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5  Zusammenfassung

Molekularbiologische Methoden haben sich seit ca. zehn Jahren ergänzend zu Klinik und Histopathologie in der Diagnostik der kutanen B-Zell Lymphome etabliert. Besonders in frühen Stadien ist eine Abgrenzung zu benignen chronischen Entzündungen oft schwierig. Hier sind molekularbiologische Ansätze vielversprechend, da diese auf dem Nachweis von klonalen Proliferationen von B-Zellen beruhen, welche in benignen Infiltraten nicht, oder nur selten vorkommen.

Ziel der Arbeiten war die Etablierung molekularbiologischer Methoden zur Diagnostik der CBCL. Dabei sollten mehrere in der Literatur beschriebene PCR-Ansätze untersucht werden und auch verschiedene Primer neu kombiniert werden.

Ziel war es, eine Methode zu finden, bei der mit geringem Arbeitsaufwand die größtmögliche Sensitivität erreicht werden kann.

Diese Aufgaben wurden in mehreren Arbeitsschritten bearbeitet: Zunächst erfolgte die Testung der Primer mit der Simulationssoftware Oligo. Anschließend wurden die PCR, welche im Oligo ein zufriedenstellendes Ergebnis lieferten, zunächst an DNA aus polyklonalen PBMC, dann an DNA aus in Paraffin eingebetteten polyklonalen Hautproben getestet. Die PCR-Ansätze, die mit der Kapillarelektrophorese (CE) Profile mit einem Gauß-ähnlichen Verteilungsmuster lieferten, wurden für die Untersuchung der CBCL ausgewählt.

Eine monoklonale B-Zell Population zeigt eine dominante Bande im Genescan.

Durch den Vergleich von Profilen von CBCL-Proben und Proben von benignen Hautinfiltraten wurden objektive Kriterien für die Interpretation der Genescanprofile festgelegt.

Die computergestützte Analyse der Primer ergab häufig relevante Primer-Primer–Dimerisierungen.

Bei der Testung der ungeschachtelten PCR-Ansätze an polyklonaler DNA zeigte sich bis auf wenige Ausnahmen eine unvollständige bzw. gar keine Gauß-ähnliche Verteilungskurve im relevanten Basenpaarbereich.

Durch die Etablierung von halb- bzw. geschachtelten PCR-Ansätzen konnte die Ausbeute an spezifischen Amplifikat erheblich gesteigert werden.

Mit drei verschiedenen geschachtelten PCR für den IgH- FR1-; FR2- und FR3-Bereich und die bereits in der Routinediagnostik verwendete ungeschachtelte FR3-PCR wurde die Untersuchung durchgeführt.

Zum Vergleich von Klinik und Histologie mit dem molekularbiologischen Untersuchungsergebnis wurden zwei Gruppen gebildet und die aus dem Bioptat extrahierte DNA [Seite 82↓]nach ihrer Amplifikation mittels der CE (Genescan) separiert.

Bei einigen Patienten war es nicht möglich mit den vorhandenen Proben ein Amplifikat mit allen verschiedenen PCR zu erhalten.

Wenn man die Patienten, bei deren Proben kein Amplifikat produziert werden konnte, unberücksichtigt lässt, konnte in Gruppe 1 (Patienten mit klinisch und histologisch gesichertem kutanen B-Zell-Lymphom) in 60 % (21/35) ein monoklonales Amplifikat nachgewiesen werden, in Gruppe 2 (nicht an einem Lymphom erkrankte Personen) wurden bis auf die FR2-PCR, bei der zwei falsch klonale Fälle auftraten, nur polyklonale Ergebnisse gefunden.

Für die Sensitivität der einzelnen PCR-Assays ergeben sich danach folgende Prozentzahlen: FR1n – 47%, FR2n – 16%, FR3sn – 29%, FR3s – 30%, nur auf Proben bezogen, bei denen in der jeweiligen PCR ein Amplifikat produziert werden konnte. Eine höhere Sensitivität konnte für die Kombination aller vier PCR gegenüber der Routine-PCR FR3(s) statistisch gesichert werden (McNemar-Test<0,05). Die Spezifitäten differierten nicht signifikant voneinander (FR1n-100%, FR2n-91%, FR3sn-100%, FR3s-PCR-100%).

Das Auftreten von Pseudoklonen (FR1n 7%, FR2n 17%, FR3sn-PCR 3%, FR3s 0%) machte eine Prüfung auf Reproduzierbarkeit der Ergebnisse unbedingt erforderlich.

Unter der Beachtung von Zeitaufwand, Sensitivität, erfolgreicher Amplifikation und Auftreten von Pseudoklonalität empfiehlt sich zuerst die Durchführung der FR3s-PCR und anschließend die Verwendung der FR1n-PCR. Nur wenn diese negativ sind oder kein Amplifikat bilden, sollte die FR3sn-PCR angewandt werden.

Für CBCL-Proben die mit allen vier PCR ein polyklonales oder gar kein Produkt bildeten, wurde noch eine zusätzliche FR3-PCR mit einem deutlich anderen FR3-Primer durchgeführt. Diese brachte keine zusätzliche Sensitivität.

Die Untersuchung einiger Proben nicht primär kutaner Lymphome zeigte eine ähnliche Sensitivität wie bei den CBCL.

Zusammenfassend ist zu sagen, dass gemeinsame Verwendung der in dieser Arbeit entwickelten PCR eine Sensitivitätssteigerung von 30% auf 60% ermöglichen.

Die molekularbiologische Untersuchung ist somit als Ergänzung zum klinischen und histopathologischen Befund in der Mehrzahl der analysierten Fälle von CBCL hilfreich.


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12.05.2004