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4  Diskussion

4.1 Konventionelle Methoden zur CBCL-Diagnostik

In der Diagnostik kutaner B-Zell-Lymphome kommen zur Zeit eine Vielzahl von Methoden zum Einsatz.

Größtes differentialdiagnostisches Problem sind die kutanen lymphatischen Hyperplasien bzw. Pseudolymphome. Standard in der Diagnostik der CBCL ist neben der klinischen Untersuchung die Histopathologie. Für die Diagnose lymphoidzelliger Proliferationen der Haut ist die Beurteilung der Infiltratarchitektur und eine genaue zytomorphologische Charakterisierung der Zellen notwendig. Dies ist schwierig und erfordert intensives Training (Kerl et al. 1994). Caro und Helwig (1969) versuchten eindeutige Kriterien für die Unterscheidung von CBCL versus Pseudolymphom zu ermöglichen. Eine Übersicht über diese Kriterien zeigt Tabelle 39:

Tab. 39: Unterschiede von B-Zell Lymphomen und B-Zell Pseudolymphomen

Histologie

B-Zell Lymphom

B-Zell-Pseudolymphom

Architektur

Zunahme des Infiltratvolumens und der Dichte in der Tiefe („bottom heavy“; „cone shaped“),

Aufbau asymmetrisch

keilförmige Abnahme des Infiltrats in der Tiefe

(„top heavy“, „wedge-shaped”),

Aufbau symmetrisch

Infiltrat

monomorph, dicht, schlecht abgegrenzt, infiltrierendes Wachstum,

adnexielle Strukturen betroffen

polymorph, weniger dicht, gut abgegrenzt

Keimzentren

selten, mit dünnem Randwall (Verlust des zonalen Aufbaus)

oft mit dickem Randwall

Epidermale Veränderungen

(Atrophie/Hyperplasie;

Hyperkeratose etc.)

selten

häufig

Fibrotische Veränderungen um das Infiltrat

gelegentlich

selten

Gefäße

keine vermehrte Anzahl von 

Gefäßen

zahlreiche Gefäße mit plumpen Endothelzellen häufig

Eosinophilie/Makrophagen

selten

häufig

Nekrosen

möglich

fehlen

aus (Fritsch 1998, S.642, Santucci et al. 1991, Cerroni und Kerl 1994b)

Das mikroskopische Bild der CBCL ist jedoch abhängig vom Krankheitsstadium und ein fließender Übergang zwischen Pseudolymphom zu Lymphom ist möglich. So fanden Baldassano et al (1999) keine Unterschiede in der Architektur des Infiltrats (bottom heavy, top heavy) und keine Unterschiede bezüglich der Eosinophilie bei kutanen lymphatischen Hyperplasien und bei Marginalzonenlymphomen. Entgegen der bisherigen Erkenntnisse konnten sie Keimzentren signifikant häufiger in Marginalzonenlymphomen als in Pseudolymphomen nachweisen.

Biopsien von Läsionen der perivaskulären Dermatitis oder der lymphatischen Infiltration der Haut (Typ: Jessner Kanof) enthalten häufig atypische mononukleäre Zellen, aber wenige [Seite 65↓]Keimzentren innerhalb des dermalen Infiltrats und der Dermis und sind somit schwer von frühen Infiltraten eines CBCL abgrenzbar (Santucci et al. 1991, Kempf et al. 1999). Fremdkörperreaktionen, z.B. von Tätowierungen oder Insektenstichen, können ebenfalls histologische Merkmale kutaner B-Zell-Lymphome aufweisen (Santucci et al. 1991).

Besonders in frühen Stadien der CBCL ist es deswegen nur selten möglich, anhand einer einzelnen Biopsie eine sichere Diagnose zu stellen. Mehrere, von unterschiedlichen Läsionen und zu unterschiedlicher Zeit entnommene Gewebeproben sind notwendig, um eine endgültige Zuordnung vorzunehmen (Rijlaarsdam et al. 1990). Dies stellt eine höhere Belastung des Patienten dar.

Immunhistochemische Untersuchungen gehören heute zu den etablierten Verfahren in der Diagnose kutaner Lymphome. Die Immunphänotypisierung gestattet in Zweifelsfällen die Abgrenzung von nicht lymphatischen großzelligen undifferenzierten Tumoren sowie die Unterscheidung von B- und T-Zelltumoren (Kerl et al. 1994). Dies trifft jedoch nur eingeschränkt für die Früherkennung des Krankheitsbildes zu (Arnold et al. 1983).

Für die Differentialdiagnose gegenüber benignen Hautinfiltraten ist die Analyse der Immunglobulinleichtketten bedeutsam. Monotypische Leichtkettenexpression deutet auf ein CBCL hin (Santucci et al. 1991). Ein Nachweis dieser gelingt in etwa 60% der CBCL (Baldassano et al. 1999).

Wenn aber in der initialen Phase eines malignen Prozesses eine große Anzahl von „normalen“ Zellen im Präparat vorhanden ist, ist eine Darstellung der Immunglobulin-Leichtkettenrestriktion nicht möglich (Arnold et al. 1983). Insgesamt ist es aufgrund des hohen Hintergrundsignals durch unspezifische Antikörperbindung manchmal schwer zu beurteilen, ob eine Leichtkettenrestriktion vorhanden ist (Hughes et al. 2001). Hinzu kommt, dass einige B-Zell Infiltrate, benigne oder maligne, keine Immunglobuline exprimieren (Cerroni und Kerl 1994b).

Die unterschiedliche Expression von CDw75 (LN1), die hilfreich ist in der Differenzierung von follikulären Lymphomen von floriden reaktiven follikulären Hyperplasien der Lymphknoten, kann nicht für die Unterscheidung von Pseudolymphomen und kutanen follikulären Lymphomen eingesetzt werden (Cerroni und Kerl 1994b).

Ritter et al. (1994) fanden heraus, dass ein Infiltrat mit >75% B-Zellen, Koexpression von CD-43 (Marker für myeloische Zellen) und CD-20, abnormale CD-45RA-Expression in den Keimzentren und ein Nachweis von PCNA („proliferating cell nuclear antigene“) auf mehr als 30% der Zellen stark auf ein primär kutanes Lymphom hindeutet.

Baldassano et al.(1999) konnten jedoch mit ihrer Studie keine Koexpression von CD20 und CD43 nachweisen. Sie vermuteten, dass es sich bei den CD43+, CD20+ Fällen, beschrieben von [Seite 66↓] Ritter et al, um andere B-Zell Neoplasien, wie z.B. Mantelzelllymphome gehandelt habe.

Ein weiterer Parameter für die Diagnose eines CBCL ist eine B:T Zell-Ratio >3:1 (Baldassano et al. 1999). Sie ist jedoch nicht bei T-Zell reichen CBCL zu finden (Cerroni und Kerl 1994b). Wenn die Immunohistochemie auch einen großen Fortschritt gegenüber ausschließlich klinischer und histologischer Untersuchungen darstellt, so kommt auch sie an ihre diagnostischen Grenzen.

4.2 Molekularbiologische Methoden zur CBCL-Diagnostik

4.2.1 Nachweis eines klonalen IgH-Rearrangements

Der Nachweis von Klonalität, sowohl mit der Southernblot als auch mit der PCR und den verschiedenen Varianten der Produktanalyse, beruhen auf dem Ansatz, dass jede B-Zelle ihr individuelles Rearrangement besitzt, und dass nur klonale B-Zellen identische Rearrangements haben. Landa et al (1993) konnten zeigen, dass die molekularbiologischen Methoden gegenüber der Immunophänotypisierung wesentlich sensitiver sind. Bis auf wenige Ausnahmen gibt es keine entzündlichen oder physiologischen Zustände bei denen eine B-Zell Monoklonalität vorgefunden wird (Kempf et al. 1999).

Aus dem gemeinsamen Ansatz der molekularbiologischen Verfahren ergeben sich neben den Vorteilen auch die grundsätzlichen Nachteile dieser Verfahren:

Das Vorhandensein einer monoklonalen B-Zellvermehrung ist nicht eindeutig pathognomonisch für ein CBCL (Rijlaarsdam et al. 1992, Landa et al. 1993). Es gibt auch benigne Dermatosen mit klonaler B-Zellproliferation, die unter Umständen schwer von den CBCL zu unterscheiden sind:

Z.B. die Lymphadenosis cutis benigna (Kempf et al. 1999), die lymphatische Infiltration der Haut vom Typ Jessner Kanof, Fremdkörperreaktionen z.B. Tätowierungen oder Insektenstichreaktionen (Santucci et al. 1991), aber auch chronische Entzündungen der Haut und Autoimmunerkrankungen (Baldassano et al. 1999).

Diese Beobachtung führte zu der Hypothese nach der solche B-Zell Pseudolymphome in Wirklichkeit niedrig maligne kutane B-Zell Lymphome sind (Burg et al. 1994). Der Übergang von einem Pseudolymphom zum kutanen Lymphom ist beschrieben worden (Shelley et al. 1981, Wood et al. 1989, Rijlaarsdam et al. 1992, Hammer et al. 1993).

Das kann nicht allein dadurch erklärt werden, dass die Hautläsionen zuvor klinisch und histologisch falsch diagnostiziert wurden. Des weiteren erklärt dieses Phänomen, warum es nicht möglich ist, eindeutige klinische und histologische Kriterien für die Unterscheidung Pseudolymphom versus CBCL zu finden. Die Bedeutung von „klonalen Pseudolymphomen“ ist unklar, da sowohl Pseudolymphome als auch, bis auf wenige Ausnahmen, die CBCL eine gute Prognose haben.


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Die Chance, dass Patienten mit klonalen Pseudolymphomen an einem systemischen Lymphom erkranken ist sehr gering. Rijlaarsdam et al., (1992) empfehlen dennoch eine Eradikation der Hautläsionen und ein Monitoring dieser Patienten.

Neben der Spezifität ist die Sensitivität der Methode von entscheidender Bedeutung. Die monoklonale Proliferation der malignen Zelle findet immer in der Umgebung anderer B-Zellen statt, deren junktionale Region Unterschiede zum Klon aufweist. Im Gegensatz zu Veränderungen, deren Auftreten allein pathognomonisch für eine Neoplasie ist, wie z.B. der BCR-ABL-Rekombination bei etwa einem Drittel aller adulten ALL-Fälle (Bartram 1993), muss bei den genannten Verfahren die Prädominanz einer Veränderung (monoklonales Rearrangement) gegenüber einem Hintergrund ähnlicher Merkmale (polyklonale Rearrangements) dargestellt werden. Insofern ist die Sensitivität in einem hohem Maße von dem Auflösungsvermögen der produktdarstellenden Verfahren abhängig (Trainor et al. 1991).

Ungewöhnliche oder aberrante Rekombinationen sowie Mutationen der einzelnen IgH-Gene können auftreten, die mit den eingesetzten Primern bzw. Sonden nicht erfasst werden und zu falsch negativen Ergebnissen führen (Bouloc et al. 1999, Golembowski et al. 2000).

Dennoch ist die molekularbiologische Technik sensitiver als histologische bzw. immunophänotypische Techniken (Kitamura et al. 1996). Wood et al.(1989) konnten zeigen, dass in frühen Infiltraten, die in der Immunphänotypisierung noch keine Leichtkettenrestriktion zeigten, ein klonales Rearrangement bereits nachgewiesen werden kann.

4.2.1.1 Southernblot

Für einen langen Zeitraum war Southern Blotting die meist angewandte Methode zum Klonalitätsnachweis in der Diagnostik kutaner Lymphome. Mit der Entwicklung der PCR-Methoden, wurde das Southern Blotting aufgrund folgender Nachteile abgelöst:

Man benötigt eine große Menge intakter DNA, d.h. ca. 10µg (Mc Carthy et al. 1990). Da die DNA hochmolekular (30-50kb) (Lehmann et al. 1995) sein muss, ist eine Analyse von Paraffinproben oft nicht möglich (Mc Carthy et al. 1990). Die Technik ist mit einem hohen Zeitaufwand verbunden, von der DNA-Extraktion bis zur Auswertung werden mindestens 2-3 Tage benötigt. Der gerätetechnische Aufwand ist ebenfalls groß, nicht zuletzt aufgrund der radioaktiven Detektion der Rearrangements (Volkenandt et al. 1994).

Durch unspezifische Adhärenz des radioaktiven Materials an der Membran und durch degradierte DNA kann es entweder zur Maskierung rearrangierter Banden kommen, oder zur Entstehung von pseudoklonalen Banden. Die Interpretation des Blotbildes bereitet Schwierigkeiten, da Banden der Keimbahnkonfiguration und Banden aus dem polyklonalen Hintergrund mit den monoklonalen Banden interferieren (Cossman et al. 1991). Mit der Methode [Seite 68↓]ist ein Nachweis von klonalen Zellen in einem Gemisch mit polyklonalen Zellen bis zu einem Anteil von 1-5% möglich (Curco et al. 1997).

4.2.1.2 PCR-Techniken

Aufgrund ihrer Vorteile wurde die PCR-Technik für die routinemäßige Diagnostik der CBCL etabliert. Im Gegensatz zum Southernblot werden bei der IgH-PCR wesentlich kleinere Fragmente mit einer Länge von 100 bis höchstens 550 bp untersucht. Aufgrund der exponentiellen Amplifikation während der PCR können vergleichsweise geringe Mengen (20ng) analysiert werden (Hoeve et al. 2000). Dies ist besonders in der Routinediagnostik von Bedeutung, wenn nur kleine Mengen von z.T. degenerierter DNA aus Paraffinschnitten vorhanden sind, und wenn, vor allem bei Hautbiopsien, viele nicht lymphatische Zellen in der Probe vorhanden sind.

Weitere Vorteile sind, dass der Zeitaufwand sehr gering ist d.h., die Diagnostik ist innerhalb eines Tages möglich. Auf Radioaktivität kann verzichtet werden (Volkenandt et al. 1994). Nach der elektrophoretischen Auftrennung der PCR-Produkte ist eine weitergehende Analyse, zum Beispiel eine Sequenzierung und Konstruktion patientenspezifischer Primer zur Verlaufskontrolle, möglich.

Die Sensitivität der Methode wird vom Anteil der nichtklonalen Zellen, die ein rearrangiertes IgH-Gen besitzen und vom verwendeten Separationsverfahren bestimmt.

Die Angaben in der Literatur zur Sensitivität der IgH-PCR schwanken je nach Elektrophoresemethode zwischen 0,5%-5% (Mc Carthy et al. 1990, Trainor et al. 1991, Diss et al. 1993, Lehmann et al. 1995, Tierens et al. 1996, Ayling und Iland 1999, Fodinger et al. 1999, Theriault et al. 2000, Elenitoba et al. 2000), einige konnten Klonalität bis 0,001% nachweisen (Brisco et al. 1990, Sugahara et al. 1999). Die Daten beziehen sich auf eine Verdünnung von monoklonaler DNA mit DNA reaktiver Lymphozyten aus Tonsillen oder PBMC. Nihal et al.(2000) konnten zeigen, dass die Sensitivität sehr stark vom Anteil der polyklonalen Zellen abhängig ist. Bei der Verdünnung von klonalen Zellen mit einer Karzinomzelllinie SCC-13, welche kein Rearrangement des IgH-Gens zeigt, war die Detektionsrate 0,25-1%, bei der Verdünnung mit DNA einer reaktiven Tonsille lag die Detektionsrate nur noch bei 30-40%. In unserer Untersuchung konnte eine Sensitivität von 0,5% bzw. 2,5% trotz Verdünnung mit DNA von PBMC erreicht werden.

Unabhängig davon, dass wahrscheinlich alle malignen B-Zellerkrankungen klonal auftreten, ist ein monoklonales Analyseergebnis nicht pathognomonisch für ein CBCL wie unter 4.1. beschrieben.

Falsch monoklonale Ergebnisse können aber auch andere Ursachen haben:

Aufgrund der Fähigkeit der PCR DNA-Fragmente millionenfach zu amplifizieren, kann die Kontamination des PCR-Reaktionsgemisches selbst mit geringen Mengen DNA eine starke, [Seite 69↓]falsch monoklonale Bande in der Elektrophorese produzieren (Volkenandt et al. 1993). Deshalb führten wir bei jedem PCR-Ansatz immer eine Negativkontrolle durch. Sind bei dieser Probe Banden im spezifischen Größenbereich zu erkennen, so ist der gesamte Ansatz zu wiederholen (Diaz-Cano 1996). Bei der in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen konnte keine Kontamination festgestellt werden.

Des weiteren kann es bei einem sehr geringen Anteil von B-Lymphozyten im entnommenen Bioptat durch eine exponentielle Amplifikation einer der wenigen im Extrakt enthaltenen IgH-Rearrangements zu einer Imitation monoklonaler Banden kommen (Diaz-Cano 1996, Hoeve et al. 2000, Elenitoba et al. 2000). Bereits bei einer Verdünnung polyklonaler DNA mit plazentärer DNA im Verhältnis von 1:200 bei einer Gesamtkonzentration von 50 ng/µl entstehen pseudoklonale Banden (Elenitoba et al. 2000). Storch-Hagenlocher et al. (2000) konnten zeigen, dass es bei einer geringen Konzentration an polyklonaler DNA zur Entstehung von unvollständigen sogenannten oligoklonalen Profilen im Genescan kommt, wie sie auch in unserer Untersuchung beobachtet wurden (3.4.2). Wurde die Konzentration der polyklonalen DNA noch weiter verringert, reduzierte sich das Profil auf nur noch ein oder zwei Banden im Genescan und täuschte so ein falsch klonales Ergebnis vor. Aufgrund dieser Problematik empfiehlt es sich, nicht weniger als 50ng DNA mit einem Anteil an B-Zellen von mindestens 10% (5 ng) in der PCR einzusetzen (Elenitoba et al. 2000). Möglicherweise war der Anteil an B-Zellen in den von uns untersuchten Hautproben nicht immer ausreichend, so das Pseudoklonalität angezeigt wurde.

Die Gefahr ein „pseudoklonales Ergebnis“ zu erhalten, besteht auch dann, wenn jeweils nur ein fam-Primer pro PCR-Ansatz verwendet wird (monoplex-PCR). Z.B. beim Primer für die VH6-Familie, da B-Zellen mit VH6-Rearrangement, aufgrund der Tatsache, dass zu dieser Genfamilie nur ein VH-Gen gehört, im Bioptat unterrepräsentiert sind. Aus diesem Grunde wurden in unserer Arbeit nur fam-Primer im Multiplex-Ansatz verwandt.

Aber auch bei der Verwendung von cons-Primern kann es, aufgrund der Heterogenität im Primerbindungsbereich der einzelnen rearrangierten IgH-Gene, zu einer nichtproportionalen Amplifikation einzelner Rearrangements kommen und damit zur Vortäuschung monoklonaler Banden (Zhou et al. 1999, Ritter et al. 1997). Diese Tatsache könnte bei der durchgeführten FR3-PCR(sn) unserer Untersuchungen zu pseudoklonalen Ergebnissen geführt haben.

„Pseudoklonale“ Peaks bzw. Banden, wie auch von uns beobachtet, sind nicht reproduzierbar (Storch-Hagenlocher et al. 2000). So fanden Ritter et al. (1997) in 18 von 40 benignen Infiltraten Monoklonalität, aber nur in vier Fällen war die monoklonale Bande reproduzierbar. Aufgrund dieser Tatsache ist es wichtig, jede Probe in zwei unabhängigen PCR-Assays zu analysieren (Brisco et al. 1990, Elenitoba et al. 2000). Außerdem sind hochauflösende Elektrophoresetechniken [Seite 70↓](Genescan) zu verwenden, um auch noch geringe Unterschiede in der Größe eines/einer klonalen Peaks/Bande zu erkennen (Hoeve et al. 2000, Storch-Hagenlocher et al. 2000).

Ein weiterer Faktor, der zur Entstehung eines falsch klonalen Ergebnisses beitragen kann, ist die Existenz von mikroklonalen B-Zell Populationen, entstanden durch Antigenstimulation bei einem reaktiven Prozess. Dies wird besonders dann zum Problem, wenn „microdissected“ Material verwendet wird (Elenitoba et al. 2000). („Microdissected“ bedeutet, dass unter mikroskopischer Sicht ein suspekt erscheinendes Areal eines histologischen Schnittes zunächst mit einer Nadel mobilisiert wird und dann unter Zugabe eines Wassertropfens aspiriert wird.) Denn lokal entstandene Mikroklone können reproduzierbare Banden erzeugen und somit den akzeptierten Kriterien für Monoklonalität genügen. Aus diesem Grunde wurde in unserer Untersuchung kein „microdissected“ Material verwandt. Auch wenn höhere Sensitivitäten erreicht werden können (Signoretti et al. 1999), sollten Daten von Untersuchungen mit „microdissected“ Material kritisch bewertet werden (Zhou et al. 1999).

Nicht amplifizierbare DNA, wie auch in unserer Arbeit z.B. bei FR1 in bis zu 30% der Proben vorhanden, kann von verschiedenen technischen Problemen, wie schlechte DNA-Qualität, zu wenig Material, oder Kontamination mit inhibitorisch wirkenden Agenzien (z.B. Ethanol, Schwermetalle) resultieren. Bei dem Vergleich von Kryoproben versus Paraffinproben konnten einige Untersucher eine Gleichwertigkeit beider nachweisen (Hughes et al. 2001), andere wieder konnten zeigen, dass mit Kryoproben bessere Resultate erzielt werden können (Hoeve et al. 2000).

In unserer Untersuchung standen nur wenige Kryoproben zur Verfügung, so dass ein Vergleich Kryo- versus Paraffinproben nicht möglich war. Die hauptsächliche Verwendung von Paraffinproben könnte jedoch Ursache dafür sein, dass einige Proben nicht amplifizierbar waren.

Falsch polyklonale Ergebnisse, wie in unserer Arbeit zu 40% vorhanden, entstehen, wenn der Anteil klonaler Zellen unter der Sensitivitätsgrenze liegt (Diaz-Cano 1996), oder die Primer nicht binden können. Letzteres kann verschiedene Ursachen haben: Zum einen Mutationen des Primerbindungsbereiches, häufig bei Keimzentrumszelllymphomen (Golembowski et al. 2000).

Zum anderen inkomplette Rearrangements oder Translokationen, die den IgH-Komplex mit einbeziehen (Hoeve et al. 2000).

Bei der Verwendung von cons-Primern, die wir für die FR3(sn), FR3(s) und FR2(n) verwandten, besteht die Gefahr, dass bestimmte seltene Rearrangements des VH oder JH-Gens nicht erkannt werden (Hoeve et al. 2000).

Ein weiteres Problem ist die Demaskierung klonaler Banden aufgrund der weiter oben schon erwähnten ungleichen Amplifikation einzelner Segmente oder degradierter DNA, die dann [Seite 71↓]häufig zu unvollständigen Profilen im Genescan führen und somit Oligoklonalität vortäuschen. Auf diese Möglichkeit wurde in unserer Untersuchung bereits hingewiesen (siehe Abschnitt 3.6.).

Auswahl des geeigneten Genortes

Es besteht die Möglichkeit das IgH-Gen oder die beiden IgL-Gene κ, λ für die PCR als Matrizen zu verwenden.

Die klonalen Zellen können entweder den κ oder den λ-Genort rearrangeriert haben.

Deshalb muss man sowohl für das κ-Gen als auch für das λ-Gen eine PCR durchführen, um alle möglichen Rearrangements zu erfassen. Unter den 76 Vκ und ca. 70 Vλ Segmenten gibt es nur wenig Homologien, so dass in der Routine viele PCR-Ansätze nötig wären, um genügend Rearrangements zu erfassen (Hoogeveen et al. 1998). Verschiedene Versuche wurden unternommen, um die Vielzahl der zu amplifizierenden Gensegmente zu reduzieren. Shiokawa et al.(1998) verwendeten cDNA. Dies reduzierte die Anzahl der V-Segmente, da nur die funktionalen Segmente als mRNA transkribiert werden. Außerdem konnte man die Schwierigkeit der Amplifikation der verschiedenen J-Segmente umgehen, indem man einen Primer für die konstante Region verwendete. Die Verwendung von mRNA ist allerdings erstens, nur sehr eingeschränkt bei Paraffinproben möglich, und zweitens, durch die ubiquitär vorkommenden RNAsen, sehr störanfällig. Falsch monoklonale Banden können durch Überrepräsentation von Amplifikaten reaktiver B-Zellen entstehen, während klonale Banden durch Amplifikate polyklonaler B-Zellen maskiert werden können.

In der hier durchgeführten Untersuchung wurde nur eine PCR für Vκ durchgeführt. Die alleinige Verwendung der Vκ-Segmente erfasst etwa 70% aller B-Zellen und kann somit die Anzahl der PCR-Ansätze reduzieren (Gong et al. 1999).

Ein anderes Problem ist die geringe Längenvariabilität der CDR3-Region von nur 10-15 Basenpaaren aufgrund der fehlenden D-Segmente. Dies macht es schwierig, klonale von polyklonalen Proliferationen bei der Verwendung von Agarose- oder Polyacrylamidgelen zu unterscheiden (Shiokawa et al. 1998). Vermutlich ist dies auch der Grund dafür, dass bei der in dieser Arbeit verwendeten IgL-PCR die Genescan-Analyse nur ein bis zwei breite Peaks zeigte (siehe Abschnitt 3.2.5).

Aufgrund dieser Schwierigkeiten wird fast ausschließlich der IgH-Genlokus für die verschiedenen PCR-Ansätze gebraucht. Er rearrangeriert in der B-Zell Entwicklung vor dem IgL-Lokus, so dass auch klonale Zellen, die von einem früheren Entwicklungsstadium ausgehen, erfasst werden. Es handelt sich im Gegensatz zum IgL-Gen nur um einen Genort und durch das D-Segment ist eine ausreichende Längenvariabilität der CDR3-Region vorhanden. Der IgH [Seite 72↓]Lokus enthält 123 V-Segmente, 25 D-Segmente und 9 J-Segmente (Matsuda et al. 1998). Dreiundachtzig der V-Segmente und drei der J-Segmente sind Pseudogene. Pseudogene sind fehlerhafte Gene, die strukturell einem funktionellen Gen ähneln, deren Produkte jedoch nicht exprimiert werden. Wenn man davon ausgeht, dass alle B-Zellen zumindest ein Allel mit einem funktionalen Rearrangement besitzen, so kann man die Pseudogene bei der Primerwahl vernachlässigen. Sowohl die V- als auch die J-Segmente enthalten homologe Sequenzabschnitte (Framework-Regionen), die die Konstruktion von Konsensusprimern möglich macht. Zusätzlich können Primer für die Leader-Region, die dem V-Segment vorgelagert ist, verwendet werden. Jeweils ein Primer für das V- und einen für das J-Segment pro PCR-Ansatz führen immer zur Amplifikation der CDR3-Region, die den klonspezifischen Marker darstellt.

Analyse der verwendeten Primerkombinationen

Die Analyse aller Primersysteme erfolgte mit der Oligo 5.0 Primer Analysis Software. Dabei wurden die Doppelstrangbildungen der einzelnen Primer sowie der Primer untereinander, die Schmelztemperaturen und die interne Stabilität der spezifischen Primer-DNA-Doppelstränge untersucht (2.2.11.4).

Relevante Doppelstrangbildungen der 3’Enden zeigten sich bei vier der untersuchten JH-Primer, bei zwei Primern für die Leaderregion jedoch nicht bei den FR3-Primern. Bei der Testung der Multiplex-Systeme zeigten alle getesteten Systeme, bis auf die FR3-PCR 3.1 und 3.2 Bindungen dieser Art mit einem Betrag der freien Enthalpie bis 10 kcal/mol. Doch gerade die PCR 3.1 und 3.2, welche laut Oligo-Programm gut funktionieren sollten, stellten sich bei der praktischen Testung als nicht geeignet heraus. Damit ist der prädiktive Wert der theoretischen Primersuche in Frage zu stellen.

Die Höhe des dG Betrages für 3‘ Dimere scheint mit dem Auftreten unspezifischer Banden kleiner Größen zu korrelieren: Während bei der PCR3.5 [FR3-PCR(sn)] mit 3‘Dimeren mit einem dG Betrag bis 5 kcal/mol kaum unspezifische Produkte kurzer Längen beobachtet wurden, traten beim Multiplexprimer-System der FR1-PCR mit einem Betrag für dG bis 10 kcal/mol mehrere Banden dieser Art auf (s. 3.2.1.2.2; 3.2.2.2) Die Größe der Produkte entspricht nicht immer der erwarteten Länge für Dimere von etwa 25-40bp. Es zeigen sich häufig größere Banden, die auch von PCR zu PCR variieren können. Wahrscheinlich handelt es sich dabei um eine Vergrößerung der Dimere entsprechend einer Primerlänge durch fortwährende Anlagerung der 3’Enden. Eine solche Reaktion entzieht sich aufgrund ihrer Komplexität der Simulationssoftware.

Die 5‘Dimere könnten Ursache für eine geringere Ausbeute der PCR sein, wenn ein großer Teil des vorhandenen Primers 5’ Doppelstrangbindungen eingeht.


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Die Schmelztemperaturen der Haarnadeln lagen bei dem größten Teil der Primer unter 40°C. Da die Anlagerungstemperatur bei allen durchgeführten PCR-Assays mindestens 52°C betrug, stellten die Haarnadeln größtenteils kein Hindernis für den Ablauf der PCR dar.

Bei der Untersuchung der Schmelztemperaturen der einzelnen Primer zeigten die Multiplexsysteme der Leader- und FR1-PCR große Differenzen von bis zu 25°C. Ob dies für die Effizienz der PCR eine Rolle spielte, lässt sich schwer sagen, da auch die anderen unter Punkt 2.2.11.4. beschriebenen Kriterien für das Funktionieren einer PCR wie z.B. Dimerbildungen überschritten wurden. Allerdings zeigte sich auch bei der PCR 3.5 [FR3-PCR(sn)] in der 2. Runde Schmelztemperaturunterschiede bis zu 20°C bei ausreichender Effizienz der PCR.

Bei der Untersuchung der internen Stabilität der Primer ergaben sich auch für effiziente Primer [ FR3-Fodinger et al., FR1-Hayashi et al, FR1.1 und FR1.3 -Küppers et al.] nur mäßige Werte. Dieser Parameter scheint demnach von untergeordneter Bedeutung zu sein.

Eines wurde bei der Untersuchung der Primer mit der Simulationssoftware Oligo vor allem ersichtlich: Die Primer mit den degenerierten Basenabfolgen [FR1-Hayashi et al.; FR2 -Ramasamy et al.] stellen ein erhebliches Problem da. Da das Programm die Zeichen für degenerierte Basen (z.B. N für die Basen A, T, G oder C) nicht erkennt, sind alle Varianten einzeln einzugeben. Bei Primern, wo nur an ein oder zwei Stellen in der Basenabfolge zwei verschiedene Basen zur Auswahl stehen, besteht noch die Möglichkeit die daraus resultierenden vier Varianten einzeln mit dem Oligo zu untersuchen. Ist der Primer aber stärker degeneriert, wie z.B. der FR2-PrimernachRamasamy et al., so ergeben sich in diesem Fall schon 128 verschiedene Möglichkeiten. Diese müsste man zunächst alle einzeln untersuchen und anschließend im Multiplex-Programm. Des weiteren wird es bei Multiplex-Primersystemen schwierig sein, die einzelnen Primer so zu verändern, dass man ein zufriedenstellendes Ergebnis bezüglich der Dimerisierung erhält. Bei den hier durchgeführten Untersuchungen war es häufig so, dass, wenn ein Dimer zwischen zwei Primern beseitigt wurde, eine neue Dimerbildung mit einem anderen Primer entstand.

Dieser Aufwand steht nicht in Relation mit dem daraus resultierenden Nutzen. Denn letztendlich lässt sich doch nicht sicher vorhersagen, ob die PCR sich in der Praxis als effizient erweist, wie das bereits in diesem Abschnitt erwähnte Beispiel mit der PCR 3.1 und 3.2 zeigt.

Trotz der Schwierigkeiten, die bei der Verwendung von Multiplex-Primersystemen auftreten, sind sie von einigen Untersuchern verwendet worden (Deane und Norton 1991, Lehmann et al. 1995)

Meier et al. (2001) beschrieben eine Multiplex-PCR sogar mit 26 Primern, wiesen aber darauf hin, dass diese PCR nur für Proben mit einem Anteil klonaler Zellen von mindestens 5-10% funktionieren. Darüber hinaus untersuchten sie DNA-Proben von nodulären B-Zell-Lymphomen, welche sich durch einen höheren Anteil von Lymphozyten im Gegensatz zu DNA-Proben der [Seite 74↓]Haut auszeichnen.

Als Fazit ergeben sich daraus nur zwei Varianten: 1. Reduktion der Primer pro Ansatz durch Verwendung von wenig oder nicht degenerierten Primern und/oder Verteilung der Primer auf mehrere PCR-Ansätze um Dimerbildungen vorzubeugen, 2. Verstärkung der Effizienz der PCR durch Verwendung von geschachtelten PCR-Ansätzen. Ersteres hätte wieder einen großen Arbeits- und Zeitaufwand aufgrund der vielen PCR-Ansätze zur Folge. Deshalb wurde zur Bearbeitung der Aufgabenstellung auf die zweite Möglichkeit zurückgegriffen.

4.2.1.3 Wahl der Elektrophoresemethode

Für die Darstellung der Amplifikate stehen verschiedene Elektrophoresemethoden zur Verfügung: AGE, TGGE, CE (Kapillarelektrophorese-Genescan), PAGE (Polyacrylamidelektrophorese), DGGE (Denaturierende Gelelektrophorese), SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism). Die AGE sollte nicht verwendet werden, da aufgrund der geringen Auflösung eine Unterscheidung zwischen mono- und polyklonalen Amplifikaten nicht möglich ist (Aubin et al. 1995). Sie wurde in dieser Untersuchung nur zur Feststellung, ob ein Amplifikat vorhanden ist, verwendet.

Die für die Untersuchung der CBCL gewählte CE auf automatischen DNA-Sequenziergelen bietet mehrere Vorteile gegenüber den herkömmlichen Elektrophorese-Methoden: Durch die Auswertung der CE mit einer geeigneten Software können Längenunterschiede von einer Base detektiert werden. Anhand der Fragmentprofile aus verschiedenen Proben kann man so vergleichende Aussagen bezüglich des Klons machen, ohne zu Sequenzieren (Beaubier et al. 2000). Zusätzlich können durch die exakte Größenbestimmung Kontaminationen erkannt werden und so falsch klonale Ergebnisse vermieden werden. Die Grenze zwischen Polyklonalität und Monoklonalität wird durch die Berechnung der Ratio des klonalen Peaks objektivierbar (Lukowsky et al. 2002). Derkson et al.(1999) verglichen die PAGE, die SSCP mit radioaktiv markierten Primern und die CE mit fluoreszenzmarkierten Primern. Die CE hatte mit 69% die höchste Sensitivität, allerdings war der Unterschied zu den anderen Methoden nicht signifikant.

In den Verdünnungsreihen konnte eine höhere Sensitivität der CE gegenüber anderen Elektrophoresemethoden nachgewiesen werden (Galimberti et al. 1999, Beaubier et al. 2000).

Zusätzlich ergeben sich noch einige technische Vorteile: Der Arbeitsaufwand ist geringer, da die Analyse mit dem Genescan automatisiert abläuft, und somit keine Zeit für die Gelherstellung und anschließende Färbung aufgewandt werden muss. Eine verminderte Abhängigkeit von Polyacrylamid und seiner Toxizität ist ein weiterer Vorteil der CE. Nachteilig sind das teure Equipment und die höheren laufenden Kosten für die Reagenzien und Kapillaren (Beaubier et al. 2000).


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4.3  Diskussion der Vergleichsuntersuchungen

4.3.1 Gruppeneinteilung

Um bei differenten Analyseergebnissen verschiedener PCR einschätzen zu können, welches der beiden Resultate richtig ist, war die Einteilung in zwei Gruppen mit vorhersagbarer Klonalität unumgänglich. Dabei dienten Klinik und Histologie als Grundlage der Zuordnung. Unter diesen Bedingungen ist auch eine Korrelation von Klinik bzw. Histologie und Molekularbiologie möglich.

Gruppe 1 wurde als Kollektiv von Patienten definiert, deren Infiltrat monoklonal sein sollte, also Proben von Patienten mit klinisch und histologisch sicheren kutanem B-Zell Lymphom. Bei Patienten der Gruppe 2 wurde klinisch und histologisch ein CBCL ausgeschlossen. In Gruppe 3 wurden Patienten mit einem gesicherten Lymphom, welches sich systemisch manifestierte, eingeordnet. Ungeachtet dessen können in Gruppe 1 als auch in Gruppe 3 polyklonale Fälle auftreten, z.B. in den Anfangstadien, wenn die Anzahl monoklonaler Zellen unter der Nachweisgrenze des angewandten Verfahrens liegt (Diaz-Cano 1996), oder in fortgeschrittenen Stadien von B-Zell-Lymphomen, bei denen durch Mutationen keine Primerbindung mehr erfolgen kann (Golembowski et al. 2000, Galimberti et al. 1999). Ein klonales Ergebnis in Gruppe 2 ist zu erwarten, wenn einem CBCL mit unspezifischem klinischen und histologischen Bild eine andere Diagnose zugeordnet wurde bzw. wenn es sich um Diagnosen handelt, bei denen ein klonales Rearrangement in der Literatur beschrieben wurde (Rijlaarsdam et al. 1992, Landa et al. 1993). Die Auswahl der Patienten aus Gruppe 2 erfolgte nicht zufällig, sondern nur für Probanden, bei denen eine Probebiopsie entnommen wurde. Dies hat aber auch den Vorteil einer Fokussierung auf differentialdiagnostisch wichtige Dermatosen.

4.3.2 Ergebnisse des Vergleichs der PCR-Ansätze

Der Einsatz gleicher Mengen identischer DNA-Extrakte und ein identisches Verfahren zur Produktseparation erlaubten den Vergleich der verschiedenen PCR-Ansätze, da nur das Bindungsverhalten der verwendeten Primer Einfluss auf die Ergebnisse hatte.

Unterschiedliche Ergebnisse waren in erster Linie aufgrund der unterschiedlichen Erfassung der Segmente in beiden Systemen zu erwarten.

Mit 47% war die FR1-PCR die sensitivste, mit 16% die FR2-PCR die mit der geringsten Detektionsrate. Die höchste Sensitivität mit 60% ergab sich aus der Kombination aller vier PCR. Frühere PCR-Studien für die Detektion klonaler Populationen in systemischen B-Zell Lymphomen haben Sensitivitäten zwischen 40% und 100% berichtet. Eine Auswahl der wichtigsten Studien zeigt Tabelle 40:


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Tab. 40: Ergebnisse verschiedener Arbeiten zu nodulären Lymphomen bzw. Leukämien

Referenz

Lymphom-Typ

verwendete PCR

Monoklonal

Trainor et al. 1990

NHL, CLL

sn FR3

39/52 (75%)

Deane et al. 1991

ALL, CLL

sFR1 multi

109/116 (94%)

Ramasamy et al. 1992

ALL, NHL, CLL, MM

sn FR2

18/22 (82%)

Diss et al. 1993

MALT, CB/CC, CLL

sn FR2 und sn FR3

85/94 (90%)

Aubin et al. 1995

FCCL, MCL

sFR3, sFR2, sFR1cons, sFR1 multi

253/351 (72%)

Lehmann et al. 1995

NHL, CLL

sFR3, sFR1 multi

54/60 (90%)

Kitamura et al. 1996

NHL

nFR3, nFR2

27/31 (87%)

Linke et al. 1997

NHL, CLL, ALL

sn FR3

17/20 (85%)

Galimberti et al. 1999

NHL

sFR3, sFR2

34/46 (69%)

Legende:

NHL: Non-Hodgkin Lymphom

FCCL: Follikel-Zentrumszell-Lymphom

CLL: Chronisch lymphatische Leukämie

MM: Multiples Myelom

ALL: Akute lymphatische Leukämie

MALT: Lymphom des Mucosa assoziierten lymphatischen Gewebes

MCL: Mantelzelllymphom

cb/cc: zentoblastisch/zentrozytisches Lymphom

Legende:

Wenige Studien wurden bisher zu den CBCL durchgeführt. Auch hier schwanken die Detektionsraten stark (Tab.41):

Tab. 41: Eine Auswahl der Studien zu CBCL

Referenz

Lymphom-Typ

verwendete PCR

Monoklonal

Ritter et al. 1997

CBCL

sn FR3

12/35 (34%)

Cerroni et al. 1997

CBCL (MZL)

sn FR3

18/26 (69%)

Bouloc et al.1999

CBCL

s FR3

35/52 (66%)

Signoretti et al. 1999

CBCL

sn FR3

4/10 (40%)

Nihal et al. 2000

CBCL(12), NHL(6), Zelllinien (7)

n FR1 multi, s FR3

17/25 (84%)

Alaibac et al. 2001

CBCL (nur FCCL)

s FR1

10/15 (66%)

Child et al. 2001

CBCL

s FR1, s FR3, s leader

31/39 (79%)

Insgesamt ist zu erkennen, dass die Detektionsraten der Studien mit CBCL wie auch in unserer Arbeit kleiner sind, als die der systemischen Lymphome. Diese geringere Sensitivität könnte die häufiger auftretende somatische Hypermutation der VH-Region widerspiegeln, die zu einem Versagen der Amplifikation führt (Diss et al. 1993, Aubin et al. 1995). FCCL, MZL und „high grade“-Lymphome extranodalen Ursprunges zeigen hohe Mutationsraten, welches die geringere Detektionsrate gegenüber der B-CLL oder den Mantelzelllymphomen erklären würde (Essop et al. 1997, Hoeve et al. 2000). CBCL zeigen im Gegensatz zu NHL und Leukämien häufig einen hohen Anteil von reaktiven Zellen, welche die Signalintensität der monoklonalen Population reduzieren. Eine kleiner B-Zell Klon könnte somit unterhalb der Nachweisgrenze liegen.

Die Sensitivität von 60%, die in dieser Arbeit gefunden wurde, ist mit der Sensitivität der anderen Arbeiten über CBCL vergleichbar (siehe Tab. 41). Dass wir unter den oberen Werten (z.B. 79%, Child et al. 2001) einiger Untersucher liegen, kann auf verschiedene Ursachen [Seite 77↓]zurückgeführt werden: 1. In dieser Arbeit wurden in Paraffin eingebettete Proben verwendet. Paraffin-Proben zeigen gegenüber Kryoproben eine deutlich geringere Sensitivität. Hoeve et al (2000) konnten Sensitivitätsunterschiede bis zu 20% nachweisen. 2. Die vergleichsweise etwas geringere Sensitivität (0,5 bzw. 2,5%) der in dieser Arbeit verwendeten Elektrophoresemethode. Bei der Verwendung von radioaktiven Primern und Auswertung mit PAGE kann die Sensitivität auf 0,1% gesteigert werden (Deane und Norton 1991). 3. Auswertung der Elektrophorese-Ergebnisse: In einigen, hauptsächlich älteren Arbeiten wurde die AGE als alleiniges Mittel zur Auswertung der PCR verwandt (Trainor et al. 1991, Ramasamy et al. 1992, Essop et al. 1997, Alaibac et al. 2001). Diese Methode ist, aufgrund ihrer geringen Auflösung und der damit verbundenen Schwierigkeit zwischen poly- und monoklonalen Amplifikaten zu unterscheiden, nicht mehr empfehlenswert (Aubin et al. 1995, Child et al. 2001). Des weiteren ist mit der CE eine Amplifikatlängenbestimmung auf ein Basenpaar genau möglich (Galimberti et al. 1999). Durch diese hohe Auflösung kann man Kontaminationen und Pseudoklone erheblich besser detektieren. Außerdem wurde in dieser Arbeit jedes Ergebnis auf Reproduzierbarkeit geprüft und strenge Regeln für die Auswertung der Genescan-Profile aufgestellt. Dies kann letztlich dazu beitragen, dass der Anteil an monoklonalen Proben sinkt, da falsch klonale Ergebnisse systematisch ausgeschaltet werden können. 4. Ein Vergleich der verschiedenen Arbeiten erscheint oft schwierig, da der Anteil der einzelnen CBCL-Entitäten sehr variiert (Aubin et al. 1995). So kann bei einer CBCL-Gruppe mit einem hohen Anteil an FCCL eine niedrige Detektionsrate resultieren, da die Mutationsrate dieses Subtyps der CBCL besonders hoch ist. Auch die Auswahl der Proben, spielt eine Rolle. In einigen Arbeiten war, wie auch in dieser Arbeit, eine positive Histologie und Immunhistochemie (Aubin et al. 1995, Ritter et al. 1997, Signoretti et al. 1999, Hoeve et al. 2000) ausreichend für die Diagnosestellung eines CBCLs, bei anderen war ein klonales Rearrangement in der Southernblot Analyse ausschlaggebend (Mc Carthy et al. 1990, Trainor et al. 1991, Diss et al. 1993, Child et al. 2001).

Die Wahrscheinlichkeit ein klonales Rearrangement mit der PCR zu detektieren ist sicherlich höher, wenn bereits im Southernblot ein klonales Amplifikat nachgewiesen worden ist.

Die geringe Sensitivität der FR2-PCR (17%) im Verhältnis zu einem hohen Anteil an Pseudoklonen (17%) zeigt, dass diese PCR für die Routine-Diagnostik nur eingeschränkt verwendbar ist. Zu einem ähnlichen Ergebnis kamen Nihal et al. (2000), welche die FR2-PCR aufgrund von widersprüchlichen Ergebnissen nicht weiter für die Diagnostik verwandten. In früheren Arbeiten wurden mit einer FR2-PCR Sensitivitäten von bis zu 80% erreicht (Ramasamy et al. 1992, Diss et al. 1993).

Die in der vorliegenden Arbeit gefundene Sensitivität für die FR3-PCR(sn) und FR3-PCR(s) von etwa 30% korreliert mit dem Wert von 34%, die Child et al. (2001) bei der Untersuchung der kutanen „low grade“ (niedrig malignen) Lymphome mit einer ungeschachtelten FR3-PCR detektierten. Ritter et al. (1997) und Signoretti et al. (1999) erreichten bei der Untersuchung der [Seite 78↓]CBCL mit einer FR3-PCR(sn) ebenfalls nur eine Sensitivität von 34% bzw. 40%.

Im Jahre 2000 verglichen Nihal et al. eine FR3-PCR(s) mit einer FR1-PCR(n). Ein klonales Rearrangement wurde in 11/12 Fällen mit dem FR3-Primer, aber nur in 5/12 Fällen mit dem FR1-Primerset gefunden. Dies steht im Gegensatz zu unseren Ergebnissen nach denen die FR1-PCR mit 47% eine höhere Sensitivität als die FR3-PCR zeigte. Die Ursache könnte sein, dass Nihal et al. in der zweiten Runde der FR1-PCR einen FR2-Primer verwendete, der aufgrund seiner degenerierten Sequenz schlechte Bindungseigenschaften besitzt. Die höhere Sensitivität der FR1-PCR gegenüber der FR3-PCR wurde von anderen Untersuchern bestätigt (Lehmann et al. 1995, Theriault et al. 2000, Child et al. 2001).

Child et al. (2001) konnten zeigen, dass die Verwendung von Leader-Primern die höchste Sensitivität bei der Untersuchung von CBCL hat. Mit diesen Primern konnte in der hier vorgestellten Untersuchung zwar ein Amplifikat bei der Verwendung von DNA aus PBMC produziert werden, jedoch nicht mit DNA aus Paraffinproben von Hautmaterial. Wahrscheinlich entsteht aufgrund der relativ großen Amplifikatlänge von ca. 500bp nur sehr wenig Amplifikat, so dass eine Detektion der daraus resultierenden schwachen Banden in der Elektrophorese nur mit radioaktiv markiertem Amplifikat und anschließender Autoradiographie, wie von Child et al.(2001) beschrieben, möglich ist.

In vielen Arbeiten wurden mehrere PCR verglichen, und die Detektionsraten variieren oft stark. Aber wenn die Ergebnisse der verschiedenen PCR kombiniert werden, steigt die Gesamtsensitivität (Diss et al. 1993, Aubin et al. 1995, Essop et al. 1997, Galimberti et al. 1999). Diese Erkenntnis stimmt mit dem Ergebnis dieser Arbeit überein.

Die in dieser Untersuchung gefundene Pseudoklonalität ist ein Phänomen, dass auch von anderen Untersuchern beobachtet wurde (Ritter et al. 1997, Nihal et al. 2000).

Die Prüfung monoklonaler Amplifikate auf Reproduzierbarkeit wie auch in dieser Arbeit erfolgt, ist somit unumgänglich.

Die Spezifität der verschiedenen PCR-Assays liegt bei den meisten Untersuchern bei 100% (Storch-Hagenlocher et al. 2000, Hughes et al. 2001, Child et al. 2001). In dieser Arbeit konnte ebenfalls eine 100%ige Spezifität für die einzelnen PCR gefunden werden, mit Ausnahme der FR2-PCR. Da es sich bei den zwei klonalen Fällen um Pyodermien handelt, sind diese als falsch monoklonal zu werten. Auch in anderen Arbeiten wurden Klone in histologisch benigne erscheinenden Infiltraten gefunden (Ritter et al. 1997, Bouloc et al. 1999). Diese geringere Spezifität kann durch das Auftreten von Pseudoklonalität erklärt werden, wie vermutlich bei uns in der FR2-PCR, oder durch die Gruppeneinteilungen zustande kommen. Häufig werden sogenannte Pseudolymphome mit zu der Kontrollgruppe gezählt, bei denen monoklonale Amplifikate schon häufiger beschrieben wurden (Santucci et al. 1991, Rijlaarsdam et al. 1992, Landa et al. 1993).


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4.3.3  Auswertung der Genescan-Profile

Mit Hilfe der CE ist eine Auftrennung der PCR-Produkte auf ein Basenpaar genau möglich. Das Genescan-Profil eines Amplifikats zeigt sowohl die Basenpaarlänge der Peaks als auch deren Fluoreszenzintensität, welche sich in der Peakhöhe widerspiegelt. Bei Verwendung gleicher Bedingungen für einen Genescan-Lauf (gleiche Kapillare, gleiches Polymer, etc.) liegt die Größenvariabilität der Peaks bei 0,5bp (Galimberti et al. 1999). Zusätzlich ist eine Größenvariabilität des klonalen Peaks um 1bp möglich, da die Standard Taq-Polymerase die Eigenschaft besitzt, ein Adeninnukleotid, unabhängig von der Matrize, an das entstandene Amplifikat anzuhängen.

Es konnte gezeigt werden, dass die Messung der Peakhöhen eine ungefähre Schätzung des relativen Anteils klonaler Zellen erlaubt (Sprouse et al. 2000, Lukowsky et al. 2002). In den in dieser Arbeit durchgeführten Verdünnungsreihen konnte jedoch kein proportionales Verhältnis zwischen Peakhöhe und dem Anteil klonaler DNA ermittelt werden (siehe 3.3). Ursache hierfür ist sehr wahrscheinlich die geschachtelte PCR. Durch die Durchführung von zwei PCR-Ansätzen verschiebt sich das Verhältnis zwischen polyklonaler und monoklonaler DNA.

Trotz der exakten Auftrennung der Produkte erfordert die Interpretation des Profils Erfahrungen. Ursache hierfür ist, dass es auch bei benignen Dermatosen zu Abweichungen von der, idealerweise bei Polyklonalität vorhandenen, Gaußschen Verteilungskurve kommt (Witzens et al. 1997). Im Gegensatz zu der PAGE oder TGGE, wo der Untersucher nur subjektiv entscheiden kann, ob sich im relevanten Bereich eine Bande vom polyklonalen Hintergrund hervorhebt, ist mit Hilfe der Peakhöhen beim Genescan eine objektive Auswertung möglich. Die Kriterien dafür sind jedoch festzustellen (Sprouse et al. 2000). Für die Untersuchung der kutanen T-Zell Lymphome (CTCL) sind bereits einige Berechnungsmöglichkeiten veröffentlicht worden (Witzens et al. 1997, Sprouse et al. 2000, Lee et al. 2000, Lukowsky et al. 2002). Die Berechnung von Lee et al. (2000)beruht auf dem Verhältnis von Peakhöhe des klonalem Peak zur Peakhöhe der normal verteilten Kurve. Diese Variante setzt, wie auch die Berechnung von Witzens et al. (1997), ein vollständiges polyklonales Hintergrundprofil voraus. Bei den in dieser Arbeit untersuchten Proben war dies häufig nicht der Fall. Am geeignetsten für diese Arbeit erschien deshalb die Berechnung von Lukowsky et al (2002) (siehe Abschnitt 3.1).

Zur Berechnung der Ratio werden nur die beiden benachbarten Peaks benötigt. Eine Überbewertung der sich am Rand befindenden klonalen Peaks wird durch die Bedingung, dass deren Peakhöhe die durchschnittliche Peakhöhe des Profils nicht unterschreiten darf, vermieden. Eine Schwierigkeit besteht in der Festlegung der Ratio, ab welcher ein Peak als monoklonal gilt. Dies ist nur durch Untersuchungsreihen mit poly- und monoklonalen Proben zu ermitteln. Bei [Seite 80↓]den CTCL scheint eine Ratio von zwei mindestens erforderlich zu sein (Sprouse et al. 2000, Lukowsky et al. 2002). Meier et al.(2001) legte für die Auswertung der Genescan-Profile von B-Zell NHL ebenfalls eine Ratio von mindestens zwei fest. Bei der FR1-PCR bzw. bei der FR3-PCR(sn) betrug die Ratio hervortretender Peaks im Profil der Kontrollfälle maximal 1,3 bzw. 1,4. Peak-Ratios ab 2,0 können somit als sicher monoklonal gelten. Bei der FR3-PCR(sn) konnten zwei Proben der Gruppe 1 (468/01. 18/26K) nur als unsicher monoklonal eingeschätzt werden, da der jeweilige klonale Peak nur eine Ratio von 1,9 erreichte. Da die Ratio der Kontrollen höchstens 1,4 war, wäre zu überlegen, ob bei der FR3-PCR(sn) eventuell schon Peaks mit einer Ratio von 1,9 als monoklonal eingestuft werden. Am schwierigsten war die Festlegung der Grenze bei der FR2-PCR. Bei einer Ratio von mindestens zwei traten in der Kontrollgruppe ein falsch monoklonales Ergebnis und vier Pseudoklone mit Ratios bis 3,4 auf. Aufgrund dessen sollte diese PCR nicht verwandt werden. Die FR3-PCR(s) hatte eine Ratio von höchstens 1,5 bei den Kontrollen und bei den CBCL eine Ratio von mindestens 4,3. Eine Differenzierung zwischen monoklonal und polyklonal ist somit sicher möglich.


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12.05.2004