[Seite 30↓]

3  Ergebnisse

3.1 Definition von Klonalität

Polyklonale Amplifikate von Patienten mit entzündlichen Hautinfiltraten oder peripheren Blut von Gesunden bilden ein breites, unscharfes Band (sog. „Schmier“) in der TGGE.

Bei der Fragmentanalyse führen polyklonale PCR-Produkte zu einem Gauß-Kurven ähnlichen Muster. Benachbarte Peaks entsprechen unterschiedlichen Fragmenten, die sich, da das IgH-Gen in Frame rearrangiert, in ihrer Länge durch jeweils drei Basen unterscheiden.

Amplifikate der monoklonalen Zellreihe JY bilden auf der TGGE eine scharfe Bande, und in der Fragmentanalyse einen dominanten Peak. (Abb. 3)

Abb. 3 a und b: Darstellung polyklonaler bzw. monoklonaler Amplifikate

In der TGGE wurde eine Probe als klonal eingeschätzt, wenn sie eine reproduzierbare scharfe Bande hinterließ.

Im Genescan galt eine Probe als klonal, wenn sie in zwei voneinander unabhängigen PCR einen einzelnen, deutlich von einem möglichen polyklonalen Hintergrund abgrenzbaren Peak gleicher Größe zeigte. Um den Peak als sicher monoklonal einstufen zu können, wurde folgende Formeln zur Berechnung verwendet:


[Seite 31↓]

Berechnung der „Ratio“:

(Lukowsky et al. 2002)

Berechnung des „Peak under the curve“:

(Lukowsky et al. 2002)

Die „Ratio“ setzt den dominierenden Peak ins Verhältnis zu seinen beiden benachbarten Peaks und muss, nach unseren Erfahrungen, >2 sein. Peaks mit einer Ratio von 1,8-2,0 wurden als unsicher monoklonal eingestuft. Die Berechnung des „Peaks under the curve“ setzt den abgrenzbaren Peak ins Verhältnis zur durchschnittlichen Peakhöhe des gesamten Profils. Das Ergebnis muss >1 betragen.

PCR-Amplifikate einiger CBCL-Patienten, bei denen beide IgH-Allele rearrangeriert im B-Zell-Klon vorlagen, zeigten sich zwei scharfe Banden bzw. zwei klonale Peaks in der TGGE bzw. im Genescan. Sie wurden ebenfalls zu den klonalen Fällen gezählt.

Wenn sich in der Fragmentanalyse ein Muster zeigte, das weder als monoklonal, noch als polyklonal einzuordnen war, mit drei bis sechs dominierenden Peaks, so wurden diese Fälle als oligoklonal eingestuft. Meistens waren diese Peaks bei der Wiederholung der PCR jedoch nicht reproduzierbar. Das heißt die abgrenzbaren Peaks hatten nun eine andere Basenpaarlänge, die Ergebnisse sind „pseudo-oligoklonal“.

Bei einigen CBCL-Patienten zeigte der klonale Peak bei der Wiederholung der Analyse unterschiedliche Fragmentlängen. Bei anderen war die Probe in der ersten Analyse oligoklonal und in der zweiten Analyse monoklonal oder umgekehrt. Diese Ergebnisse wurden als pseudoklonal (d.h. als falsch klonal) eingestuft.

Nach Auftrennung mittels AGE ist eine Unterscheidung zwischen monoklonaler Bande und polyklonaler Bande meist nicht möglich (Aubin et al. 1995). Sie ist aber zur Überprüfung einer erfolgreichen Amplifikation sinnvoll.

3.2 Ergebnisse der Suche geeigneter Primersysteme

3.2.1 Die FR3 - PCR in der Übersicht

Für den FR3-Bereich entwickelte Brisco et al. bereits 1990 als erste einen cons-Primer und führten eine halb-geschachtelte PCR durch. Sowohl die FR3-Primer als auch die JH-, bzw. LJH/VLJH-Primer wurden im Laufe der Zeit mehrmals variiert (siehe Tab. 4). Ob sn- oder s- PCR, die Sensitivität liegt bei beiden Methoden bei den NHL um 40-80% (Diss et al. 1993, [Seite 32↓] Albrecht et al. 1993, Height et al. 1996, Signoretti et al. 1999). Die Sensitivität bei der Untersuchung der CBCL ist gering (30-60%) (Ritter et al. 1997, Cerroni et al. 1997, Signoretti et al. 1999).

3.2.1.1 Ergebnisse der Überprüfung der FR3- und JH-Primer im Oligo

Da es Ziel war, für die Routinediagnostik geeignete, einfache und rationelle PCR-Methoden zu finden, wurden zuerst Primersysteme für ungeschachtelte PCR untersucht.

Die Analyse der Primer erfolgte mit dem Programm: OLIGO 5.0 Primer Analysis Software for Windows, National Biosciences, Inc., USA. Die für die einzelnen Analysen notwendigen Parameter wurden in Anlehnung an das OLIGO 5.0 ausgewählt (siehe 2.2.11.4.).

Aufgrund der geringeren Variabilität in der Sequenz der Primer wurden nur die FR3-Primer nach Hayashi et al. (1999), Brisco et al. (1990) und Lehmann et al. (1995) ausgewählt (s.Tab. 4). Der FR3–Primer von Lehmann et al(1995)wird bereits in der Routinediagnostik im Lymphomlabor der Dermatologie der Charité verwendet. Ausserdem wurde der FR3-Primer nach Fodinger et al (1999) VH26 untersucht, da er am VH-Gen eine Bindungsstelle weiter 5‘ als der FR3-Primer nach Hayashi et al. (1999) oder Brisco et al.(1990)besitzt. Von den JH-Primern wurden zunächst die JH-Primer nach MC Carthy et al. (1990), Inghirami et al. (1993) und Galimberti et al. (1999) ausgewählt. Für die geschachtelten PCR wurden die Primer nach Brisco et al. (1990) und Hayashi et al. (1999) untersucht. Die Ergebnisse zeigt Tab. 13:

Tab. 13: Ergebnisse der Primerprüfung mit Oligo für FR3/JH

Primer

Sequenz

Das stabilste 3' Dimer in kcal/mol

Das stabilste Dimer im 5‘Bereich in kcal/mol

Haarnadel

Tm

in °C

Interne

Stabilität, 3'

FR3-Primer

FR3(BRI90)

 

1.*

ACA CGG CCG TGT ATT ACT GT

-3,2

-25,5

0.01 kcal/mol,Tm=25°C

62.6

5.8

2.*

ACA CGG CTG TGT ATT ACT GT

-3,2

-3,2

0.01 kcal/mol,Tm=25°C

57.2

5.8

3.*

ACA CGG CCC TGT ATT ACT GT

-3,2

-9,3

1.10 kcal/mol

61.7

5.8

4.*

ACA CGG CTC TGT ATT ACT GT

-3,2

-3,6

1.10 kcal/mol

56.6

5.8

FR3(HAY99)

 

1.*

CTG TCG AGA CGG CTC TGT ATT ACT G

keine

-6,8

1.30 kcal/mol

69.9

5.7

2.*

CTG TCG AGA CGG CCC TGT ATT ACT G

keine

-9,3

keine

73.7

5.7

3.*

CTG TCG AGA CGG CTG TGT ATT ACT G

keine

-6,8

keine

70.5

5.7

4.*

CTG TCG AGA CGG CCG TGT ATT ACT G

keine

-19,1

keine

74.4

5.8

FR3(LEH95)

ACA CGG CCG TGT ATT ACT GT

-3,2

-25,5

0.01 kcal/mol,Tm=25°C

62.6

5.8

FR3(FOD99)

AAC AGC CTG AGA GCC GAG GA

-3,1

-6,7

-0,6kcal/mol

69

8,5

JH-Primer

JH(ING93)

AAG CTT TGA GGA GAC GGT GAC CA

-1,9

-10,1

keine

72.2

6.7

JH(GAL99)

ACC TGA GGA GAC GGT GAC CA

-1,9

-4,7

-0.20 kcal/mol,Tm=30°C

72.7

6.7

JH(MCC90)

AAC TGC AGA GGA GAC GGT GAC C

-4,4

-10,1

keine

70.1

7.0

LJH(BRI90)

TGA GGA GAC GGT GAC C

-4,4

-4,4

keine

54

6,5

VLJH(BRI90)

GT GAC CAG GGT NCC TTG GCC CCA G

-1,6

-9,8

-2.10 kcal/mol,Tm=68°C

79

6,5

LJH(HAY99)

AAC TGC AGA GGA GAC GGT GAC C

-4,4

-10,1

keine

70

6

VLJH

(HAY99;1-5)

AAG CTT GTG ACC AGG GT(G/T/C) CC(T/C) TGG CCC CAG

-1,6

-10,1

-2.10 kcal/mol,Tm=64°C

88

6,5

VLJH

(HAY99;6)

AAG CTT GTG ACC GTG GTC CCT TGC CCC CAG

-1,6

-10,1

-0.70 kcal/mol,Tm=41°C

89

6,5

*verschiedene Varianten des Primers, die durch den degenerierten Code entstehen, Tm Schmelztemperatur

Positiv zu bewerten ist, dass alle FR3-Primer keine 3‘Dimere über –3,2 kcal/mol und keine [Seite 33↓]relevanten Haarnadeln bilden.

Auffällig ist die Doppelstrangbildung der Primer nach Hayashi et al.(1999)und nach Brisco et al.(1990) im 5‘-Bereich. Bei den JH-Primern liegt der Primer nachMc Carthy et al.(1990)mit -4,4kcal/mol über dem kritischen dG-Wert für 3‘ Dimere von 3,5kcal/mol. Die Haarnadel-Bildung beim JH–Primer Galimberti et al.(1999) ist mit einer Schmelztemperatur von 30° C zu vernachlässigen, da die Annealing-Temperatur während der PCR weitaus höher liegt. Auch bei den JH-Primern kommt es zur relevanten Doppelstrangbildung im 5‘-Bereich, da der Primer aber in der nächsten Runde wieder zur Verfügung steht, ist dies von geringerer Bedeutung.

Die LJH/VLJH–Primer nach Brisco et al.(1990)und Hayashi et al.(1999) liegen bei der Testung ebenfalls häufig über den Normwerten. Besonders die hohe Schmelztemperatur bei den Haarnadeln könnte zu einer geringeren Effizienz der PCR führen.

Die interne Stabilität am 3‘ Ende war mit Ausnahme des Primers nach Fodinger et al.(1999) bei allen Primern unter 7,7 kcal/mol.

Um zu prüfen, ob die Primer untereinander Dimere bilden und welcher JH–Primer am besten geeignet ist, wurden die Primer mit Hilfe der Multiplex-Funktion des Oligo getestet. Die Anforderungen an die getesteten Primer und die Bedeutung der Symbole sind unter Punkt 2.2.11.4 bereits erläutert worden.

Die Ergebnisse der Multiplex-Testung des FR3-Primer Brisco et al. mit allen untersuchten JH-Primern zeigt die Tabelle 14, die des FR3-Primer Hayashi et al. Tab. 15.

Tab. 14: Ergebnisse der Multiplex Testung FR3 (Brisco et al. 1990)-PCR3.1

Primer

Moderate

TM in °C

FR3–BRI90 (1)

-3.2 M

57.2

FR3–BRI90 (2)

-3.2 M

56.6

FR3–BRI90 (3)

-3.2 M

61.7

FR3–BRI90 (4)

-3.2 M

62.6

JH–GAL99

-1.9 M

66.8

JH–ING93

-1.9 M

72.2

JH–MCC90

-4.4 D

70.1

(1)-(4)=verschiedene Varianten des Primers, die sich aus der degenerierten Sequenz ergeben

Aufgrund der stärkeren Dimerbildung ist der JH-Primer Mc Carthy et al.(1990) als 3‘-Primer nicht geeignet. Da die Differenzen der Schmelztemperaturen zwischen den FR3-Primern nach Brisco et al. und dem JH-Primer Galimberti et al.(1999) am geringsten war, wurde diese Primerkombination für die FR3-PCR 3.1 ausgewählt.


[Seite 34↓]

Tab. 15: Ergebnisse der Multiplex-Testung des FR3-Primers (Hayashi et al. 1999)-PCR3.2

Primer

High

Tm in °C

FR3 – HAY99 (1)

- M

70.5

FR3 – HAY99 (2)

- M

69.9

FR3 – HAY99 (3)

- M

74.4

FR3 – HAY99 (4)

- M

73.7

JH – ING93

-1.9 M

72.2

JH – GAL99

-1.9 M

66.8

JH – MCC90

-4.4 D

70.1

(1)-(4)=verschiedene Varianten des Primers, die sich aus der degenerierten Sequenz ergeben.

Die Primer dieser Multiplex-Testung erfüllen sogar die Anforderungsstufe „high“. Aufgrund der Schmelztemperaturdifferenz wurde hier der JH-Primer nach Inghirami et al.(1993) ausgewählt.

Die Analyse des Primersystems für die FR3-PCR von Fodinger et al. (1999)erfolgte entsprechend der Prüfung einzelner Primer im Oligo, da hier nur zwei Primer auf Dimerbildung untereinander getestet wurden (Tab. 16).

Tab. 16: Ergebnis der Testung von FR3(FOD99) und JH(GAL99) (PCR3.3)

Primer

Das stabilste 3' Dimer

Das stabilste Dimer im 5‘Bereich

FR3 – Fodinger et al (FOD99)

-3,1 kcal/mol

-6,7 kcal/mol

Ergebnis der Testung beider Primer untereinander:

-1,9 kcal / mol

-6,7 kcal / mol

JH – Galimberti et al (GAL99)

-1,9 kcal/mol

-4,7 kcal/mol

Das getestete System entspricht den Anforderungen für hochstringente Primer.

Als Vergleich für die Effizienz und Qualität (evtl. Nebenbanden) sollte die FR3-PCR nach Lehmann et al. (1995)dienen, die bereits seit fünf Jahren in der Routine-Diagnostik angewandt wurde. Auch diese Primer wurden, entsprechend der Prüfung einzelner Primer, im Oligo getestet:

Tab. 17: Ergebnis der Testung von FR3(LEH95) und JH(MCC90) (PCR 3.4)

Primer

Das stabilste 3'Dimer

Das stabilste Dimer im 5‘Bereich

FR3 – Lehmann (LEH95)

-3,2 kcal/mol

-25,5 kcal/mol

Ergebnis der Testung beider Primer untereinander:

-3,5 kcal / mol

-8,0 kcal / mol

JH - Mc Carthy (MCC90)

-4,4 kcal/mol

-10,1 kcal/mol

Diese Primer genügen aufgrund des 3’ Dimers des JH-Primers nach Mc Carthy et al. (1990), der 5’ Dimere des FR3-Primers Lehmann et al.(1995) bzw. des JH-Primers nach Mc Carthy et al. und des 5’Dimeres zwischen beiden Primern den Anforderungen an eine hochstringente Primersuche nicht.

3.2.1.2 PCR-Ergebnisse der getesteten FR3-Systeme

Alle mit Hilfe der Testung im Oligo ausgewählten Primersysteme wurden an DNA aus polyklonalen Hautbiopsien (in Paraffin eingebettet) und PBMC getestet und in der Agarosegelelektrophorese und im Genescan analysiert.

Ergebnisse der Konsensusprimer-PCR (s)

Die Tabelle zeigt die Ergebnisse der AGE und des Genescan:


[Seite 35↓]

Tab. 18: Ergebnisse der PCR 3.1.-3.4.

PCR

3.1

3.2

3.3

3.4

Agarosebild:

unspezifische Banden:

von 40-60bp, bei ca. 120bp, 130bp, 210bp, 350bp

von 40-60bp

nein

von 40-50bp, bei ca. 210bp

polyklonaler Schmier:

nein

nein

ja, im Bereich von 100-150bp

ja, im Bereich von 80-120bp

Genescan:

unspezifische Banden:

ja, konstant bei 30bp, 31bp, 32bp,85bp

ja, konstant bei 36bp, 40bp

ja, von 40-55bp

ja, von 30-55bp, konstant bei 20bp, 33bp,44bp,94bp,217bp

polyklonales Profil:

nein

einige Peaks erkennbar, aber kein polyklonales Profil

ja

ja

geeignet:

nein

nein

ja

ja

Abb. 4: aus (Rychlik 2000)

Obwohl die Primer der PCR 3.1 und 3.2 unter den Bedingungen „moderate“ bzw. „high“ keine 3‘ Dimere über -3,5 kcal/mol zeigten, konnte kein spezifisches Produkt amplifiziert werden.

Das in Abbildung 4 dargestellte Diagramm zeigt die theoretische Abhängigkeit der Effizienz der PCR von der Bildung von 3‘ Dimere. Die Kurve ist nur als ungefähre Richtlinie zu betrachten, da die Effizienz der PCR auch von der Anlagerungstemperatur, der Spezifität der Primer und anderen Parametern abhängt. Ab -3,5 kcal/mol beträgt die Ausbeute nur noch etwa 75%.

Die besondere Bedeutung der 3‘ Dimmer-Formation erklärt sich daraus, dass diese nicht besonders stabil sein müssen. Nur wenig Zeit wird von der Polymerase benötigt, um das 3‘ Ende des Dimers zu erkennen und die Polymerisation zu starten. Insofern werden die Dimere sogar bevorzugt verlängert. Aus dieser Situation ergibt sich dann eine Kettenreaktion. Die exlongierten Primer könne wiederum weitere 3‘ Dimere untereinander oder mit noch unverlängerten Primern bilden, womöglich mit weitaus höherem dG.

Vielleicht wird dieser Mechanismus noch dadurch verstärkt, dass in der PCR 3.1 und 3.2 jeweils fünf verschiedene Primer zum Einsatz kommen. Die verlängerten Primer stehen für die PCR [Seite 36↓]nicht mehr zur Verfügung. Warum bei der PCR 3.1 gar kein Amplifikat im korrekten Größenbereich entsteht, bleibt unklar.

Die PCR 3.3 und 3.4 zeigten in Elektrophorese und Genescan ein polyklonales Profil. Obwohl der JH-Primer Mc Carthy et al. (1990) ein 3‘ Dimer mit einem dG von –4,4 kcal/mol und mit dem FR3-Primer Lehmann et al. (1995)ein 3‘ Dimer von -3,5 kcal/mol bildet, entsteht ein polyklonales Amplifikat.

Eine Erklärung hierfür wäre, dass bei dem PCR-System 3.3, im Gegensatz zu PCR 3.1 und 3.2, hier nur zwei statt fünf verschiedene Primer in einem PCR-Ansatz verwendet werden und somit die Möglichkeiten der gegenseitigen Verlängerung von Dimeren geringer sind.

Die PCR 3.4 erfüllte im Oligo die Anforderungen für eine hochstringente Primersuche.

Wegen der Vermutung, dass die Fluoreszenzmarkierung beim JH-Primer die Sensitivität der PCR noch mehr senken könnte, wurde die PCR 3.1 auch mit unmarkiertem Primer durchgeführt und mit der TGGE ausgewertet. Es zeigten sich wiederum nur unspezifische Banden im Elektrophoresebild. Auch die Durchführung der PCR 3.1 mit einem Stufen-PCR-System (Storch-Hagenlocher et al. 2000), wie unter Punkt 2.2.2.2 (PCR-Prog. 3) erläutert, brachte keine Verbesserung der Ergebnisse. Stufen-PCR-System bedeutet, dass man die Anlagerungstemperatur während des Ablaufes des PCR-Programmes stufenweise um einige °C erhöht. Es wurden noch weitere Primerkombinationen getestet (Tab. 19).

Auch diese Versuche brachten keine Verbesserung der Effektivität der PCR. Einige Kombinationen zeigten zwar ein polyklonales Ergebnis, doch die Ausbeute des spezifischen Amplifikats, beurteilt nach der Stärke des polyklonalen „Schmiers“ in der AGE bzw. nach der Höhe und Regelmäßigkeit der Peaks im Genescan, war bei keiner deutlich besser als bei der seit langem routinemäßig durchgeführten PCR (PCR 3.4).

Tab. 19: Ergebnisse der Testung weiterer PCR

   

JH(GAL99)

  

JH(ING93)

  

JH(MCC90)

  

JH(DEA91)

FR3(BRI90)

B:

E:

- , PD

B:

E:

(+)

B:

E:

(+)

B:

E:

+

 

G:

PD , ~

         
 

T:

- , PD

         

H:

E:

- , PD

H:

 

n.d.

H:

 

n.d .

H:

 

n.d.

 

G:

- , PD

         

FR3(LEH95)

B:

 

n.d.

B:

 

n.d.

B:

E:

+

B:

 

n.d.

    

G:

+

  

H:

 

n.d.

H:

 

n.d.

H:

E:

+

H:

 

n.d.

      

G:

+

  

FR3(HAY99)

B:

E:

PD, ~

B:

E:

(+) , PD

B:

E:

-

B:

 

n.d.

G:

PD , ~

      

H:

E:

- , PD

H:

E:

(+) , PD

H:

 

n.d.

H:

 

n.d.

G:

- , PD

      


[Seite 37↓]

B:

-Blutprobe(PBMC)

PD

-Primerdimere

H:

-Hautprobe(Paraffin)

~

-das polyklonale Profil ist von unspez. Peaks überlagert

E:

-Agarosegelelektrophorese

+

-spezifisches Amplifikat in ausreichender Konzentration vorhanden

G:

-Genescan

(+)

-spezifisches Amplifikat nur in geringer Konzentration vorhanden,

-d. h. in der Elektrophorese nur schwach sichtbarer "Schmier"

T:

-TGGE

n.d.

-nicht durchgeführt

-

-kein Amplifikat

Legende der Tab 19:

Ergebnisse der Konsensusprimer-PCR (sn)

Eine Möglichkeit die Ausbeute der PCR zu erhöhen, und somit trotz Dimerbildung ein spezifisches Amplifikat zu erhalten, ist die Durchführung einer geschachtelten PCR.

Drei verschiedene Primersysteme, wie in Abschnitt 2.2.3. beschrieben, wurden getestet: FR3.5, FR3.6, FR3.7. Das dG der 3‘Dimere der verschiedenen Primer untereinander bei der Testung im Oligo lag zwischen -3,0 und –5 kcal/mol. Bei allen drei PCR war sowohl bei der Verwendung von PBMC als auch bei der Verwendung von Paraffinschnitten in der AGE ein polyklonaler „Schmier“ erkennbar.

Da das PCR-System 3.7 hauptsächlich für die anschließende Klonierung entwickelt wurde [Primer mit Restriktionssequenz-(Inghirami et al. 1993)], wurden nur die PCR 3.5 und 3.6 mit FAM-markierten Primern durchgeführt. Nach der Genescan-Analyse zeigten beide PCR polyklonale Profile im spezifischen Bereich. Aus zwei wesentlichen Gründen wurde die PCR 3.5. für die Untersuchung der CBCL ausgewählt:

  1. Die PCR 3.5 (Brisco et al.) zeigte im Durchschnitt größere Peakhöhen und weniger unspezifische Banden im Bereich von 20-40bp. (Abb. 5)
  2. Bei den Profilen der PCR 3.6 (Hayashi et al.) waren die Peaks des Genescan-Profils etwas unregelmäßiger, teilweise gingen sie fließend ineinander über, so dass eine Interpretation der Profile eventuell erschwert würde. (Abb. 6)

Abb. 5: Genescan-Profile der PCR 3.5 und 3.6 (PBMC)


[Seite 38↓]

Abb. 6: Genescan-Profile der PCR 3.5 und 3.6 (Paraffin)

3.2.2 Die FR1 - PCR im Überblick

Für den FR1-Bereich des VH-Genes sind zwei Primersysteme mit fam-Primern (Marks et al. 1991, Küppers et al. 1994) und ein System mit einem cons-Primer entwickelt worden (Aubin et al. 1995). Die meisten Untersucher verwenden die fam-Primer in einem Multiplex-Ansatz (Lehmann et al. 1995, Aubin et al. 1995), einige jeweils nur einen Primer pro PCR-Ansatz (Deane und Norton 1991, Child et al. 2001). Eine Übersicht über die FR1-Primer gibt die Tabelle 6 im Abschnitt 2.2.4.

Ähnlich wie bei der FR3-PCR variiert auch hier die Sensitivität in den Studien zwischen 52%-90% (Deane und Norton 1991, Aubin et al. 1995, Hayashi et al. 1999, Nihal et al. 2000, Child et al. 2001). Dies liegt vermutlich an den verschiedenen PCR-Strategien, zum Teil aber auch an den unterschiedlichen Subtypen von B-Zell Lymphomen bzw. Leukämien, die in der jeweiligen Studie untersucht wurden (Aubin et al. 1995).

Die FR1-PCR-Systeme wurden zunächst mit PBMC und unmarkierten Primern durchgeführt, da diese erfahrungsgemäß spezifische Amplifikate in höherer Menge liefern.

3.2.2.1 Ergebnisse der Überprüfung der FR1-Primer im Oligo

Da die fam-Primer von Küppers et al. (1994) bereits von mehreren anderen Arbeitsgruppen verwandt wurden, wurde die Testung im Oligo zunächst mit diesen durchgeführt. Die Tabelle 20 zeigt die Dimerbildung der Primer mit sich selbst, Tabelle 21 die Dimerbildung der Primer untereinander.


[Seite 39↓]

Tab. 20: Ergebnisse der Primerprüfung mit Oligo

Primer

Sequenz

Das stabilste 3' Dimer in kcal/mol

Das stabilste 5'Dimer gesamt in kcal/mol

Haarnadel

Tm

in °C

Interne Stabilität, 3'

FR1.1a(KÜP94)

5‘ CCT CAG TGA AGG TCT CCT GCA AGG C 3‘

-3,3

-6,9

-0,4 kcal/mol, Tm = 32 °C

77

9

FR1.1b(KÜP94)

5‘ CCT CAG TGA AGG TTT CCT GCA AGG C 3‘

-3,1

-6,9

-0,4 kcal/mol, Tm = 32 °C

77

9

FR1.2(KÜP94)

5‘ GTC CTG CGC TGG TGA AAC CCA CAC A 3‘

-1,9

-9,8

-0,7 kcal/mol, Tm = 41 °C

81

7

FR1.3(KÜP94)

5‘ GGG GTC CCT GAG ACT CTC CTG TGC AG 3

-3,5

-6,9

1.50 kcal/mol

80

8,5

FR1.4a(KÜP94)

5‘ GAC CCT GTC CCT CAC CTG CGC TGT C 3‘

-2,9

-9,8

2,30 kcal/mol

81

7,5

FR1.4b(KÜP94)

5‘ GAC CCT GTC CCT CAC CTG CAC TGT C 3‘

-2,9

-6,9

2.30 kcal/mol

77

6

FR1.5a(KÜP94)

5‘ AAA AAG CCC GGG GAG TCT CTG AGG A 3‘

-1,6

-16

Keine

79

8

FR1.5b(KÜP94)

5‘ AAA AAG CCC GGG GAG TCT CTG AAG A 3‘

-3,2

-16

1.30 kcal/mol

77

7

FR1.6(KÜP94)

5‘ ACC TGT GCC ATC TCC GGG GAC AGT G 3'

-1,9

-9,8

0,4 kcal/mol, Tm = 18 °C

81

6,5

Tab. 21: Ergebnisse der Multiplex-Testung FR1(KÜP)/JH(GAL)

Primer:

Moderate*

TM in °C

FR1.1a(KÜP94)

-3,1M

77

FR1.1b(KÜP94)

-3,1M

77

FR1.2(KÜP94)

-3,1M

81,4

FR1.3(KÜP94)

-8,5M

79,6

FR1.4a(KÜP94)

-6,6M

81,2

FR1.4b(KÜP94)

-9,8M

77,3

FR1.5a(KÜP94)

-6,3M

78,8

FR1.5b(KÜP94)

-6,2M

77,1

FR1.6(KÜP94)

-9,6M

81,3

JH(GAL99)

-6,0M

66,8

*dG der 3‘-Dimere bis -10,0 kcal/mol

Trotz der hohen dG-Werte in der Multiplextestung wurde zunächst eine Multiplex-PCR, das heißt alle sechs FR1-Primer in einem PCR-Ansatz, durchgeführt (siehe 2.2.4, PCR 1.1).

3.2.2.2 PCR-Ergebnisse der getesteten FR1-Systeme

In der AGE waren nur unspezifische Banden im Bereich von 20-200 bp erkennbar. Im korrekten Bereich von 270-350 bp waren keine Banden sichtbar.

Vermutlich ist durch die vielen 3‘ Dimere mit relativ hohem dG-Betrag die Bildung eines spezifischen Amplifikates nicht möglich.

Um die Möglichkeiten der Dimerbildungen zu reduzieren, wurde die PCR mit jeweils nur einem fam-Primer und einem JH-Primer durchgeführt. Da die meisten VH-Gene den Familien eins und drei angehören, wurden zunächst die fam-Primer für VH1 und VH3 verwendet.

Da sich bei 57 °C Anlagerungstemperatur gleichfalls kein Amplifikat in der AGE zeigte, wurde die Temperatur schrittweise erniedrigt. Erst bei 52°C Anlagerungstemperatur war Amplifikat im korrekten Größenbereich von 270-340bp in der AGE erkennbar. In der TGGE erwies sich das Amplifikat als ein Unspezifisches: Es zeigte sich kein polyklonaler „Schmier“, sondern eine Folge aus mehreren, scharf begrenzten Banden (sog. „Leitern“).

Es wurden weitere PCR-Ansätze mit unterschiedlichen, in der Literatur beschriebenen, Primerkombinationen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tab. 22 dargestellt:


[Seite 40↓]

Tab. 22: Getestete Primerkombinationen der FR1-PCR

FR1-Primer

JH-Primer (single PCR)

nested:

  

LJH(BRI90)

  

LJH(HAY99)

JH(GAL99)

  

JH(DEA91)

  

JH(MCC90)

  

VLJH(BRI90)

  

VLJH(BRI90)

  

VLJH(HAY99)

FR1multiplex(KÜP94)

B

E

- ; PD

B

E

- ; PD

B

E

-;PD

B

E

- ; PD

B

E

- ; PD

B

E

- ; PD

FR1einzeln(KÜP94)

B

E

PD ; ~

B

E

-

B

E

-

B

E

-

  

n.d.

  

n.d.

FR1.1-7(MAR91)

B

T

~

  

n.d.

  

n.d.

  

n.d.

  

n.d.

B

E

- ; PD

FR1cons(AUB95)

  

n.d.

  

n.d.

  

n.d.

  

n.d.

B

T

~, PD

B

E

~, PD

B:

-Blutprobe(PBMC)

PD

-Primerdimere

 

H:

-Hautprobe(Paraffin)

~

-das polyklonale Profil ist von unspez. Peaks überlagert

 

E:

-Agarosegelelektrophorese

+

-spezifisches Amplifikat in ausreichender Konzentration vorhanden

 

G:

-Genescan

(+)

-spezifisches Amplifikat nur in geringer Konzentration vorhanden,

-d. h. in der Elektrophorese nur schwach sichtbarer "Schmier"

 

T:

-TGGE

 

n.d.

-nicht durchgeführt

-

-kein Amplifikat

 

Keine der getesteten PCR zeigte ein zufriedenstellendes Ergebnis.

3.2.2.3 Entwicklung des neuen Primersystems

Eine Möglichkeit, sehr sensitiv einen Genabschnitt zu amplifizieren, ist, eine PCR durchzuführen, die sowohl im VH-Genabschnitt, als auch im JH-Genabschnitt geschachtelt ist. Primer, die in den verschiedenen FR1-PCR bereits verwendet wurden, wurden neu kombiniert (siehe 2.2.4, PCR1.2).

Vor der Durchführung dieser PCR wurden auch diese Primer im Oligo getestet. Die dG-Werte der 3‘ Dimere waren im Bereich von –2 bis –11 kcal/mol und überschritten somit zum Teil weit die vorgegebene Grenze von –3,5 kcal/mol. Trotz dieser schlechten Testwerte, war in der AGE ein Amplifikat im korrekten Bereich von 270-340 bp erkennbar.

Bei der Durchführung der PCR mit dem FAM-markierten Primer VLJH nach Brisco et al. (1990) zeigte sich im Genescan ein polyklonales Profil (Abb. 7). Diese PCR wurde für die Untersuchung der CBCL eingesetzt.

Abb. 7: Genescan-Profile der PCR 1.2


[Seite 41↓]

3.2.3  Die Leader - PCR

Eine weitere Möglichkeit das VDJ-Rearrangement zu amplifizieren ist die Verwendung von Primern die an die Leader-Region des VH-Gens binden. Child et al. (2001) konnten mit diesem PCR-Ansatz in 74% ein klonales Amplifikat bei primär kutanen B-Zell Lymphomen nachweisen.

Die bisher veröffentlichten Primer sind in Tab. 8 zusammengefasst.

3.2.3.1 Ergebnisse der Überprüfung der Leader-Primer im Oligo

Auch die Primer der Leader-Region des VDJ-Rearrangements wurden zunächst einzeln (Tab. 23) und dann im Multiplex-Programm des Oligo getestet (Tab. 24).

Tab. 23: Ergebnisse der Primerprüfung

Primer

Das stabilste 3' Dimer in kcal/mol

Das stabilste 5‘ Dimer gesamt in kcal/mol

Haarnadel

Tm

in °C

Int.

Stab., 3'

Inghirami et al.1993

VH1

-4,7

-5,3

keine

69.3

8.2

VH2

-1,6

-4,7

-0,4 kcal/mol, Tm = 34 °C

59.5

8.2

VH3

-4,7

-5,3

1.40 kcal/mol

67.9

8.2

VH4

-1,9

-4,4

0.80 kcal/mol, Tm = 4 °C

58.6

7.0

VH5

keine

-5

-0.80 kcal/mol, Tm = 45 °C

74.0

7.8

VH6

-3,4

-3,4

2.20 kcal/mol

57.2

7.9

Tab. 24: Ergebnisse der Multiplex-Testung

Primer

Moderate

TM in C

Inghirami et al. 1993

VH1

-6.6 M

69.3

VH2

-4.7 M

53.9

VH3

-6.6 M

67.9

VH4

-5.0 M

58.6

VH5

- M

74.0

VH6

-3.4 M

57.2

JH

-6.3 M

72.2

dG der 3' Dimere <-6.7kcal/mol

Die hohen dG-Werte zeigen an, dass eine Multiplex-PCR mit allen sechs Leader-Primern theoretisch nicht möglich ist.

Mit einer geschachtelten PCR mit allen sechs LEA-Primern und den LJH/VLJH-Primer nach Brisco et al .(1990)konnte kein Amplifikat erzeugt werden.

Deshalb wurde eine ungeschachtelte PCR mit jeweils einem Leader-Primer pro Ansatz durchgeführt. Primer und PCR-Programm wurden der Arbeit von Child et al. (2001) entnommen (siehe 2.2.5).

3.2.3.2 PCR-Ergebnisse des Leader-Systems

Mit dem Leader PCR-System werden vergleichsweise große Amplifikate, d.h. mit einer Länge von ca. 500bp gebildet. Es wurden zuerst unmarkierte Primer verwendet. Die Auswertung der PCR erfolgte deshalb mit der TGGE.


[Seite 42↓]

Testung mit DNA aus PBMC (polyklonal)

Die spezifischen Amplifikate, das heißt Amplifikate im richtigen Größenbereich, die sich als „Schmier“ in der TGGE darstellen, sind, wenn vorhanden, nur sehr schwach und häufig nur mit den Leader-Primern VH1 und VH3 vorhanden. Offensichtlich reicht die Anzahl entsprechend langer DNA-Moleküle nicht aus, um eine erfolgreiche Amplifikation zu ermöglichen. Das würde erklären, warum die PCR mit dem VH1- und dem VH3-Primer funktioniert. VH1- und VH3-Gene bilden die beiden größten VH-Familien. Somit ist auch die Menge an DNA-Matrize dieser Familien in der Probe relativ am größten.

Testung mit Paraffinproben der CBCL

Es wurden DNA-Proben von in Paraffin eingebetteten Hautproben zehn ausgewählter CBCL-Patienten mit der Leader-PCR getestet. Bei keiner Probe konnte spezifisches Produkt amplifiziert werden.

Testung mit Kryoproben der CBCL

Die Leader-PCR erfolgte auch mit Kryoproben von CBCL-Patienten: In Kryoproben ist die DNA besser erhalten als in Paraffinproben (Hoeve et al. 2000).

Tab. 25: Ergebnisse der Leader-PCR

Name

Erg.Rout.

Leader 1

Leader 2

Leader 3

Leader 4

Leader 5

Leader 6

P.A.

poly

k.A.

k.A.

poly

k.A.

k.A.

k.A.

W.J.

mono

k.A.

k.A.

poly

mono

n.a.

k.A.

H.G. (1)

mono

poly

k.A.

poly

mono

n.a.

k.A.

S.P.(1)

mono

poly

n.d.

poly

n.d.

n.d.

n.d.

K.W.(2)

mono

poly

k.A.

mono

poly

(poly)

k.A.

Wie aus der Tabelle 25 ersichtlich, konnte in den kleineren VH-Familien oft kein Produkt amplifiziert werden. Dennoch sind 3 von 5 untersuchten Proben klonal.: einmal in der Familie VH3 und zweimal in der Familie VH4.

Ob es sich bei den diskreten Banden in der TGGE wirklich um Monoklonalität oder um einen sogenannten „sampling error“ (s. 3.4.2) handelt, lässt sich aufgrund der geringen Anzahl untersuchter Proben schwer sagen. Auffällig ist, dass zwei der fünf untersuchten Proben in VH4 monoklonal sind, obwohl VH4 mit sechs funktionalen VH-Genen nur die drittgrößte Familie ist.

Da für die Untersuchung der CBCL hauptsächlich Paraffinproben zur Verfügung standen, wurde die Leader-PCR für die Diagnostik nicht verwandt.

3.2.4 Die FR2 - PCR im Überblick

Eine Übersicht über die FR2-Primer gibt die Tabelle 10 im Abschnitt 2.2.6.

Die Sensitivität der FR2-PCR-Systeme liegt bei der Untersuchung von NHL im Bereich von 42%-85% (Diss et al. 1993, Kitamura et al. 1996, Gong et al. 1999). Für die CBCL liegen keine Daten vor. Eine Testung der Primer im Oligo ist bei diesen stark degenerierten FR2-Primern [Seite 43↓]nicht möglich, da das Oligo-Programm die degenerierten Basen nicht erkennt.

Wie bereits bei der FR3-PCR wurden zuerst die ungeschachtelten und dann die geschachtelten PCR getestet.

Die Durchführung der ungeschachtelten PCR erfolgte in Anlehnung an die Arbeit von Galimberti et al .(1999) (PCR 2.1). Die Primer für die geschachtelte PCR wurden der Arbeit von Diss et al.(1993) (PCR 2.2) und Kitamura et al.(1996) (PCR 2.3) entnommen.

3.2.4.1 PCR-Ergebnisse der FR2-Systeme

Eine Übersicht gibt Tabelle 26:

Tab. 26: Ergebnisse der PCR 2.1.-2.3.

PCR

2.1

2.2

2.3

AGE

unspezifische Banden:

von 30-50bp viele Nebenbanden

von 150-200bp viele Nebenbanden

wenige im Bereich von 30-50bp

Amplifikat im korrekten Bereich:

nein

ja

ja, im Bereich von 220-280bp

TGGE

polyklonaler Schmier:

nicht durchgeführt

nein, „Leitern“ unspezifischer Banden

nicht durchgeführt

Genescan

polyklonales Profil:

nicht durchgeführt

nicht durchgeführt

ja

geeignet:

nein

nein

ja

Bei der PCR FR2.1 wurde die Anlagerungs-Temperatur schrittweise bis auf 52°C erniedrigt. Bei 52°C zeigten sich Banden im Bereich von 200-240bp, die sich aber auf der TGGE als unspezifisch herausstellten.

Die PCR FR2.3 wurde für die Untersuchung der CBCL ausgewählt. (Abb. 8)

Abb. 8: Genescan-Profile der PCR 2.3

3.2.5 Die IgL - PCR

Wenn man verschiedene Primer-Sets verwendet, um das IgH-Rearrangement zu amplifizieren, bleiben, unabhängig von der Lymphomart, immer noch mindestens 20% der klonalen Rearrangements unerkannt (Gong et al. 1999, Child et al. 2001).


[Seite 44↓]

Um noch mehr Lymphome zu erfassen, haben einige Untersucher spezifische Primer entwickelt, die entweder die Leader- oder die FR1-Region des Ig-Leichtkettengens erkennen (Hawkins et al. 1994, Hoogeveen et al. 1998).

Viele dieser Studien basierten nur auf einer kleinen Anzahl von Fällen, da die Amplifikation des Ig-Leichtkettengens viele verschiedene familienspezifische Primerpaare benötigt. Außerdem sind die Amplifikate groß (ca.350bp) und somit ist die PCR mit Paraffinproben oft nicht erfolgreich (Küppers et al. 1995, Gong et al. 1999).

Gong et al., (1999) entwickelten cons-Primer für die FR3κ-Region und die Jκ-Region zur Amplifikation der CDR3-Region des Igκ-Gens. Studien zeigten, dass die Amplifikation der κ-Kette für den Nachweis der Klonalität ausreicht, da ca. 80% der klonalen B-Zellen, die λ-Ketten exprimieren, auch einen rearrangierten Igκ-Lokus besitzen, und somit ein Nachweis der Klonalität mit dem Primerset für die CDR3-Region des Igκ-Gens möglich ist (Gong et al. 1999).

In 52% konnten Gong et al ., mit dieser PCR-Methode ein klonales Rearrangement nachweisen.

Da die Variabilität der Länge der CDR3-Region des κ-Gens sehr klein ist (Produktlängen von 126-144bp) ist die Auswertung mit Elektrophoresemethoden zu empfehlen, die sowohl nach der Länge als auch nach der Sequenz auftrennen (Shiokawa et al. 1998, Gong et al. 1999).

Es wurde die IgL-PCR nach Gong et al.(1999)durchgeführt und die Produkte mittels TGGE und Genescan ausgewertet (siehe Abschnitt 2.2.7).

3.2.5.1 PCR-Ergebnisse der IgL-PCR

Die PCR nach Gong et al. wurde mit DNA-Proben aus polyklonalen PBMC durchgeführt.

Abb. 9: Genescan-Profile der IgL-PCR

Material: PBMC

Im Genescan zeigte sich bei allen untersuchten PBMC-Proben ein konstanter Peak mit einer Basenpaarlänge von 120-135bp. Der Peak hat sein Maximum bei 127 bp. (siehe Abb. 9)

In der TGGE ergab sich folgendes Bild:

Bei ca. 125-130 bp zeigte sich nur eine sehr diskrete Bande, die nach unten und oben scharf begrenzt ist.


[Seite 45↓]

Da es sich bei den untersuchten Proben um polyklonale B-Zell Populationen handeln sollte, müsste sich im TGGE-Bild eine polyklonale „Wolke“ abbilden. Aufgrund des konstanten Peaks im Genescan und der scharfen Begrenzung der Bande in der TGGE wurde das Amplifikat der IgL-PCR als unspezifisch interpretiert.

3.3 Nachweisgrenze

Um für die zwei PCR (PCR 3.5; PCR 1.2) eine untere Nachweisgrenze zu ermitteln, wurde eine Verdünnungsreihe erstellt, indem unterschiedliche Mengen extrahierter DNA von der monoklonalen Zelllinie JY mit extrahierter DNA von PBMC zusammen amplifiziert wurden. Die Menge an DNA pro Ansatz betrug jeweils 500 ng. Die Verdünnungsstufen (V1-V6) waren 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5% und 0,1%.

Verdünnungsschema: (Konzentration bei beiden DNAs: 100ng/µl)

Ca. 30% der in den PBMC enthaltenen Zellen sind B-Lymphozyten. Nur diese Zellen haben ein rearrangiertes IgH-Gen und bilden ein Amplifikat bei der Durchführung einer IgH-PCR. Für die tatsächliche Menge an DNA / Zellen ist demzufolge mit dem Faktor 3 zu korrigieren.

Bei der FR1-PCR(n) war ein klonaler Peak bis zu einer Verdünnungsstufe von 0,5% nachweisbar (Abb. 10). Unter Beachtung des Korrekturfaktors entspräche dies einer Nachweisgrenze von ca. 1,5%. Bis zu einer Verdünnungsstufe von 2,5% war ein klonaler Peak bei der FR3-PCR(sn) sicher detektierbar. Bei 1% und 0,5 % klonaler DNA betrug die Ratio des klonalen Peaks nur noch 1,8 (Abb. 11). Dieses Ergebnis ist als unsicher monoklonal einzustufen. Unter Beachtung des Korrekturfaktors, beträgt also die untere Nachweisgrenze der geschachtelten FR3-PCR sicher 7,5%, grenzwertig ist ein Nachweis bis 1,5% möglich.

Für die Praxis sind eher die unkorrigierten Werte relevant, da sich in der Hautbiopsie neben den B-Zellen auch andere Zellen befinden.

Die niedrigere Nachweisgrenze der FR1-PCR könnte beim Vergleich der beiden PCR-Assays eine höhere Sensitivität der FR1-PCR zufolge haben.

Auf eine Untersuchung der unteren Nachweisgrenze der FR2-PCR wurde verzichtet, da sie für die Routinediagnostik aufgrund der hohen Pseudoklonalität nicht empfohlen werden kann (siehe Abschnitt 3.4.2).

Abb. 10 a-c: Verdünnungsreihe der FR1.2(n)-PCR

Abb. 11 a-d: Verdünnungsreihe der FR3.5(sn)-PCR


[Seite 47↓]

3.4  Analyse der CBCL-Fälle (Gruppe 1)

Zur Gegenüberstellung von Klinik bzw. Histologie und Molekularbiologie wurden die Patienten wie unter Abschnitt 2.1.1 beschrieben in zwei Gruppen eingeteilt, d.h. es wurden 51 Patienten der Gruppe 1 und 22 Patienten der Gruppe 2 zugeordnet. Folgende PCR kamen zum Einsatz:

1. PCR: FR3-cons 3.4(s), 2. PCR: FR1-multiplex 1.2(n), 3. PCR: FR2-cons 2.3(n), 4. PCR: FR3-cons 3.5(sn), für eine kleine Patientengruppe die PCR FR3-cons 3.3(s).

Die Abbildung 12 zeigt für jede PCR jeweils ein Beispiel für ein monoklonales und ein polyklonales Ergebnis:


[Seite 48↓]

Abb. 12: Darstellung der Genescan-Profile für die angewandten PCR (Proben Nr. s. Tab. 27)

Eine Auflistung sämtlicher Ergebnisse enthält Tabelle 27:


[Seite 49↓]

Tab. 27: PCR-Ergebnisse der untersuchten CBCL-Proben (Gruppe1)

Patient

Proben Nr.

Art

FR1(n)

FR2(n)

FR3(sn)

FR3(s)

H.G.(1)

822/01

18/46(K)

1038/01

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

m

m

k.A.

p

p

k.A.

m

p

p

m

m

p

S.M.(2)

501/00

926/01

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

m

m

p

p

m

m

m

m

C.R.

768/01

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

k.A.

p

p

p

H.H.

1149/01

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

p

p

p

p

H.D.

443/01

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

k.A.

p

p

p

K.W.(1)

020/00

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

m

(m)

p

p

K.R.

1008/01

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

p

p

p

p

K.N.

170/01

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

p

p

p

p

K.W.(2)

843/01

18/58(K)

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

X

m

p

m

p

m

p

m

K.L.

221/01

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

(m)

m

m

k.A.

M.R.

1255/01

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

p

p

m

m

O.B.

249/01

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

p

p

p

p

P.A.

541/01

880/01

18/56(K)

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

k.A.

p

p

(m)

k.A.

p

p

p

p

p

p

p

S.P.(1)

18/26(K)

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

m

p

(m)

m

S.M.(1)

140/00

1052/01

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

k.A.

m

k.A.

p

p

p

k.A.

p

S.J.

6251

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

k.A.

k.A.

p

p

W.G.

1329/01

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

k.A.

p

p

p

W.L.

180/01

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

p

p

p

p

W.W.

7355

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

m

ol

p

p

Z.W.

393/01

Follikel-Zentrumszell-Lymphom

m

p

m

m

A.M.

1137/00

821/01

Immunozytom(IC)/

Marginalzonenlymphom(MZL)

m

m

m

m

p

p

p

p

C.K.

1151/01

IC/MZL

k.A.

ol

m

k.A.

H.G.(2)

1218/01

IC/MZL

m

m

m

m

M.D.

1155/01

IC/MZL

k.A.

p

p

p

F.D.

455/01

IC/MZL oder Plasmozytom

ol

ol

p

k.A.

B.M.

7619

unklassifiziertes CBCL

ol

X

m

p

B.E.

468/01

unklassifiziertes CBCL

k.A.

k.A.

(m)

m

B.L.

6656

unklassifiziertes CBCL

m

X

(m)

p

B.I.

8168

unklassifiziertes CBCL

m

X

ol

p

D.R.

7587

unklassifiziertes CBCL

X

X

ol

p

E.E.

229/00

unklassifiziertes CBCL

k.A.

X

p

p

G.G.

5542

unklassifiziertes CBCL

k.A.

m

m

m

H.C.

7955

unklassifiziertes CBCL

ol

ol

ol

p

H.G.

8624

unklassifiziertes CBCL

m

X

X

m

K.U.

7464

unklassifiziertes CBCL

k.A.

p

p

p

L.A.

5865

8074

unklassifiziertes CBCL

m

p

p

m

m

p

m

p

M.W.

564/01

unklassifiziertes CBCL

k.A.

p

p

p

M.G.

766/01

unklassifiziertes CBCL

k.A.

m

p

p

P.L.

783/01

unklassifiziertes CBCL

(m)

k.A.

ol

k.A.

Q.E.

5136

unklassifiziertes CBCL

k.A.

k.A.

p

p

R.R.

573/01

unklassifiziertes CBCL

p

p

p

p

S.H.(1)

991/00

unklassifiziertes CBCL

p

p

p

p

S.H.(2)

7068

unklassifiziertes CBCL

k.A.

m

m

p

S.C.

5334

unklassifiziertes CBCL

X

X

ol

p

S.P.(2)

179/01

unklassifiziertes CBCL

p

p

p

p

S.T.

82/01

unklassifiziertes CBCL

k.A.

X

X

k.A.

S.E.

7426

unklassifiziertes CBCL

m

m

m

m

U.L.

434/01

199/01

845/01

unklassifiziertes CBCL

p

m

m

p

p

p

p

m

p

p

m

p

W.K.

7343

unklassifiziertes CBCL

p

X

p

p

K.G.

1128/01

CBCL der unteren Extremität

m

ol

m

m

W.J.

893/01

18/51(K)/LK

CBCL der unteren Extremität

k.A.

(m)

X

(m)

p

p

m

m

Legende:

p: polyklonal

k.A.: kein Amplifikat

X: Pseudoklonal

m: monoklonal

(m): unsicher monoklonal

ol: (pseudo)oligoklonal

LK : Lymphknoten

  

Legende:

Insgesamt konnte bei der FR1-PCR in 35%, bei der FR2-PCR in 16% und bei der FR3-PCR(sn) in 29% der untersuchten Patienten ein monoklonales Amplifikat nachgewiesen werden. Bei der FR3-PCR(s) waren 27% der untersuchten Patienten monoklonal. Unter Berücksichtigung aller vier verschiedenen PCR lag die diagnostische Sensitivität bei 53%.

Bezogen auf die Proben (n=63) lag die Gesamtsensitivität nur bei 51%. Diese Differenz ergibt sich daraus, dass bei einigen Patienten, mehrere Hautproben zur Verfügung standen. Die Basenpaarlänge des klonalen Rearrangements stimmte in den verschiedenen Proben eines Patienten immer überein.

Bei fünf der neun Patienten, bei denen mehrere Hautbiopsien zur Verfügung standen, konnte allerdings nicht in allen untersuchten Hautproben ein Klon nachgewiesen werden.

Die untersuchten Proben waren nicht immer in allen vier PCR monoklonal. Zum Beispiel konnte bei der Testung der Proben in 12 Fällen nur mit einer der vier durchgeführten PCR ein monoklonales PCR-Produkt nachgewiesen werden. Neunmal war ein monoklonales Ergebnis in [Seite 50↓]zwei der vier PCR vorhanden, achtmal in drei der vier und dreimal in allen vier PCR.

Die Proben, die nur in einer PCR monoklonal waren, verteilten sich wie folgt auf die verschiedenen PCR:

Tab. 28: Anzahl der Proben, die nur in einer PCR monoklonal waren

PCR

FR1

FR2

FR3sn

FR3s

Summe

Anzahl der Proben

8

2

0

2

12

Bei einigen Patienten war es nicht möglich mit den vorhandenen Proben ein Amplifikat zu erhalten: Die FR1-PCR zeigte in 30% der Patienten kein Amplifikat, die FR2-PCR in 4% und mit der FR3-PCR(s) war bei 10% der Patienten kein Produkt amplifizierbar. Mit der FR3-PCR(sn) konnte bei allen untersuchten Proben ein spezifisches Amplifikat nachgewiesen werden. Wenn die Patienten, bei deren Proben kein Amplifikat produziert werden konnte, unberücksichtigt bleiben, so ergeben sich für die Berechnung der Sensitivität folgende Prozentzahlen: FR1–47%, FR2–16%, FR3(sn)–29%, FR3(s)–30%. Die Sensitivität beträgt dann insgesamt 60%.

3.4.1 Nicht eindeutige Ergebnisse

Einige untersuchte Proben zeigten zwar einen reproduzierbaren klonalen Peak, doch erfüllten die Kriterien für die Monoklonalität aus folgenden Gründen nicht:

1. Fehlende Reproduzierbarkeit:

Die Probe war bei der ersten Untersuchung monoklonal, bei der Wiederholung die DNA nicht mehr amplifizierbar.

2. Peak-Ratio ≤ 2,0:

Die Probe ist als unsicher mono zu bewerten, da die Ratio des monoklonalen Peaks bei einem oder beiden PCR-Ansätzen im Bereich von 1,8-2,0 liegt (siehe Abb. 13).

3. Profil degeneriert:

Es ist ein reproduzierbarer monoklonaler Peak nachweisbar, doch das Hintergrundprofil ist unregelmäßig: Peaks fehlen oder dominieren.

4. Peak nicht in

Frame:

Der Abstand des monoklonalen Peaks zu seinen benachbarten Peaks ist nicht drei Basenpaare.

Eine Übersicht gibt die Tabelle 29:


[Seite 51↓]

Tab. 29: Zusammenfassung der nicht eindeutigen Ergebnisse

R-Nr.

Lymphomart

  

Bemerkungen:

FR1

Erg.

Peak

Peak-Ratio

  

221/01

FCCL

mono!

310

7584*.

FR1-PCR n. repr.

k.A.

  

(PCR: FR2, FR3(sn) mono; FR3(s) k.A.)

k.A.

   

783/01

unklassif.

CBCL

mono!

290

3164*

FR1-PCR n.repr.

k.A.

  

(PCR: FR3(sn) oligo; FR2, FR3(s) k.A.)

k.A.

   

18/51K

CBCL der unt. Extr.

Lymphknoten

mono

305

*

FR1-PCR n.repr.

k.A.

  

(PCR: FR2 unsicher mono; FR3(sn) poly; FR3(s) mono)

FR2

 

Erg.

Peak

Peak-Ratio

 

20/00

FCCL

mono

294

7,6

FR2-PCR: Peak Ratio≤2

mono

258

1,8

(PCR: FR1 mono; FR3(sn) poly; FR3(s) k.A.)

541/01

FCCL

mono

245

1,8

FR2-PCR: Peak Ratio≤2

mono

245

2,2

(PCR: FR1 k.A.; FR3(sn); FR3(s) poly)

18/51K

CBCL der unt. Extr.

Lymphknoten

mono

245

2,2

FR2-PCR: Profil degeneriert

mono

246

2,8

(PCR: FR1 unsicher mono; FR3(sn) poly; FR3(s) mono)

FR3(sn)

 

Erg.

Peak

Peak-Ratio

 

6656

unklassif.

CBCL

mono

69

5,9

FR3(sn)-PCR: Peak nicht in Frame

mono

70

5,1

(PCR: FR1 mono; FR2 Pseudo; FR3(s) k.A.)

mono

70

6

 

468/01

unklassif.

CBCL

mono

78

1,9

FR3(sn)-PCR: Peak Ratio≤2

mono

78

1,9

(PCR: FR1, FR2 k.A.; FR3(s) mono)

18/26K

FCCL

mono

87

2

FR3(sn)-PCR: Peak Ratio≤2

mono

87

1,9

(PCR: FR1, FR3(s) mono; FR2 poly)

*Höhe des Peaks im Genescan: aufgrund des fehlenden Hintergrundprofils ist eine Peakberechnung
n. mgl. in Klammern: Ergebnisse der anderen durchgeführten PCR bei der jeweiligen Probe

Zwei Beispiele für Proben, bei denen die Peak-Ratio ≤ 2.0 war zeigt Abb. 13:


[Seite 52↓]

Abb. 13: Profile von Proben mit einer Peak-Ratio ≤ 2

Zählt man die nicht eindeutigen Fälle mit zu den monoklonalen Ergebnissen, so erhöht sich die Sensitivität bei FR1 um 3 % auf 50%, bei FR2 um 6% auf 22%, und bei FR3(sn) um 6% auf 35%. Die Gesamtsensitivität bleibt allerdings bei 60%. (Alle Prozentangaben beziehen sich auf die Proben, bei denen ein Amplifikat produziert werden konnte.)

3.4.2 Das Auftreten sogenannter „Pseudoklonalität“

Pseudoklonalität ist dadurch definiert, dass die Fragmentgrößen des monklonalen Peaks einer Probe bei Wiederholung der PCR variieren bzw. der monoklonale Peak bei der Wiederholung nicht mehr vorhanden ist. Bei der Untersuchung der Proben fiel auf, dass das Auftreten von Pseudoklonen bei den geschachtelten PCR häufig ist. Bei der FR1-PCR trat bei 3 von den 63 untersuchten Proben Pseudoklonalität auf. Das ist ein Anteil von etwa 5%, bzw. bezogen auf die amplifizierbaren Proben ein Anteil von 7%. Bei zwei dieser Proben zeigte keine der anderen drei durchgeführten PCR ein monoklonales Amplifikat. Somit hätte die Beurteilung „monoklonal“ zu einem falsch positiven Gesamtresultat geführt. Bei allen 6 Profilen (pro Probe zwei PCR-Analysen) der drei Proben bei denen Pseudoklonalität auftrat, stellten sich ein oder zwei klonale(r) Peak(s) ohne polyklonalen Hintergrund dar.

Drei der mit der FR1-PCR(n) untersuchten Proben zeigten ein pseudo-oligoklonales Amplifikat (4% bzw. 7% bezogen auf die amplifizierbaren Proben).

Bei der FR3-PCR(sn) waren 2 von 63 untersuchten Proben (3%) pseudoklonal. Bei einer Probe hätte dies zu einer falsch positiven Gesamtbeurteilung geführt. Fünf untersuchte Proben zeigten ein pseudo-oligoklonales Profil (8%).

Der Anteil pseudoklonaler Ergebnisse war mit 16% bzw. 17% (bezogen auf die amplifizierbaren Proben) bei der FR2-PCR(n) am höchsten. Pseudooligoklonalität war in 8% bzw. 9% der untersuchten Proben nachweisbar. Die Abbildung 14 zeigt Beispiele für pseudoklonale Ergebnisse, die Abbildung 15 Beispiele für pseudo-oligoklonale Ergebnisse:


[Seite 53↓]

Abb. 14: Beispiele für pseudoklonale Ergebnisse


[Seite 54↓]

Abb. 15: Beispiele für pseudo-oligoklonale Ergebnisse

Bei der FR3-PCR(s) fanden wir keine Pseudoklonalität. Es wurde deshalb untersucht, ob die Pseudoklone gerade dann erzeugt werden, wenn in der FR3-PCR(s) kein Produkt amplifiziert werden konnte. Für die DNA, die älter als 3 Monate war, wurde die FR3-PCR(s) wiederholt. Die Ergebnisse dazu zeigt die Tabelle 30:


[Seite 55↓]

Tab. 30: Zusammenhang von Pseudoklonalität und negativer Routine FR3-PCR

PCR

Pseudoklone

k.A. bei FR3-PCR(s)

FR1(n)

3

1

FR2(n)

10

8

FR3(sn)

2

2

Es wird ersichtlich, dass ein Zusammenhang zwischen dem Ergebnis k.A. bei der FR3-PCR(s) und pseudoklonalem Ergebnis bei den anderen PCR bestehen könnte. Eine verallgemeinernde Aussage kann nicht getroffen werden, da die Probenanzahl zu gering ist.

Um zu untersuchen, ob das Alter der Probe beim Auftreten von Pseudoklonen eine Rolle spielt, wurden die länger gelagerten DNA-Proben je nach Alter in drei Gruppen, entsprechend der Tab. 31 eingeteilt:

Tab. 31: Beziehung zwischen Pseudoklonalität und Alter der Probe

Alter der Probe

Probenanzahl

Pseudoklone gesamt

%

Pseudo FR1(n)

%

Pseudo FR2(n)

%

Pseudo FR3(sn)

%

bis 3 Monate

41

4

10%

1

2,5%

2

5%

1

2,5%

bis 12 Monate

6

1

17%

0

0%

1

17%

0

0%

älter

17

10

59%

2

12%

7

41%

1

6%

Die Tabelle 29 macht deutlich, dass vor allem Proben, die älter sind als ein Jahr, bei der Analyse häufiger falsch klonale Ergebnisse im Sinne von Pseudoklonen erzeugen. Eine Erklärung für dieses Phänomen wäre, dass die DNA dieser Proben schon so degradiert ist, dass es zu einem „sampling error“ führt. (Sampling error bedeutet, dass nur noch wenige Kopien von IgH-Rearrangements vollständig erhalten sind, die dann, je nachdem welche Rearrangements bevorzugt amplifiziert werden, zur Imitation klonaler Banden unterschiedlicher Größe in der Elektrophorese führen.).

Die Ursache für die Entstehung von Pseudoklonen insbesondere bei der FR2-PCR könnte sein, dass es aufgrund der vielen Dimerbildungen des degenerierten FR2-Primers zu einer Inhibition der einzelnen Primervarianten untereinander kommt, so dass nur wenige für die Amplifikation zur Verfügung stehen. Diese erkennen dann auch nur eine kleine Auswahl von IgH-Rearrangements und könnten so ein pseudoklonales Ergebnis hervorrufen.

3.4.3 Untersuchung falsch polyklonaler Proben mit der PCR 3.3. (Fodinger et al.)

Bei acht Patienten der Gruppe 1, die in allen vier angewandten PCR [FR1(n);FR2(n);FR3(sn);FR3(s)] ein polyklonales Ergebnis zeigten, wurde die FR3-PCR 3.3 nach Fodinger et al. (1999) (s. 2.2.3) an Kryoproben dieser Patienten durchgeführt, um herauszufinden, ob diese PCR zusätzliche monoklonale Ergebnisse liefert. Der FR3-Primer dieser PCR bindet weiter 5’ im VH-Gen. Möglich wäre also, dass mit dieser PCR B-Zell-Klone [Seite 56↓]erfasst werden, die mit der FR3-PCR(sn) bzw. mit der FR3-PCR(s) nicht amplifiziert werden konnten, da sie in dem Bereich, wo die FR3-Primer dieser beiden PCR binden, mutiert sind.

Dennoch wurde bei keiner der acht Proben Klonalität gefunden. Entweder sind die B-Zell Klone dieser Patienten auch in diesem Primerbindungsbereich mutiert, oder die Konzentration an dominanter DNA reicht nicht aus, um im Genescan eine klonale Bande zu erhalten. Insgesamt waren die Profile der Proben sehr unregelmäßig. Das heißt es zeigte sich kein typisches polyklonales Verteilungsmuster, sondern es fehlten Peaks im Profil oder einige Peaks ragten über die Kurve hinaus. Eine Auswahl an Profilen zeigt die Abbildung 16:

Abb. 16: FR3 (Fodinger et al. 1999)

3.5 Analyse der Kontrollen (Gruppe 2)

Alle PCR-Ansätze ausgenommen einige der FR2-PCR(n) zeigten ein polyklonales Muster: Bei zwei Proben von Patienten mit Pyodermie zeigte sich nach der FR2-PCR(n) ein reproduzierbarer klonaler Peak im Produkt. Bei einer Probe war die Ratio der Peaks bei beiden PCR-Analysen >2 und somit nach unserer Definition sicher monoklonal. Da für Pyodermien bisher keine klonalen Infiltrate in der Literatur beschrieben worden sind, und weder Histologie noch Klinik einen Anhalt für ein CBCL bot, ist die Beurteilung des Ergebnisses schwierig („sampling error“?).

Auch bei dieser Untersuchung trat Pseudoklonalität auf. Der Anteil an pseudoklonalen Ergebnissen für die FR2-PCR(n) war bei beiden Gruppen ähnlich hoch: Gruppe 1: 17%, Gruppe 2: 20%. Die Tabelle 32 gibt eine Übersicht über die untersuchten Fälle:


[Seite 57↓]

Tab. 32: PCR-Ergebnisse der 2.Gruppe (Kontrollen)

R - Nr.

Diagnose

1.PCR

FR1(n)

FR2(n)

FR3(s)

FR3(sn)

79

Pseudolymphom

1.PCR

k.A.

p

p

p

111

Pseudolymphom

1.PCR

(p)

p

p

p

123

B-Zellreiche MF

1.PCR

k.A.

m(2,2)

p

p

2.PCR

 

ol

  

200

Pseudolymphom

1.PCR

k.A.

m(n.mgl.*)

p

p

2.PCR

k.A.

ol

  

296

B-Zellreiche MF

1.PCR

k.A.

m(2,7)

p

p

2.PCR

k.A.

p

  

336

B-Zellreiche MF

1.PCR

k.A.

p

p

p

2.PCR

(p)

   

304

Pseudolymphom

1.PCR

k.A.

p

p

p

2.PCR

k.A.

p

 

p

340

Pseudolymphom

1.PCR

p

p

p

p

2.PCR

(p)

p

 

p

387

Pseudolymphom

1.PCR

p

ol

p

p

2.PCR

(p)

m(2,8)

 

p

3.PCR

 

ol

  

440

Pseudolymphom

1.PCR

(p)

p

(p)

p

732/02

Pyodermie

1.PCR

k.A.

ol

k.A.

p

2.PCR

 

ol

  

615/02

Pyodermie

1.PCR

(p)

ol

(p)

p

2.PCR

 

p

  

176/02

Pyodermie

1.PCR

k.A.

p

k.A.

p

81/02

Pyodermie

1.PCR

k.A.

p

k.A.

p

8713/01

Pyodermie

1.PCR

k.A.

p

(p)

p

8714/01

Pyodermie

1.PCR

(p)

k.A.

(p)

p

8698/01

Pyodermie

1.PCR

p

p

k.A.

p

8345/01

Pyodermie

1.PCR

k.A.

p

p

p

8347/01

Pyodermie

1.PCR

k.A.

m(3,4)

k.A.

p

2.PCR

 

m(2,3)

  

8282/01

Pyodermie

1.PCR

k.A.

m(1,9)

(p)

p

2.PCR

 

m(1,8)

  

8283/01

Pyodermie

1.PCR

k.A.

k.A.

k.A.

p

8100/01

Pyodermie

1.PCR

k.A.

ol

(p)

p

2.PCR

 

p

  

Legende:

ol: (pseudo)oligoklonal“

* Höhe des Peaks im Genescan: aufgrund des fehlenden Hintergrundprofils ist eine Peakberechnung nicht möglich,

(p): Profil mit geringen Peakhöhen

(in Klammern ist die Ratio angegeben)

Legende:

Bei der FR1-PCR(n) konnte häufig kein PCR-Produkt erhalten werden. Auch die Proben, bei denen ein Produkt generiert werden konnte, zeigten im Genescan ein Profil, das insgesamt geringe Peakhöhen aufwies(„schwaches Profil“). Häufig fehlten einige Peaks innerhalb des Bandenmusters. Die Profile der FR3-PCR(sn) zeigten bei allen untersuchten Proben der Gruppe 2 ein vollständiges Gaußsches-Verteilungsmuster. Die Tabelle 33 fasst die Ergebnisse zusammen.

Tab. 33: Ergebnisse der Kontrollen

 

Proben bei denen ein Produkt generiert werden konnte (n)

Proben zeigen Genescan-Profil mit geringen Peakhöhen (n)

Pseudoklone (n)

monoklonale Fälle (n)

unsicher monoklonale Fälle (n)

FR1(n)

7/22

7 (100%)

0

0

0

FR2(n)

20/22

0

4 (20%)

1 (5%)

1 (5%)

FR3(sn)

22/22

0

0

0

0

FR3-PCR(s)

16/22

6 (38%)

0

0

0


[Seite 58↓]

Bei jedem PCR-Ansatz wurde als polyklonale Kontrolle DNA von PBMC gesunder Probanden mit analysiert. Bei diesen Proben konnte bei allen vier verschiedenen PCR immer ein polyklonales Profil mit Genescan nachgewiesen werden.

3.6 Vergleich der molekularbiologischen Resultate mit Klinik und Histologie

Zur Gegenüberstellung von Klinik bzw. Histologie und Molekularbiologie wurden 35 Patienten der Gruppe 1, deren DNA mit allen vier PCR-Assays amplifizierbar war (s. Tab. 27) und 22 Patienten der Gruppe 2 untersucht. Die Untersuchung erfolgte wie beschrieben (s. 3.4 / 3.5). Die beobachteten Peaks wurden anhand der festgelegten Kriterien (s. 3.1) den Kategorien monoklonal oder polyklonal zugeordnet. In Gruppe 1 wurden dabei 60% monoklonale Fälle gefunden, in Gruppe zwei zeigten sich 91% polyklonale Fälle.

Tab. 34: Ergebnisse der PCR nach Auswertung mittels Genescan

 

monoklonal n (%)

polyklonal n (%)

gesamt n

Gruppe 1

21 (60 %)

14 (40 %)

35

Gruppe 2

2 (9 %)

20 (91 %)

22

Unter Beachtung der Gruppenkriterien ergibt sich demnach eine relativ hohe diagnostische Spezifität (91%) bei vergleichsweise geringer diagnostischer Sensitivität (60%) der Methoden.

Die niedrige Sensitivität ergibt sich aus verschiedenen Gründen. Die Menge monoklonaler DNA im untersuchten Gewebeschnitt kann so gering sein, dass sich das daraus entstandene Amplifikat in der Elektrophorese nicht vom polyklonalen Hintergrund abhebt (Diaz-Cano 1996, Ritter et al. 1997).

Der Nachweis eines monoklonalen PCR-Produktes bereitet besonders in frühen Krankheitsphasen Schwierigkeiten, da der Anteil klonaler B-Zellen in der Läsion im Verhältnis zu reaktiven B-Zellen noch relativ klein ist (Ritter et al. 1997). Die Patienten der Gruppe 1 wurden nicht nach einzelnen Krankheitsstadien eingeteilt, das Auftreten einer solchen Konstellation als Ursache eines fehlenden Nachweises von Monoklonalität ist möglich. Die Wahrscheinlichkeit dafür ist dennoch gering, weil in diesen frühen Stadien häufig auch Klinik und Histologie schwierig zu beurteilen sind, eine eindeutige Lymphomhistologie jedoch Einschlusskriterium für das Patientenkollektiv 1 war.

Die Primer selbst können die Ursache sein, da zwar die häufigsten, jedoch nicht alle möglichen Rearrangements des IgH Locus erfasst werden. Daneben sind auch Veränderungen innerhalb rekombinierter IgH Gene im Sinne von Transrearrangements (Hoeve et al. 2000) und Mutationen (Golembowski et al. 2000) einzelner Segmente beschrieben, die eine Amplifikation unterbinden würden, weil zumindest einer der beiden Primer nicht binden kann. Falsch polyklonale Ergebnisse entstehen jedoch immer nur dann, wenn oben genannte Veränderungen im malignen [Seite 59↓]Klon biallel auftreten oder das zweite Allel in Form von einer Keimbahnkonfiguration bzw. in Form von einem rearrangierten Pseudogen auftritt, welches von den Primern nicht erfasst wird. Weiterhin ergab sich ein technisches Problem bei der Auswertung der Proben. Bei mehreren untersuchten Proben zeigte sich im Genescan ein oligoklonales Profil, d.h. ein Profil mit drei oder mehr dominanten Peaks. Bei der Wiederholung der PCR zeigte sich ein anderes oligoklonales Bild (pseudo-oligoklonal). Eine Überlagerung eines möglichen klonalen Peaks durch „pseudo-oligoklonale“ Banden wäre denkbar.

3.7 Vergleich der Ergebnisse der verschiedenen PCR-Systeme

Im Gegensatz zur PCR FR3(s) ist es mit den zusätzlich eingesetzten PCR (FR1(n);FR2(n);FR3(sn)) notwendig mehrere PCR-Ansätze je Patient durchzuführen, da es sich 1. um geschachtelte PCR handelt und 2. eine Wiederholung der PCR, aufgrund des Auftretens von Pseudoklonen, nötig ist. Die Frage, ob mit diesem erheblichen Mehraufwand ein Gewinn an diagnostischer Sensitivität bei beibehaltener Spezifität zu erreichen ist, war Ausgangspunkt des Vergleichs der Methoden.

Des weiteren stellt sich die Frage, wie viele PCR-Ansätze sinnvoll kombiniert werden sollten, um bei geringen Arbeitsaufwand eine ausreichend hohe Sensitivität zu erreichen.

Zur Beantwortung der ersten Frage wurde zunächst die PCR FR3(s) mit der Kombination aus vier PCR (FR1(n)-, FR2(n)-, FR3(sn)- PCR und der PCR FR3(s) = Komb.-PCR) verglichen. Die Auswertung basiert nur auf den Proben, bei denen in allen vier PCR ein Amplifikat nachweisbar war (n=35). In Gruppe 1 wurden mit Hilfe der FR3-PCR(s) 40 % (14/35) monoklonale Fälle gefunden. Das entspricht einer diagnostischen Sensitivität von ebenfalls 40 %, entsprechend der Gruppeneinteilung (sicheres CBCL). Nach der Kombination der vier PCR-Assays konnten 60 % (21/35) monoklonale Fälle diagnostiziert werden, die Sensitivität beträgt demzufolge 60 %. Die Tabelle 35 gibt eine Zusammenfassung der Ergebnisse:

Tab. 35: Zusammenfassung der Ergebnisse der Gruppe 1 und 2

Gruppe 1

 

FR3(s)

Summe

Gruppe 2

 

FR3(s)

Summe

  

mono

poly

   

mono.

poly

 

Komb.-PCR

mono

14

7

21

Komb.-PCR

mono

0

2

2

 

poly

0

14

14

 

poly

0

20

20

Summe

 

14

21

35

Summe

 

0

22

22

Um die höhere Empfindlichkeit der Kombinationsuntersuchung zu verifizieren, wurde der Test nach McNemar für nominal skalierte, abhängige Stichproben durchgeführt (Timischl 2000). Als Hypothese H0 wurde postuliert, dass kein signifikanter Unterschied zwischen PCR FR3(s) und Komb.-PCR besteht. Die Alternativhypothese H1 war eine signifikant unterschiedliche Sensitivität beider Methoden. Nach Mc Nemar errechnet sich u2, indem das Quadrat der [Seite 60↓]Differenz von jeweils in einem Verfahren monoklonalen Fällen [(0-7)2=49] durch die Gesamtanzahl der in beiden Methoden unterschiedlich bewerteten Fälle [0+7=7] dividiert wird (Timischl 2000). Der Wert für u2 beträgt demnach 7. Bei einem Freiheitsgrad von 1 und einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% ist der kritische Wert für u2 3,84. Da u2 größer als der kritische Wert ist, muss die Hypothese H0 abgelehnt werden. Es gilt H1, innerhalb des untersuchten Kollektivs von an CBCL erkrankten Personen besteht ein signifikanter Unterschied der Sensitivitäten beider Methoden. Unter Einbeziehung der oben errechneten Prozentwerte ist die diagnostische Sensitivität der Kombination der vier PCR innerhalb der Stichprobe signifikant höher.

Eine weitere Möglichkeit einen signifikanten Unterschied zwischen zwei Testmöglichkeiten zu erkennen, ist die Berechnung eines Konfidenzintervalles für die entsprechenden Testergebnisse (Timischl 2000). Da die Anzahl der untersuchten Proben n>20 und die Anzahl der monoklonalen Proben (m) 10 ≤ m ≤ n-10 beträgt, kann man in folgender Weise vorgehen:

(Timischl 2000)

h:relative Häufigkeit mit der das erwartete Ergebnis eintritt
z 1- α/2:Wert der Verteilungsfunktion für einen Fehler α von 5%=1,96
n:Stichprobenumfang

Setzt man für h=p=0,4 für die FR3(s)-PCR und für n=35 so ergibt sich ein Konfidenzintervall von 24%-56%. Analog ergibt sich für die Kombination aller PCR ein Konfidenzintervall von 54%-76%. Das heißt tendentiell bringt Kombination aller PCR ein besseres Ergebnis, ein signifikanter Unterschied besteht bei dieser Methode allerdings nicht.

Im zweiten Kollektiv wurden mit der PCR FR3(s) nur polyklonale Fälle gefunden, was einer diagnostischen Spezifität von 100 % innerhalb der Stichprobe entspricht. Bei der FR2-PCR(n) wurde zweimal ein monoklonales Amplifikat nachgewiesen. Die Spezifität der Kombination aller PCR beträgt daher nur 91%. Statistisch konnte kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Methoden gefunden werden. (s. Tab. 36)

Tab. 36: Erfassung der Signifikanz des Unterschiedes der Spezifität mit dem Test nach Mc Nemar

H0: Spezifität(FR3(s)) = Spezifität (Komb.-PCR)

H1: Spezifität(FR3(s))≠ Spezifität (Komb.-PCR)

Freiheitsgrad= 1

Irrtumswahrscheinlichkeit= 5%

kritischer Wert für u2= 3,84

u2= (2-0)2/ (2+0)

u2= 2

2< 3,84

→ H0 angenommen

(Timischl 2000)

Die kombinierten PCR erfordern einen erheblichen Arbeitsaufwand. Es sind insgesamt sieben verschiedene PCR-Ansätze pro Probe nötig. Bei Monoklonalität muss die jeweilige PCR


[Seite 61↓]

wiederholt werden, um Pseudoklonalität auszuschließen. Ein derartiger Aufwand ist sicherlich in der Routinediagnostik als Screening nicht sinnvoll, aber in Einzelfällen wichtig.

Es sollte versucht werden, mit dem ersten Test möglichst viele Proben mit klonalen B-Zell Infiltraten herauszufinden, da somit eine weitere Untersuchung nicht mehr nötig ist. Eine Übersicht über die Sensitivitäten, die sich aus der jeweiligen Kombination verschiedener PCR ergeben, gibt Tab. 37.

Tab. 37: Sensitivität der angewandten PCR-Methoden

 

FR3(s)+

 

FR3(s)+

 

FR3(s)+

 

FR3s

FR1n

FR2n

FR3sn

FR1n

FR2n

FR3sn

FR1n+FR2n

FR1n+FR3sn

FR2n+FR3sn

FR1n+FR2n

FR1n+FR3sn

FR2n+FRsn

FR1n+

FR2n+

FR3sn

FR1n+

FR2n+

FR3sn

m/n

14/46

17/36

8/49

15/51

19/35

16/44

17/46

17/35

20/36

18/48

20/35

21/36

19/45

21/36

21/35

%

30,4%

47,2%

16,3%

29,4%

54,3%

36,4%

37,0%

48,6%

55,6%

36,0%

57,1%

58,3%

42,2%

58,3%

60,0%

n: Patientenproben mit amplifizierbarer DNA; m: Patientenproben monoklonal

Die größte Sensitivität hat die FR1-PCR mit 47%. Nachteilig ist, dass in 7% der amplifizierbaren Proben Pseudoklonalität auftrat. Ein Nachweis über die Reproduzierbarkeit eines monoklonalen Ergebnisses ist daher zwingend erforderlich. Da es sich um eine geschachtelte PCR handelt, sind somit vier PCR-Ansätze nötig. Ein weiterer Nachteil ist, dass in 30% der untersuchten Proben kein Amplifikat erhalten wurde. Aufgrund dieser Umstände scheint die FR1-PCR für DNA aus Paraffinschnitten als initiale Methode nicht geeignet.

Eine gleichhohe Sensitivität weisen die halbgeschachtelte und ungeschachtelte FR3-PCR auf (29% bzw. 30%), wahrscheinlich aufgrund ähnlicher Bindungsstellen am Genom. Aus zweierlei Gründen scheint die ungeschachtelte FR3-PCR geeigneter zu sein: 1. es ist nur ein Ansatz pro PCR nötig, 2. es trat keine Pseudoklonalität auf, so dass eine Wiederholung der PCR zur Überprüfung der Ergebnisse nicht unbedingt erforderlich ist. In ca. 30% der CBCL ist somit mit nur einem PCR-Ansatz ein Klonnachweis möglich. Daher sollte lediglich wenn mit der ungeschachtelten FR3-PCR kein Amplifikat erhalten werden kann, die FR3-PCR(sn) angewandt werden.

Danach muss entschieden werden, mit welcher PCR die restlichen ca. 70% der Proben weiter untersucht werden sollten. Die höchste, von uns erreichte Sensitivität, die bei der Kombination von zwei PCR erreicht werden kann, ergibt sich aus der Kombination der PCR FR3(s) mit der FR1-PCR und beträgt 54%. Mit nur insgesamt fünf PCR-Ansätzen werden somit bereits etwa 90%, der mit der Kombination aller vier PCR als monoklonal diagnostizierbaren Proben, erfasst. Die restlichen 10% können mit der FR3-PCR(sn) und der FR2-PCR(n) erkannt werden. Ob sich der Aufwand von zusätzlichen vier PCR-Ansätzen lohnt, um die Sensitivität von 54% auf 60% zu erhöhen, sollte von Fall zu Fall entschieden werden. Die FR2-PCR(n) sollte jedoch nur verwendet werden, wenn alle andere Möglichkeiten erschöpft sind, da die Validität der PCR [Seite 62↓]aufgrund des hohen Anteils an Pseudoklonen und der geringeren Spezifität fraglich ist.

So kann folgendes Schema empfohlen werden:

Abb. 17: Fließschema für die PCR-Diagnostik:

*nur wenn das molekularbiologische Ergebnis unbedingt erforderlich ist

3.8 Statistische Bewertung

Um die Ergebnisse des Tests auf die Gesamtpopulation übertragen zu können, müsste die Stichprobe genügend groß gewählt werden. Nach Clauß und Ebner (1978)berechnet sich die Stichprobenmindestgröße bei nominalskalierten Daten nach der Beziehung n≥u2*p*(1-p)/e2

(n: Umfang der Stichprobe, u: der u-Wert, der dem gegebenen Sicherheitsniveau entspricht, p: relative Häufigkeit, e: Absolutbetrag der Abweichung des empirischen relativen Häufigkeitswertes vom entsprechenden Parameter).

Bei einem Freiheitsgrad von 1 und einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% liegt der kritische u2 - Wert bei 3,84.

Ähnliche Untersuchungen ergaben eine Häufigkeit des monoklonalen Ergebnisses von etwa 65% bei CBCL (Cerroni et al. 1997, Bouloc et al. 1999, Alaibac et al. 2001, Child et al. 2001). Für die Variable p galt demzufolge dieser Wert, wegen der großen Differenzen zwischen den einzelnen Publikationen wurde e=20% gewählt. Für Gruppe 1 folgt, dass der Stichprobenumfang größer als 22 sein muss. Für Gruppe 2, wo p nahe 100% liegen sollte, wurde p=95% und e=5% gesetzt, es ergibt sich, das n>73 sein muss.

Aufgrund der zu kleinen Stichprobengröße in Gruppe 2 können die Ergebnisse nicht ohne weiteres auf die Gesamtpopulation übertragen werden. Außerdem war die Auswahl der Kontrollen nicht zufällig, da nur Material von diagnostischen Hautbiopsien, nicht aber von Gesunden untersucht werden konnte. Die quantitativen Ergebnisse der Vergleiche sollten nicht über die Stichprobe hinaus als uneingeschränkt gültig betrachtet werden, qualitativ ist jedoch mit einer höheren Sensitivität und gleichbleibender Spezifität bei der Kombination der vier PCR zu rechnen.


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3.9  Analyse der nicht primär kutanen Lymphome (Gruppe 3)

Insgesamt wurden sechs Patienten mit einem primär extrakutanen Lymphom untersucht. Eine Ausnahme bildet ein Fall von Mycosis fungoides (MF): Die Erkrankung manifestiert sich primär in der Haut, hatte sich aber zum Zeitpunkt der Probenentnahme bereits systemisch ausgebreitet. Obwohl es sich bei MF um ein prmär kutanes T-Zell Lymphom handelt, erfolgte die Einteilung in die Gruppe 3, da der Verdacht bestand, daß es auch zu einer klonalen Entartung der B-Zellen gekommen sein könnte.

In vier von sechs Fällen (66%) konnte ein monoklonales Amplifikat nachgewiesen werden (Tab. 38). Die größte Sensitivität hat die FR1-PCR mit 50%.

Tab. 38: Ergebnisse der Gruppe 3:

Art

Material

Proben-Nr.

FR1(n)

FR2(n)

FR3(sn)

FR3(s).

B-NHL

Tonsille

P658

m

p

m

p

B-NHL

Lymphknoten

P757

m

X

ol

k.A.

B-NHL

Hautmetastase

1217/01

p

p

p

p

MF

PBMC

878/01

ol

X

ol

m

MALT-Lymphom

Colonbiopsie

621/01

p

p

p

k.A.

MALT-Lymphom

Lunge

P655

m

m

m

k.A.

Legende:
X: pseudoklonal; ol: oligoklonal


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12.05.2004