2  Material und Methoden

Alle Chemikalien wurden mit dem Reinigungsgrad „zur Analyse“ erworben.

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Tab. 2.1 : Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide.

^aAngaben des Herstellers laut Synthese-Report (MWG, Ebersberg, D)

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Die in dieser Arbeit verwendeten humanen Karzinomzellinien wurden freundlicherweise vom Zellkulturlabor des Instituts für Pathologie der Charité zur Verfügung gestellt (Tab. 2.2).

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Tab. 2.2 : Humane Karzinomzellinien.

Bei dem verwendeten Bakterienstamm Escherichia coli TOP10F’ (Invitrogen) handelt es sich nach den Angaben des Herstellers um folgenden Genotyp:

F’ {lacI^q Tn10 (Tet^R)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 deoR araD139 Δ(ara-leu)7697 galU gal/K rpsL (Str^R) endA1 nupG.

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Alle eukaryotischen Zellen wurden im Inkubator (BBD6220, Heraeus) bei 37 °C und 95 % Luftfeuchtigkeit in Gegenwart von 5 % CO₂ in modifiziertem L-15-Medium angezogen. Den cisplatinresistenten Zellinien wurden folgende Mengen Cisplatin zugesetzt: A2780RCIS 10 µg/ml, D43/86RCIS 2 µg/ml und MewoRCIS 1 µg/ml Medium.

Zweimal wöchentlich wurde der Zustand der Zellen mikroskopisch beurteilt (Zelldichte, eventuelle Infektionen oder abgestorbene Zellen). Je nach den Erfordernissen wurden die Zellen trypsiniert (50-100 µl Trypsin-Lösung/cm² Zellkulturgefäßboden; Inkubation bei 37 °C bis zum Ablösen der Zellen), um ihre Anzahl im Zellkulturgefäß zu verringern oder nur ein Mediumwechsel durchgeführt.

Trypsin-Lösung

Die Trypsin/EDTA-Lösung (Biochrom AG) enthält 0,5 % Trypsin und 0,2 % EDTA in 10 x PBS. Diese Lösung wurde vor Gebrauch 1:10 mit autoklaviertem A. bidest. verdünnt und sterilfiltriert.

Die Zellen wurden bei Konfluenz trypsiniert, 1:1 mit Medium versetzt, um das Trypsin zu inhibieren, und 5 min bei 950 rpm und 25 °C zentrifugiert (Zentrifuge: GS-6KR, Beckman-Coulter, 200 x g). Das Zellpellet wurde in 95 % FKS und 5 % DMSO resuspendiert (ca. 2 x 10⁶ Zellen/ml). Diese Zellsuspension wurde in Aliquots von je 1 ml in Einfrierröhrchen überführt. Über Nacht wurden diese Röhrchen in einer mit Isopropanol gefüllter Einfrierbox langsam auf –80 °C abgekühlt. Danach wurden die Röhrchen in andere Boxen umgelagert und weiterhin bei –80 °C gelagert. Bei Bedarf wurden die Röhrchen aufgetaut und die Zellsuspension in ein Zellkulturgefäß mit modifiziertem L-15-Medium gegeben. Nach dem Anheften der Zellen, spätestens jedoch nach 24 h, wurde ein Mediumwechsel durchgeführt.

Die Transfektionen wurden mit Hilfe des DMRIE-C-Reagenzes (GibcoBRL) durchgeführt. Es wurden Zellen der Linie A2780 bzw. A2780RCIS (ohne Zytostatikum im Medium) in Zellkulturgefäßen mit 3,5 cm Durchmesser ausgesät und mindestens 24 h bis zu einer Konfluenz von 30-50 % kultiviert. Plasmid-DNA (Kap. 2.2.6) wurde mit 1/10 3 M Natriumazetat (pH 5,2) und 2,5 Volumen absolutem Ethanol 30 min bei –20 °C gefällt und anschließend 20 min bei 4 °C und 14 000 rpm (Zentrifuge: 5417R, Eppendorf) zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20 µl sterilem 10 x PCR-Puffer (inklusive 15 mM MgCl₂, Perkin Elmer) aufgenommen, unter sterilen Bedingungen ein Aliquot abgenommen und die DNA-Menge spektrophotometrisch bestimmt. 2 µg Plasmid-DNA wurden zu 1 ml OPTI-MEM gegeben. 5 µl DMRIE-C-Reagenz wurden in einem zweiten Röhrchen in ebenfalls 1 ml OPTI-MEM aufgenommen. Die beiden Lösungen wurden zueinander gegeben und vorsichtig gemischt. Damit sich die Lipid-DNA-Komplexe bilden konnten, wurde die Lösung 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Zellrasen wurde 1 x mit 2 ml OPTI-MEM gewaschen und das Medium mit den Lipid-DNA-Komplexen zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden 5 h mit dieser Lösung bei 37 °C und 5 % CO₂ im Brutschrank inkubiert. Die Transfektionslösung wurde entfernt, 2,5 ml modifiziertes L-15-Medium zu den Zellen gegeben und die Zellen wie gewohnt weiter kultiviert. Nach 24 h wurden die Zellen trypsiniert und auf Zellkulturschalen mit 10 cm Durchmesser umgesetzt. Gleichzeitig wurden die Zellen ab diesem Zeitpunkt unter einem Selektionsdruck von 800 µg/ml G418 gehalten. Nach ca. 2 Wochen konnten die [Seite 33↓]heranwachsenden Klone gepickt und auf Zellkulturgefäße mit 1 cm Durchmesser umgesetzt werden. Die Zellen wurden im Folgenden dauerhaft unter Selektionsdruck gehalten. Die Zellen auf einer Kontrollplatte, die mit einer Lipid-Lösung ohne DNA transfiziert wurde, starben innerhalb einer Woche nach der Transfektion unter Selektionsdruck vollständig ab.

Plattenkulturen

E.coli-Kulturen wurden auf LB-Agar-Platten (Schalen mit 10 cm Durchmesser und 20 ml LB-Agar), die 100 µg/ml Ampicillin oder Carbenicillin enthielten, mittels Spatel ausplattiert und bei 37 °C im Brutschrank für 16-20 h angezogen.

LB-Agar

Schüttelkulturen

E. coli-Kulturen wurden in 5 ml-Ansätzen über Nacht in LB-Medium unter Zusatz von Ampicillin oder Carbenicillin (Endkonzentration: 100 µg/ml) bei 37 °C unter Schütteln bei 160 rpm angezogen.

LB-Medium

Anlage von Stammkulturen

Zur langfristigen Lagerung wurden Bakterien nach Schüttelkultur in LB-Medium mit 20 % (v/v) Glyzerin aufgenommen und bei –80 °C gelagert. Zur Reaktivierung wurden diese Stammkulturen aufgetaut und einige µl in LB-Medium unter Zusatz von 100 µg/ml Ampicillin oder Carbenicillin erneut als Schüttelkultur herangezogen.

Für die Transformationen wurde der One Shot^TM Reagent-Kit (Invitrogen) verwendet. Zu 50 µl auf Eis aufgetauter Bakteriensuspension (TOP10F’-E.coli-Stamm) wurden 2 µl 0,5 M β-Mercaptoethanol gegeben, vorsichtig gemischt, 2 µl ligiertes Plasmid (Kap. 2.2.18) zugegeben und 30 min auf Eis inkubiert. Danach erfolgte ein Hitzeschock bei 42 °C für 30 s. Die Bakterien wurden erneut auf Eis gestellt und nach ca. 2 min unter sterilen Bedingungen 250 µl SOC-Medium zugegeben. Die transformierten Bakterien wurden 1 h bei 37 °C unter Schütteln von 170 rpm inkubiert, 100 µl Bakteriensuspension auf vorbereitete LB-Agar-Platten ausplattiert und über Nacht kultiviert (Kap. 2.2.4).

Die Plasmid-DNA wurde mit dem QIAprep-Spin-Plasmid-Kit (Qiagen) isoliert. 4 ml der Übernachtkulturen von E. coli wurden bei 3000 rpm und Raumtemperatur für 5 min pelletiert (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf) und nach Protokoll weiterbehandelt. Die Plasmid-DNA wurde mit 50 µl Elutionspuffer eluiert.

Die Restriktion der DNA mit Restriktionsendonukleasen erfolgte nach den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen für das jeweilige Restriktionsenzym in 20 µl-Ansätzen. Nach Zugabe der Restriktionsendonuklease (10 U) und dem dazu passenden Puffer wurden die Ansätze mit Plasmid-DNA bei 37 °C ca. 2 h oder über Nacht inkubiert.

Gesamt-RNA wurde aus eukaryotischen Zellen unter Verwendung von Trizol^® (GibcoBRL) isoliert. Die Zellen wurden unter Zugabe von 1 ml Trizol^®/10 cm² bewachsene Fläche in ihrem Zellkulturgefäß lysiert und dieses Lysat in ein phenolbeständiges 15 ml-Röhrchen überführt. Pro ml Trizol wurden 0,2 ml Chloroform zugegeben, ca. 15 s intensiv geschüttelt [Seite 35↓]und für weitere 2-3 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden 15 min bei 4 °C und 3000 rpm (Zentrifuge: GS-6KR, Beckman-Coulter, 2060 x g) zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wurde abgenommen und in ein neues 15 ml-Röhrchen überführt. Unter Zugabe von 0,5 ml Isopropanol (pro ml zu Beginn eingesetztes Trizol^®) wurde die RNA bei –20 °C über Nacht gefällt. Danach wurde sie durch Zentrifugation bei 3000 rpm und 4 °C innerhalb von 10 min pelletiert. Das Pellet wurde in 70 %igem Ethanol in DEPC-Wasser (0,2 % DEPC in A. bidest., autoklaviert) gewaschen, in ein 2 ml-Reaktionsgefäß überführt und nochmals 5 min bei 4 °C und 9500 rpm (Zentrifuge: 5417R, Eppendorf) abzentrifugiert. Das Pellet wurde luftgetrocknet und in DEPC-Wasser aufgenommen. Die Proben wurden bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Der aufzutrennenden RNA wurde 1,8 Volumen RNA-Ladepuffer zugesetzt. Die Proben wurden bei 65 °C denaturiert, danach sofort auf Eis überführt und nach dem Abkühlen aufgetragen. Die gelchromatographische Auftrennung erfolgte bei 75 V in 1,0 %igen Agarosegelen in 1 x MOPS-Puffer und 6 % Formaldehyd. Als Laufpuffer wurde 1 x MOPS-Puffer verwendet. Zur Orientierung wurden in einer zusätzlichen Bahn 1 µl farbstoffenthaltender 6 x Blue/Orange Loading Dye (Promega) aufgetragen.

Die Konzentrationsmessung von Nukleinsäuren wurde am UV-Spektrophotometer (Hitachi) bei einer Wellenlänge von 260 nm durchgeführt. Für die Bestimmung der Konzentrationen wurden folgende Umrechnungsfaktoren berücksichtigt: 1 OD entpricht 50 µg/ml doppelsträngiger DNA bzw. 40 µg/ml RNA.

Nach der elektrophoretischen Auftrennung von RNA (Kap. 2.2.9) wurde das Agarosegel 30 min durch Schwenken in A. bidest. gewaschen. Die RNA wurde über Nacht unter Verwendung von 10 x SSC als Transferpuffer auf eine positiv geladene Nylonmembran (Amersham Pharmacia Biotech) transferiert (Kapillarblot nach Sambrook und Russell, 2001). Die Blot-Effektivität wurde durch Vergleich von Gel und Membran auf dem UV-Transilluminator (MWG-Biotech) kontrolliert. Im UV-Crosslinker (Hoefer) wurde die RNA mit der Nylonmembran quervernetzt (0,12 mJ/cm²). Diese Blots konnten entweder sofort verwendet oder trocken bei Raumtemperatur gelagert werden.

Für die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde das Megaprime^TM DNA Labelling System (Amersham) verwendet. 25 ng der zu markierenden DNA wurden in 28 µl A. bidest. aufgenommen und 5 µl Hexanukleotid-Zufallsprimer dazugegeben. Die DNA-Doppelstränge wurden bei 95 °C aufgeschmolzen. Während das Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur verblieb, wurden 10 µl 5 x Markierungspuffer, 5 µl ³²P-dCTP (50 µCi) und 2 µl (1 U/µl) DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben und vorsichtig gemischt. Die Markierung erfolgte bei 37 °C für 30 min. Anschließend wurde die DNA erneut bei 95 °C denaturiert und auf Eis abgekühlt.

Die Blots (Kap. 2.2.11) wurden bei 58 °C für mindestens eine Stunde in ExpressHyb^TM Hybridisierungslösung (Clontech) prähybridisiert. Danach wurde die markierte Sonde (Kap. 2.2.12) zugegeben. Die Hybridisierung erfolgt über Nacht bei 58 °C. Die nicht gebundene DNA wurde am nächsten Tag in vier aufeinanderfolgenden Waschschritten entfernt: 2 x 15 min bei Raumtemperatur mit 2 x SSC (Kap. 2.2.12)/0,1 % SDS und 2 x 15 min bei 58 °C in 0,1 x SSC/0,1 % SDS. Die Exposition der Blots erfolgte auf Röntgenfilm (Kodak).

Entfernung von gebundenen Sonden

Eine 0,1 %ige SDS-Lösung in A. bidest. wurde hergestellt und aufgekocht. Die bereits benutzte Membran wurde in die Lösung gegeben und 30 bis 60 min in der sich abkühlenden Flüssigkeit inkubiert. Danach konnte sie erneut für eine Hybridisierung verwendet werden.

Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen wurde unter Verwendung des Superscript Preamplification System for First Stand cDNA Synthesis (GibcoBRL) in cDNA nach den Angaben des Herstellers umgeschrieben. Es wurden Hexanukleotide mit zufälliger Sequenz als Primer verwendet, um pro Ansatz 2 µg Gesamt-RNA umzuschreiben. Die cDNAs wurden 1:50 für RT-PCR bzw. 1:5 für die Quantifizierung mittels real-time-RT-PCR in A. bidest. verdünnt.

Die Amplifikation erfolgte im PCR-Thermal Cycler (Biometra) nach folgendem Programm:

1. Thermische Aktivierung der Polymerase: 12 min, 94 °C;

2. DNA-Amplifikation in 36 Zyklen, bestehend aus

2.1 Denaturierung der Doppelstrang-DNA: 60 s, 94 °C;

2.2 Hybridisierung der Primer an die komplementären Sequenzen: 90 s, bei T_H (Tab. 2.3);

2.3 Elongation der Primer: 90 s, 72 °C;

3. Extension: 5 min, 72 °C

4. Abkühlung: ohne Zeitvorgabe, 4 °C.

Tab. 2.3 : Primer-Hybridisierungstemperaturen (T _H ) der durchgeführten PCRs.

^a PCR mit AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase
^b RT-PCR mit Advantage^®-Polymerase-Mix
^c real-time-RT-PCR im Lightcycler
^dZusatz von Betain (Endkonzentration: 1 M) und DMSO (Endkonzentration: 5 %)

RT-PCR mit Advantage ® -Polymerase-Mix:

Der Advantage^®-Polymerase-Mix (Clontech) enthält die KlenTaq-1-DNA-Polymerase, eine weitere Polymerase, die eine 3‘-5‘-Korrekturleseaktivität besitzt, und den TaqStart^TM- Antikörper, damit eine automatische hot start-PCR ermöglicht wird. Dieser Polymerase-Mix bietet durch seine besondere Zusammensetzung u. a. die Möglichkeit, besonders lange PCR-Fragmente zu amplifizieren. Die PCR-Ansätze waren wie folgt zusammengesetzt:

Die Amplifikation erfolgte im PCR-Thermal Cycler (Biometra) nach folgendem Programm:

1. Initiale Denaturierung: 1 min, 94 °C;

2. DNA-Amplifikation in 36 Zyklen, bestehend aus
2.1 Denaturierung der Doppelstrang-DNA: 30 s, 94 °C;
2.2 Hybridisierung der Primer an die komplementären Sequenzen: 30 s, bei T_H (Tab. 2.3);
2.3 Elongation der Primer: 6 min, 68 °C;

3. Extension: 6 min, 68 °C

4. Abkühlung: ohne Zeitvorgabe, 4 °C.

Real-time -RT-PCR im Lightcycler:

Die Lightcycler-Technologie (Roche) bietet die Möglichkeit, den Verlauf einer PCR am Computer-Monitor mitzuverfolgen und aufgrund einer mitlaufenden Standardreihe mittels mathematischen Methoden auf die Ausgangsmolekülzahl in einer Probe für eine bestimmte Matrize zu schließen. Die PCR-Ansätze waren wie folgt zusammengesetzt:

In einem Lauf konnten bis zu 32 PCRs gleichzeitig durchgeführt werden. Es wurden bei jedem Lauf eine Nullkontrolle (A. bidest.) und eine Standardreihe von 6 bis 8 Proben (in 2er oder 10er Verdünnungsstufen) mitgeführt. Vor jeder Quantifizierung wurde der spezifische Meßpunkt für eine PCR bestimmt. Dazu wurde eine Probe-PCR für die Matrize durchgeführt und die Schmelzkurve für das Produkt analysiert. Die Meßtemperatur (T_Meß) wurde so ausgewählt, daß sie knapp vor dem Abschmelzen des PCR-Produktes lag. Bei dieser Temperatur liegen eventuelle Primer-Dimere bereits als DNA-Einzelstränge vor und werden somit nicht mitgemessen.

Die Amplifikation erfolgte im LightCycler (Roche) nach folgendem Programm:

1. Initiale Denaturierung: 10 min, 95 °C;

2. DNA-Amplifikation in 40-50 Zyklen, bestehend aus
2.1 Denaturierung der Doppelstrang-DNA: 15 s, 95 °C;
2.2 Hybridisierung der Primer an die komplementären Sequenzen: 5 s, bei T_H (Tab. 2.3);
2.3 Elongation der Primer: 10 s, 72 °C;
2.4 Meßpunkt: ohne Zeit, T_Meß, messen;

3. Schmelzkurve: ohne Zeit, 95 °C; 15 s, 65 °C; in 0,1 °C/s auf 95 °C, fortwährend messen;

4. Abkühlung: 30 s, 40 °C.

Die gelchromatographische Auftrennung von DNA erfolgte bei 85 V in 1,0-1,5 %igen Agarosegelen mit 1 x TAE als Laufpuffer. Die Gele enthielten 0,2 µg/ml Ethidiumbromid. Den Proben wurde anteilig 6 x Blue Orange Loading Dye (Promega) zugesetzt. Nach dem [Seite 41↓]Gellauf wurden die Banden durch UV-Beleutung sichtbar gemacht und photographisch dokumentiert.

Nach Agarosegel-Elektrophorese (Kap. 2.2.16) wurde die DNA-Fragmente unter UV-Licht mit einem Skalpell ausgeschnitten. Für die Gelelution wurde der QIAquick Gel Extraction-Kit (QIAGEN) verwendet und nach dem Herstellerprotokoll vorgegangen. Die DNA wurde in 30 oder 50 µl Elutionspuffer aufgenommen.

Ligation mit T4-DNA-Ligase:

Die Ligation erfolgt über Nacht bei 12 °C.

Ligation von PCR-Produkten:

Die Ligation erfolgte mit den Kits TOPO TA Cloning^® (Vektor: pCR^® 2.1 TOPO) und Eukaryotic TOPO TA Cloning^® (Vektor: pcDNA3.1/V5/His-Topo) von Invitrogen nach den Angaben des Herstellers.

Die zu sequenzierende Plasmid-DNA wurde auf eine Konzentration von 0,1 µg/µl eingestellt. Anschließend wurde die Sequenzierung von Dr. Martin Meixner am Institut für Genetik der Humboldt-Universität zu Berlin durchgeführt. Es wurden der DNA-Sequenzierautomat ABI-373 und der ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit verwendet.

Um für Ribozyme gut zugängliche Sequenzen in der Ziel-mRNA zu identifizieren, wurden die Programme DNASIS 3.0 (Hitachi) und mFOLD 3.1 (http://bioinfo.math.rpi.edu) genutzt. Da die Gesamt-mRNA für eine Faltungsanalyse zu lang war (die vom Anbieter gesetzten Grenzen liegen bei 3000 nt), wurden innerhalb der MRP2-mRNA kürzere Bereiche (Größe 1000 bis 2000 nt) gewählt. Bei der Auswahl der Ribozyme wurde diejenige potentielle Sekundärstruktur betrachtet, die über die geringste freie Energie ΔG verfügt (Zarrinkar und Williamson, 1994; Zuker und Stiegler, 1981).

Um die ausgewählten Ribozyme in vitro mittels T7-Polymerase transkribieren zu können, müssen die Ribozym-DNA-Matrizen eine vorangestellte T7-Promotorsequenz besitzen. Die Einzelstrang-Oligonukleotide RcMAT7-fw/rev und RcMBT7-fw/rev wurden chemisch synthetisiert (Tab. 2.1). Je 2,5 nmol T7-Promotor-Ribozym-Oligonukleotid (fw und rev) wurden zusammengegeben und folgendes Temperaturprotokoll durchgeführt:

1. Denaturierung der ssDNA-Oligonukleotide: 2 min 94 °C;
2. Hybridisierung der ssDNA-Oligonukleotide: 8 min 70 °C;
3. Abkühlung der dsDNA-Oligonukleotidlösung: auf 4 °C.

Als Matrizen für die in vitro-Transkription wurden die zu Doppelsträngen hybridisierten T7-Promotor-Ribozym-Oligonukleotide (Kap. 2.2.21) und PCR-Produkte für die Substrate mit vorangestelltem T7-Promotor verwendet (Kap. 2.2.15, Tab. 2.3). Die Reaktionsansätze waren wie folgt zusammengesetzt:

Die Ansätze wurden 2 h bei 37 °C inkubiert und anschließend die Reaktion durch Zugabe von 10 µl 3 x PAGE-Auftragepuffer abgestoppt.

Die Auftrennung der in vitro-Transkriptionsprodukte sowie die Charakterisierung der Ribozyme durch zeit- und substratabhängige Kinetiken erfolgte mittels PAGE in 1 x TBE als Laufpuffer. Das Gel setzte sich wie folgt zusammen:

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Die Bestandteile wurden zusammengegeben, der Harnstoff gelöst und die Lösung durch Filtern entgast. Für die Polymerisierung wurden weiterhin zugegeben:

Die Auftrennung erfolgte bei kurzen Gelen (Länge: 20 cm) zunächst 20 min bei 15 W, anschließend bis zur kompletten Auftrennung bei 25 W. Bei langen Gelen (Länge: 42 cm) erfolgte der Lauf zuerst 30 min bei 20 W, danach bis zur vollständigen Auftrennung bei 40 W. Nach Exposition auf Röntgenfilm (Kodak) bei –80 °C konnten die in vitro-Transkriptionsprodukte nach ca. 15 min bzw. bei analytischen Gelen die Ausgangs- und Spaltprodukte eines Schnittversuchs nach 1-3 Tagen sichtbar gemacht werden.

Röntgenfilm und Polyacrylamidgel wurden zur Deckung gebracht. In Höhe der Banden auf dem Film wurde der entsprechende Gelbereich ausgeschnitten, die Probe in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt und mit einer Pipettenspitze zerkleinert. Nach Zugabe von 400 µl RNA-Elutionspuffer wurden die Proben durch sequenzielles Einfrieren mit flüssigem Stickstoff und anschließendem Auftauen bei 37 °C weiter aufgeschlossen. Die Proben wurden über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Proben 5 min [Seite 45↓]bei 14 000 rpm (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf) zentrifugiert und der Überstand in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Die eluierte RNA wurde durch Zugabe von 0,1 Volumen 3 M Natriumazetat, 2,5 Volumen Ethanol und 5 µg Glykogen für 3 h bei –70 °C gefällt. Die RNA wurde 1 h bei 14 000 rpm (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf) pelletiert, kurz mit 70 %igem Ethanol in DEPC-Wasser (Kap. 2.2.8) gewaschen und erneut für 15 min zentrifugiert. Das Pellet wurde getrocknet und im β-Counter Wallac 1409 (Wallac) vermessen.

RNA-Elutionspuffer

Die Stoffmenge radioaktiv markierter RNA kann aus der im β–Counter gemessenen Stahlung berechnet werden.

In die Berechnung ging außerdem der Faktor W ein, der den Einbau von unmarkiertem UTP an einer beliebigen Position des transkribierten Moleküls beschreibt. Dieser Faktor wird aus dem Quotienten der Stoffmenge eingesetzten unmarkierten UTPs und der Anzahl von UMPs je transkribiertem Molekül berechnet:

Somit ergibt sich die Stoffmenge des Transkriptes nTranskript aus dem Produkt der gemessenen Radioaktivität der Probe Ameß und dem Quotienten W/A:

Die ribozymatische Spaltung der RNA in vitro wurde in einem Gesamtvolumen von 10 µl unter Anwesenheit von unterschiedlichen Mengen Substrat und Ribozym (Tab. 2.4) in 1 x Ribozym-Puffer bei 37 °C durchgeführt. Nach bis zu fünfstündiger Inkubation wurden die Ansätze mit 10 µl 3 x PAGE-Auftragepufffer (Kap. 2.2.22) versetzt.

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Tab. 2.4 : Reaktionsbedingungen bei der RNA-Prozessierung.

Die Initialgeschwindigkeit v_ini der ribozymatischen RNA-Spaltung bezeichnet die Geschwindigkeit der Umsetzung des ungespaltenen RNA-Substrates S in die beiden Spaltprodukte P bei anfänglichem Substratüberschuß. Sie wird aus dem Quotienten der Stoffmenge des gebildeten Produktes P zum Zeitpunkt t errechnet (Hendry et al., 1997):

Die Initialgeschwindigkeit entspricht dabei dem Anstieg im angenommenen linearen Anfangsbereich des Graphen n(P_t) = f(t), da dieser Bereich die Reaktion unter Substratüberschuß widerspiegelt.

Der Reaktionsparameter k_cat/k_M (nach Heidenreich & Eckstein, 1992) wurde aus der ribozym-konzentrationsabhängigen Spaltung des RNA-Substrates nach folgender Gleichung berechnet:

Die Gültigkeit ist auf einen Bereich beschränkt, bei dem bei steigender Ribozymkonzentration auch eine Zunahme der Spaltprodukte zu verzeichnen ist. Der Parameter k_cat/k_M ist nach Umstellung der Heidenreich´schen Formel wie folgt definiert:

Der Parameter k_cat/k_M entspricht dem Anstieg im angenommenen linearen Teils des –ln S_u/t = f(c_Rz)-Diagramms.

Eine weitere Berechnungsmöglichkeit (Hendry et al., 1995) berücksichtigt, daß die Reaktion nicht bis zum vollständigen Abbau des Substrates fortschreitet, sondern in der Praxis einen Maximalwert an gespaltenem Substrat bzw. entstandenem Produkt annimmt. Daher kann man den folgenden Zusammenhang definieren:

Auch diese Formel ist in dem Bereich definiert, in dem bei steigender Ribozymkonzentration auch eine Zunahme der Spaltprodukte zu verzeichnen ist. Für den Parameter k_cat/k_M nach Hendry et al. (1995) ergibt sich nach Umformung der folgende Zusammenhang:

Der Parameter k_cat/k_M nach Hendry et al. (1995) entspricht dem Anstieg des angenommenen linearen Abschnitts des Graphen im –ln S_max/t = f(c_Rz)-Diagramm.

Der kinetische Parameter k_obs beschreibt den beobachteten Stoffumsatz für die Gesamtreaktion aus Assoziation des Ribozyms mit seinem Zielmolekül und der Spaltung selbst. Er wurde nach seiner Definition (Heidenreich et al., 1994) aus der zeitabhängigen Kinetik ermittelt:

Der Parameter k_obs nach Heidenreich et al. (1994) entspricht dem Anstieg des angenommenen linearen Abschnitts des Graphen im –ln S_u = f(t)-Diagramm. Analog zu den Berechnungen von k_cat/k_M wurde berücksichtigt, daß die Reaktion nicht bis zum vollständigen Abbau des Substrates fortschreitet und k_obs nach Hendry et al. (1995) berechnet:

Nach Umformung ergibt sich:

Der Parameter k_obs nach Hendry et al. (1995) entspricht dem Anstieg des angenommenen linearen Abschnitts des Graphen im –ln((P_∞-P_t)/P_Δ) = f(t)-Diagramm.

Eukaryotische Zellen wurden in Zellkulturschalen mit einem Durchmesser von 8 cm ausgesät. Bei einer Konfluenz von ca. 80 % wurde das Zellkulturmedium abgesaugt und die Zellen zweimal mit eiskaltem 1 x PBS gewaschen. Die Schalen wurden auf Eis gestellt, je 3 ml Hypolyse-Puffer zugegeben, kurz geschwenkt und 5 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden abgeschabt, die Suspension in einen Homogenisator überführt und durch 10-12maliges Hochziehen und Runterdrücken des Pistills geschert. Die Suspension wurde in 15 ml-Röhrchen überführt und 10 min bei 4 °C und 2200 rpm (Zentrifuge: GS-6KR, Beckman-Coulter, 1100 x g) zentrifugiert. Der Überstand wurde in Ultrazentrifugen-Röhrchen gegeben und 30 min bei 4 °C und 60 000 rpm (Zentrifuge: Optima^TM TL, Beckman-Coulter, 153 000 x g) zentrifugiert. Das Pellet wurde in einer geeigneten Menge 4 x Proben-Puffer (50-200 µl) resuspendiert, 10 min bei 95 °C inkubiert und erneut 5 min bei 14 000 rpm und 4°C und zentrifugiert. Der Überstand wurde aliquotiert und bei –80 °C gelagert.

Hypolyse-Puffer

1 Cocktail-Tablette mit Proteinase-Inhibitoren (Roche) wird in 2 ml A. bidest. vollständig aufgelöst. Diese 2 ml werden zu 48 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) gegeben. Die Lösung ist ca. 2 Wochen bei 4 °C lagerbar.

In 2 ml Reaktionsgefäßen wurde je 1 ml Elutionslösung für Protein-Färbung vorgelegt. Auf einer Nitrozellulosemembran wurden nebeneinander 2 µl-Tröpfchen von den zu bestimmenden Proteinlösungen gesetzt (Doppelbestimmung). Außerdem wurde - ebenfalls als Doppelbestimmung - BSA in 1 x PBS (Kap. 2.2.28) in bekannter Proteinkonzentration als Eichreihe mitgeführt. Die Membran wurde für 60-90 s mit einer Amidoschwarzlösung gefärbt. Nach Abkippen der Färbelösung wurde die Membran mittels Entfärber-Lösung so lange entfärbt, bis die Nitrozellulosemembran des Hintergrundes wieder fast weiß war. Die Protein-Punkte waren nun blau. Mit einem Skalpell wurden die Punkte samt Hintergrund in annähernd gleich großen Quadraten ausgeschnitten und in die vorbereiteten Reaktionsgefäße mit der Elutionslösung gegeben. Für den Referenzwert wurde ein Quadrat mit Hintergrund ausgeschnitten. Die Reaktionsgefäße wurden ca. 20 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Dabei ging die Blaufärbung auf den Elutionspuffer über. Diese gefärbte Lösung wird in Einmal-Küvetten gegeben. Unter Nutzung des Spektrophotometers (Pharmacia) und dem Programm VWSS (Pharmacia) wurde der Referenzwert Null gesetzt und die Extinktion der Proben bei einer Wellenlänge von 630 nm bestimmt. Nach Auftragen der Eichkurve konnte die Proteinkonzentration der Proben ermittelt werden.

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30 µg Membranproteine wurden mit 2 x Probenpuffer (Kap. 2.2.28) auf 15 µl eingestellt und 5-10 min bei 95 °C denaturiert. Die Proben wurden 1 min bei 14 000 rpm (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf) zentrifugiert und der Überstand aufgetragen. Die Auftrennung der Membranproteine erfolgte mittels PAGE in 1 x Laufpuffer zunächst 30 min bei 65 V, danach für weitere 1,5 bis 2 h bei 95 V.

7,5 %iges Trenngel

Sammelgel

10 x Laufpuffer

Nach der PAGE für Proteine wurden das Sammelgel abgetrennt. Trenngel, Zellulosenitrat-Membran und 6 Lagen Whatman-Papier gleicher Größe wurden in 1 x Transfer-Puffer äquilibriert. Der Transfer erfolgte in einer Semi-dry-Blotapparatur (Biometra), wobei die sandwich-artige Übereinanderschichtung von Whatman-Papier, Membran und Gel nach den Angaben des Herstellers ausgeführt wurde, bei 3 mA/cm² Blotfläche für 90 min.

1 x Transferpuffer

Nachdem die nach ihrer Größe aufgetrennten Proteine auf Nitrozellulose-Membranen transferiert wurden, schloß sich der Nachweis von Proteinen an, die sich auf diesen Membranen befanden. Das MRP2-Protein wurde gleichzeitig mit Aktin (Kontrolle der [Seite 54↓]Beladung) nachgewiesen. Dazu wurden die primären Antikörper gegen MRP2, Klon M₂I-4 (Sanbio), 1:100 und X-Actin, Klon C4 (Chemicon) 1:4000 in 1 % Magermilchpulver in 0,05 % TBST eingesetzt und ca. 1 ½ h bei Raumtemperatur unter Schwenken (Schwenker: WT16, Stufe 6) inkubiert. Die Membran wurde viermal in 0,05 % TBST innerhalb von 30 min gewaschen (Schüttler: KL2, 420 rpm). Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem sekundären Antikörper Anti-Maus, mit POD-Markierung (Dianova) in einer Verdünnung von 1:10 000 in 0,05 % TBST für ca. 1 h unter Schwenken (Schwenker: Stufe 6). Es wurde erneut viermal in 0,05 % TBST innerhalb von 30 min gewaschen (Schüttler: KL2, 420 rpm). Die Detektion erfolgte mittels ECL^TM-Kit (Amersham Pharmacia Biotech) nach den Angaben des Herstellers. Die Exposition der Blots erfolgte 5-15 min auf Hyperfilm ECL (Amersham).

0,05% TBST

Der Zellproliferationsassay basierend auf einer Färbung mittels SRB bietet eine Möglichkeit, behandelte und unbehandelte Zellen hinsichtlich ihrer Zellzahl zu vergleichen, die mit der gefärbten Proteinmenge korreliert (Perez et al., 1993).

Es wurden auf einer 96-Kaviditäten-Mikrotiterplatte 3 x 10 Kaviditäten pro Testreihe mit je 800 Zellen/Vertiefung in je 100 µl modifiziertem L-15-Medium ausgesät. Auf diese Weise konnten zwei Tests pro Platte durchführt werden. Der verbleibende Rand wurden als Verdunstungsschutz mit je 200 µl sterilem 1 x PBS belegt (Kap. 2.2.28). Nach 24 h wurden 100 µl zytostatikahaltiges Medium zugegeben und die Zellen für weitere 5 Tage kultiviert. Danach wurde das Medium abgenommen und die Zellen mit 10 % Trichloressigsäure 1 h bei 4 °C fixiert. Der Zellrasen wurde 5 x mit Wasser gewaschen und eine Proteinfärbung für 10 min mittels SRB-Färbelösung (100 µl/Kavidität) durchgeführt. Die Färbelösung wurde mittels fünfmaliger Waschungen mit 1 %iger Essigsäure entfernt und die Mikrotiterplatten [Seite 55↓]getrocknet. Die vorhandenen Protein-SRB-Komplexe wurden in 300 µl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 gelöst. Die Intensität der Färbung wurde durch photometrische Messung mit dem Plattenlesegerät EL340 (BioTek) bei 562,5 nm gegen 690 nm Referenzwellenlänge bestimmt. Die Werte der unbehandelten Zellen wurden auf 100 % gesetzt und aus der Meßreihe die IC₅₀ bestimmt.

SRB-Färbelösung

Eukaryotische Zellen wurden in Kulturschalen mit 3,5 cm Durchmesser ausgesät (Dreifachbestimmung) und bis zu 80 % Konfluenz kultiviert. Die Zellen wurden trypsiniert und 1:1 mit Medium versetzt, um das Trypsin zu inhibieren. Nach der Bestimmung der Zellzahl wurden die Zellen bei Raumtemperatur und 950 rpm 5 min pelletiert (Zentrifuge: GS-6KR, Beckman-Coulter, 200 x g) und in 100 µl 6 %iger Trichloressigsäure resuspendiert. Durch starkes Vortexen wurden die Zellen aufgeschlossen, die Zelltrümmer 4 min bei 12 000 rpm (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf) abzentrifugiert und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Mit diesem Zelllysat wurde die zweistufige Glutathionbestimmung (modifiziert, Tietze, 1969) durchgeführt. Durch Mitführung von Standardreihen für GSH und GSSG konnten die Glutathionmengen in den Lysaten quantifiziert werden.

Bestimmung von reduziertem Glutathion (GSH)

40 µl Zelllysat wurden in eine 96-Kaviditäten-Mikrotiterplatte pipettiert, 80 µl Ellman´s Puffer (0,3 M Dinatriumhydrogenphosphat in A. bidest.) und 10 µl Ellman´s Reagenz (0,04 % (w/v) 5,5‘-Dithiobis-(2-nitrobenzoe)-säure in 0,1 % (w/v) Trinatriumzitrat, in A. bidest.) zugegeben. Die Platte wurde kurz geschüttelt und sofort im Plattenlesegerät EL 340 bei 405 nm gegen 690 nm Referenzwellenlänge gemessen.

Bestimmung von Gesamt-Glutathion (GSH und GSSG)

40 µl Zelllysat wurden in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß gegeben und mit 300 µl Ether gewaschen, um lipide Elemente zu entfernen. Die Proben wurden 15 min im Vakuum getrocknet, um den verbleibenden Ether zu entfernen. 40 µl frisch angesetztes Natriumborhydrid (20 mg/ml in A. bidest.) wurden zugegeben und durch 40-minütige Inkubation bei 37 °C oxidiertes Glutathion (GSSG) in reduziertes (GSH) überführt. Das überschüssige Natriumborhydrid wurde durch langsame Zugabe von 37,5 µl 1 M HCl gelöscht. Danach wurden 40 µl Azeton und 30 µl 1 M Tris-HCl, pH 8,5 zugegeben und gemischt. 150 µl wurden auf eine 96-Kaviditäten-Mikrotiterplatte aufgetragen, 80 µl Ellman’s Puffer und 10 µl Ellman’s Reagenz (siehe Bestimmung von GSH) zugegeben, kurz geschüttelt und im Plattenlesegerät EL 340 bei 405 nm gegen 690 nm Referenzwellenlänge gemessen.

Eukaryotische Zellen wurden in Zellkulturgefäßen mit 75 cm² Kulturfläche ausgesät (Doppelbestimmung) und bei ca. 60 % Konfluenz für 24 h mit Cisplatin (0, 25 oder 100 µM) behandelt. Die Zellen wurden trypsiniert und 1:1 mit modifiziertem L-15-Medium versetzt. Die Zellzahl wurde bestimmt, 2 x 10⁶ Zellen abgenommen, pelletiert, mit eiskaltem 1 x PBS (Kap. 2.2.28) gewaschen und erneut pelletiert (Zentrifuge: GS-6KR, Beckman-Coulter, 200 x g). Für die Bestimmung der Caspase-3-Aktivität wurde der Caspase 3 Activity Assay (Roche) verwendet und die Prozedur nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Proben wurden im Plattenlesegerät SPECTRA-FLUOR (Tecan) mit einem Excitation-Filter von 405 nm und einem Emission-Filter von 535 nm gemessen. Anhand der mitgeführten Standardreihe für den Fluoreszenzfarbstoff AFC konnte die Caspase-3-Aktivität quantifiziert werden.

Eukaryotische Zellen wurden in Zellkulturgefäßen mit 3,5 cm Durchmesser ausgesät und bei einer Konfluenz von ca. 60 % mit Cisplatin (0, 25 oder 100 µM) für 2 bis 72 h behandelt. Die Zellen wurden trypsiniert, mit eiskaltem 1 x PBS (Kap. 2.2.28) gewaschen, pelletiert (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf, 3000 rpm) und in 1 ml 70 %igem Ethanol aufgenommen. Bis zum Tag der Messung wurden die Zellen bei 4 °C aufbewahrt. Vor der Messung wurden die Zellen pelletiert (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf, 3000 rpm), in 1 ml Lösung A aufgenommen [Seite 57↓]und für 1 h bei 37 °C inkubiert. Es wurde erneut zentrifugiert und die Zellen in 0,5 ml Lösung B aufgenommen. 5 000 oder 10 000 Zellen wurden im FACScan (BD) im Fluoreszenzkanal FL-2 gemessen und über die Software Cellquest ausgewertet.