[Seite 19↓]

2  Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1  Chemikalien

Alle Chemikalien wurden mit dem Reinigungsgrad „zur Analyse“ erworben.


[Seiten 20 - 21↓]

Azeton

Merck (Darmstadt, D)

Acrylamid/Bisacrylamid (19:1)

Quantum (Heidelberg, D)

Agarose Ultra PureTM

GibcoBRL (Eggenstein, D)

Amidoschwarz (napthol blue black)

Sigma (Steinheim, D)

Ammoniumazetat

Merck (Darmstadt, D)

Ammoniumperoxodisulfat (APS)

Merck (Darmstadt, D)

Ampicillin-Natriumsalz

Bristol-Myers (Heidelberg, D)

Bacto® Agar

Difco (Heidelberg, D)

Bacto® Trypton

Difco (Heidelberg, D)

Bacto® Hefeextrakt

Difco (Heidelberg, D)

Betain

Sigma (Steinheim, D)

Borsäure

Merck (Darmstadt, D)

Bovines Serumalbumin, Fraktion V (BSA)

Serva (Heidelberg, D)

5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Galaktopyranosid
(X-Gal)

Promega (Mannheim, D)

Bromphenolblau

Sigma (Steinheim, D)

Carbenicillin-di-Natriumsalz

Serva (Heidelberg, D)

Carboplatin

Bristol-Myers (Heidelberg, D)

Chloroform

Merck (Darmstadt, D)

Cisplatin

Gry-Pharm (Kirchzarten, D)

Daunorubicin

Pharmacia (Erlangen, D)

Diethylpyrokarbonat (DEPC)

Serva (Heidelberg, D)

Dikaliumhydrogenphosphat

Merck (Darmstadt, D)

Dimethyldichlorosilan-Lösung (2%) in Oktamethyl-zyklotetrasiloxan (Repel Silane ES plus one)

Pharmacia (Erlangen, D)

Dimethylsulfoxid (DMSO)

Sigma (Steinheim, D)

Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat

Merck (Darmstadt, D)

5,5‘-Dithionbis-(2-nitrobenzoe)-säure

Sigma (Steinheim, D)

DL-Dithiothreitol (DTT)

Sigma (Steinheim, D)

Dodecylsulfat-Natriumsalz (SDS)

Merck (Darmstadt, D)

Essigsäure

J. T. Baker (Griesheim, D)

Ethanol

J. T. Baker (Griesheim, D)

Ether

Sigma (Steinheim, D)

Ethidiumbromid-Lösung (10 mg/ml)

GibcoBRL (Eggenstein, D)

Ethylendiamintetraessigsäure-di-Natriumsalz (EDTA)

Serva (Heidelberg, D)

Etoposid

Bristol-Myers (Heidelberg, D)

Fetuin

Sigma (Steinheim, D)

Formaldehyd (37 %)

J. T. Baker (Griesheim, D)

Formamid

Merck (Darmstadt, D)

G418-Sulfat

Calbiochem-Novabiochem (Schwalbach, D)

D-(+)-Glukose-Lösung (45 %)

Sigma (Steinheim, D)

L-Glutamin (200 mM)

Biochrom AG (Berlin, D)

Glutathion, oxidierte Form, freie Säure, ca. 98 %,

Ethanol-frei, lyophilisiertes Pulver

Sigma (Steinheim, D)

Glutathion, reduzierte Form, freie Säure, mind. 98 %

Sigma (Steinheim, D)

Glyzin

Serva (Heidelberg, D)

Glykogen

Roche (Mannheim, D)

Glyzerin (pflanzlich)

Serva (Heidelberg, D)

Harnstoff

Merck (Darmstadt, D)

Insulin (40 IE/ml), Insuman® Rapid

Hoechst Marion Roussell (München-Martinsried, D)

Isopropanol (2-Propanol)

J. T. Baker (Griesheim, D)

Kaliumchlorid

Merck (Darmstadt, D)

Kaliumdihydrogenphosphat

Merck (Darmstadt, D)

Magermilchpulver (skim milk)

Difco (Heidelberg, D)

Magnesiumchlorid

Merck (Darmstadt, D)

MEM-Vitamine, 100 x in Na2HPO4

Biochrom AG (Berlin, D)

Methanol

J. T. Baker (Griesheim, D)

3-(n-Morpholino)-Propansulfonsäure (MOPS)

Merck (Darmstadt, D)

Natriumazetat

Merck (Darmstadt, D)

Natriumborhydrid

Sigma (Steinheim, D)

Natriumchlorid

Merck (Darmstadt, D)

Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat

Merck (Darmstadt, D)

Natriumhydrogenkarbonat (7,5 % w/v)

Biochrom KG (Berlin, D)

Natriumhydroxid-Plätzchen

Merck (Darmstadt, D)

Propidiumiodid (mindestens 95 %)

Sigma (Steinheim, D)

Salzsäure (32 %)

Merck (Darmstadt, D)

Sulforhodamin B (SRB) (85 %)

Sigma (Steinheim, D)

N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin (TEMED)

Sigma (Steinheim, D)

Transferrin

Roche (Mannheim, D)

Trasylol® (Wirkstoff: Aprotinin)

Bayer AG (Leverkusen, D)

Trichloressigsäure

Merck (Darmstadt, D)

Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid

(Tris-HCl)

Merck (Darmstadt, D)

Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris-Base)

Merck (Darmstadt, D)

tri-Natriumzitratdihydrat

Merck (Darmstadt, D)

TritonX-100

Sigma (Steinheim, D)

Tween® 20

Serva (Heidelberg, D)

Vincristin

Gry-Pharm (Kirchzarten, D)

2.1.2  Radiochemikalien

32P] dCTP (3000 Ci/mmol)

ICN Biochemicals (Eschwege, D)

32P] UTP (800 Ci/mmol)

ICN Biochemicals (Eschwege, D)

2.1.3  Enzyme (inklusive Puffer) und Inhibitoren


[Seite 22↓]

Advantage® cDNA Polymerase Mix

Clontech (Heidelberg, D)

AmpliTaqGoldTM, DNA-Polymerase (5 U/µl)

Perkin Elmer (Rodgau-Jüdesheim, D)

One-Phor-All Buffer PLUS, 10 x

Pharmacia (Erlangen, D)

Proteinase K (600 U/ml)

QIAGEN (Hilden, D)

Restriktionsendonukleasen:

 

EcoRI (10 U/µl)

Roche (Mannheim, D)

KpnI (10 U/µl)

Roche (Mannheim, D)

XbaI (10 U/µl)

Roche (Mannheim, D)

Restriktionspuffer, 10 x, L und H

Roche (Mannheim, D)

RNase, DNase-frei (500 µg/ml)

Roche (Mannheim, D)

RNaseOUT™ (RNase-Inhibitor, 40 U/µl)

GibcoBRL (Eggenstein, D)

T4 DNA-Ligase (6 U/µl), FPLCpure®

Pharmacia (Erlangen, D)

T7 RNA-Polymerase (50 U/µl)

New England Biolabs

(Frankfurt/Main, D)

2.1.4  Nukleinsäuren

ATP (100 mM, pH7,5)

Pharmacia (Erlangen, D)

DNA-Längenstandards:

 

100 bp DNA-Längenstandard, 1 µg/µl

GibcoBRL (Eggenstein, D)

GeneRulerTM, 1kb DNA Leiter, 0,5 µg/µl

MBI Fermentas (St. Leon-Rot, D)

dNTP-Set (100 mM)

Roche (Mannheim, D)

NTP-Set (100 mM)

Roche (Mannheim, D)

Oligonukleotide (Tab. 2.1)

MWG (Ebersberg, D)

RNA-Längenstandard 0,24-9,5 kb (1 µg/µl)

GibcoBRL (Eggenstein, D)


[Seiten 23 - 25↓]

Tab. 2.1 : Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide.

Name

Sequenz

Tm (°C)a

1-MOAT-rev

5‘-ACC ATC ACC CCA ACA CCT GC-3‘

61,4

2-MOAT-fw

5‘-TTT CCA ACT GTG CTT CAA GCT G-3‘

58,4

3-MOAT-rev

5‘-TGA CCC CCA CTA AGA TTT ATA CCC-3‘

61,0

Name

Sequenz

Tm (°C)a

4-MOAT-fw

5‘-CAT CAC CAT CAA GGG CAC CAC-3‘

61,8

5-MOAT-rev

5‘-ATC CGG CCT GTG GGT GTT G-3‘

61,0

6-MOAT-fw

5‘-TGC TTG GAC CAG TGA CTC TAA AAT C-3‘

61,3

7-MOAT-rev

5‘-ACA CCA ATC TTC TCC ATG CTA CC-3‘

60,6

8-MOAT-fw

5‘-TGA GCG AAT AAC TGA GTA CAC AAA AG-3‘

60,1

9-MOAT-fw

5‘-ATG CTG GAG AAG TTC TGC-3‘

53,7

10-MOAT-fw

5‘-TGA AGA GAT GAA AAC CAA GAC-3‘

54,0

11-MOAT-rev

5‘-CTG CTA GAA TTT TGT GCT GT-3‘

53,2

12-MOAT-fw

5‘-TAA TCT AGC CTA CTC CTG CCT GTT C-3‘

63,0

13-MOAT-fw

5‘-AAA TAA TCC ATC ATC CAT AGC-3‘

52,0

MOAT-14

5‘-AAT AGG GAC AGG AAC CAG G-3‘

56,7

cMOAT-a1

5‘-GGA ACA ATT GTA GAG AAA GGA TC-3‘

57,1

cMOAT-b1

5‘-CAC AAA CGC AAG GAT GAT GAA GAA-3‘

59,3

G3PDH-a1

5‘-TGA AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG GT-3‘

64,8

G3PDH-b1

5‘-CAT GTG GGC CAT GAG GTC CAC CAC-3‘

67,8

GAPDH-fw

5’-CAC CGT CAA GGC TGA GAA C-3’

58,8

GAPDH-rev

5’-ACC ACT GAC ACG TTG GCA G-3’

58,8

Pgp-fw

5‘-GCC CTT GGA ATT ATT TCT TT-3‘

51,2

Pgp-rev

5‘-TGG GTG AAG GAA AAT GTA AT-3‘

51,2

PMS2-fw

5‘-CAG TCA GCG TGC AGC AGT TAT TTT CC-3‘

64,8

PMS2-rev

5‘-ACT CCT TCC AAC TCC ATG CGT GCA-3‘

64,4

hMLH1-fw

5‘-GGT TCA TTC ACA GCT CTG TAG-3‘

57,9

hMLH1-rev

5‘-CAC AGC GTT TAG TAC CCT CA-3‘

57,3

MSH2-fw

5‘-GAA GAT ACC ACT GGC TCT CAG TCT CTG-3‘

66,5

MSH2-rev

5‘-GCA CTT ATT AAT GTT GAC TGC ATC TTC TTT-3‘

61,3

LRP-a3

5‘-GGA TGT CAA GAC CGG AAA GGT GCG-3‘

66,1

LRP-b3

5‘-CCA GCT GAG AGG GAC AAC ACT GTG AAC-3‘

68,0

BCRP-fw

5‘-GTT TAT CCG TGG TGT GTC TGG-3‘

59,8

BCRP-rev

5‘-CTG AGC TAT AGA GGC CTG GG-3‘

61,4

RibcMA-fw

5‘-CTG CTG TGG CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA AAC ATA GGC T-3‘

>75

Name

Sequenz

Tm (°C)a

RibcMA-rev

5‘-CTA GAG CCT ATG TTT CGT CCT CAC GGA CTC ATC AGC CAC AGC AGG TAC-3‘

>75

PMRibcMA-fw

5‘-CTG CTG TGG CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA CAC ATA GGC T-3‘

>75

PMRibcMA-rev

5‘-CTA GAG CCT ATG TGT CGT CCT CAC GGA CTC ATC AGC CAC AGC AGG TAC-3‘

>75

RibcMB-fw

5‘-CGA ATC CAG CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA AAC TGC TGT T-3‘

74,6

RibcMB-rev

5‘-CTA GAA CAG CAG TTT CGT CCT CAC GGA CTC ATC AGC TGG ATT CGG TAC-3‘

>75

PMRibcMB-fw

5‘-CGA ATC CAG CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA CAC TGC TGT T-3‘

>75

PMRibcMB-rev

5‘-CTA GAA CAG CAG TGT CGT CCT CAC GGA CTC ATC AGC TGG ATT CGG TAC-3‘

>75

M13(-20)-fw

5‘-GTA AAA CGA CGG CCA G-3‘

51,8

M13-rev

5‘-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3‘

50,4

vector-fw

5‘-CTG CTT ACT GGC TTA TCG AAA T-3‘

56,5

vector-rev

5‘-GAG GGG CAA ACA ACA GAT G-3‘

56,7

T7MOAT-fw3

5‘-TAA TAC GAC TCA CTA TAG CCT GTC GGC TCT GGG AAA TCC TC-3‘

73,5

MOAT-rev2

5’-GCA CAG GCC TCC AGT ACT TG-3’

58,6

MOAT-rev3

5’-CCT CCA GGC AGC ATT TCC AAG TCT-3’

68,2

RcMAT7-fw

5‘-TAA TAC GAC TCA CTA TAG TGC TGT GGC TGA TGA GTC CGT GAG GAC GAA ACA TAG GC-3‘

77,5

RcMAT7-rev

5‘-GCC TAT GTT TCG TCC TCA CGG ACT CAT CAG CCA CAG CAC TAT AGT GAG TCG TAT TA-3‘

77,5

RcMBT7-fw

5‘-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA TCC AGC TGA TGA GTC CGT GAG GAC GAA ACT GCT GT-3‘

76,7

RcMBT7-rev

5‘-ACA GCA GTT TCG TCC TCA CGG ACT CAT CAG CTG GAT TCC TAT AGT GAG TCG TAT TA-3‘

76,7

TP53-fw

5’-ATG GAG GAG CCG CAG TCA G-3’

61,0

Name

Sequenz

Tm (°C)a

TP53-rev

5’-TCA GTC TGA GTC AGG CCC TTC TG-3’

64,2

MRP-a

5‘-AGA ACC TCA GTG TCG GGC AGC G-3‘

68,8

MRP-b

5‘-TCG CAT CTC TGT CTC TCC TGG G-3‘

64,5

aAngaben des Herstellers laut Synthese-Report (MWG, Ebersberg, D)

2.1.5  Kits, Fertiglösungen und Antikörper


[Seite 26↓]

Blue/Orange 6x Loading Dye

Promega (Mannheim, D)

Caspase 3 Activity Assay (96 Tests)

Roche (Mannheim, D)

Color Marker (Leiter für Proteingele)

Sigma (Steinheim, D)

complete (Protease-Inhibitoren-Cocktail-Tabletten)

Roche (Mannheim, D)

DMRIE-C Reagent

GibcoBRL (Eggenstein, D)

ECL-KitTM Western Blotting Detection Reagents

Amersham Pharmacia Biotech

(Freiburg, D)

Eukaryotic TOPO TA Cloning® Kit
(pcDNA3.1/V5/His-TOPO)

Invitrogen (Carlsbad, USA)

ExpressHyb™ Hybridization Solution

Clontech (Heidelberg, D)

Fötales Kälberserum (FKS)

GibcoBRL (Eggenstein, D)

Leibovitz L-15 Medium

Bio Whittaker (Verviers, Belgien)

LightCycler- FastStart DNA Master SYBR Green I

Roche (Mannheim, D)

Monoklonaler AK Anti-Aktin, Klon C4

Chemicon (Hofheim, D)

Monoklonaler AK cMOAT/MRP2, Klon M2I-4

Sanbio (Beutelsbach, D)

Megaprime™DNA Labelling System

Amersham (Braunschweig, D)

One ShotTM Reagent (TOP10F‘)

Invitrogen (Carlsbad, USA)

OPTI-MEM I

GibcoBRL (Eggenstein, D)

Peroxidase-konjugierter Kaninchen Anti-Maus

Antikörper, IgG (H+L)

Dianova (Hamburg, D)

QIAprep Spin Plasmid Kit

QIAGEN (Hilden, D)

QIAquick Gel Extraction Kit

QIAGEN (Hilden, D)

SOC-Medium

Invitrogen (Carlsbad, USA)

SuperScriptTM Preamplification System for First
Strand cDNA Synthesis

GibcoBRL (Eggenstein, D)

TOPO TA Cloning® Kit (pCR®2.1 TOPO)

Invitrogen (Carslbad, USA)

Trizol®-Reagenz

GibcoBRL (Eggenstein, D)

Trypsin/EDTA-Lösung

Biochrom AG (Berlin, D)

2.1.6  Geräte


[Seite 27↓]

Autoklav, Technoclav 50

Tecnomara (Fernwald-Steinbach, D)

Brutschrank B6120

Heraeus (Hanau, D)

Densitometer GS-670

BioRad (Richmond, USA)

FACScan

BD (Heidelberg, D)

Feinwaage MC1, Laboratory LC6200S

Sartorius (Göttingen, D)

Filmentwickler Hyperprocessor

Amersham Pharmacia Biotech

(Freiburg, D)

Fotodokumentation:

 

- Digital Printer UP-D860E Gel Print 2000i

Sony (Tokyo, J)

- UV-Transilluminator

MWG-Biotech (Ebersberg, D)

Gelelektrophoresekammern:

 

- Mini-Sub Cell GT, Wide Mini-Sub Cell GT

BioRad (Richmond, USA)

- PA-Gelelektrophoreseapparatur Modell S4S

OWL SS (Portsmouth, USA)

Heizblock TCR 100

Roth (Karlsruhe, D)

Homogenisatoren Glas-Col®

Faust-Laborbedarf

(Schaffenhausen, CH)

Hybridisierungsofen OV1

Biometra (Göttingen, D)

Inkubator BBD6220

Heraeus (Hanau, D)

Kühlfalle Vapor Trap

BioRad (Richmond, USA)

LightCycler

Roche (Mannheim, D)

Magnetrührer RCT Basic

Ika Labortechnik (Staufen, D)

Netzgeräte:

 

Power Pac 300

BioRad (Richmond, USA)

Constant Power Supply EC PS 3000/150

Pharmacia (Erlangen, D)

PCR-Gerät DNA Thermal Cycler

Perkin Elmer (Rodgau-Jüdesheim, D)

PCR-Gerät TRIO-ThermoblockTM

inklusive TRIO Heizdeckel

Biometra (Göttingen, D)

Phasenkontrastmikroskop ULWCD 0.30

Olympus (Hamburg, D)

pH-Meter 320

Mettler Toledo (Schwerzenbach, CH)

Pipetboy acu

Integra Bioscience (Fernwald, D)

Pipetten Reference (0,5-10 µl; 2-20 µl; 10-100 µl;

50-250 µl; 200-1000 µl; 500-2500 µl)

Eppendorf (Hamburg, D)

Plattenlesegerät EL 340 Bio Kinetics Reader

BioTek (Winooski, USA)

Plattenlesegerät SPECTRA FLUOR

Tecan (Crailsheim, D)

Reinraumwerkbank Typ DLF/BSS6 KLIIA

CAT (Stuttgart, D)

Schüttler KL2

Edmund Bühler (Thübingen, D)

Schwenker WT16

Biometra (Göttingen, D)

Scintillationsmeßgerät Wallac 1409

Wallac (Freiburg, D)

Semi-dry Blotapparatur

Biometra (Göttingen, D)

Spektrophotometer Biochrom-4060

Pharmacia (Erlangen, D)

Spektrophotometer U-1100

Hitachi (Yokohama, J)

Steril-Bank Lamin Air HBB 2472

Heraeus (Hanau, D)

Thermomixer 5436

Eppendorf (Hamburg, D)

UV Crosslinker UVC1000

Hoefer (San Francisco, USA)

Vortexer VF2

IKA-Labortechnik (Staufen, D)

Wasseraufbereiter Milli-Q Plus

Millipore (Schwalbach, D)

Wasserbad 1083

GFL (Burgwedel, D)

Wasserbad Certomat® WR

B. Braun (Melsungen, D)

Zählkammer Fuchs-Rosenthal

Superior (Marienfeld, D)

Zentrifugen:

 

GS-6KR Zentrifuge (GH 3.8 Rotor)

Beckman-Coulter

(Unterschleißheim-Lohhof, D)

OptimaTM TL Ultrazentrifuge (Rotor TLA 100.3)

Beckman-Coulter

(Unterschleißheim-Lohhof, D)

Tischzentrifuge 5415C, ohne Kühlung

Eppendorf (Hamburg, D)

Tischzentrifuge 5417R, mit Kühlung

Eppendorf (Hamburg, D)


[Seite 28↓]

2.1.7  Verbrauchsmaterial

Blotmembran Hybond N+

Amersham Pharmacia Biotech

(Freiburg, D)

Chromatographiepapier 3MM CHR

Whatman (Maidstone, UK)

Einmal-Küvetten Plastibrand®

Brand (Wertheim, D)

Fotomaterial:

 

- Röntgenfilm Biomax MR

Kodak (Stuttgart, D)

- Hyperfilm ECL

Amersham Pharmacia Biotech

(Freiburg, D)

- Entwickler RP X-OMAT EX

KODAK (Rochester, USA)

- Fixierer RP X-OMAT LO

KODAK (Rochester, USA)

- Druckerpapier Typ II UPP-110 HD

Sony (Tokyo, J)

Handschuhe SaveSkin SatinPLUS

Kimberly-Clark

(Mühlheim-Kärlich, D)

Klebeband Tesa transparent

Beiersdorf (Hamburg, D)

Paketklebeband Tesa

Beiersdorf (Hamburg, D)

Parafilm

Roth (Karlsruhe, D)

Pipettenspitzen (20, 100, 1000, 2500 µl)

Eppendorf (Hamburg, D)

Protran BA 85 Zellulosenitrat

Schleicher & Schuell (Dassel, D)

Reaktionsgefäße Safe Lock (500, 1500, 2000 µl)

Eppendorf (Hamburg, D)

Röhrchen (15 und 50 ml)

Nunc (Wiesbaden, D)

Zellkultur:

 

Schalen (35x10, 100x20, 150x25 mm)

BD (Heidelberg, D)

Serologische Pipetten (2, 5, 10, 25 ml)

BD (Heidelberg, D)

Kulturflaschen (25, 75, 175 cm2)

BD (Heidelberg, D)

Platten (je 6, 12, 96 Vertiefungen)

BD (Heidelberg, D)

2.1.8  Biologisches Material

Die in dieser Arbeit verwendeten humanen Karzinomzellinien wurden freundlicherweise vom Zellkulturlabor des Instituts für Pathologie der Charité zur Verfügung gestellt (Tab. 2.2).


[Seite 29↓]

Tab. 2.2 : Humane Karzinomzellinien.

Name

Diagnose

Selektion

Referenz

A2780

Ovarialkarzinom

-

Eva et al., 1982

A2780RCIS10

Ovarialkarzinom

Cisplatin

nicht publiziert

Mewo

Melanom

-

Fogh et al., 1978

MewoRCIS1

Melanom

Cisplatin

Kern et al., 1997

D43/86

Nebennierenrindenzellkarzinom

-

nicht publiziert

D43/86RCIS2

Nebennierenrindenzellkarzinom

Cisplatin

nicht publiziert

Bei dem verwendeten Bakterienstamm Escherichia coli TOP10F’ (Invitrogen) handelt es sich nach den Angaben des Herstellers um folgenden Genotyp:

F’ {lacIq Tn10 (TetR)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 deoR araD139 Δ(ara-leu)7697 galU gal/K rpsL (StrR) endA1 nupG.

2.1.9  Computer und Software


[Seite 30↓]

Internet-Recherche

 

Netscape Explorer, Version 4.01

Netscape (Mountain View, USA)

Sequenzabgleich (BLAST)

http//:www.ncbi.nlm.nih.gov

RNA-Faltung

 

DNASIS, Version 3.0

Hitachi (Yokohama, J)

mFOLD, Version 3.1

http://bioinfo.math.rpi.edu

Washington University

(St. Louis, USA)

Text-, Tabellen-, Abbildungsbearbeitung

 

MS Office, Version 7.0

Microsoft (Redmont, USA)

Origin, Version 5.0

Microcal Software

(Northampton, USA)

GraphPad Prism®, Version 3.02

GraphPad Software (San Diego, USA)

Molecular Analyst, Version 1.4

BioRad (Richmond, USA)

Adobe Photoshop, Version 5.0 LE

Adobe (San Jose, USA)

FACS-Messungen

 

Cellquest, Version 1.2.2

BD (Heidelberg, D)

Caspase-Assay

 

easyWin screening V6.0a

Tecan (Crailsheim, D)

ELISA-Reader

 

KinetiCalc Version 2.12

Bio Tek (Winooski, USA)

Spektrophotometer Biochrom-4060

 

VWSS Version 2.0

Pharmacia (Erlangen, D)

LightCycler

 

LightCycler Software Version 3

Roche (Mannheim, D)


[Seite 31↓]

2.2  Methoden

2.2.1  Zellkultur

Alle eukaryotischen Zellen wurden im Inkubator (BBD6220, Heraeus) bei 37 °C und 95 % Luftfeuchtigkeit in Gegenwart von 5 % CO2 in modifiziertem L-15-Medium angezogen. Den cisplatinresistenten Zellinien wurden folgende Mengen Cisplatin zugesetzt: A2780RCIS 10 µg/ml, D43/86RCIS 2 µg/ml und MewoRCIS 1 µg/ml Medium.

Zweimal wöchentlich wurde der Zustand der Zellen mikroskopisch beurteilt (Zelldichte, eventuelle Infektionen oder abgestorbene Zellen). Je nach den Erfordernissen wurden die Zellen trypsiniert (50-100 µl Trypsin-Lösung/cm2 Zellkulturgefäßboden; Inkubation bei 37 °C bis zum Ablösen der Zellen), um ihre Anzahl im Zellkulturgefäß zu verringern oder nur ein Mediumwechsel durchgeführt.

modifiziertes L-15-Medium

  

FKS

10 %

Die sterilen Substanzen wurden

L-Glutamin

1,0 mM

500 ml L-15-Medium zugegeben.

Transferrin

1,25 mg

 

Fetuin

3,75 mg

 

Insulin

40 IE

 

Trasylol® (Aprotinin)

0,002 % (v/v)

 

NaHCO3

0,1125 % (w/v)

 

Glukose

0,05 % (w/v)

 

MEM-Vitamine

1 x

 

Trypsin-Lösung

Die Trypsin/EDTA-Lösung (Biochrom AG) enthält 0,5 % Trypsin und 0,2 % EDTA in 10 x PBS. Diese Lösung wurde vor Gebrauch 1:10 mit autoklaviertem A. bidest. verdünnt und sterilfiltriert.


[Seite 32↓]

2.2.2  Einfrieren und Auftauen von eukaryotischen Zellen

Die Zellen wurden bei Konfluenz trypsiniert, 1:1 mit Medium versetzt, um das Trypsin zu inhibieren, und 5 min bei 950 rpm und 25 °C zentrifugiert (Zentrifuge: GS-6KR, Beckman-Coulter, 200 x g). Das Zellpellet wurde in 95 % FKS und 5 % DMSO resuspendiert (ca. 2 x 106 Zellen/ml). Diese Zellsuspension wurde in Aliquots von je 1 ml in Einfrierröhrchen überführt. Über Nacht wurden diese Röhrchen in einer mit Isopropanol gefüllter Einfrierbox langsam auf –80 °C abgekühlt. Danach wurden die Röhrchen in andere Boxen umgelagert und weiterhin bei –80 °C gelagert. Bei Bedarf wurden die Röhrchen aufgetaut und die Zellsuspension in ein Zellkulturgefäß mit modifiziertem L-15-Medium gegeben. Nach dem Anheften der Zellen, spätestens jedoch nach 24 h, wurde ein Mediumwechsel durchgeführt.

2.2.3  Transfektion der Zellinien A2780 und A2780RCIS

Die Transfektionen wurden mit Hilfe des DMRIE-C-Reagenzes (GibcoBRL) durchgeführt. Es wurden Zellen der Linie A2780 bzw. A2780RCIS (ohne Zytostatikum im Medium) in Zellkulturgefäßen mit 3,5 cm Durchmesser ausgesät und mindestens 24 h bis zu einer Konfluenz von 30-50 % kultiviert. Plasmid-DNA (Kap. 2.2.6) wurde mit 1/10 3 M Natriumazetat (pH 5,2) und 2,5 Volumen absolutem Ethanol 30 min bei –20 °C gefällt und anschließend 20 min bei 4 °C und 14 000 rpm (Zentrifuge: 5417R, Eppendorf) zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20 µl sterilem 10 x PCR-Puffer (inklusive 15 mM MgCl2, Perkin Elmer) aufgenommen, unter sterilen Bedingungen ein Aliquot abgenommen und die DNA-Menge spektrophotometrisch bestimmt. 2 µg Plasmid-DNA wurden zu 1 ml OPTI-MEM gegeben. 5 µl DMRIE-C-Reagenz wurden in einem zweiten Röhrchen in ebenfalls 1 ml OPTI-MEM aufgenommen. Die beiden Lösungen wurden zueinander gegeben und vorsichtig gemischt. Damit sich die Lipid-DNA-Komplexe bilden konnten, wurde die Lösung 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Zellrasen wurde 1 x mit 2 ml OPTI-MEM gewaschen und das Medium mit den Lipid-DNA-Komplexen zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden 5 h mit dieser Lösung bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank inkubiert. Die Transfektionslösung wurde entfernt, 2,5 ml modifiziertes L-15-Medium zu den Zellen gegeben und die Zellen wie gewohnt weiter kultiviert. Nach 24 h wurden die Zellen trypsiniert und auf Zellkulturschalen mit 10 cm Durchmesser umgesetzt. Gleichzeitig wurden die Zellen ab diesem Zeitpunkt unter einem Selektionsdruck von 800 µg/ml G418 gehalten. Nach ca. 2 Wochen konnten die [Seite 33↓]heranwachsenden Klone gepickt und auf Zellkulturgefäße mit 1 cm Durchmesser umgesetzt werden. Die Zellen wurden im Folgenden dauerhaft unter Selektionsdruck gehalten. Die Zellen auf einer Kontrollplatte, die mit einer Lipid-Lösung ohne DNA transfiziert wurde, starben innerhalb einer Woche nach der Transfektion unter Selektionsdruck vollständig ab.

2.2.4  Kultur von Bakterien

Plattenkulturen

E.coli-Kulturen wurden auf LB-Agar-Platten (Schalen mit 10 cm Durchmesser und 20 ml LB-Agar), die 100 µg/ml Ampicillin oder Carbenicillin enthielten, mittels Spatel ausplattiert und bei 37 °C im Brutschrank für 16-20 h angezogen.

LB-Agar

Bacto® Agar

1,5 % (w/v)

Die Komponenten wurden in

Bacto® Trypton

1,0 % (w/v)

A. bidest. gelöst und autoklaviert.

Bacto® Hefeextrakt

0,5 % (w/v)

 

NaCl, pH 7,0

170 mM

 

Schüttelkulturen

E. coli-Kulturen wurden in 5 ml-Ansätzen über Nacht in LB-Medium unter Zusatz von Ampicillin oder Carbenicillin (Endkonzentration: 100 µg/ml) bei 37 °C unter Schütteln bei 160 rpm angezogen.

LB-Medium

Bacto® Trypton

1 % (w/v)

Die Komponenten wurden in

Bacto® Hefeextrakt

0,5 % (w/v)

A. bidest.gelöst und autoklaviert.

NaCl, pH 7,0

170 mM

 

Anlage von Stammkulturen

Zur langfristigen Lagerung wurden Bakterien nach Schüttelkultur in LB-Medium mit 20 % (v/v) Glyzerin aufgenommen und bei –80 °C gelagert. Zur Reaktivierung wurden diese Stammkulturen aufgetaut und einige µl in LB-Medium unter Zusatz von 100 µg/ml Ampicillin oder Carbenicillin erneut als Schüttelkultur herangezogen.


[Seite 34↓]

2.2.5  Transformation von E. coli

Für die Transformationen wurde der One ShotTM Reagent-Kit (Invitrogen) verwendet. Zu 50 µl auf Eis aufgetauter Bakteriensuspension (TOP10F’-E.coli-Stamm) wurden 2 µl 0,5 M β-Mercaptoethanol gegeben, vorsichtig gemischt, 2 µl ligiertes Plasmid (Kap. 2.2.18) zugegeben und 30 min auf Eis inkubiert. Danach erfolgte ein Hitzeschock bei 42 °C für 30 s. Die Bakterien wurden erneut auf Eis gestellt und nach ca. 2 min unter sterilen Bedingungen 250 µl SOC-Medium zugegeben. Die transformierten Bakterien wurden 1 h bei 37 °C unter Schütteln von 170 rpm inkubiert, 100 µl Bakteriensuspension auf vorbereitete LB-Agar-Platten ausplattiert und über Nacht kultiviert (Kap. 2.2.4).

2.2.6  Mini-Präparation von Plasmid-DNA aus E.coli

Die Plasmid-DNA wurde mit dem QIAprep-Spin-Plasmid-Kit (Qiagen) isoliert. 4 ml der Übernachtkulturen von E. coli wurden bei 3000 rpm und Raumtemperatur für 5 min pelletiert (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf) und nach Protokoll weiterbehandelt. Die Plasmid-DNA wurde mit 50 µl Elutionspuffer eluiert.

2.2.7  Behandlung von Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen

Die Restriktion der DNA mit Restriktionsendonukleasen erfolgte nach den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen für das jeweilige Restriktionsenzym in 20 µl-Ansätzen. Nach Zugabe der Restriktionsendonuklease (10 U) und dem dazu passenden Puffer wurden die Ansätze mit Plasmid-DNA bei 37 °C ca. 2 h oder über Nacht inkubiert.

2.2.8  Präparation von RNA

Gesamt-RNA wurde aus eukaryotischen Zellen unter Verwendung von Trizol® (GibcoBRL) isoliert. Die Zellen wurden unter Zugabe von 1 ml Trizol®/10 cm2 bewachsene Fläche in ihrem Zellkulturgefäß lysiert und dieses Lysat in ein phenolbeständiges 15 ml-Röhrchen überführt. Pro ml Trizol wurden 0,2 ml Chloroform zugegeben, ca. 15 s intensiv geschüttelt [Seite 35↓]und für weitere 2-3 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden 15 min bei 4 °C und 3000 rpm (Zentrifuge: GS-6KR, Beckman-Coulter, 2060 x g) zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wurde abgenommen und in ein neues 15 ml-Röhrchen überführt. Unter Zugabe von 0,5 ml Isopropanol (pro ml zu Beginn eingesetztes Trizol®) wurde die RNA bei –20 °C über Nacht gefällt. Danach wurde sie durch Zentrifugation bei 3000 rpm und 4 °C innerhalb von 10 min pelletiert. Das Pellet wurde in 70 %igem Ethanol in DEPC-Wasser (0,2 % DEPC in A. bidest., autoklaviert) gewaschen, in ein 2 ml-Reaktionsgefäß überführt und nochmals 5 min bei 4 °C und 9500 rpm (Zentrifuge: 5417R, Eppendorf) abzentrifugiert. Das Pellet wurde luftgetrocknet und in DEPC-Wasser aufgenommen. Die Proben wurden bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

2.2.9  Agarosegel-Elektrophorese von RNA

Der aufzutrennenden RNA wurde 1,8 Volumen RNA-Ladepuffer zugesetzt. Die Proben wurden bei 65 °C denaturiert, danach sofort auf Eis überführt und nach dem Abkühlen aufgetragen. Die gelchromatographische Auftrennung erfolgte bei 75 V in 1,0 %igen Agarosegelen in 1 x MOPS-Puffer und 6 % Formaldehyd. Als Laufpuffer wurde 1 x MOPS-Puffer verwendet. Zur Orientierung wurden in einer zusätzlichen Bahn 1 µl farbstoffenthaltender 6 x Blue/Orange Loading Dye (Promega) aufgetragen.

25 x MOPS-Puffer

  

MOPS, pH 7,0

5 M

Der Puffer wurde im Dunkeln

Natriumazetat

12,5 M

gelagert. Der pH-Wert wurde

Na2EDTA

0,25 M

mit 1 M Essigsäure eingestellt.

in A. bidest.

  
   

RNA-Auftragepuffer

  

Formamid

570 µl

 

Formaldehyd (37%ig)

170 µl

 

25 x MOPS

60 µl

 

Ethidiumbromid-Lösung

4 µl

 


[Seite 36↓]

2.2.10  Bestimmung von Nukleinsäure-Konzentrationen

Die Konzentrationsmessung von Nukleinsäuren wurde am UV-Spektrophotometer (Hitachi) bei einer Wellenlänge von 260 nm durchgeführt. Für die Bestimmung der Konzentrationen wurden folgende Umrechnungsfaktoren berücksichtigt: 1 OD entpricht 50 µg/ml doppelsträngiger DNA bzw. 40 µg/ml RNA.

2.2.11  Northern-Blot

Nach der elektrophoretischen Auftrennung von RNA (Kap. 2.2.9) wurde das Agarosegel 30 min durch Schwenken in A. bidest. gewaschen. Die RNA wurde über Nacht unter Verwendung von 10 x SSC als Transferpuffer auf eine positiv geladene Nylonmembran (Amersham Pharmacia Biotech) transferiert (Kapillarblot nach Sambrook und Russell, 2001). Die Blot-Effektivität wurde durch Vergleich von Gel und Membran auf dem UV-Transilluminator (MWG-Biotech) kontrolliert. Im UV-Crosslinker (Hoefer) wurde die RNA mit der Nylonmembran quervernetzt (0,12 mJ/cm2). Diese Blots konnten entweder sofort verwendet oder trocken bei Raumtemperatur gelagert werden.

20 x SSC

  

NaCl

3,0 M

Der pH-Wert wurde mit 1 M

Na3-Zitrat, pH 7,0

0,3 M

Essigsäure eingestellt.

in A. bidest.

  

2.2.12  Markierung von DNA-Sonden

Für die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde das MegaprimeTM DNA Labelling System (Amersham) verwendet. 25 ng der zu markierenden DNA wurden in 28 µl A. bidest. aufgenommen und 5 µl Hexanukleotid-Zufallsprimer dazugegeben. Die DNA-Doppelstränge wurden bei 95 °C aufgeschmolzen. Während das Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur verblieb, wurden 10 µl 5 x Markierungspuffer, 5 µl 32P-dCTP (50 µCi) und 2 µl (1 U/µl) DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben und vorsichtig gemischt. Die Markierung erfolgte bei 37 °C für 30 min. Anschließend wurde die DNA erneut bei 95 °C denaturiert und auf Eis abgekühlt.


[Seite 37↓]

2.2.13  Northern-Hybridisierung

Die Blots (Kap. 2.2.11) wurden bei 58 °C für mindestens eine Stunde in ExpressHybTM Hybridisierungslösung (Clontech) prähybridisiert. Danach wurde die markierte Sonde (Kap. 2.2.12) zugegeben. Die Hybridisierung erfolgt über Nacht bei 58 °C. Die nicht gebundene DNA wurde am nächsten Tag in vier aufeinanderfolgenden Waschschritten entfernt: 2 x 15 min bei Raumtemperatur mit 2 x SSC (Kap. 2.2.12)/0,1 % SDS und 2 x 15 min bei 58 °C in 0,1 x SSC/0,1 % SDS. Die Exposition der Blots erfolgte auf Röntgenfilm (Kodak).

Entfernung von gebundenen Sonden

Eine 0,1 %ige SDS-Lösung in A. bidest. wurde hergestellt und aufgekocht. Die bereits benutzte Membran wurde in die Lösung gegeben und 30 bis 60 min in der sich abkühlenden Flüssigkeit inkubiert. Danach konnte sie erneut für eine Hybridisierung verwendet werden.

2.2.14  Reverse Transkription

Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen wurde unter Verwendung des Superscript Preamplification System for First Stand cDNA Synthesis (GibcoBRL) in cDNA nach den Angaben des Herstellers umgeschrieben. Es wurden Hexanukleotide mit zufälliger Sequenz als Primer verwendet, um pro Ansatz 2 µg Gesamt-RNA umzuschreiben. Die cDNAs wurden 1:50 für RT-PCR bzw. 1:5 für die Quantifizierung mittels real-time-RT-PCR in A. bidest. verdünnt.

2.2.15  Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

PCR mit AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase:

in µl

im Ansatz

10 x PCR-Puffer (inklusive 15 mM MgCl2)

2, 5

1 x

dNTPs (je 10 mM)

0,5

200 µM

5‘-Oligonukleotidprimer (5 µM)

1

200 nM

3‘-Oligonukleotidprimer (5 µM)

1

200 nM

Matrix-DNA (cDNA 1:50)

10

50-100 ng

AmpliTaq GoldTM

0,2

1 U

A. bidest.

auf 25

 


[Seite 38↓]

Die Amplifikation erfolgte im PCR-Thermal Cycler (Biometra) nach folgendem Programm:

1. Thermische Aktivierung der Polymerase: 12 min, 94 °C;

2. DNA-Amplifikation in 36 Zyklen, bestehend aus

2.1 Denaturierung der Doppelstrang-DNA: 60 s, 94 °C;

2.2 Hybridisierung der Primer an die komplementären Sequenzen: 90 s, bei TH (Tab. 2.3);

2.3 Elongation der Primer: 90 s, 72 °C;

3. Extension: 5 min, 72 °C

4. Abkühlung: ohne Zeitvorgabe, 4 °C.

Tab. 2.3 : Primer-Hybridisierungstemperaturen (T H ) der durchgeführten PCRs.

5’-Primer

3’-Primer

TH (°C)

Zweck der PCR

cMOAT-a1

cMOAT-b1

55

Expressionsvergleicha, Einsatz als Sonde im Northern-Blota, Quantifizierung der Expressionc

9-MOAT-fw

11-MOAT-rev

52

Amplifikation des offenen Leserahmens von MRP2/cMOAT/ABCC2b,d

2-MOAT-fw

3-MOAT-rev

55

Punktmutationsanalyse in MRP2a,d

GAPDH-fw

GAPDH-rev

55

Quantifizierung der Expressionc, Einsatz als Sonde im Northern Blota

G3PDH-a1

G3PDH-b1

55

Expressionsvergleicha

Pgp-fw

Pgp-rev

50

Expressionsvergleicha

PMS2-fw

PMS2-fw

60

Expressionsvergleicha

hMLH1-fw

hMLH1-rev

55

Expressionsvergleicha

hMSH2-fw

hMSH2-rev

55

Expressionsvergleicha

LRP-a3

LRP-a3

60

Expressionsvergleicha

BCRP-fw

BCRP-rev

50

Expressionsvergleicha

MRP-a

MRP-b

60

Expressionsvergleicha

TP53-fw

TP53-rev

56

Mutationsanalysea,d

T7MOAT-fw3

MOAT-rev2

62

Matrix-DNA für in-vitro-Transkriptiona

T7MOAT-fw3

MOAT-rev3

62

Matrix-DNA für in-vitro-Transkriptiona

vector-fw

vector-rev

55

Insertkontrolle nach Klonierung in pcDNA3.1a,d

a PCR mit AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase
b RT-PCR mit Advantage®-Polymerase-Mix
c real-time-RT-PCR im Lightcycler
dZusatz von Betain (Endkonzentration: 1 M) und DMSO (Endkonzentration: 5 %)


[Seite 39↓]

RT-PCR mit Advantage ® -Polymerase-Mix:

Der Advantage®-Polymerase-Mix (Clontech) enthält die KlenTaq-1-DNA-Polymerase, eine weitere Polymerase, die eine 3‘-5‘-Korrekturleseaktivität besitzt, und den TaqStartTM- Antikörper, damit eine automatische hot start-PCR ermöglicht wird. Dieser Polymerase-Mix bietet durch seine besondere Zusammensetzung u. a. die Möglichkeit, besonders lange PCR-Fragmente zu amplifizieren. Die PCR-Ansätze waren wie folgt zusammengesetzt:

 

in µl

im Ansatz

10 x PCR-Puffer

2,5

1 x

dNTPs (je 10 mM)

1,0

400 µM

5‘-Oligonukleotidprimer (5 µM)

1

200 nM

3‘-Oligonukleotidprimer (5 µM)

1

200 nM

Betain (5 M)

5

1 M

DMSO (50 %ig)

2,5

5 %

Matrix-DNA (cDNA 1:50)

10

50-100 ng

50 x Advantage®-Polymerase-Mix

1,0

2 x

A. bidest.

auf 25

 

Die Amplifikation erfolgte im PCR-Thermal Cycler (Biometra) nach folgendem Programm:

1. Initiale Denaturierung: 1 min, 94 °C;

2. DNA-Amplifikation in 36 Zyklen, bestehend aus
2.1 Denaturierung der Doppelstrang-DNA: 30 s, 94 °C;
2.2 Hybridisierung der Primer an die komplementären Sequenzen: 30 s, bei TH (Tab. 2.3);
2.3 Elongation der Primer: 6 min, 68 °C;

3. Extension: 6 min, 68 °C

4. Abkühlung: ohne Zeitvorgabe, 4 °C.

Real-time -RT-PCR im Lightcycler:

Die Lightcycler-Technologie (Roche) bietet die Möglichkeit, den Verlauf einer PCR am Computer-Monitor mitzuverfolgen und aufgrund einer mitlaufenden Standardreihe mittels mathematischen Methoden auf die Ausgangsmolekülzahl in einer Probe für eine bestimmte Matrize zu schließen. Die PCR-Ansätze waren wie folgt zusammengesetzt:


[Seite 40↓]

 

in µl

im Ansatz

MgCl2 (25 mM)

2,4

4 mM

5‘-Oligonukleotidprimer (10 µM)

1,0

500 nM

3‘-Oligonukleotidprimer (10 µM)

1,0

500 nM

DNA Master SYBR Green I

2,0

1 x

A. bidest.

auf 18

 

Matrix-DNA (cDNA 1:5)

2,0

100-200 ng

In einem Lauf konnten bis zu 32 PCRs gleichzeitig durchgeführt werden. Es wurden bei jedem Lauf eine Nullkontrolle (A. bidest.) und eine Standardreihe von 6 bis 8 Proben (in 2er oder 10er Verdünnungsstufen) mitgeführt. Vor jeder Quantifizierung wurde der spezifische Meßpunkt für eine PCR bestimmt. Dazu wurde eine Probe-PCR für die Matrize durchgeführt und die Schmelzkurve für das Produkt analysiert. Die Meßtemperatur (TMeß) wurde so ausgewählt, daß sie knapp vor dem Abschmelzen des PCR-Produktes lag. Bei dieser Temperatur liegen eventuelle Primer-Dimere bereits als DNA-Einzelstränge vor und werden somit nicht mitgemessen.

Die Amplifikation erfolgte im LightCycler (Roche) nach folgendem Programm:

1. Initiale Denaturierung: 10 min, 95 °C;

2. DNA-Amplifikation in 40-50 Zyklen, bestehend aus
2.1 Denaturierung der Doppelstrang-DNA: 15 s, 95 °C;
2.2 Hybridisierung der Primer an die komplementären Sequenzen: 5 s, bei TH (Tab. 2.3);
2.3 Elongation der Primer: 10 s, 72 °C;
2.4 Meßpunkt: ohne Zeit, TMeß, messen;

3. Schmelzkurve: ohne Zeit, 95 °C; 15 s, 65 °C; in 0,1 °C/s auf 95 °C, fortwährend messen;

4. Abkühlung: 30 s, 40 °C.

2.2.16  Agarosegel-Elektrophorese von DNA

Die gelchromatographische Auftrennung von DNA erfolgte bei 85 V in 1,0-1,5 %igen Agarosegelen mit 1 x TAE als Laufpuffer. Die Gele enthielten 0,2 µg/ml Ethidiumbromid. Den Proben wurde anteilig 6 x Blue Orange Loading Dye (Promega) zugesetzt. Nach dem [Seite 41↓]Gellauf wurden die Banden durch UV-Beleutung sichtbar gemacht und photographisch dokumentiert.

50 x TAE

  

Tris-Azetat, pH 8,0

2,0 M

Der pH-Wert wurde mit 1 M

Na2EDTA

50 mM

Essigsäure eingestellt

in A. bidest.

  

2.2.17  Elution von DNA-Fragmenten

Nach Agarosegel-Elektrophorese (Kap. 2.2.16) wurde die DNA-Fragmente unter UV-Licht mit einem Skalpell ausgeschnitten. Für die Gelelution wurde der QIAquick Gel Extraction-Kit (QIAGEN) verwendet und nach dem Herstellerprotokoll vorgegangen. Die DNA wurde in 30 oder 50 µl Elutionspuffer aufgenommen.

2.2.18  Ligation von DNA-Fragmenten

Ligation mit T4-DNA-Ligase:

 

im Ansatz

Plasmid pcDNA3.0, geschnitten KpnI/XbaI (Kap. 2.2.7),

nach Gelelution (Kap. 2.2.17)

0,3-0,4 pmol

Ribozym-DNA, hybridisiert (Kap. 2.2.21)

100 pmol

10 x One-Phor-All Buffer PLUS

1 x

T4-DNA-Ligase FPLCpure®

12 U

ATP

1 mM

A. bidest.

auf 20 µl

Die Ligation erfolgt über Nacht bei 12 °C.

Ligation von PCR-Produkten:

Die Ligation erfolgte mit den Kits TOPO TA Cloning® (Vektor: pCR® 2.1 TOPO) und Eukaryotic TOPO TA Cloning® (Vektor: pcDNA3.1/V5/His-Topo) von Invitrogen nach den Angaben des Herstellers.


[Seite 42↓]

2.2.19  Sequenzierung von DNA

Die zu sequenzierende Plasmid-DNA wurde auf eine Konzentration von 0,1 µg/µl eingestellt. Anschließend wurde die Sequenzierung von Dr. Martin Meixner am Institut für Genetik der Humboldt-Universität zu Berlin durchgeführt. Es wurden der DNA-Sequenzierautomat ABI-373 und der ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit verwendet.

2.2.20  Identifikation potentieller Ribozym-Schnittstellen in der MRP2-mRNA

Um für Ribozyme gut zugängliche Sequenzen in der Ziel-mRNA zu identifizieren, wurden die Programme DNASIS 3.0 (Hitachi) und mFOLD 3.1 (http://bioinfo.math.rpi.edu) genutzt. Da die Gesamt-mRNA für eine Faltungsanalyse zu lang war (die vom Anbieter gesetzten Grenzen liegen bei 3000 nt), wurden innerhalb der MRP2-mRNA kürzere Bereiche (Größe 1000 bis 2000 nt) gewählt. Bei der Auswahl der Ribozyme wurde diejenige potentielle Sekundärstruktur betrachtet, die über die geringste freie Energie ΔG verfügt (Zarrinkar und Williamson, 1994; Zuker und Stiegler, 1981).

2.2.21  Ribozym-DNA-Matrizen für die in vitro -Transkription

Um die ausgewählten Ribozyme in vitro mittels T7-Polymerase transkribieren zu können, müssen die Ribozym-DNA-Matrizen eine vorangestellte T7-Promotorsequenz besitzen. Die Einzelstrang-Oligonukleotide RcMAT7-fw/rev und RcMBT7-fw/rev wurden chemisch synthetisiert (Tab. 2.1). Je 2,5 nmol T7-Promotor-Ribozym-Oligonukleotid (fw und rev) wurden zusammengegeben und folgendes Temperaturprotokoll durchgeführt:

  1. Denaturierung der ssDNA-Oligonukleotide: 2 min 94 °C;
  2. Hybridisierung der ssDNA-Oligonukleotide: 8 min 70 °C;
  3. Abkühlung der dsDNA-Oligonukleotidlösung: auf 4 °C.


[Seite 43↓]

2.2.22  in vitro -Transkription

Als Matrizen für die in vitro-Transkription wurden die zu Doppelsträngen hybridisierten T7-Promotor-Ribozym-Oligonukleotide (Kap. 2.2.21) und PCR-Produkte für die Substrate mit vorangestelltem T7-Promotor verwendet (Kap. 2.2.15, Tab. 2.3). Die Reaktionsansätze waren wie folgt zusammengesetzt:

 

in µl

im Ansatz

10 x T7-Transkriptionspuffer

4

1 x

NTPs

2,5

625 µM

RNaseOUT (RNase-Inhibitor)

1

40 U

[α-32P] UTP

1

312,5 nM

T7-Polymerase

1

50 U

A. bidest.

auf 40

 

Die Ansätze wurden 2 h bei 37 °C inkubiert und anschließend die Reaktion durch Zugabe von 10 µl 3 x PAGE-Auftragepuffer abgestoppt.

3 x PAGE-Auftragepuffer

  

Harnstoff

8 M

Der Puffer wurde bei –20°C gelagert.

Glyzerol

8,7 % (v/v)

 

Bromphenolblau

0,02 % (w/v)

 

Xylencyanol

0,02 % (w/v)

 

Orange G(w/v)

0,02 %

 

in A. bidest.

  

2.2.23  Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) von RNA

Die Auftrennung der in vitro-Transkriptionsprodukte sowie die Charakterisierung der Ribozyme durch zeit- und substratabhängige Kinetiken erfolgte mittels PAGE in 1 x TBE als Laufpuffer. Das Gel setzte sich wie folgt zusammen:


[Seite 44↓]

Menge

im Ansatz

Harnstoff

42 g

7 M

Acrylamid/Bisacrylamid (40 %ig)

20 ml

8 % (v/v)

10 x TBE

10 ml

1 x

in A. bidest.

  

Die Bestandteile wurden zusammengegeben, der Harnstoff gelöst und die Lösung durch Filtern entgast. Für die Polymerisierung wurden weiterhin zugegeben:

APS (10 %ig in A. bidest.)

800 µl

TEMED

80 µ

10 x TBE

  

Tris/HCl, pH 8,0

0,9 M

Der pH-Wert wurde mit 1 M

Borsäure

0,9 M

HCl eingestellt

Na2EDTA

25 mM

 

in A. bidest.

  

Die Auftrennung erfolgte bei kurzen Gelen (Länge: 20 cm) zunächst 20 min bei 15 W, anschließend bis zur kompletten Auftrennung bei 25 W. Bei langen Gelen (Länge: 42 cm) erfolgte der Lauf zuerst 30 min bei 20 W, danach bis zur vollständigen Auftrennung bei 40 W. Nach Exposition auf Röntgenfilm (Kodak) bei –80 °C konnten die in vitro-Transkriptionsprodukte nach ca. 15 min bzw. bei analytischen Gelen die Ausgangs- und Spaltprodukte eines Schnittversuchs nach 1-3 Tagen sichtbar gemacht werden.

2.2.24 Elution und Fällung von RNA aus Polyacrylamidgelen

Röntgenfilm und Polyacrylamidgel wurden zur Deckung gebracht. In Höhe der Banden auf dem Film wurde der entsprechende Gelbereich ausgeschnitten, die Probe in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt und mit einer Pipettenspitze zerkleinert. Nach Zugabe von 400 µl RNA-Elutionspuffer wurden die Proben durch sequenzielles Einfrieren mit flüssigem Stickstoff und anschließendem Auftauen bei 37 °C weiter aufgeschlossen. Die Proben wurden über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Proben 5 min [Seite 45↓]bei 14 000 rpm (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf) zentrifugiert und der Überstand in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Die eluierte RNA wurde durch Zugabe von 0,1 Volumen 3 M Natriumazetat, 2,5 Volumen Ethanol und 5 µg Glykogen für 3 h bei –70 °C gefällt. Die RNA wurde 1 h bei 14 000 rpm (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf) pelletiert, kurz mit 70 %igem Ethanol in DEPC-Wasser (Kap. 2.2.8) gewaschen und erneut für 15 min zentrifugiert. Das Pellet wurde getrocknet und im β-Counter Wallac 1409 (Wallac) vermessen.

RNA-Elutionspuffer

Tris/HCl, pH 8,0

500 mM

Der Puffer wurde vor Gebrauch

Na2EDTA

1 mM

sterilfiltriert. Der pH-Wert wurde mit

MgCl2

0,1 mM

1 M HCl eingestellt.

SDS

0,1 % (w/v)

 

in A. bidest.

  

2.2.25 Bestimmung der Stoffmenge radioaktiv markierter RNA

Die Stoffmenge radioaktiv markierter RNA kann aus der im β–Counter gemessenen Stahlung berechnet werden.

 

A

= eingesetzte Aktivität [Bq]

 

Akal

= eingesetzte Aktivität zum Zeitpunkt der Kalibrierung [Bq]

 

tkal

= Zeit der Kalibrierung [d]

 

t1/2

= Halbwertzeit des eingesetzten Isotopes [d]

In die Berechnung ging außerdem der Faktor W ein, der den Einbau von unmarkiertem UTP an einer beliebigen Position des transkribierten Moleküls beschreibt. Dieser Faktor wird aus dem Quotienten der Stoffmenge eingesetzten unmarkierten UTPs und der Anzahl von UMPs je transkribiertem Molekül berechnet:


[Seite 46↓]

 

W

= Faktor für zufälligen Einbau unmarkierten UTPs [nmol]

 

nUTP

= eingesetztes unmarkiertes UTP [nmol]

 

NUMP

= Anzahl der UMPs im transkribierten Molekül

Somit ergibt sich die Stoffmenge des Transkriptes nTranskript aus dem Produkt der gemessenen Radioaktivität der Probe Ameß und dem Quotienten W/A:

 

nTranskript

= Stoffmenge des Transkriptes [nmol]

 

Ameß

= gemessene Radioaktivität [Bq]

 

W

= Faktor für zufälligen Einbau unmarkierten UTPs [nmol]

 

A

= eingesetzte Aktivität [Bq]

2.2.26  in vitro -RNA-Prozessierung

Die ribozymatische Spaltung der RNA in vitro wurde in einem Gesamtvolumen von 10 µl unter Anwesenheit von unterschiedlichen Mengen Substrat und Ribozym (Tab. 2.4) in 1 x Ribozym-Puffer bei 37 °C durchgeführt. Nach bis zu fünfstündiger Inkubation wurden die Ansätze mit 10 µl 3 x PAGE-Auftragepufffer (Kap. 2.2.22) versetzt.

10 x Ribozym-Puffer

  

Tris/HCl, pH 7,5

400 mM

Der Puffer wurde vor Gebrauch

MgCl2

120 mM

sterilfiltriert. Der pH-Wert wurde

in A. bidest.

 

mit 1 M HCl eingestellt


[Seite 47↓]

Tab. 2.4 : Reaktionsbedingungen bei der RNA-Prozessierung.

 

Nachweis der

Aktivität

Bestimmung von vini

und kobs

Bestimmung von kcat/kM

c[Substrat]

200 nM

20 nM

40 nM

c[Ribozym]

200 nM

100 nM

0; 20; 40; 80; 120; 200; 300; 400 nM

t

120 min

0; 0,5; 1; 2; 3; 5; 10; 20; 30; 60; 120; 180; 300 min

15 min

2.2.27 Berechnung der Reaktionsparameter der ribozymatischen Spaltung

Die Initialgeschwindigkeit vini der ribozymatischen RNA-Spaltung bezeichnet die Geschwindigkeit der Umsetzung des ungespaltenen RNA-Substrates S in die beiden Spaltprodukte P bei anfänglichem Substratüberschuß. Sie wird aus dem Quotienten der Stoffmenge des gebildeten Produktes P zum Zeitpunkt t errechnet (Hendry et al., 1997):

 

vini

= Initialgeschwindigkeit [mol·s-1]

 

n(Pt)

= Stoffmenge der Spaltprodukte zum Zeitpunkt t [mol]

 

t

= Reaktionszeit [s]

Die Initialgeschwindigkeit entspricht dabei dem Anstieg im angenommenen linearen Anfangsbereich des Graphen n(Pt) = f(t), da dieser Bereich die Reaktion unter Substratüberschuß widerspiegelt.

Der Reaktionsparameter kcat/kM (nach Heidenreich & Eckstein, 1992) wurde aus der ribozym-konzentrationsabhängigen Spaltung des RNA-Substrates nach folgender Gleichung berechnet:


[Seite 48↓]

 

Su

= Anteil des ungespaltenen am eingesetzen Substrat zum Zeitpunkt t

 

Pt

= Produktanteil zum Zeitpunkt t

 

kcat/kM

= Reaktionsparameter nach Heidenreich & Eckstein (1992)

 

t

= Reaktionszeit [s]

 

cRz

= Ribozymkonzentration [M]

Die Gültigkeit ist auf einen Bereich beschränkt, bei dem bei steigender Ribozymkonzentration auch eine Zunahme der Spaltprodukte zu verzeichnen ist. Der Parameter kcat/kM ist nach Umstellung der Heidenreich´schen Formel wie folgt definiert:

Der Parameter kcat/kM entspricht dem Anstieg im angenommenen linearen Teils des –ln Su/t = f(cRz)-Diagramms.

Eine weitere Berechnungsmöglichkeit (Hendry et al., 1995) berücksichtigt, daß die Reaktion nicht bis zum vollständigen Abbau des Substrates fortschreitet, sondern in der Praxis einen Maximalwert an gespaltenem Substrat bzw. entstandenem Produkt annimmt. Daher kann man den folgenden Zusammenhang definieren:

 

Smax

= Anteil des ungespaltenen am maximal spaltbaren Substrat zum

Zeitpunkt t

 

Pt

= Produktanteil zum Zeitpunkt t

 

P

= Produkt zum Zeitpunkt t=∞

 

PΔ

= Differenz zwischen dem Prozentsatz des Produktes bei t=∞ und t=0

 

kcat/kM

= Reaktionsparameter nach Hendry et al. (1995)

 

t

= Reaktionszeit [s]

 

cRz

= Ribozymkonzentration [M]


[Seite 49↓]

Auch diese Formel ist in dem Bereich definiert, in dem bei steigender Ribozymkonzentration auch eine Zunahme der Spaltprodukte zu verzeichnen ist. Für den Parameter kcat/kM nach Hendry et al. (1995) ergibt sich nach Umformung der folgende Zusammenhang:

Der Parameter kcat/kM nach Hendry et al. (1995) entspricht dem Anstieg des angenommenen linearen Abschnitts des Graphen im –ln Smax/t = f(cRz)-Diagramm.

Der kinetische Parameter kobs beschreibt den beobachteten Stoffumsatz für die Gesamtreaktion aus Assoziation des Ribozyms mit seinem Zielmolekül und der Spaltung selbst. Er wurde nach seiner Definition (Heidenreich et al., 1994) aus der zeitabhängigen Kinetik ermittelt:

 

kobs

= Konstante für die beobachtete Spaltung nach Heidenreich et al. (1994)

 

Su

= Anteil des ungespaltenen am eingesetzten Substrat zum Zeitpunkt t

 

t

= Reaktionszeit [s]

Der Parameter kobs nach Heidenreich et al. (1994) entspricht dem Anstieg des angenommenen linearen Abschnitts des Graphen im –ln Su = f(t)-Diagramm. Analog zu den Berechnungen von kcat/kM wurde berücksichtigt, daß die Reaktion nicht bis zum vollständigen Abbau des Substrates fortschreitet und kobs nach Hendry et al. (1995) berechnet:

 

kobs

= Konstante für die beobachtete Spaltung nach Hendry et al. (1995)

 

Pt

= Produkt zum Zeitpunkt t

 

P

= Produkt zum Zeitpunkt t=∞

 

P

= Differenz zwischen dem Prozentsatz des Produktes bei t=∞ und t=0

 

t

= Reaktionszeit [s]


[Seite 50↓]

Nach Umformung ergibt sich:

Der Parameter kobs nach Hendry et al. (1995) entspricht dem Anstieg des angenommenen linearen Abschnitts des Graphen im –ln((P-Pt)/PΔ) = f(t)-Diagramm.

2.2.28  Präparation von Membranproteinen

Eukaryotische Zellen wurden in Zellkulturschalen mit einem Durchmesser von 8 cm ausgesät. Bei einer Konfluenz von ca. 80 % wurde das Zellkulturmedium abgesaugt und die Zellen zweimal mit eiskaltem 1 x PBS gewaschen. Die Schalen wurden auf Eis gestellt, je 3 ml Hypolyse-Puffer zugegeben, kurz geschwenkt und 5 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden abgeschabt, die Suspension in einen Homogenisator überführt und durch 10-12maliges Hochziehen und Runterdrücken des Pistills geschert. Die Suspension wurde in 15 ml-Röhrchen überführt und 10 min bei 4 °C und 2200 rpm (Zentrifuge: GS-6KR, Beckman-Coulter, 1100 x g) zentrifugiert. Der Überstand wurde in Ultrazentrifugen-Röhrchen gegeben und 30 min bei 4 °C und 60 000 rpm (Zentrifuge: OptimaTM TL, Beckman-Coulter, 153 000 x g) zentrifugiert. Das Pellet wurde in einer geeigneten Menge 4 x Proben-Puffer (50-200 µl) resuspendiert, 10 min bei 95 °C inkubiert und erneut 5 min bei 14 000 rpm und 4°C und zentrifugiert. Der Überstand wurde aliquotiert und bei –80 °C gelagert.

10 x PBS

  

NaCl

1,37 M

Der Puffer wurde vor Gebrauch

Na2HPO4

43 mM

autoklaviert. Der pH-Wert 7,3 ergibt

KCl

27 mM

sich aus der Zusammensetzung der

KH2PO4

14 mM

Lösung.

   


[Seite 51↓]

Hypolyse-Puffer

1 Cocktail-Tablette mit Proteinase-Inhibitoren (Roche) wird in 2 ml A. bidest. vollständig aufgelöst. Diese 2 ml werden zu 48 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) gegeben. Die Lösung ist ca. 2 Wochen bei 4 °C lagerbar.

4 x Proben-Puffer

 

1 M Tris-HCl, pH 6,8

1,2 ml

150 mM DTT

247 mg

20 % SDS

2 ml

Glyzerin

2 ml

Bromphenolblau, gesättigt in 0,1 % Ethanol

1-2 Tropfen

2.2.29  Bestimmung von Protein-Konzentrationen

In 2 ml Reaktionsgefäßen wurde je 1 ml Elutionslösung für Protein-Färbung vorgelegt. Auf einer Nitrozellulosemembran wurden nebeneinander 2 µl-Tröpfchen von den zu bestimmenden Proteinlösungen gesetzt (Doppelbestimmung). Außerdem wurde - ebenfalls als Doppelbestimmung - BSA in 1 x PBS (Kap. 2.2.28) in bekannter Proteinkonzentration als Eichreihe mitgeführt. Die Membran wurde für 60-90 s mit einer Amidoschwarzlösung gefärbt. Nach Abkippen der Färbelösung wurde die Membran mittels Entfärber-Lösung so lange entfärbt, bis die Nitrozellulosemembran des Hintergrundes wieder fast weiß war. Die Protein-Punkte waren nun blau. Mit einem Skalpell wurden die Punkte samt Hintergrund in annähernd gleich großen Quadraten ausgeschnitten und in die vorbereiteten Reaktionsgefäße mit der Elutionslösung gegeben. Für den Referenzwert wurde ein Quadrat mit Hintergrund ausgeschnitten. Die Reaktionsgefäße wurden ca. 20 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Dabei ging die Blaufärbung auf den Elutionspuffer über. Diese gefärbte Lösung wird in Einmal-Küvetten gegeben. Unter Nutzung des Spektrophotometers (Pharmacia) und dem Programm VWSS (Pharmacia) wurde der Referenzwert Null gesetzt und die Extinktion der Proben bei einer Wellenlänge von 630 nm bestimmt. Nach Auftragen der Eichkurve konnte die Proteinkonzentration der Proben ermittelt werden.


[Seite 52↓]

Elutionslösung

 

 

Ethanol

50 ml

50 % (v/v)

0,5 M EDTA, pH 8,0

10 µl

500 µM

0,5 M NaOH

5 ml

25 mM

A. bidest.

45 ml

auf 100 ml

 

 

 

Amidoschwarz-Färbelösung

 

 

Amidoschwarz

 

0,1 % (w/v)

Methanol

 

45 % (v/v)

Essigsäure

 

10 % (v/v)

in A. bidest.

 

 

 

 

 

Entfärber-Lösung

 

 

Methanol

 

45 % (v/v)

Essigsäure

 

1 % (v/v)

in A. bidest.

 

 

2.2.30 Polyacrylamidgel-Elektrophorese von Proteinen

30 µg Membranproteine wurden mit 2 x Probenpuffer (Kap. 2.2.28) auf 15 µl eingestellt und 5-10 min bei 95 °C denaturiert. Die Proben wurden 1 min bei 14 000 rpm (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf) zentrifugiert und der Überstand aufgetragen. Die Auftrennung der Membranproteine erfolgte mittels PAGE in 1 x Laufpuffer zunächst 30 min bei 65 V, danach für weitere 1,5 bis 2 h bei 95 V.

7,5 %iges Trenngel

A. bidest.

8,4 ml

Nach dem Gießen wurde das

1 M Tris-HCl, pH 8,8

7,5 ml

Trenngel bis zum vollständigen

Acrylamid/Bisacrylamid (40 %ig)

3,75 ml

Polymerisieren mit Isopropanol

SDS (10 %ig)

200 µl

überschichtet.

APS (10 %ig)

150 µ

 

TEMED

15 µ

 


[Seite 53↓]

Sammelgel

A. bidest.

6,4 ml

0,5 M Tris-HCl, pH 6,8

2,5 ml

Acrylamid/Bisacrylamid (40 %ig)

1,0 ml

SDS (10 %ig)

100 µl

APS (10 %ig)

75 µl

TEMED

15 µl

10 x Laufpuffer

Tris-Base

30 g

Glyzin

144 g

SDS

10 g

A. bidest.

auf 1 l

2.2.31 Western-Blot

Nach der PAGE für Proteine wurden das Sammelgel abgetrennt. Trenngel, Zellulosenitrat-Membran und 6 Lagen Whatman-Papier gleicher Größe wurden in 1 x Transfer-Puffer äquilibriert. Der Transfer erfolgte in einer Semi-dry-Blotapparatur (Biometra), wobei die sandwich-artige Übereinanderschichtung von Whatman-Papier, Membran und Gel nach den Angaben des Herstellers ausgeführt wurde, bei 3 mA/cm2 Blotfläche für 90 min.

1 x Transferpuffer

Tris-Base

3,03 g

25 mM

Glyzin

14,4 g

192 mM

Methanol

200 ml

20 %

A. bidest.

auf 1 l

 

2.2.32 Antikörper-Reaktion und Detektion mittels Chemolumineszenz

Nachdem die nach ihrer Größe aufgetrennten Proteine auf Nitrozellulose-Membranen transferiert wurden, schloß sich der Nachweis von Proteinen an, die sich auf diesen Membranen befanden. Das MRP2-Protein wurde gleichzeitig mit Aktin (Kontrolle der [Seite 54↓]Beladung) nachgewiesen. Dazu wurden die primären Antikörper gegen MRP2, Klon M2I-4 (Sanbio), 1:100 und X-Actin, Klon C4 (Chemicon) 1:4000 in 1 % Magermilchpulver in 0,05 % TBST eingesetzt und ca. 1 ½ h bei Raumtemperatur unter Schwenken (Schwenker: WT16, Stufe 6) inkubiert. Die Membran wurde viermal in 0,05 % TBST innerhalb von 30 min gewaschen (Schüttler: KL2, 420 rpm). Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem sekundären Antikörper Anti-Maus, mit POD-Markierung (Dianova) in einer Verdünnung von 1:10 000 in 0,05 % TBST für ca. 1 h unter Schwenken (Schwenker: Stufe 6). Es wurde erneut viermal in 0,05 % TBST innerhalb von 30 min gewaschen (Schüttler: KL2, 420 rpm). Die Detektion erfolgte mittels ECLTM-Kit (Amersham Pharmacia Biotech) nach den Angaben des Herstellers. Die Exposition der Blots erfolgte 5-15 min auf Hyperfilm ECL (Amersham).

0,05% TBST

Tris-Base

4,50 g

Tris-HCl

34,25 g

NaCl

43,90 g

Tween® 20

2,5 ml

A. bidest.

auf 5 l

2.2.33 Proliferationsassay mittels SRB

Der Zellproliferationsassay basierend auf einer Färbung mittels SRB bietet eine Möglichkeit, behandelte und unbehandelte Zellen hinsichtlich ihrer Zellzahl zu vergleichen, die mit der gefärbten Proteinmenge korreliert (Perez et al., 1993).

Es wurden auf einer 96-Kaviditäten-Mikrotiterplatte 3 x 10 Kaviditäten pro Testreihe mit je 800 Zellen/Vertiefung in je 100 µl modifiziertem L-15-Medium ausgesät. Auf diese Weise konnten zwei Tests pro Platte durchführt werden. Der verbleibende Rand wurden als Verdunstungsschutz mit je 200 µl sterilem 1 x PBS belegt (Kap. 2.2.28). Nach 24 h wurden 100 µl zytostatikahaltiges Medium zugegeben und die Zellen für weitere 5 Tage kultiviert. Danach wurde das Medium abgenommen und die Zellen mit 10 % Trichloressigsäure 1 h bei 4 °C fixiert. Der Zellrasen wurde 5 x mit Wasser gewaschen und eine Proteinfärbung für 10 min mittels SRB-Färbelösung (100 µl/Kavidität) durchgeführt. Die Färbelösung wurde mittels fünfmaliger Waschungen mit 1 %iger Essigsäure entfernt und die Mikrotiterplatten [Seite 55↓]getrocknet. Die vorhandenen Protein-SRB-Komplexe wurden in 300 µl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 gelöst. Die Intensität der Färbung wurde durch photometrische Messung mit dem Plattenlesegerät EL340 (BioTek) bei 562,5 nm gegen 690 nm Referenzwellenlänge bestimmt. Die Werte der unbehandelten Zellen wurden auf 100 % gesetzt und aus der Meßreihe die IC50 bestimmt.

SRB-Färbelösung

Sulforhodamin B

0,4 % (w/v)

Essigsäure

0,1 % (v/v)

in A. bidest.

 

2.2.34 Glutathion-Assay

Eukaryotische Zellen wurden in Kulturschalen mit 3,5 cm Durchmesser ausgesät (Dreifachbestimmung) und bis zu 80 % Konfluenz kultiviert. Die Zellen wurden trypsiniert und 1:1 mit Medium versetzt, um das Trypsin zu inhibieren. Nach der Bestimmung der Zellzahl wurden die Zellen bei Raumtemperatur und 950 rpm 5 min pelletiert (Zentrifuge: GS-6KR, Beckman-Coulter, 200 x g) und in 100 µl 6 %iger Trichloressigsäure resuspendiert. Durch starkes Vortexen wurden die Zellen aufgeschlossen, die Zelltrümmer 4 min bei 12 000 rpm (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf) abzentrifugiert und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Mit diesem Zelllysat wurde die zweistufige Glutathionbestimmung (modifiziert, Tietze, 1969) durchgeführt. Durch Mitführung von Standardreihen für GSH und GSSG konnten die Glutathionmengen in den Lysaten quantifiziert werden.

Bestimmung von reduziertem Glutathion (GSH)

40 µl Zelllysat wurden in eine 96-Kaviditäten-Mikrotiterplatte pipettiert, 80 µl Ellman´s Puffer (0,3 M Dinatriumhydrogenphosphat in A. bidest.) und 10 µl Ellman´s Reagenz (0,04 % (w/v) 5,5‘-Dithiobis-(2-nitrobenzoe)-säure in 0,1 % (w/v) Trinatriumzitrat, in A. bidest.) zugegeben. Die Platte wurde kurz geschüttelt und sofort im Plattenlesegerät EL 340 bei 405 nm gegen 690 nm Referenzwellenlänge gemessen.

Bestimmung von Gesamt-Glutathion (GSH und GSSG)


[Seite 56↓]

40 µl Zelllysat wurden in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß gegeben und mit 300 µl Ether gewaschen, um lipide Elemente zu entfernen. Die Proben wurden 15 min im Vakuum getrocknet, um den verbleibenden Ether zu entfernen. 40 µl frisch angesetztes Natriumborhydrid (20 mg/ml in A. bidest.) wurden zugegeben und durch 40-minütige Inkubation bei 37 °C oxidiertes Glutathion (GSSG) in reduziertes (GSH) überführt. Das überschüssige Natriumborhydrid wurde durch langsame Zugabe von 37,5 µl 1 M HCl gelöscht. Danach wurden 40 µl Azeton und 30 µl 1 M Tris-HCl, pH 8,5 zugegeben und gemischt. 150 µl wurden auf eine 96-Kaviditäten-Mikrotiterplatte aufgetragen, 80 µl Ellman’s Puffer und 10 µl Ellman’s Reagenz (siehe Bestimmung von GSH) zugegeben, kurz geschüttelt und im Plattenlesegerät EL 340 bei 405 nm gegen 690 nm Referenzwellenlänge gemessen.

2.2.35 Caspase-3-Assay

Eukaryotische Zellen wurden in Zellkulturgefäßen mit 75 cm2 Kulturfläche ausgesät (Doppelbestimmung) und bei ca. 60 % Konfluenz für 24 h mit Cisplatin (0, 25 oder 100 µM) behandelt. Die Zellen wurden trypsiniert und 1:1 mit modifiziertem L-15-Medium versetzt. Die Zellzahl wurde bestimmt, 2 x 106 Zellen abgenommen, pelletiert, mit eiskaltem 1 x PBS (Kap. 2.2.28) gewaschen und erneut pelletiert (Zentrifuge: GS-6KR, Beckman-Coulter, 200 x g). Für die Bestimmung der Caspase-3-Aktivität wurde der Caspase 3 Activity Assay (Roche) verwendet und die Prozedur nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Proben wurden im Plattenlesegerät SPECTRA-FLUOR (Tecan) mit einem Excitation-Filter von 405 nm und einem Emission-Filter von 535 nm gemessen. Anhand der mitgeführten Standardreihe für den Fluoreszenzfarbstoff AFC konnte die Caspase-3-Aktivität quantifiziert werden.

2.2.36 Zellzyklus-Analyse mittels Durchflußzytometrie

Eukaryotische Zellen wurden in Zellkulturgefäßen mit 3,5 cm Durchmesser ausgesät und bei einer Konfluenz von ca. 60 % mit Cisplatin (0, 25 oder 100 µM) für 2 bis 72 h behandelt. Die Zellen wurden trypsiniert, mit eiskaltem 1 x PBS (Kap. 2.2.28) gewaschen, pelletiert (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf, 3000 rpm) und in 1 ml 70 %igem Ethanol aufgenommen. Bis zum Tag der Messung wurden die Zellen bei 4 °C aufbewahrt. Vor der Messung wurden die Zellen pelletiert (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf, 3000 rpm), in 1 ml Lösung A aufgenommen [Seite 57↓]und für 1 h bei 37 °C inkubiert. Es wurde erneut zentrifugiert und die Zellen in 0,5 ml Lösung B aufgenommen. 5 000 oder 10 000 Zellen wurden im FACScan (BD) im Fluoreszenzkanal FL-2 gemessen und über die Software Cellquest ausgewertet.

Lösung A

 

TritonX-100

0,1 % (v/v)

BSA (Fraktion V)

0,5 % (w/v)

RNase, DNase-frei

5 µg/ml

in A. bidest.

 
  

Lösung B

 

TritonX-100

0,1 % (v/v)

BSA (Fraktion V)

0,5 % (v/v)

Propidiumiodid

5 µg/ml

in A. bidest.

 


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04.08.2004