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2  Material und Methoden

2.1 Untersuchungsmaterial

2.1.1 Patienten

Untersucht wurden in flüssigem Stickstoff gefrorene oder in Paraffin eingebettete Biopsien aus Hautläsionen von insgesamt 79 Patienten der Dermatologischen Klinik der Charité, der Pathologie der Charité und auswärtigen Einsendern. Alle Proben wurden zur Gegenüberstellung von Klinik bzw. Histologie und Molekularbiologie nach folgenden Kriterien in drei Gruppen eingeteilt:

2.1.1.1 Gruppe 1: CBCL-Patienten

In diese Gruppe wurden alle Patienten aufgenommen, bei denen ein CBCL klinisch und histologisch sicher diagnostiziert war. Die Gruppe umfasst 51 CBCL-Patienten darunter 20 Patienten mit FCCL, fünf mit einem MZL/IC, zwei mit einem CBCL der unt. Extr. und 24 Patienten mit unklassifizierten CBCL.

Von einigen Patienten standen mehrere Proben zur Untersuchung zur Verfügung, so dass insgesamt 63 Proben (27 FCCL, 6 MZL/IC, 3 CBCL der unt. Extr.. , 27 unklassif. CBCL) analysiert wurden.

2.1.1.2 Gruppe 2: Kontrollen

In Gruppe 2 wurden 22 Patienten eingeordnet, bei denen histologisch und klinisch ein CBCL sicher ausgeschlossen war und denen eine Hautprobe aufgrund einer anderen Diagnose entnommen wurde.

Gruppe 2 enthielt auch CLH, z.B. Pseudolymphome oder Insektenstichreaktionen d.h. Krankheitsbilder, bei denen inkonstant monoklonale Infiltrate beschrieben wurden (Santucci et al. 1991, Rijlaarsdam et al. 1992, Baldassano et al. 1999, Kempf et al. 1999, Bouloc et al. 1999, Hughes et al. 2001).

Die klinische Diagnose wurde in der Sprechstunde für kutane Lymphome der Charité gestellt. Die histologischen Untersuchungen erfolgten durch Frau Oberärztin Dr. Audring, Fachärztin für Pathologie und Laborleiterin des histologischen Labors der Hautklinik der Charité.

2.1.1.3 Gruppe 3: Nicht primär kutane Lymphome

In Gruppe 3 wurden Patienten eingeordnet, die an einem systemischen Lymphom erkrankt waren. (6 Patienten: 4 Proben unterschiedlicher Lokalisation aus der Pathologie der Charité, 1 Hautprobe, PBMC (siehe Abschnitt 2.2.1) einer MF - Patientin aus der Dermatologie der Charité).


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2.1.2  Geräte

2.1.3 Chemikalien, Reagenzien, Pufferlösungen

-PBS:

1,7mM NaCl; 0,064mM KCl; 0,375% Tris-Base; 0,002% Phenolrot; pH 7,4

-Ficoll-Pâque plus:

Amersham Pharmacia Biotech Inc

-MOPS-Puffer:

0,2 M MOPS (pH 7,0); 50mM Natriumacetat; 5mM EDTA, pH 8,0

-TBE:

89mM Tris-Base; 89mM Borsäure; 2mM EDTA; pH 8,0

-Extraktionspuffer:

50mM KCl; 10mM Tris/HCl; 0,45% nonidet-P40; 0,45% Tween20; pH 8,3

-Ladepuffer (10x):

0,25% Bromphenolblau; 0,25% Xylencyanol; 15% Ficoll

-PCR-Kits:

(jeweils mit 10x PCR-Buffer und MgCl2)

-AmpliTaq Gold:

Part No.: 4311814, Applied Biosystems

-Ampli Taq:

Part No.: N804-0153, Applied Biosystems

-dNTP-Set:

Amersham Pharmacia Biotech Inc

-Agarose:

Life Technologies

-2% Agarose:

2% Agarose in 1x TBE-Puffer; 0,5µg/µl Ethidiumbromid

-Größenstandard:

100bp DNA Ladder, Invitrogen life technologies

-Polyacrylamidgel:

 

-für die TGGE:

8% Polyacrylamid in 1x MOPS-Puffer; 8M Harnstoff; 0,05% Glycerin; 0,06% Ammoniumpersulfat; 0,06% TEMED

-Genescan:

 

-Größenstandard:

Genescan 500 TM ROX, PE Applied Biosystems

-Formamid:

Merck

-Polymer:

Performance Optimized Polymer 6 (POP6), Applied Biosystems

-Pufferlösung:

Buffer 10x, Applied Biosystems


[Seite 21↓]

2.2  Methoden

2.2.1 DNA-Isolation

Von in Paraffin konserviertem Gewebe (Hautbioptat) wurden 10 Schnitte mit 10 µm Dicke angefertigt. Durch zweimalige Extraktion in je 1 ml Xylol, gefolgt von je 1 ml Äthanol (96 %) wurde deparaffinisiert. Nach der Trocknung im Vakuum erfolgte der DNA-Aufschluß (s.u.).

Zur Gewinnung von PBMC, d.h. mononukleären Zellen aus peripheren Blut für die Funktionskontrollen wurden aus 20 ml heparinisiertem Blut Zellen mittels Zentrifugation über einen Ficoll-Gradienten (20 min bei 2400 U/min) gewonnen. Nach der Reinigung der abgetrennten Zellen durch zweimalige Zentrifugation (10 min, 1100 U/min) in PBS wurden die Zellen der DNA-Präparation zugeführt.

Die PBMC, deparaffinisiertes Gewebe oder zerkleinertes, gefrorenes Gewebe (Kryoproben) wurden nach Aufnahme in den Extraktionspuffer unter Zusatz von 40 µg Proteinase K 16 Stunden bei 55 °C inkubiert. Anschließend erfolgte die Inaktivierung des Enzyms für 15 min bei 95 °C. Fünf  µl des Ansatzes wurden in der PCR eingesetzt.

2.2.2 PCR-Grundlagen

2.2.2.1 Verschiedene Reaktionsgemische (RG)

  1. Die Reaktionsgemische (50 µl) enthielten 10fach-PCR-Puffer; 4 mM MgCl2; 200 µM je dNTP; 0,667 µM je Primer; 2,25 U Taq Polymerase und 5µl DNA.
  2. Wie 1. nur mit Ampli Taq Gold-Polymerase anstelle der Ampli Taq-Polymerase.
  3. Reaktionsgemisch für die geschachtelten PCR-Systeme: Wie 1. nur mit Ampli Taq Gold-Polymerase anstelle von Ampli Taq-Polymerase. In der 1. Runde wurden 5µl DNA zugesetzt, in der 2. Runde 1µl Amplifikat aus der 1. Runde.

Die Ampli Taq Gold-Polymerase ist eine sogenannte „Hot start Polymerase“, die erst bei 95 °C aktiviert wird. Somit wird die Elongation von eventuell vorhandenen Primerdimeren bzw. Haarnadeln vor dem Start der PCR verhindert.

Für die Fragmentanalyse wurden mit 5-Carboxy-Fluoreszin markierte Primer (JH-FAM) eingesetzt.

2.2.2.2 PCR-Programme

Es handelt sich bei allen Programmen um eine Standard-PCR mit den drei Schritten:

1. Denaturierung, 2. Anlagerung, 3. Extension.

Die Zeitdauer und die benötigten Temperaturen der einzelnen Schritte sind in der Tab. 3 wiedergegeben.


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Tab. 3: Verwendete PCR-Programme (PCR-Prog.):

   

1 Zyklus besteht aus:

 

PCR-Programm:

erste Denaturierung

Zyklenzahl:

Denaturierung

Anlagerung

Extension

abschließende Extension

1

4 min 95°C

30

1 min 95°C

1min 57°C

1 min 72°C

5 min 72°C

2

10 min 95°C

42

1 min 95°C

2 min 68°C

1 min 72°C

7 min 72°C

3

9 min 94°C

5

10

30

10 sec 94°C

10 sec 94°C

15 sec 94°C

1 min 53°C

30 sec 55°C

30 sec 57°C

1 min 72°C

30 sec 72°C

30 sec 72°C

7 min 72°C

4

9 min 95°C

30

1 min 95°C

1 min 55°C

1 min 72°C

4 min 72°C

5

9 min 95°C

30

1 min 95°C

1 min 52°C

1 min 72°C

4 min 72°C

6

10 min 95°C

40

1 min 94°C

1,5 min 56°C

1 min 72°C

7 min 72°C

7

7 min 95°C

33

1 min 95°C

1 min 66°C

1,5 min 72°C

5 min 72°C

8

5 min 94°C

4

4

30

15 sec 94°C

15 sec 94°C

15 sec 94°C

1 min 64°C

1 min 62°C

1 min 60°C

1 min 72°C

1 min 72°C

1 min 72°C

7 min 72°C

9

7 min 95°C

30

1 min 95°C

1 min 60°C

1,5 min 72°C

4 min 72°C

2.2.3 FR3-PCR-Systeme

Die erwartete Produktlänge liegt bei 60-130bp.

Eine Übersicht über die bisher beschriebenen FR3- bzw. JH-Primer gibt die Tab. 4:


[Seite 23↓]

Tab. 4: Die in der Literatur am häufigsten verwendeten FR3- und JH-Primer

FR 3

Autor

Sequenz

Codons

VH

MC Carthy et al. 1990

       

CTG

TCG

AGA

CGG

CCG

TGT

ATT

ACT

G

  

87-95

FR3A

Hayashi et al. 1999

       

CTG

TCG

ACA

CGG

C(C/T)(G/C)

TGT

ATT

ACT

GT

  

87-95

FR3

Brisco et al. 1990

         

ACA

CGG

C(C/T)(G/C)

TGT

ATT

ACT

GT

  

89-95

FR3

Lehmann et al. 1995

         

ACA

CGG

CCG

TGT

ATT

ACT

GT

  

89-95

VH26

Fodinger et al. 1999

         

A

CGG

CCC

TGT

ATT

ACT

G

  

89-95

V 670

Fodinger et al. 1999

AAC

AGC

CTG

AGA

GCC

GAG

GA

           

80-86

RE1-FR3

Inghirami et al. 1993

 

*

G

GTG

GAT

CGA

TGA

ATT

CTT

ACA

CGG

C(C/T)(G/C)

TGT

ATT

ACT

GT

  

89-95

RE1

Inghirami et al. 1993

 

*

G

GTG

GAT

CGA

TGA

ATT

CTT

          

FR3.1

Kitamura et al. 1996

        

G

AC(A/T)

C(A/G)G

C(G/C)(G/A)

TGT

A(T/C)T

(T/A)CT

G

  

89-95

FR3.2

Kitamura et al. 1996

         

ACA

CGG

C(C/T)(G/C)

TGT

ATT

ACT

GT

  

89-95

* kursiv gedruckter Teil entspricht einer Restriktionssequenz

                 

JH Primer

Autor

Sequenz

Codons

ungeschachtelt:

                   

JH cons.

MC Carthy et al. 1990

    

AAC

TGC

AGA

GGA

GAC

GGT

GAC

C

      

105-112

JH

Inghirami et al. 1993

    

AAG

CTT

TGA

GGA

GAC

GGT

GAC

CA

      

105-112

JH-RE2

Inghirami et al. 1993

G

GAT

GGT

ACC

AAG

CTT

TGA

GGA

GAC

GGT

GAC

CA

      

105-112

JH

Deane und Norton 1990

     

ACC

TGA

GGA

GAC

GGT

GAC

CAG

GGT

     

106-112

Jhcons

Aubin et al. 1994

     

ACC

TGA

GGA

GAC

GGT

GAC

C(A/G)(G/T)

(G/T)GT

    

106-112

JH 1,2,4,5

Aubin et al. 1994

entspricht JH-Primer von Deane und Norton 1991

          

106-112

JH 3

Aubin et al. 1994

    

T

ACC

TGA

AGA

GAC

GGT

GAC

CAT

TGT

     

105-112

JH 6

Aubin et al. 1994

     

ACC

TGA

GGA

GAC

GGT

GAC

CGT

GGT

     

106-112

JH

Galimberti et al. 1999

     

ACC

TGA

GGA

GAC

GGT

GAC

CA

      

106-112

JH

Bouloc et al. 1999

     

ACC

TGA

GGA

GAC

GGT

GAC

C

      

106-112

geschachtelt:

                   

LJH

Brisco et al. 1990

      

TGA

GGA

GAC

GGT

GAC

C

      

107-112

VLJH

          

GT

GAC

CAG

GGT

NCC

TTG

GCC

CCA

G

101-109

LJH

Trainor et al. 1991

     

ACC

TGA

GGA

GAC

GGT

GAC

C

      

106-112

VLJH

          

GT

GAC

CAG

GGT

NCC

TTG

GCC

CCA

G

101-109

BJ-outer

Kitamura et al. 1996

    

CTT

ACC

TGA

GGA

GAC

GGT

GA

       

105-111

BJ-inner

          

GT

GAC

CAG

GGT

NCC

TTG

GCC

CCA

G

101-109

LJH

Hayashi et al. 1999

    

AAC

TGC

AGA

GGA

GAC

GGT

GAC

C

      

105-112

VLJH

(JH 1-5)

Hayashi et al. 1999

       

AA

GCT

TGT

GAC

CAG

GGT

(G/T/C)

    

103-109

VLJH(JH6)

Hayashi et al. 1999

       

AA

GCT

TGT

GAC

CGT

GGT

CCC

TTG

C

  

103-109


[Seite 24↓]

Die in dieser Arbeit eingesetzten PCR-Systeme sind in Tab. 5 aufgelistet:

Tab. 5: Aufstellung der durchgeführten PCR für FR3

PCR mit Konsensusprimern (cons), ungeschachtelt (s)

PCR

FR3-Primer

JH-Primer

Reaktionsgemisch

PCR-Programm

3.1

BRI90

GAL99

1

1

3.2

HAY99

ING93

1

1

3.3

FOD99

GAL99

2

2

3.4*

LEH95

MCC90

1

1

3.1b

BRI90

GAL99

2

3

PCR mit Konsensusprimern, halbgeschachtelt (sn)

PCR

FR3-Primer

LJH/VLJH-Primer

Reaktionsgemisch

PCR-Programm

3.5

BRI90

BRI90

3

4

3.6

HAY99

HAY99

3

5

PCR mit Konsensusprimern, sn

PCR

FR3.1/3.2-Primer

JH-Primer

Reaktionsgemisch

PCR-Programm

3.7

RE1-FR3/RE1 ING93

JH-RE2

3

6

*zur Zeit durchgeführte PCR im Lymphomlabor der Dermatologie

2.2.4 FR1-PCR-Systeme

Die erwartete Produktlänge liegt bei 280-340bp. Eine Übersicht über die FR1-Primer gibt Tab.6:

Tab. 6: Die in der Literatur am häufigsten verwendeten FR1-Primer

Deane und Norton 1991

Codons

FR1.1

 

CCT

CAG

TGA

AGG

TCT

CCT

GCA

AGG

  

16-24

FR1.2

TCC

TGC

GCT

GGT

GAA

AGC

CAC

ACA

8-16

FR1.3

GGT

CCC

TGA

GAC

TCT

CCT

GTG

CA

16-23

FR1.4a

TC

GGA

GAC

CCT

GTC

CCT

CAC

CTG

CA

14-22

FR1.4b

CGC

TGT

CTC

TGG

TAA

CTC

CAT

CAG

 

22-30

FR1.5

GAA

AAA

GCC

CGG

GGA

GTC

TCT

GAA

11-19

FR1.6

CCT

GTG

CCA

TCT

CCG

GGG

ACA

GTG

20-28

Küppers et al. 1994

FR1.1

  

CCT

CAG

TGA

AGG

T(C/T)T

CCT

GCA

AGG

 

 

16-25

FR1.2

G

TCC

TGC

GCT

GGT

GAA

ACC

CAC

ACA

 

7-16

FR1.3

GG

GGT

CCC

TGA

GAC

TCT

CCT

GTG

CAG

15-23

FR1.4

   

GAC

CCT

GTC

CCT

CAC

CTG

C(G/A)C

TGT

C

16-24

FR1.5

 

AA

AAA

GCC

CGG

GGA

GTC

TCT

GA(A/G)

GA

 

11-20

FR1.6

entspricht FR1.6 Deane und Norton 1991

Aubin et al. 1995

FR1.1

entspricht FR1.1 Deane und Norton 1991

FR1.2

entspricht FR1.2 Deane und Norton 1991

FR1.3

 

C

TCT

CCT

GTG

CAG

CCT

CTG

G

19-26

FR1.4a

T

GTC

CCT

CAC

CTG

C(G/A)(T/C)

TG

 

17-23

FR1.5

entspricht FR1.5 Deane und Norton 1991

FR1.6

CT

CAC

TCA

CCT

GTG

CCA

TC

 

17-23

Marks et al. 1991

HVH1

 

CAG

GTG

CAG

CTG

GTG

CAG

TCT

G

 

ca.

4-11

HVH2

CAG

GTC

AAC

TTA

AGG

GAG

TCT

G

HVH3

GAG

GTG

CAG

CTG

GTG

GAG

TCT

G

HVH4

CAG

GTG

CAG

CTG

CAG

GAG

TCG

G

HVH5

GAG

GTG

CAG

CTG

CTG

CAG

TCT

G

HVH6

CAG

GTA

CAG

CTG

CAG

CAG

TCA

G

Aubin et al. 1995

FR1,cons

 

AG

GTG

CAG

CTG

(G/C) (A/T)G

(G/C) AG

TC (G/A/T)

GG

 

ca.

4-11

kursiv: Unterschiede in der Sequenz

Die von uns angewandten PCR-Systeme für FR1 sind in Tab. 7 dargestellt:


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Tab. 7: Aufstellung der durchgeführten PCR für FR1

PCR mit fam- Primern, multiplex-alle fam Primer in einem Ansatz, sn

PCR

FR1-Primer

JH-Primer

Reaktionsgemisch

PCR-Programm

1.1

KÜP91

GAL99

2

1

PCR mit fam- Primern, multiplex, n

PCR

FR1-Primer 1./2.Runde

LJH/VLJH-Primer

Reaktionsgemisch

PCR-Programm

1.2

AUB95/KÜP94

BRI91

3

4

2.2.5 Leader-PCR-Systeme

Die erwartete Produktlänge liegt bei 450-550bp.

Eine Übersicht über die bisher beschriebenen Leader(LEA)-Primer gibt die Tab. 8:

Tab. 8: Die in der Literatur am häufigsten verwendeten LEA-Primer

Campbell et al. 1992

VH1(CAM92)

C

ACA

CCA

TGG

ACT

GGA

CCT

GGA

G

 

VH2(CAM92)

  

ATG

GAC

ATA

CTT

TGT

TCC

AG G

CTC

VH3(CAM92

  

CCA

TGG

AGT

TT G

GGC

TGA

GC T

GG

VH4(CAM92)

 

AC

ATG

AAA

CA Y

CTG

TGG

TTC

TT C

C

VH5(CAM92)

  

ATG

GGG

TCA

ACC

GCC

ATC

CT C

G

VH6(CAM92)

  

ATG

TCT

GTC

TCC

TTC

CTC

AT C

TTC

Inghirami et al. 1993

VH1(ING93)

  

CCA

TGG

ACT

GGA

CCT

GGA

G G

 

VH2(ING93)

  

ATG

GAC

ATA

CTT

TGT

TCC

AG

 

VH3(ING93)

  

CCA

TGG

AGT

TTG

GGC

TGA

GC

 

VH4(ING93)

  

ATG

AAA

CAC

CTG

TGG

TTC

TT

 

VH5(ING93)

  

ATG

GGG

TCA

ACC

GCC

ATC

CT

 

VH6(ING93)

  

ATG

TCT

GTC

TCC

TTC

CTC

AT

 

kursiv: Unterschiede in der Sequenz

Die von uns angewandten PCR-Systeme für die Leader-Region sind in Tab. 9 dargestellt:

Tab. 9: Aufstellung der durchgeführten PCR für die LEA-Region

PCR mit fam Primern, pro Ansatz nur einer der 6 fam Primer, s

PCR

LEA-Primer

JH-Primer

Reaktionsgemisch

PCR-Programm

LEA.1

CAM92

DEA90

2

7

2.2.6 FR2-PCR-Systeme

Die erwartete Produktlänge liegt bei 220-280bp.

Für den FR2-Lokus sind in der Literatur zwei verschiedene Primer beschrieben:

Tab. 10: Die in der Literatur am häufigsten verwendeten FR2-Primer

FR 2

Autor

Sequenz

Codon

FR2.1

Ramasamy et al. 1992

TGG

(A/G)TC

CG(C/A)

CAG

(G/C)C(T/C)

(T/C)CN

GG

 

36-42

FR2.2

Ramasamy et al. 1992

 

GTC

CTG

CAG

GC(C/T)

(C/T)CC

GG(A/G)

AA(A/G)

(A/G)GT

CTG

GAG

TGG

37-47

FR2.1

Kitamura et al. 1996

TGG

(A/G)TC

CG(C/A)

CAG

(G/C)C(T/C)

(T/C)C

 

36-41

FR2.2

Kitamura et al. 1996

 

GTC

CTG

CAG

GC(C/T)

(C/T)CC

GG(A/G)

AA(A/G)

(A/G)GT

CTG

GAG

 

37-46

Die von uns angewandten PCR-Systeme für die FR2-Region sind in Tab. 11 dargestellt:


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Tab. 11: Aufstellung der durchgeführten PCR für FR2

PCR mit cons-Primern, s

PCR

FR2-Primer

JH-Primer

Reaktionsgemisch

PCR-Programm

2.1

RAM92 (FR2.1)

GAL99

1

1

PCR mit cons-Primern, sn

PCR

FR2-Primer

LJH/VLJH-Primer

Reaktionsgemisch

PCR-Programm

2.2

RAM92 (FR2.1)

BRI91

3

4

PCR mit cons-Primern, n

PCR

FR2-Primer 1./2. Runde

LJH/VLJH-Primer

Reaktionsgemisch

PCR-Programm

2.3

KIT96 (FR2.1/2.2)

KIT96

3

9

2.2.7 Die IgL-PCR

Es wurde nur für die κ-Kette eine PCR durchgeführt.

Die erwartete Produktlänge liegt bei 120-150bp.

Folgende Primer kamen zum Einsatz:

FR3κ (Gong et al. 1999):5‘TTC AG(C/T) GGC AGC GG(A/G) TCT GGG 3‘Codons 62-68

JHκ(Gong et al. 1999):5‘ CA(G/C) CTT (G/T)GT CCC (C/T)TG GCC GAA 3‘Codons 98-104

Reaktionsgemisch: 1, PCR-Programm: 8

2.2.8 Agarosegelelektrophorese (AGE)

Die Überprüfung der PCR-Amplifikation erfolgte durch Elektrophorese in 2%igem Agarosegel mit Zusatz von Ethidiumbromid. Dann wurden jeweils 8 µl des PCR-Produkts mit 2 µl Ladepuffer aufgetragen, in 1x TBE-Puffer bei 60 V eine Stunde aufgetrennt und anschließend bei UV-Durchleuchtung fotografiert.

In der Agarose darstellbare PCR-Produkte wurden im Anschluss sowohl mit Genescan-Analyse als auch in der TGGE analysiert.

2.2.9 Temperaturgradientengelelektrophorese (TGGE)

Es wurden 5 µl PCR-Produkt mit 0,5 µl Ladepuffer auf die TGGE aufgetragen. Mit dem TGGE-System „Maxi“ (Biometra, Göttingen) erfolgte die Separation entsprechend dem Protokoll der Hersteller (Quiagen 1994) und mit einem Gradienten von 20 °C bis 55 °C bei 300 –350 V, 2:40 h Laufzeit und anschließender Silberfärbung.

2.2.10 Kapillarelektrophorese (Genescan)

12 µl deionisiertes Formamid, 0,8µl Größenstandard (Genescan 500TM ROX) und 1 µl fluoreszenzmarkiertes PCR-Produkt wurden 2 min bei 95°C denaturiert und darauf in Eis abgekühlt, um einzelsträngige DNA zu erhalten.

Anschließend wurden die Proben im automatischen DNA-Kapillarsequenzergerät ABI Prism 310 separiert und analysiert: Nach einer Injektionszeit von 5 Sekunden erfolgte die Elektrophorese bei 60°C und 15kV in einer 47cm langen, mit POP6-Gel gefüllten Kapillare. Die Separationszeit [Seite 27↓]betrug 25 min für die FR3-PCR und 36 min für alle anderen PCR.

Die Auswertung erfolgte mit der GeneScan 372 Software (PE Applied Biosystems), wie im Handbuch beschrieben.

2.2.11 Primeranalyse im Oligo

2.2.11.1 Anforderungen an geeignete PCR-Primer

Ein optimaler PCR-Primer soll effizient an der Ziel-DNA binden, dabei aber keine unspezifischen Bindungen mit der DNA oder anderen Primern eingehen. Ausserdem müssen die Bindungseigenschaften der Primer möglichst ähnlich sein, um einen asymmetrischen PCR-Verlauf zu vermeiden. Asymmetrisch bedeutet, dass die Bedingungen für eine suffiziente Bindung an die DNA für den einen Primer gut sind, für den anderen aber schlecht und somit die Bildung des Amplifkates nicht in ausreichender Menge erfolgen kann.

2.2.11.2 Unspezifische Doppelstrang-Bildung mit der Ziel-DNA

Da das menschliche Genom ca. 3,5 Milliarden Basenpaare enthält (Bachmann 1986), ist die Entwicklung eines Primers, der nur eine effiziente Bindungsstelle an der Ziel-DNA besitzt, nahezu unmöglich. Es wird immer Sequenzabschnitte im Genom geben, die der Zielsequenz für die Primerbindung so ähneln, dass der Primer an der falschen Stelle bindet. Ist das 3’Ende an der Doppelstrangbildung beteiligt, kommt es zur Verlängerung des Primers an der unspezifischen Sequenz. Kommt es zur Anlagerung im 5’Bereich, ohne Bindung am 3’Ende, unterliegt der Primer keinen Veränderungen.

2.2.11.3 Effiziente Doppelstrangbildung mit der Ziel-DNA

Ein Maß für die Stabilität des Doppelstrangs zwischen Primer und DNA-Fragment ist die Änderung der freien Enthalpie (dG). Je größer der Betrag der Abnahme der freien Enthalpie ist, desto höher ist die Stabilität der entstehenden Verbindung (Rychlik und Rhoads 1989). Da bei der Ausbildung der drei Wasserstoffbrücken zwischen Guanin und Cytosin mehr Energie frei wird als bei der Bildung der zwei Wasserstoffbrücken zwischen Adenin und Thymin, ist Stabilität des DNA-Doppelstranges anhand des Prozentsatzes vorhandenen Guanins und Cytosins zu bestimmen (Breslauer et al. 1986). Das Oligo-Programm berechnet daraus die interne Stabilität des Primers. Von besonderer Bedeutung ist die Sequenz am 3’ Ende des Primers. Eine Verlängerung des Oligonukleotids durch die Taq-Polymerase erfolgt immer dann, wenn dieser Teil an ein einzelsträngiges DNA-Molekül gebunden ist.

Optimale Primer sollen eine hohe Stabilität im 5‘ Bereich haben (großes dG) und eine geringe Stabilität im 3‘ Bereich (kleines dG). Wäre dG am 3‘ Ende hoch, so könnte es unabhängig von den Bindungen am 5‘ Ende zur Extension kommen. Damit sinkt die Spezifität des Primers, da zur Extension nicht die vollständige Anlagerung erforderlich ist. Das hohe dG im 5‘ Bereich ist [Seite 28↓]nötig, damit der Primer dennoch effizient binden kann. Eine weitere Möglichkeit, die Stabilität der Primer-DNA-Doppelstränge zu ermitteln, ist die Berechnung der Schmelztemperaturen der jeweiligen Oligonukleotide. Eine große Differenz erschwert eine effiziente und spezifische PCR. Wird die Anlagerungstemperatur in den Bereich des Primers mit der höheren Schmelztemperatur gelegt, kann der Primer mit der niedrigen Schmelztemperatur nicht in ausreichendem Maße binden, die PCR verläuft ineffizient. Im umgekehrten Falle kommt es neben der effizienten Anlagerung des Primers B zu vermehrten unspezifischen Doppelstrangbildungen des Primers A mit dem höheren Schmelzpunkt.

2.2.11.4 Doppelstrang-Bildung zwischen Primern

Auch die unerwünschten Bindungen zwischen Primern lassen sich in zwei Gruppen einteilen:

1. Mindestens ein 3’Ende eines Primers ist in die Doppelstrangbildung einbezogen, es kommt zur Verlängerung dieses Primers (bei Beteiligung beider 3‘ Enden kommt es zur exponentiellen Vermehrung)

2. Es kommt außerhalb der 3’Enden zur Ausbildung eines Doppelstranges. Nach erneuter Denaturierung stehen die Primer wieder der spezifischen Reaktion zur Verfügung

Einen Sonderfall stellt die Doppelstrangbildung innerhalb eines Primers dar. Auch bei der Ausbildung dieser sogenannten Haarnadelstrukturen liegt der Beteiligung des 3’Endes eine besondere Bedeutung bei, da sie zur Primerverlängerung führt. Haarnadelstrukturen ohne Beteiligung des 3’Endes beeinflussen die PCR-Ausbeute dagegen kaum.

Die für die Analysen der einzelnen Primer gewählten Parameter wurden in Anlehnung an die in OLIGO 5.0 empfohlenen Parameter für eine hochstringente Primersuche gewählt:

3’Dimere:

statthaft, wenn dG > -3,5kcal/mol

weitere Dimere:

statthaft, wenn dG > -7,5kcal/mol

Haarnadelstruktur:

statthaft, wenn dG > 0kcal/mol

interne Stabilität:

maximaler Wert für dG im 3’Bereich = -7,7 kcal/mol

Wenn mehr als zwei Primer an einer PCR beteiligt sind, wurden die Primer im Multiplex-Programm des Oligo auf Doppelstrangbildungen untereinander untersucht. Dort hatten die Primer die Anforderungen „high“ bzw. „moderate“ zu erfüllen (s. Tab. 12):


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Tab. 12: Anforderungen an die Primer im Multiplex-Programm des Oligo

Anforderung

moderate

high

-Minimale Basenlänge der Primer:

21 bp

21 bp

-Maximales dG der 3' Dimere:

-3.7 kcal/mol

-3,5 kcal/mol

-Anzahl der bp, die am Dimer beteiligt sind:

max. 6bp

max. 4bp

-3' Ende, das auf 3’ Dimere untersucht wurde:

7bp

12bp

-Maximales dG für Haarnadeln:

-0.8 kcal/mol

0 kcal/mol

-3' terminale Stabilität im Bereich von:

-9.8 - -5.5 kcal/mol

-9.8 bis -5.5 kcal/mol

M – Multiplexed

-bedeutet, dass der Primer mit allen andern Primern kompatibel ist

 

(unter den angegebenen Bedingungen)

NC - nicht

-bedeutet, dass der Primer mit einem oder mehreren der anderen Primer nicht kompatibel ist

kompatibel

(unter den angegebenen Bedingungen)

D – Dimer

bedeutet, dass der Primer nicht mit den anderen getestet werden kann, da er in sich schon ein

 

3'Dimer mit einem dG bildet, das die max. Grenze übersteigt

Bei einigen Multiplex-Analysen musste der Betrag des maximalen dG der 3‘-Dimere noch erhöht werden, um alle Primer in die Multiplex Analyse einzuschließen. Die Änderungen werden bei der jeweiligen Abbildung angegeben.

Des weiteren wurde die Schmelztemperatur der einzelnen Oligonukleotide berechnet und verglichen. Grundlage hierfür waren die Verfahren nach Breslauer et al(1986) ( 2(A+T)°+4(G+C)°-Methode) und Wetmur (Nearest-Neighbor-Method) (Rychlik et al. 2000). Als maximale Differenz der Schmelztemperaturen haben wir 10°C festgelegt. Bei Unterschieden der mit den beiden Verfahren berechneten Differenzen wurde für die Bewertung das Ergebnis nach der Nearest-Neighbor-Method zugrunde gelegt.


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12.05.2004