier hier diskutierten Referenzverfahren die Prüfbereiche, deren Ergebnisgenauigkeit sowie die Einsatzgebiete dargestellt. Somit steht einer Aufnahme dieser vier Referenzverfahren in den BAM-Katalog sowie in den CMC-Katalog des BIPM nichts entgegen.