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1  Einleitung

In Deutschland erkranken jährlich schätzungsweise 350 000 Menschen neu an Krebs. Nach den Herz-Kreislauferkrankungen ist Krebs in der westlichen Welt die zweithäufigste Todesursache. Da sich die Bevölkerungsstruktur immer mehr in Richtung zu Menschen mit höherem Lebensalter verschiebt und das Krebsrisiko mit dem Alter zunimmt, wird in etwa 15 Jahren Krebs die Haupttodesursache sein (Becker und Wahrendorf, 1998).

25 bis 30 % aller Krebstodesfälle gehen auf das Rauchen zurück. Epidemiologische Untersuchungen der letzten Jahre weisen darauf hin, daß die Ernährungsgewohnheiten mit 20 bis 42 % an einer Krebsentstehung beteiligt sind (Willet, 1995). Weitere wichtige Risikofaktoren sind virale Infektionen, bestimmte genetische Prädispositionen, erhöhter Alkoholkonsum, sowie Expositionen mit bestimmten chemischen Stoffen oder Stahlungen, wie z. B. ionisierende und UV-Strahlung (Harvard Report on Cancer Prevention, 1996; Becker und Wahrendorf, 1998).

Tumorerkrankungen werden durch die Kombination von chirurgischer Entfernung, Radiotherapie, Chemotherapie und in einigen Fällen auch Hyperthermie behandelt. Die Heilungserfolge sind jedoch in Abhängigkeit von der Tumorart sehr unterschiedlich. Unter der Behandlung (Selektionsdruck) entwickeln sich sehr häufig Resistenzen, die dazu führen, daß sich die Tumore nach und nach der Wirkung dieser Therapieformen entziehen. Um Krebserkrankungen möglichst erfolgreich therapieren zu können, müssen die verursachenden genetischen Veränderungen bzw. die den Resistenzen zugrunde liegenden Mechanismen erkannt und in die Diagnostik miteinbezogen werden.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Suche nach einem generellen Mechanismus für Cisplatinresistenz anhand des Vergleichs von Modellzellinien. Der Zusammenhang eines solchen Mechanismus mit der Chemoresistenz soll funktionell belegt und näher untersucht werden. Außerdem soll versucht werden, aus den Ergebnissen Ansatzpunkte für die Diagnosik und Therapie von malignen Tumoren abzuleiten.


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1.1  Chemotherapie

Neben der operativen Entferung und der Radiotherapie gehört die medikamentöse Behandlung trotz weiterer denkbarer Ansätze zu den heute am häufigsten verwendeten Therapien. Dabei werden strukturell verschiedenste natürliche, synthetische und halbsynthetische Substanzen eingesetzt, die auf sich teilende Zellen zytotoxisch oder zytostatisch wirken. Diese Stoffe werden unter dem Begriff Zytostatika oder Chemotherapeutika zusammengefaßt. Nach ihrem Wirkmechanismus werden diese Substanzen u. a. in DNA-alkylierende Agentien, Antimetabolite, Mitosehemmstoffe, Antibiotika, Enzyme und Hormone eingeteilt. Im Folgenden sollen die Zytostatika vorgestellt werden, die in dieser Arbeit Verwendung fanden.

1.1.1  Cisplatin und Carboplatin

Die zytostatische Wirkung von Cisplatin (cis-Diamindichloroplatin (II)) wurde durch Versuche mit Bakterien entdeckt (Rosenberg et al., 1965). In diesen Experimenten wurde beobachtet, daß sich E. coli im elektrischen Feld zwischen zwei Platinelektroden nicht mehr zu teilen vermag und nur noch durch Größenzunahme wachsen kann. In den folgenden Jahren wurde festgestellt, daß diese Wirkung auf Cisplatin (Abb. 1.1) zurückzuführen ist, das sich in der Lösung gebildet hatte. Heute ist Cisplatin eines der meist genutzten Zytostatika und wird u. a. bei der Behandlung von Ovarial- und Bronchialkarzinomen eingesetzt (Manetta et al., 1998; Oguri et al., 1999; Young et al., 1999). Seine Wirkung beruht hauptsächlich auf der Bildung von kovalenten Addukten von Cisplatin mit den Basen in der DNA, wodurch sich DNA-Inter- und -Intrastrang-Quervernetzungen bilden. Am häufigsten treten 1,2-d(GpG)- und 1,2-d(ApG)-Intrastrang-, sowie 1,3-d(GpNpG)-Interstrang-Addukte auf. Diese Addukte, die außerdem die DNA in ihrer Konformation verändern, behindern die Replikation und Transkription und führen im Folgenden zur Apoptose (Trimmer und Essigmann, 1999).

Abb. 1.1: Strukturformel von Cisplatin


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Für die zytostatische Wirkung werden auch Wechselwirkungen mit der RNA und DNA-Protein-Quervernetzungen diskutiert, die aber eine untergeordnete Rolle zu spielen scheinen (Übersicht in Zeller und zur Hausen, 1995).

Das ebenfalls als Zytostatikum eingesetzte Carboplatin (cis-Diamin(1,1-Cyclobutan-dicarboxylato)platin (II)) zeigt einen ähnlichen Wirkmechanismus wie Cisplatin. Carboplatin reagiert (Abb. 1.2) wesentlich weniger und langsamer mit der DNA im Vergleich zu Cisplatin und muß in einer 20- bis 40-fach höheren Konzentration eingesetzt werden, um die gleiche Wirkung zu erreichen. Der Vorteil dieses Zytostatikums in der klinischen Praxis bezieht sich auf die geringeren auftretenden Nebenwirkungen und die daraus resultierende bessere Verträglichkeit (Übersicht in Zeller und zur Hausen, 1995).

Abb. 1.2 : Strukturformel von Carboplatin

1.1.2  Daunorubicin

Eine italienische und eine französische Arbeitsgruppe entdeckten ein Zytostatikum aus dem Mikroorganismus Streptomyces peuceticus und nannten diese Verbindung „daunomycina“ bzw. „rubidomycine“, woraus sich der heute gebräuchliche Name Daunorubicin zusammensetzt (Di Marco et al., 1963; Dubost et al., 1963). Es handelt sich hierbei um ein Anthrazyklin, bestehend aus dem tetrazyklischen Chromophor Daunomycinon und dem Aminozucker Daunosamin (Abb. 1.3). Es wird hauptsächlich bei akuten Leukämien eingesetzt und wirkt am stärksten bei exponentiell wachsenden Zellen, vorwiegend in der S- und G2-Phase des Zellzyklus (Pratt et al., 1994). Die Wirkmechanismen sind bis heute nicht vollständig verstanden, jedoch scheint die nichtkovalente Bindung (Interkalation) an die DNA ein wesentlicher Mechanismus für die Zytotoxizität zu sein, worauf im Folgenden DNA- und RNA-Polymerasen behindert werden. Durch Ein- oder Zwei-Elektronenreduktion bilden sich aus Daunorubicin reaktive Verbindungen, die Proteine, Lipide und DNA alkylieren können. Als weitere Mechanismen werden u. a. die Hemmung von Topoisomerasen, Helikasen, sowie [Seite 4↓]der Metallothionein-Synthese und der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung angesehen. Außerdem wird die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und die Induktion von Apoptose über den Sphingolipid-Metabolismus diskutiert (Übersichten in Zeller und zur Hausen, 1995; Senchenkov et al., 2001).

Abb. 1.3 : Strukturformel von Daunorubicin

1.1.3  Etoposid

Etoposid (4’-Demethyl-epipodophyllotoxin-9-(4,6-O-2-ethyliden-β-D-glukopyranosid, Abb. 1.4) ist ein halbsynthetisches Derivat des Podophyllotoxins aus Podophyllum peltatum (Maiapfel). Es wird gewöhnlich in Kombination mit anderen Zytostatika z. B. bei der Behandlung des Hoden- und Ovarialkarzinoms eingesetzt (Williams et al., 1987; Zanetta et al., 1996; Rose et al., 1998). Etoposid wirkt zellzyklusphasenspezifisch und arretiert den Zellzyklus in der späten S- und frühen G2-Phase. Es wirkt dabei über die Hemmung der Topoisomerase II und scheint in dieser Funktion nicht an die DNA zu binden (Ross et al., 1984). Die Topoisomerase II führt Doppelstrangbrüche in die DNA ein, um sie entwinden zu können. An diesem Prozeß des Entwindens sind weitere Proteine beteiligt, die den sogenannten „cleavable complex“ bilden. Etoposid scheint diesen Komplex zu stabilisieren, was zu persistierenden DNA-Doppelstrangbrüchen führt. Da proliferierende Zellen einen höheren DNA-Topoisomerase II-Spiegel besitzen, sind diese Zellen empfindlicher für Epipodophyllotoxine. Durch den Metabolismus von Etoposid in der Zelle entstehen auch Derivate, die alkylierernd wirken können. Die gebildeten Chinone können außerdem zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies führen (Übersicht in Zeller und zur Hausen, 1995).


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Abb. 1.4 : Strukturformel von Etoposid

1.1.4Vincristin

Vincristin (Abb. 1.5) gehört zu den Vinca-Alkaloiden aus Catharanthus roseus syn. Vinca rosea (Madagaskar-Immergrün). Es wird in der Kombinationtherapie z. B. zur Behandlung des Non-Hodgkin-Lymphoms eingesetzt (Heim et al., 1987).

Abb. 1.5 : Strukturformel von Vincristin

Die Vinca-Alkaloide sind sogenannte Spindelgifte, d. h. sie hemmen durch Bindung an Tubulin die Bildung der Mikrotubuli, die als Bestandteil des Zytoskeletts bei der Mitose, der Zellbewegung und beim intrazellulären Transport mitwirken. In der Zelle gibt es ein Gleichgewicht von polymerisiertem (mikrotubulärem) und gelösten Tubulin. Durch die [Seite 6↓]Vinca-Alkaloide kommt es zu einer Verschiebung dieses Gleichgewichts zugunsten der gelösten Form. Aufgrund der fehlenden Mitosespindel arretieren proliferierende Zellen in der Metaphase und sterben im weiteren Verlauf ab (Übersicht in Zeller und zur Hausen, 1995).

1.2 Mechanismen der Chemoresistenz

1.2.1  Überblick

Unter Chemoresistenz versteht man die verminderte Empfindlichkeit einer Zelle gegenüber einem Zytostatikum im Vergleich zu einer anderen Zelle. Rund die Hälfte aller malignen Tumore spricht nicht auf eine zytostatische Therapie an. Man bezeichnet dies als primäre oder intrinsische Resistenz. Ein gutes Drittel der zunächst ansprechenden Tumore entwickelt im Laufe der medikamentösen Therapie eine sogenannte sekundäre Chemoresistenz. Diese Tumore lassen sich oftmals auch nicht durch andere, noch nicht angewendete Chemotherapeutika behandeln. Dieses Phänomen nennt man pleiotrope oder Multidrug-Resistenz (MDR). In diesen Tumoren haben sich Zellen in ihrem Wachstum durchgesetzt, die bestimmte Mechanismen entwickelt haben, um sich dem Zytostatikum oder dessen Auswirkungen zu entziehen. In diesem Abschnitt sollen einige dieser Mechanismen näher vorgestellt werden (Übersichten in Lage, 1999; Kaufmann und Earnshaw, 2000; Gottesman, 2002). Prinzipell kann man dabei die folgenden Möglichkeiten unterscheiden (Abb. 1.6):

  1. verminderte Aufnahme bzw. verstärkter Auswärtstransport des Zytostatikums;
  2. verändertes Zielmolekül, so daß das Zytostatikum nicht mehr binden kann;
  3. vermehrtes Zielmolekül, um Funktion aufrecht zu erhalten;
  4. Übernahme der Stoffwechselfunktion des Zielmoleküls durch einen alternativen Mechanismus (Tolerierung des Schadens);
  5. biochemische Modifikation (Entgiftung) des Chemotherapeutikums;
  6. räumliche Trennung des Zytostatikums vom Wirkort (Kompartimentierung);
  7. verstärkte Reparatur der auftretenden Schäden;
  8. Verhinderung des Zelltods durch Beeinflussung der Zellzyklus-Kontrolle und der Apoptose-Wege.


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Abb. 1.6 : Chemoresistenzmechanismen

In dieser Darstellung sind verschiedene Möglichkeiten der Resistenzentwicklung kultivierter Krebszellen zusammenfaßt (verändert nach Gottesman, 2002). Nähere Angaben siehe Text.

Ein häufig genutzter Resistenzmechanismus ist der Auswärtstransport der zytostatischen Substanzen, bei dem die Gruppe der ABC-Transporter eine wichtige Rolle spielt. Diese Proteine werden in den Kap. 1.2.2 und Kap. 1.2.3 ausführlich vorgestellt.

Das Strukturprotein LRP ( l ung r esistance-related p rotein) ist Hauptbestandteil eines Ribonukleoprotein-Komplexes, welcher in der Nähe der Kernporen lokalisiert ist. Da die LRP-Expression eine gewisse Assoziation mit Zytostatikaresistenz in Modellzellinien und Tumoren zeigt, wird eine Beteiligung am Kern-Zytoplasma-Transport bzw. am Transport über Vesikel diskutiert (Chugani et al., 1993; Izquierdo et al., 1996). LRP könnte somit an einem Multikomponenten-Resistenzmechanismus für Kompartmentierung und Exozytose beteiligt sein (Lage, 1999).

DNA-Topoisomerasen bewirken durch die von ihnen vermittelten DNA-Einzel- oder Doppelstrangbrüche die Entwindung der DNA, welches für die Replikation und Transkription benötigt wird. Einige Zytostatika inhibieren den Komplex mit der von ihnen bereits gespaltenen DNA und verhindern die Ligationsreaktion. Mutationen in den Topoisomerasen, die eine verminderte Affinität des Zytostatikums für sein Zielmolekül bewirken, können hier [Seite 8↓]eine Resistenz vermitteln. Eine verminderte Expression oder Aktivität der Topoisomerasen führen ebenfalls dazu, daß weniger DNA-Brüche im Genom akkumulieren (Übersicht in Hande, 1998; Lage, 1999; Rodriguez-Galindo et al., 2000).

Viele Zytostatika schädigen die sich teilende Zelle durch Wechselwirkungen mit der DNA (Beispiele unter Kap. 1.1.1 bis 1.1.3). Deshalb spielen Veränderungen in den Reparaturmechanismen eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Zytostatikaresistenzen. Durch Alkylierung auftretende Schäden können z. B. durch die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase direkt behoben werden. Andere Schäden – wie z. B. Cisplatin-DNA-Addukte – werden großräumiger durch das NER-System (NER = n ucleotide e xcision r epair) repariert (Übersicht in Crul et al., 1997). Im Zusammenhang mit Chemoresistenz wurde auch eine veminderte Expression der Gene des MMR-Systems (MMR = m is m atch r epair) in resistenten Tumorzellen beschrieben (Übersicht in Lage und Dietel, 1999). Möglicherweise führt die verringerte Expression über die im Folgenden gestörte Verbindung zum Zellzyklus und den Apoptosewegen zu einem Überleben der geschädigten Zelle (Hawn et al., 1995).

Viele der am Apoptose-Prozeß beteiligten Faktoren wurden in zytostatikaresistenten Zellen als verändert exprimiert beschrieben (Übersicht in Kaufmann und Earnshaw, 2000). Ob in einer Zelle Apoptose ausgelöst wird oder nicht, hängt davon ab, wie stark die Zelle geschädigt ist bzw. ob diese Schäden von Kontrollmechanismen wahrgenommen werden. Das Tumorsuppressorgen p53 spielt bei diesen Prozessen eine zentrale Rolle. Je nach Ausmaß der Schädigung löst TP53 als Transkriptionsfaktor oder durch direkte Wechselwirkung Reparaturprozesse oder Apoptose aus. Aus einer Vielzahl von Untersuchungen ist bekannt, daß TP53 in Tumoren häufig mutiert auftritt, wodurch die Funktion des Proteins teilweise oder komplett verloren gehen kann (Übersicht in Camplejohn und Rutherford, 2001).

1.2.2  Bedeutung von ABC-Transportern

In den siebziger Jahren wurde das MDR1-Gen (MDR = m ulti d rug r esistance) beschrieben, welches für das sogenannte P-Glykoprotein (P=Permeabilität) kodiert (Juliano und Ling, 1976). Das 170 kDa große Protein befindet sich in der Plasmamembran und ist für die Multidrug-Resistenz im klassischen Sinne zuständig. Es gehört zur Familie der ABC-Transporter, die sich durch das Vorhandensein von membrandurchspannenden Domänen und [Seite 9↓]ATP-Bindungsdomänen (ABC = A TP- b inding c assette) auszeichnen. Die Energie für den Transport strukturell sehr verschiedener Substanzen über diese ABC-Transportproteine wird durch die Bindung und Hydrolyse von ATP gewonnen. P-Glykoprotein kann u. a. den Transport von Anthrazyklinen, Anthrazenen, Vinca-Alkaloiden, Epipodophyllotoxinen und tubulinpolymerisierenden Zytostatika vermitteln (Übersicht in Litman et al., 2001).

In den frühen neunziger Jahren wurde ein weiterer, für Chemoresistenz wichtiger ABC-Transporter beschrieben (Cole et al., 1992), der sich durch ein etwas anderes Kreuzresistenzmuster unterschied. Es handelte sich hierbei um das MRP ( M D R -associated p rotein), welches ebenfalls Anthrazykline, Epipodophyllotoxine und Vinca-Alkaloide transportieren kann, jedoch nicht die Spindelgifte Colchicin und Taxol. Die transportierten Substanzen sind in diesem Kontext keine „Substrate“, da sie vom Transporter nicht biochemisch umgewandelt werden. Young und Holland (1999) prägten daher den Begriff Allocrite für dem Transport unveränderter Verbindungen. Die Allocrite des 190 kDa großen, ubiquitär in der Plasmamembran exprimierten Proteins werden hauptsächlich als Konjugate mit Glutathion, Glukuronsäure oder als Sulfate transportiert. In diesem Zusammenhang können auch Alterationen im Glutathionstoffwechsel, wie z. B. Überexpressionen der Glutathion-S-Transferasen, bedeutsam werden, die die Übertragung des Tripeptids Glutathion auf Zytostatika katalysieren können. Dabei kann die Konjugation selbst schon einen Entgiftungmechanismus darstellen (Übersicht in Keppler, 1999; Strange et al., 2000). In den folgenden Jahren wurden weitere Mitglieder der MRP-Familie entdeckt, die nach Abschluß des humanen Genomprojekts 10 Mitglieder umfaßt, von denen aber nur 6 bisher näher charakterisiert wurden (Übersichten in Dean et al., 2001; Efferth, 2001; Gottesman, 2002).

Im Zusammenhang mit Chemoresistenz sind neben den bisher genannten ABC-Transportern sogenannte Halbtransporter beschrieben worden. Diese besitzen im Gegensatz zu den Volltransportern mit zwei ATP-Bindungs- und mindestens zwei Transmembrandomänen nur jeweils eine davon (Abb. 1.7) und bilden für den Transport Homo-oder Heterodimere. Beispiele hierfür sind die Proteine TAP1 und TAP2 (TAP = t ransporter a ssociated with antigen p rocessing), die außer ihrer Funktion bei der Antigenpräsentation auch durch ihr Zusammenwirken beim Transport eine Resistenzerhöhung gegenüber Mitoxantron vermitteln können (Lage et al., 2001). Ende der neunziger Jahre wurde der Halbtransporter BCRP beschrieben (BCRP = b reast c ancer r esistance p rotein), welcher Resistenz gegenüber [Seite 10↓]Mitoxantron und Topotecan vermitteln kann (Doyle et al., 1998). Bei diesem Transporter ist bis heute nicht geklärt, ob er als Homo- oder Heterodimer fungiert.

Mitglieder der ABC-Transportfamilie findet man sowohl in Pro- und Eukaryoten. Für den Menschen wurden bisher 48 Voll- und Halbtransporter beschrieben. Da für viele dieser Transporter mehrere alternative Namen benutzt werden, wurde in den letzten Jahren der Versuch unternommen, eine einheitliche Nomenklatur zu entwerfen. Dazu wurden die Transporter in 7 Gruppen eingeteilt (Subfamilie A bis G), wobei sie nach ihren Ähnlichkeiten in der Sequenz gruppiert wurden (http://www.med.rug.nl/mdl/humanabc.htm und http://www.ucl.ak.uk).

Abb. 1.7 : Membrantopologie von ABC-Transportern

Dargestellt sind verschiedene Typen von ABC-Transportern in der Plasmamembran (PM).
a) mit zwei Transmembrandomänen (TM1 und TM2) und zwei nukleotidbindenden Domänen (NBD), z. B. MDR1; b) mit drei Transmembrandomänen (TM0, TM1 und TM2) und zwei NBDs, z. B. MRP1 und MRP2; c) mit je einer NBD und Transmembrandomäne (TM), z. B. BCRP. Jede der transmembranen Domänen besteht aus 6 membrandurchspannenden Helices (verändert nach Gottesman, 2002)


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1.2.3  Der ABC-Transporter MRP2/cMOAT/ABCC2

Der ABC-Transporter MRP2, auch cMOAT (canalicular multispecific organic anion transporter) genannt, gehört zur MRP-Familie. Er wurde als zweites Mitglied dieser Familie von Membrantransportern identifiziert und erhielt daher die Bezeichung MRP2. Nach der neuen Nomenklatur (Kap. 1.2.2) wurde er zur ABC-Transporter-Subfamilie C, der CFTR/MRP-ähnlichen Proteine, mit der Bezeichnung ABCC2 zugeordnet. Das humane Homolog wurde aufgrund seiner Sequenzähnlichkeit zu seinem aus der Ratte verwandten Gen kloniert (Taniguchi et al., 1996; Büchler et al., 1996). Das Gen ist auf Chromosom 10q24 lokalisiert und liefert eine mRNA von ca. 5 kb Länge. Die genomische Struktur von MRP2 besteht aus 32 Exons, deren Größe zwischen 56 und 255 bp liegt (Toh et al., 1999; Tsuji et al., 1999). Der Promotor von MRP2 enthält u. a. Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren AP1, AP2, TBP und C/EBPβ, wobei die beiden letztgenannten Bedeutung für die basale Expression von MRP2 besitzen(Tanaka et al., 1999; Stöckel et al., 2000). Das human Protein besteht aus 1545 Aminosäuren und wird hauptsächlich in der apikalen Membran von Hepatozyten exprimiert. Eine geringere Expression wurde auch für die Niere und den Dünndarm beschrieben (Kool et al., 1997). MRP2 besteht aus drei transmembranen und zwei nukleotidbindenen Domänen (Abb. 1.7) und besitzt damit eine Transmembrandomäne (am N-Terminus) mehr das das P-Glykoprotein. Durch Mutationsanalyse wurde festgestellt, daß der C-Terminus des Proteins besonders wichtig für die Lokalisation in der apikalen Membran und somit für die Ausscheidungsfunktion dieses Proteins ist (Harris et al., 2001).

Die biologische Funktion dieses Transporters besteht in der Ausscheidung von Bilirubin, das bei dem Abbau des Hämoglobins entsteht. In diesem Zusammenhang wurde auch das humane Krankheitsbild bei defektem oder fehlendem MRP2 beschrieben. Es handelt sich hierbei um das Dubin-Johnson-Syndrom, bei dem sich dunkel pigmentierte Ablagerungen in der Leber bilden und erhöhte Bilirubin-Spiegel im Blut gemessen werden. Da die Patienten im allgemeinen keine Beeinträchtigungen aufweisen, wird diese Krankheit nur sehr selten diagnostiziert (Übersicht in Zimniak, 1993). Einige Patienten wurden bereits auf Mutationen in MRP2 untersucht, wobei sowohl Punktmutationen als auch Deletionen gefunden wurden (Kamisako et al., 2000; Mor-Cohen et al., 2001).


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Nach Beschreibung des Gens wurden Expressionsuntersuchungen in Tumorzellinien durchgeführt. Bei Vergleich der Expressionshöhe mit der Sensitivität gegenüber bestimmten Zytostatika zeigte sich eine besondere Assoziation mit der Resistenz gegenüber Cisplatin (Taniguchi et al., 1996; Kool et al., 1997; Minemura et al., 1999). Häufig wurden auch Resistenzen gegenüber Anthrazyklinen, Vincristin, Etoposid und Camptothecin gefunden, wobei es je nach Zellsystem Unterschiede in diesem Kreuzresistenzmuster gab (Koike et al., 1997; Keppler et al., 1999). Der funktionelle Zusammenhang mit der Resistenzentwicklung konnte durch Transfektionsexperimente nach Klonierung der vollständigen cDNA-Sequenz von MRP2 bestätigt werden (Kawabe et al., 1999).

Für pharmakologische Untersuchungen haben sich zwei Tiermodelle der Ratte durchgesetzt, welche durch Mutation in MRP2 transportdefizient sind (Paulusma et al., 1996; Ito et al., 1997). Das Spektrum der transportierten Konjugate ist ähnlich dem von MRP (Kap. 1.2.2), jedoch mit unterschiedlichen Spezifitäten für einzelne Substanzen. So transportiert MRP1 17β-Glukuronosyl-Östradiol bevorzugt vor Monoglukuronosyl-Bilirubin, wohingegen sich die Präferenzen bei MRP2 umkehren(Übersicht in Keppler et al., 1997). In jüngerer Zeit ist man dazu übergegangen, die MRP2-Expression in Tumorpatienten zu untersuchen (Nies et al., 2001; Soini et al., 2001). Jedoch ist die Bedeutung der MRP2-Expression im Zusammenhang mit dem Ansprechen auf eine Chemotherapie bzw. dem Überleben der Tumorpatienten noch nicht ausreichend verstanden. Desweiteren wurden genetische Polymorphismen für MRP2 beschrieben (Itoda et al., 2002), deren mögliche Auswirkungen auf die Funktion des Proteins noch nicht untersucht worden sind.

1.3 Tumorzellinien zur Untersuchung von Resistenzmechanismen

Häufig benutzt man zur Aufklärung von Resistenzmechanismen Zellinienmodelle, von denen die resistenten Varianten aus der parentalen Linie durch eine allmähliche Konzentrationserhöhung eines gewählten Zytostatikums herangezogen wurden. Das Ausmaß der Resistenz (Resistenzfaktoren) kann man mit Hilfe verschiedenster Methoden bestimmen. Man unterscheidet dabei zwischen Klonogenitätsassay und Proliferationsassay. Zu den am häufigsten benutzten Proliferationsassays gehören der Sulforhodamin B-Assay (SRB-Assay) und der MTT-Test, wobei der auf einer Proteinbestimmung basierende SRB-Assay am besten mit der Zellzahl korreliert (Perez et al., 1993).


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In dieser Arbeit wurden humane Tumorzellinien aus drei verschiedenen Geweben verwendet. Die Ovarialkarzinomzellinie A2780 wurde aus einer noch nicht mit Zytostatika behandelten Patientin gewonnen (Eva et al., 1982). Die Melanomzellinie wurde aus einer Lymphknotenmetastase eines malignen Melanoms isoliert (Fogh et al., 1978) und am Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (New York, USA) etabliert. Ausgehend von dieser chemosensitiven Zellinie wurde die cisplatinresistente Variante MewoRCIS selektioniert (Kern et al., 1997). Die Nebennierenrindenkarzinomzellinie D43/86 wurde 1986 von einem männlichen Patienten im Universitätsklinikum Eppendorf (Hamburg, D) etabliert (nicht publiziert). Durch schrittweises Erhöhen der Cisplatinkonzentration im Zellkulturmedium wurden zu den Zellinien A2780 und D43/86 cisplatinresistente Varianten selektioniert (nicht publiziert) und als A2780RCIS und D43/86RCIS bezeichnet.

1.4 Ribozyme

Ribozyme sind katalytisch aktive, einzelsträngige RNA-Oligonukleotide, die als Antisense-Moleküle an ihr Zielmolekül binden und dieses endoribonukleolytisch spalten. Im Anschluß an diese Reaktion löst es sich von seinem Substrat und bindet an das nächste Zielmolekül. Diese Eigenschaft ist ein großer Vorteil gegenüber Antisense-Oligonukleotiden, die lediglich ein Zielmolekül binden und so inhibieren können. Gemäß dieser Definition gehören RNase P, Gruppe I- und II-Introns, das Spliceosom, das Hammerhead-Ribozym und das Hairpin-Ribozym in diese Gruppe (Übersicht in Lewin und Hauswirth, 2001). Natürlich vorkommende Ribozyme wurden außerdem im Hepatitis Delta-Virus und in Neurospora gefunden. Darüber hinaus wurden sogenannte DNA-Enzyme beschrieben, die in der Lage sind, RNA-Moleküle sequenzspezifisch zu spalten (Sen und Geyer, 1998).

1.4.1  Hammerhead -Ribozyme

Die Hammerhead-Ribozyme erhielten ihren Namen aufgrund der Tatsache, daß die zweidimensionale Struktur dieser Ribozyme an den Kopf eines Hammerhais erinnert (Abb. 1.8). Nach der Beschreibung der katalytischen Aktivität dieser kleinen RNA-Moleküle (Forster und Symons, 1987), wurden intensive Studien zur sekundären und tertiären Struktur durchgeführt. Dabei beschrieb man den Aufbau mit drei Stammstrukturen (Helix I, II und III), die den katalytischen Kern flankieren, und ermittelte hochkonservierte Einzelstrangbereiche [Seite 14↓]innerhalb der Hammerkopf-Struktur. Das Substrat muß die Sequenz 5’-NUX-3’ enthalten, wobei „N“ für jedes Nukleosid, „U“ für Uridin und „X“ für Adenosin, Cytidin oder Uridin steht. Die beste Spalteffizienz wurde für das 5’-GUC-3’-Triplett beschrieben (Haselhoff und Gerlach, 1988). Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit ausschließlich 5’GUC-3’-Tripletts als potentielle Schnittstellen in Betracht gezogen.

Abb. 1.8 : Hammerhead -Struktur eines Ribozyms

Dargestellt sind die Sekundärstruktur und die gebräuchliche Nomenklatur (Hertel et al., 1992) für Hammerhead-Ribozyme, sowie die Bindung an ein Substrat (verändert nach Lyngstadaas, 2001). Die Nukleotide C3 bis C15.2 sind konserviert. Mutationen in diesem Bereich führen zu Aktivitätsverlust bei der ribozymvermittelten Spaltung. Helix I besteht aus den Nukleotiden mit den Nummern 1 und 2, Helix II aus den Nukleotiden Nummer 10 und 11 und Helix III aus den Nukleotiden mit den Nummern 15 und 16. Die Ribozymschnittstelle ist durch einen Pfeil gekennzeichnet.

Hammerhead-Ribozyme wurden in den vergangenen Jahren häufig benutzt, um die Expression von Genen in Zusammenhang mit der Tumorigenese und der Chemoresistenzentwicklung zu modulieren (Übersicht in Bettinger und Read, 2001). So wurden u. a. Ribozyme gegen mdr1 (Holm et al., 1994 und 1995), GPC3 (Wichert et al., 1999), LRP (Kitazono et al., 1999), K-ras (Funato et al., 2000), BCRP (Kowalski et al., 2001 und 2002) und γ-Glutamylcystein-Synthetase (Iida et al., 2001) entwickelt und ihre Wirksamkeit erprobt.


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1.4.2  Ribozymdesign

Ribozyme katalysieren die sequenzspezifische Spaltung mittels alkalischer Hydrolyse in Gegenwart von Mg2+-Ionen. Diese Reaktion ist somit abhängig vom pH-Wert, der Temperatur und der Mg2+-Konzentration (Dahm und Uhlenbeck, 1991). Um die in vitro-Versuche weitgehend den Bedingungen in der Zelle anzupassen, wurden die Reaktionsbedingungen wie folgt gewählt: c(Mg2+) = 12 mM, pH = 7,5 und T = 37 °C (Kap. 2.2.26). Die ideale Länge der hybridisierenden Arme des Hammerhead-Ribozyms liegt bei 6 bis 8 Nukleotiden, was durch exprimentelle Erprobung festgestellt werden konnte (Lieber und Strauss, 1995).

In den letzten Jahren ist man dazu übergegangen, durch computergestützte Faltungsmethoden, die Sekundärstruktur einer gegebenen Ziel-mRNA zu berechnen. Man kann die Lage bestimmter schneidbarer Triplets nach unterschiedlichen Kriterien beurteilen und eine Vorauswahl treffen. Die Faltungsprogramme bieten im Allgemeinen mehrere Strukturvorschläge an, die sich in der freien Energie ΔG unterscheiden (z. B. mFOLD, http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/rna/form1.cgi). Man wählt solche Triplets, die an sogenannten „Schleifenstrukturen“ liegen (Stein und Cheng, 1993) bzw. Stellen, an denen die mRNA sterisch stark beansprucht wird. Die Hybridisierungssequenz der Ribozymarme muß nicht notwendigerweise an Einzelstrangbereichen der Ziel-mRNA liegen, da Ribozyme auch Tripel-Helix-Strukturen ausbilden können (Pieken et al., 1991). Diese Modelle bieten jedoch nur Ansatzpunkte. In jedem Fall ist das Ribozym im zellfreien System oder unter Nutzung von Zellinienmodellen auf seine Schnittaktivität zu testen.

1.4.3  Kinetische Parameter von Ribozymen

Die ribozymkatalysierte Spaltung einer spezifischen mRNA erfolgt in drei Schritten:

  1. Assoziation von Substrat und Ribozym;
  2. Substratspaltung unter Stabilisierung des Übergangszustandes und
  3. Destabilisierung und Dissoziation des Ribozym von seinen Schnittprodukten.

Die Bestimmung von Reaktionsparametern kann unter single turnover- oder multiple turnover-Bedingungen erfolgen. Bei single turnover-Bedingungen kann jedes Ribozym maximal nur einmal schneiden (Ribozymüberschuß). Hier spielt die Dissoziation des [Seite 16↓]Ribozyms von seinem geschnittenen Substrat keine Rolle, so daß sich die Berechnung der Reaktionsparameter vereinfacht. Diese Bedingungen werden häufig für die Bestimmung von Reaktionsparametern konstruierter Hammerhead-Ribozyme verwendet (Wichert et al., 1999; Kowalski et al., 2001; Materna et al., 2001). Bei multiple turnover-Bedingungen schneidet das Ribozym unter Substratüberschuß; jedes Ribozym kann also mehrere Substratmoleküle schneiden.

Die Initialgeschwindigkeit vini der ribozymkatalysierten RNA-Spaltung beschreibt die Geschwindigkeit des Umsatzes von ungespaltetem RNA-Substrat S in die Spaltprodukte P. Sie wird aus dem Quotienten der Stoffmenge des Produkts n(Pt) zum Zeitpunkt t errechnet (Hendry et al., 1997; Kap. 2.2.27). Die experimentelle Bestimmung des Parameters erfolgt aus dem Produkt-Zeit-Diagramm unter Nutzung des Anstiegs im annähernd linearen Anfangsbereich des Graphen. Im Laufe der Reaktion stellt sich ein Gleichgewichtszustand ein, bei dem sich das Substrat-Produkt-Verhältnis nicht mehr weiter verändert.

Der Reaktionsparameter kcat/kM ist eine Reaktionskonstante 2. Ordnung und stellt die energetische Barriere dar, die zwischen dem Ausgangs- und dem höchsten Energieniveau der Reaktion liegt. Es handelt sich dabei um den Quotienten aus der Rate des chemischen Stoffumsatzes kcat (in s-1) und der Michaelis-Konstante kM (in M). Bei einer Reaktion in zwei Schritten nach dem Muster

wobei R das Ribozym, S das Substrat und P die Spaltprodukte darstellen, entspricht kcat der Konstanten k2 und kM dem Quotienten (k-1 + k-2)/k1. Die Assoziationskonstante k1 ist bei langen Substraten, z. B. mRNAs, aufgrund von Sekundärstrukturen deutlich geringer als für Oligonukleotide (Hertel et al., 1994). Aus diesem Grund sollte die Bestimmung der Reaktionskonstanten mit möglichst langen Substraten durchgeführt werden, um eine bessere Vorhersage für die Wirksamkeit des Ribozyms in der Zelle zu erreichen. Der Reaktionsparameter kobs ist eine Reaktionskonstante 1. Ordnung und beschreibt den beobachteten Stoffumsatz der gesamten Reaktion und setzt sich aus der Summe der Dissoziationskonstante k-1 und der Konstante für die Spaltreaktion k2 zusammen.


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Experimentell werden die Reaktionsparameter kcat/kM (nach Heidenreich und Eckstein, 1992 und Hendry et al., 1995) und kobs (nach Heidenreich et al., 1994 und Hendry et al., 1995) aus Kinetiken in Abhängigkeit von der Substratkonzentration bzw. von der Zeit gewonnen (Kap. 2.2.27). Die Reaktionsparameter kcat/kM und kobs nach Hendry et al. (1995) unterscheiden sich dadurch, daß für deren Bestimmung nur das tatsächlich maximal abgebaute Substrat betrachtet wurde. In der Konsequenz sind diese kcat/kM- und kobs-Werte höher als die entsprechenden Werte ohne Berücksichtigung des Gleichgewichtszustandes (Wichert et al., 1999; Kowalski et al., 2001).

1.5 Zielstellungen der vorliegenden Arbeit

Um einen generellen Mechanismus für die Cisplatinresistenz in Tumorzellen zu finden, stehen die Ovarialkarzinomzellinie A2780, die Nebennierenrindenzellkarzinomzellinie D43/86, die Melanomzellinie Mewo und ihre jeweiligen cisplatinresistenten Varianten zur Verfügung. Mit Hilfe dieser Modellzellinien sind folgende Fragen zu beantworten:

  1. Wir hoch ist die Resistenz der cisplatinresistenten im Vergleich zu ihren parentalen Zellinien?
  2. Wie ist das Kreuzresistenzmuster in diesen Zellinien?
  3. Wie unterscheiden sich die cisplatinresistenten von den parentalen Zellinien in der Expression bekannter Gene, die eine Bedeutung für die Chemoresistenz haben könnten?
  4. Welche weiteren Faktoren könnten an der Chemoresistenz in diesen Zellinienmodellen beteiligt sein?
  5. Gibt es in den Zellinien einen gemeinsamen Unterschied in der Genexpression?
  6. Ist es möglich, mit Hilfe computergestützter Methoden und in vitro-Analysen, geeignete Ribozyme zu konstruieren, die die Expression des betreffenden Gens modulieren können?
  7. Wie effektiv sind diese Ribozyme im Vergleich zu anderen Ribozymen?
  8. Kann durch Überexpression/Ribozymeinsatz die Expression dieses Gens in Tumorzellen beeinflußt werden?
  9. Wie verändert sich dadurch das Resistenzniveau gegenüber Cisplatin und weiterer ausgewählter Zytostatika?[Seite 18↓]
  10. Wie verändern sich die Zellen nach Modulation der Expression hinsichtlich ihres Verhaltens unter Cisplatinbehandlung?
  11. Welche Möglichkeiten ergeben sich aus den Ergebnissen für die Therapie von malignen Tumoren?


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04.08.2004