[Seite 1↓]Aus der Klinik für Dermatologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

DISSERTATION

PCR und Fluoreszenz - DNA - Fragment - Analyse zum Nachweis einer monoklonalen B-Zell-Population zur Diagnostik der kutanen B-Zell Lymphome (CBCL)

zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae
(Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charitè
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Maren Marchwat
aus Eberswalde

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. PD Dr. A. Lukowsky
2. Prof. Dr. med. C. Neumann
3. Prof. Dr. H. Stein

Datum der Einreichung: 29.01.03

Datum der Promotion: 28.01.2004

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Überblick
    • 1.1.1 Kutane B-Zell Lymphome: Definition und Epidemiologie
    • 1.1.2 Klassifikation der CBCL
      • 1.1.2.1 Follikel-Zentrumszell-Lymphom
      • 1.1.2.2 Kutanes Immunozytom / Marginalzonenlymphom
      • 1.1.2.3 Großzelliges B-Zell Lymphom der unteren Extremität
      • 1.1.2.4 Intravaskuläres B-Zell Lymphom
      • 1.1.2.5 Plasmozytom
    • 1.1.3 Diagnostik der kutanen B-Zell Lymphome
    • 1.1.4 Die Genotypisierung
      • 1.1.4.1 Genetische Organisation der humanen Immunglobuline
      • 1.1.4.2  Nachweis von Translokationen
      • 1.1.4.3 Southernblot Analyse
      • 1.1.4.4 Klonalitätsanalyse mittels PCR
  • 1.2  Problemstellung
• 2  Material und Methoden
  • 2.1 Untersuchungsmaterial
    • 2.1.1 Patienten
      • 2.1.1.1 Gruppe 1: CBCL-Patienten
      • 2.1.1.2 Gruppe 2: Kontrollen
      • 2.1.1.3 Gruppe 3: Nicht primär kutane Lymphome
    • 2.1.2  Geräte
    • 2.1.3 Chemikalien, Reagenzien, Pufferlösungen
  • 2.2  Methoden
    • 2.2.1 DNA-Isolation
    • 2.2.2 PCR-Grundlagen
      • 2.2.2.1 Verschiedene Reaktionsgemische (RG)
      • 2.2.2.2 PCR-Programme
    • 2.2.3 FR3-PCR-Systeme
    • 2.2.4 FR1-PCR-Systeme
    • 2.2.5 Leader-PCR-Systeme
    • 2.2.6 FR2-PCR-Systeme
    • 2.2.7 Die IgL-PCR
    • 2.2.8 Agarosegelelektrophorese (AGE)
    • 2.2.9 Temperaturgradientengelelektrophorese (TGGE)
    • 2.2.10 Kapillarelektrophorese (Genescan)
    • 2.2.11 Primeranalyse im Oligo
      • 2.2.11.1 Anforderungen an geeignete PCR-Primer
      • 2.2.11.2 Unspezifische Doppelstrang-Bildung mit der Ziel-DNA
      • 2.2.11.3 Effiziente Doppelstrangbildung mit der Ziel-DNA
      • 2.2.11.4 Doppelstrang-Bildung zwischen Primern
• 3  Ergebnisse
  • 3.1 Definition von Klonalität
  • 3.2 Ergebnisse der Suche geeigneter Primersysteme
    • 3.2.1 Die FR3 - PCR in der Übersicht
      • 3.2.1.1 Ergebnisse der Überprüfung der FR3- und JH-Primer im Oligo
      • 3.2.1.2 PCR-Ergebnisse der getesteten FR3-Systeme
        • Ergebnisse der Konsensusprimer-PCR (s)
        • Ergebnisse der Konsensusprimer-PCR (sn)
    • 3.2.2 Die FR1 - PCR im Überblick
      • 3.2.2.1 Ergebnisse der Überprüfung der FR1-Primer im Oligo
      • 3.2.2.2 PCR-Ergebnisse der getesteten FR1-Systeme
      • 3.2.2.3 Entwicklung des neuen Primersystems
    • 3.2.3  Die Leader - PCR
      • 3.2.3.1 Ergebnisse der Überprüfung der Leader-Primer im Oligo
      • 3.2.3.2 PCR-Ergebnisse des Leader-Systems
        • Testung mit DNA aus PBMC (polyklonal)
        • Testung mit Paraffinproben der CBCL
        • Testung mit Kryoproben der CBCL
    • 3.2.4 Die FR2 - PCR im Überblick
      • 3.2.4.1 PCR-Ergebnisse der FR2-Systeme
    • 3.2.5 Die IgL - PCR
      • 3.2.5.1 PCR-Ergebnisse der IgL-PCR
  • 3.3 Nachweisgrenze
  • 3.4  Analyse der CBCL-Fälle (Gruppe 1)
    • 3.4.1 Nicht eindeutige Ergebnisse
    • 3.4.2 Das Auftreten sogenannter „Pseudoklonalität“
    • 3.4.3 Untersuchung falsch polyklonaler Proben mit der PCR 3.3. (Fodinger et al.)
  • 3.5 Analyse der Kontrollen (Gruppe 2)
  • 3.6 Vergleich der molekularbiologischen Resultate mit Klinik und Histologie
  • 3.7 Vergleich der Ergebnisse der verschiedenen PCR-Systeme
  • 3.8 Statistische Bewertung
  • 3.9  Analyse der nicht primär kutanen Lymphome (Gruppe 3)
• 4  Diskussion
  • 4.1 Konventionelle Methoden zur CBCL-Diagnostik
  • 4.2 Molekularbiologische Methoden zur CBCL-Diagnostik
    • 4.2.1 Nachweis eines klonalen IgH-Rearrangements
      • 4.2.1.1 Southernblot
      • 4.2.1.2 PCR-Techniken
        • Auswahl des geeigneten Genortes
        • Analyse der verwendeten Primerkombinationen
      • 4.2.1.3 Wahl der Elektrophoresemethode
  • 4.3  Diskussion der Vergleichsuntersuchungen
    • 4.3.1 Gruppeneinteilung
    • 4.3.2 Ergebnisse des Vergleichs der PCR-Ansätze
    • 4.3.3  Auswertung der Genescan-Profile
• 5  Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literatur
• Erklärung an Eides Statt
• Danksagung

Tabellen

• Tab. 1: Vergleich der Klassifikationen aus (Fink-Puches et al. 2002)
• Tab. 2: Die 7 VH-Familien aus (Matsuda et al. 1998)
• Tab. 3: Verwendete PCR-Programme (PCR-Prog.):
• Tab. 4: Die in der Literatur am häufigsten verwendeten FR3- und JH-Primer
• Tab. 5: Aufstellung der durchgeführten PCR für FR3
• Tab. 6: Die in der Literatur am häufigsten verwendeten FR1-Primer
• Tab. 7: Aufstellung der durchgeführten PCR für FR1
• Tab. 8: Die in der Literatur am häufigsten verwendeten LEA-Primer
• Tab. 9: Aufstellung der durchgeführten PCR für die LEA-Region
• Tab. 10: Die in der Literatur am häufigsten verwendeten FR2-Primer
• Tab. 11: Aufstellung der durchgeführten PCR für FR2
• Tab. 12: Anforderungen an die Primer im Multiplex-Programm des Oligo
• Tab. 13: Ergebnisse der Primerprüfung mit Oligo für FR3/JH
• Tab. 14: Ergebnisse der Multiplex Testung FR3 (Brisco et al. 1990)-PCR3.1
• Tab. 15: Ergebnisse der Multiplex-Testung des FR3-Primers (Hayashi et al. 1999)-PCR3.2
• Tab. 16: Ergebnis der Testung von FR3(FOD99) und JH(GAL99) (PCR3.3)
• Tab. 17: Ergebnis der Testung von FR3(LEH95) und JH(MCC90) (PCR 3.4)
• Tab. 18: Ergebnisse der PCR 3.1.-3.4.
• Tab. 19: Ergebnisse der Testung weiterer PCR
• Tab. 20: Ergebnisse der Primerprüfung mit Oligo
• Tab. 21: Ergebnisse der Multiplex-Testung FR1(KÜP)/JH(GAL)
• Tab. 22: Getestete Primerkombinationen der FR1-PCR
• Tab. 23: Ergebnisse der Primerprüfung
• Tab. 24: Ergebnisse der Multiplex-Testung
• Tab. 25: Ergebnisse der Leader-PCR
• Tab. 26: Ergebnisse der PCR 2.1.-2.3.
• Tab. 27: PCR-Ergebnisse der untersuchten CBCL-Proben (Gruppe1)
• Tab. 28: Anzahl der Proben, die nur in einer PCR monoklonal waren
• Tab. 29: Zusammenfassung der nicht eindeutigen Ergebnisse
• Tab. 30: Zusammenhang von Pseudoklonalität und negativer Routine FR3-PCR
• Tab. 31: Beziehung zwischen Pseudoklonalität und Alter der Probe
• Tab. 32: PCR-Ergebnisse der 2.Gruppe (Kontrollen)
• Tab. 33: Ergebnisse der Kontrollen
• Tab. 34: Ergebnisse der PCR nach Auswertung mittels Genescan
• Tab. 35: Zusammenfassung der Ergebnisse der Gruppe 1 und 2
• Tab. 36: Erfassung der Signifikanz des Unterschiedes der Spezifität mit dem Test nach Mc Nemar
• Tab. 37: Sensitivität der angewandten PCR-Methoden
• Tab. 38: Ergebnisse der Gruppe 3:
• Tab. 39: Unterschiede von B-Zell Lymphomen und B-Zell Pseudolymphomen
• Tab. 40: Ergebnisse verschiedener Arbeiten zu nodulären Lymphomen bzw. Leukämien
• Tab. 41: Eine Auswahl der Studien zu CBCL

Bilder

• Abb. 1: Aufbau des VDJ-Rearrangements
• Abb. 2: Bindungsorte der verschiedenen Primer
• Abb. 3 a und b: Darstellung polyklonaler bzw. monoklonaler Amplifikate
• Abb. 4: aus (Rychlik 2000)
• Abb. 5: Genescan-Profile der PCR 3.5 und 3.6 (PBMC)
• Abb. 6: Genescan-Profile der PCR 3.5 und 3.6 (Paraffin)
• Abb. 7: Genescan-Profile der PCR 1.2
• Abb. 8: Genescan-Profile der PCR 2.3
• Abb. 9: Genescan-Profile der IgL-PCR
• Abb. 10 a-c: Verdünnungsreihe der FR1.2(n)-PCR
• Abb. 11 a-d: Verdünnungsreihe der FR3.5(sn)-PCR
• Abb. 12: Darstellung der Genescan-Profile für die angewandten PCR (Proben Nr. s. Tab. 27)
• Abb. 13: Profile von Proben mit einer Peak-Ratio ≤ 2
• Abb. 14: Beispiele für pseudoklonale Ergebnisse
• Abb. 15: Beispiele für pseudo-oligoklonale Ergebnisse
• Abb. 16: FR3 (Fodinger et al. 1999)
• Abb. 17: Fließschema für die PCR-Diagnostik: