[Seite 58↓]

3  Ergebnisse

3.1 Charakterisierung der Zellinien und ihrer cisplatinresistenten Varianten

3.1.1  Wachstumsverhalten der Zellinien unter Zytostatikabehandlung

Um einen generellen Mechanismus für die Cisplatinresistenz zu finden, wurden drei verschiedene humane Karzinomzellinien und ihre jeweiligen cisplatinresistenten Varianten ausgewählt. Es handelte sich um die Ovarialkarzinomzellinien A2780 und A2780RCIS, die Nebennierenrindenzellkarzinomzellinien D43/86 und D43/86RCIS, sowie die Melanomzellinien Mewo und MewoRCIS. Unter Nutzung eines Zellproliferationsassays (Kap. 2.2.33) wurde das Ausmaß der Resistenz durch Ermittlung der IC50 bestimmt. Die IC50 gibt die Konzentration des Zytostatikums an, bei welcher nur noch die Hälfte aller Zellen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle im Untersuchungsgefäß vorliegt. Es wurden IC50-Bestimmungen für die Zytostatika Cisplatin, Carboplatin, Daunorubicin, Vincristin und Etoposid durchgeführt (Abb. 3.1 und Tab. 3.1). Alle drei cisplatinresistenten Varianten waren kreuzresistent gegenüber Carboplatin. Die höchsten Resistenzfaktoren (Rf) im Vergleich zur Ausgangszellinie wies die Zellinie A2780RCIS mit einem Rf von 16,8 gegenüber Cisplatin und Rf von 21,6 gegenüber Carboplatin auf. Die Zellinie A2780RCIS war ebenfalls resistenter gegenüber Daunorubicin und Etoposid. Die Zellinie D43/86RCIS zeigte gegenüber diesen beiden Zytostatika jedoch keine Kreuzresistenz. In der Zellinie MewoRCIS wurde eine geringe Resistenzerhöhung gegenüber Daunorubicin und Etoposid festgestellt. In keinem der drei untersuchten Zellinienpaare wurde eine Kreuzresistenz gegenüber Vincristin beobachtet.


[Seite 59↓]

Abb. 3.1 : Sensitivität der untersuchten Zellinien gegenüber Cisplatin, Carboplatin, Daunorubicin, Etoposid und Vincristin

Alle Zellen wurden kontinuierlich 5 Tage in zytostatikahaltigen Medien unterschiedlicher Konzentration kultiviert. Die am Ende der Inkubationszeit vorhandene Zellmenge wurde durch Färbung der membranständigen Proteine mittels SRB photometrisch bestimmt (Kap. 2.2.33). Die Menge der zytostatikafrei inkubierten Zellen wurde 100 % gesetzt und die weiteren Werte in Relation zu diesem Ausgangswert berechnet. Die gezeigten Werte sind Mittelwerte mit Standardabweichung einer repräsentativen Dreifachbestimmung. a) Cisplatin; b) Carboplatin; c) Daunorubicin; d) Etoposid; e) Vincristin.


[Seite 60↓]

Tab. 3.1 : IC 50 -Werte für Cisplatin, Carboplatin, Daunorubicin, Vincristin und Etoposid der untersuchten Zellinien.

Zelllinie

IC 50 – (Rf)

 

Cisplatin

[µM]

Carboplatin

[µM]

Daunorubicin

[nM]

Vincristin

[pM]

Etoposid

[nM]

A2780

2,6 (1,0)

10,8 (1,0)

5,0 (1,0)

832 (1,0)

28,5 (1,0)

A2780RCIS

43,7 (16,8),***

233,0 (21,6),***

19,1 (3,8),***

724 (0,9), n.s.

493,5 (17,3),***

D43/86

8,2 (1,0)

49,8 (1,0)

8,8 (1,0)

877 (1,0)

179,5 (1,0)

D43/86RCIS

27,6 (3,4),***

168,1 (3,4),***

7,1 (0,8), n.s.

825 (0,9), n.s.

147,4 (0,8), n.s.

Mewo

5,5 (1,0)

55,3 (1,0)

12,1 (1,0)

793 (1,0)

195,7 (1,0)

MewoRCIS

20,3 (3,7),***

158,4 (2,9),***

16,2 (1,3),**

778 (1,0), n.s.

313,9 (1,6), *

Die angegebenen IC50-Werte wurden durch nichtlineare Regression mit einem sigmoidalen Kurvenverlauf unter Nutzung des Programms GraphPad PRISM ermittelt. In Klammern ist der Resistenzfaktor Rf relativ zu der jeweiligen parentalen Zellinie angegeben. Die Signifikanz der Unterschiede wurde mit dem Student’s T-Test, 2-seitig, überprüft (n.s. = nicht signifikant; * = P<0,05; ** = P<0,01; *** = P<0,001).

3.1.2  Mutationsstatus von p53 in den Zellinien

Es sollte der p53-Status in den Zellinien ermittelt werden, um den möglichen Einfluß auf die Zytostatikaresistenz in den Zellinien abschätzen zu können. Aus den Zellinien A2780, A2780RCIS, D43/86, D43/86RCIS, Mewo und MewoRCIS wurde Gesamt-RNA isoliert (Kap. 2.2.8), cDNA synthetisiert (Kap. 2.2.14) und der offene Leserahmen von p53 mittels RT-PCR (Kap. 2.2.15) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in den prokaryotischen Vektor pCR®2.1 kloniert (Kap. 2.2.18), in E. coli transformiert (Kap. 2.2.4 und 2.2.5), die Plasmide isoliert (Kap. 2.2.6) und mittels Restriktionsanalyse auf ein bestehendes Insert kontrolliert (Kap. 2.2.7 mit EcoRI). Die Plasmide mit vorhandenem Insert wurden unter Nutzung von M13-Primern sequenziert (Kap. 2.2.19).

Nach Abgleich der ermittelten Sequenz mit der Referenzsequenz für p53 (NM_000546.2) unter Nutzung von Standard-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) wurde die RT-PCR, Klonierung und Sequenzierung wiederholt, um die Ergebnisse zu verifizieren. Die Resultate sind in der Tab. 3.2 zusammengefaßt. Die Zellinie A2780 besitzt Wildtyp-TP53 mit einem genetischen Polymorphismus für die Aminosäure 72. Von einem genetischen Polymorphismus spricht man, wenn eine genetische Variante mit einer Häufigkeit von mehr als 1 % (bei Heterozygosität 2 %) in der Bevölkerung auftritt. In TP53 tritt wahlweise die [Seite 61↓]Aminosäure Arginin oder Prolin auf, wobei Arginin häufiger zu finden ist. Dieser Unterschied führt zu veränderter Mobilität in der Elektrophorese (Quelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov, Beschreibung zur Referenzsequenz NM_000546.2). A2780RCIS besitzt außer diesem Polymorphismus zwei weitere Mutationen, die zu veränderten Aminosäuren in den Positionen 111 und 351 führen. Die Zellinien D43/86 und Mewo, sowie ihre cisplatinresistenten Varianten, besitzen ebenfalls mutiertes TP53, wobei sowohl die sensitive als auch die resistente Zellinie die gleiche Mutation aufweisen.

Tab. 3.2 : TP53-Status in den untersuchten Zellinien.

Zellinie

Nukleotidsequenz a

Aminosäuresequenz

A2780

WT (PoM: 466 g→c, cgc→ccc)

AS 72 R→P

A2780RCIS

WT (PoM: 466 g→c, cgc→ccc)

583 t→a, ctg→cag

1304 g→t, aag→aat

AS 72 R→P

AS 111 L→Q

AS 351 K→N

D43/86

828 c→a, cat→aat

As 193 H→N

D43/86RCIS

828 c→a, cat→aat

AS 193 H→N

Mewo

1023 g→a, gaa→aaa

AS 258 E→K

MewoRCIS

1023 g→a, gaa→aaa

AS 258 E→K

WT=Wildtyp, AS=Aminosäure, PoM=Polymorphismus.a Die Numerierung bezieht sich auf die Referenzsequenz NM_000546.2. Angegeben sind die Veränderungen des Nukleotids in der gegebenen Position und die daraus resultierende Veränderung des gesamten Codons.

3.1.3 Expression von Genen mit Relevanz für Chemoresistenz in den Zellinien

Nachdem das Ausmaß der Resistenz in den Zellinien A2780RCIS, D43/86RCIS und MewoRCIS im Vergleich zu ihren parentalen Ausgangslinien bekannt war, sollte im folgenden geklärt werden, wodurch sich diese Zellinien in der Expression bestimmter Gene unterscheiden. Es wurden eine Reihe von Genen ausgewählt, von denen aus vorangegangenen Untersuchungen bekannt war, daß sie im Rahmen des Erwerbs von Chemoresistenz verändert exprimiert werden können (Kap. 1.2). Dabei sollte möglichst ein Gen gefunden werden, welches in allen drei Zellinien gleichermaßen differenziell exprimiert wird, um einen generellen Mechanismus für Cisplatinresistenz zu finden.


[Seite 62↓]

Abb. 3.2 : mRNA-Expressionsanalyse mittels RT-PCR in den untersuchten Zellinien

Die Zellinien A2780, A2780RCIS, D43/86, D43/86RCIS, Mewo und MewoRCIS wurden mittels RT-PCR auf die Expression von GAPDH, MRP1, MRP2, MDR1, BCRP, LRP, hMLH1, hMLH2 und hPMS2 untersucht. Die PCR-Produkte wurden in einem ethidiumbromidhaltigen Agarosegel aufgetrennt und durch UV-Beleuchtung sichtbar gemacht (Kap. 2.2.16).

Es wurde Gesamt-RNA aus den sechs Zellinien isoliert (Kap. 2.2.8), cDNA synthetisiert (Kap. 2.2.10 und 2.2.14) und RT-PCRs (Kap. 2.2.15) für LRP, die ABC-Transporter MRP1, MRP2, MDR1 und BCRP, sowie für Komponenten des MMR-Systems ( m is m atch r epair system) hMLH1, hMSH2 und hPMS2 durchgeführt. Die Gleichmäßigkeit der cDNA-Menge der verschiedenen Zellinien wurde durch RT-PCR für das house-keeping Gen GAPDH kontrolliert (Abb. 3.2). Für LRP, hMSH2 und hPMS2 konnten keine Unterschiede zwischen den sechs verschiedenen Zellinien festgestellt werden. Die Expression von hMLH1 und [Seite 63↓]BCRP war in der Zellinie A2780RCIS im Vergleich zu ihrer parentalen Linie vermindert. Dies war in den Zellinien D43/86RCIS und MewoRCIS nicht der Fall. Die cisplatinresistente Variante MewoRCIS exprimierte etwas weniger MRP1 im Vergleich zur sensitiven Variante Mewo. In den Zellinien A2780RCIS und D43/86RCIS war die Expression von MRP1 gegenüber ihren parentalen Zellinien nicht verändert. Die Expression von MDR1 war in A2780RCIS und D43/86RCIS im Vergleich zu A2780 bzw. D43/86 erhöht, jedoch in der Zellinie MewoRCIS gegenüber der sensitiven Zellinie Mewo vermindert. Die Expression des ABC-Transporters MRP2 war in allen drei cisplatinresistenten Zellinien im Vergleich zu ihrer jeweiligen parentalen Zellinie erhöht, so daß dieses Gen für die weiteren Untersuchungen ausgewählt wurde.


Abb.
3.3 : Expression der MRP2-mRNA in den untersuchten Zellinien

Die aus den Zellinien isolierte Gesamt-mRNA wurde in einem formaldehydhaltigen Agarosegel aufgetrennt und auf Nylonmembran übertragen. Eine durch PCR generierte MRP2-Sonde (453 bp) wurde radioaktiv markiert und mit der membrangebundenen MRP2-mRNA hybridisiert. Das Ausmaß der Expression konnte durch Exposition mit einem Röntgenfilm sichtbar gemacht werden. Zur Beladungskontrolle wurde mit einer GAPDH-Sonde hybridisiert (Kap. 2.2.8 bis 2.2.13).

Dieser Unterschied konnte im Northern-Blot (Kap. 2.2.8 bis 2.2.13) für A2780RCIS und MewoRCIS bestätigt werden (Abb. 3.3). Die Länge der MRP2-mRNA im Northern-Blot betrug 5 kb. Die Expression von MRP2 in den Zellinien D43/86 und D43/86RCIS war jedoch zu niedrig, um sie mit dieser Methode beurteilen zu können. Aus diesem Grund und um die [Seite 64↓]Expression von MRP2 zu quantifizieren, wurde für alle sechs Zellinien real-time-RT-PCR durchgeführt (Kap. 2.2.15). Es wurde die cDNA hinsichtlich ihrer Molekülzahl für GAPDH und MRP2 analysiert und die Expression von MRP2 in den Zellinien auf GAPDH normalisiert. Auch diese Analyse zeigte, daß in allen drei cisplatinresistenten Zellinien MRP2 verstärkt auf mRNA-Ebene exprimiert wurde (Tab. 3.3). Der größte Unterschied ergab sich im Zellinien-Paar A2780 zu A2780RCIS. Die MRP2-Expression in den Zellinien D43/86 und D43/86RCIS war im Vergleich zu den anderen untersuchten Zellinien am niedrigsten und zeigte auch den geringsten Unterschied.

Tab. 3.3 : Real-time -RT-PCR zur Quantifizierung der MRP2-Expression in den
Zellinien.

Zellinie

MRP2-mRNA-Expression a

(normalisiert auf GAPDH)

Faktor der Überexpression (x-fach) b

A2780

0,0028

1,0

A2780RCIS

0,0556

19,9

D43/86

0,0022

1,0

D43/86RCIS

0,0032

1,5

Mewo

0,0043

1,0

MewoRCIS

0,0159

3,7

aDie Expression für GAPDH und MRP2 wurde in 3 unabhängigen Experimenten bestimmt. Es wurde der Mittelwert gebildet und die MRP2-Expression im Verhältnis zur GAPDH-Expression ausgedrückt. bDer Faktor der Überexpression bezieht sich auf die jeweilige parentale Zellinie.

Um zu überprüfen, ob auch auf Proteinebene ein Unterschied in der MRP2-Expression besteht, wurden aus den Zellinien Membranproteine isoliert und diese im Western-Blot mit einem MRP2-Antikörper analysiert (Kap. 2.2.28 bis 2.2.32). Auch hier bestätigte sich die erhöhte Expression von MRP2 in den cisplatinresistenten Zellinien (Abb. 3.4), wobei die jeweiligen Unterschiede im Northern-Blot, Western-Blot und der real-time-RT-PCR vergleichbar waren.


[Seite 65↓]

Abb. 3.4 : MRP2-Protein-Expression in den untersuchten Zellinien

Die aus den Zellinien isolierten Membranproteine wurden in einem denaturierenden SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf Nitrozellulose übertragen. Nach dem Blocken wurde die Membran gleichzeitig mit Anti-MRP2-Antikörper und Anti-Aktin-Antikörper inkubiert. Die Detektion erfolgte mit einem Chemolumineszenz-System (Kap. 2.2.28 bis 2.2.32).

MRP2 gehört zu einer Reihe von ABC-Transportern, die Konjugate mit Glutathion transportieren können. In diesem Zusammenhang spielt der Gehalt von Glutathion in der Zelle, besonders der Gehalt von reduziertem Glutathion, bei Transportprozessen eine Rolle (Kap. 1.2). Um die Möglichkeiten des Transports von Zytostatika, diskutieren zu können, wurde der Glutathion-Gehalt in den Zellinien A2780, A2780RCIS, D43/86, D43/86RCIS, Mewo und MewoRCIS bestimmt (Kap. 2.2.34). Es zeigte sich, daß die cisplatinresistenten Zellinien A2780RCIS und D43/86RCIS einen signifikant höheren Gehalt an reduziertem Glutathion aufwiesen als die parentalen Zellinien A2780 bzw. D43/86. Der Unterschied zwischen den Zellinien A2780 und A2780RCIS war für reduziertes Glutathion am größten und die Zellinie A2780 zeigte den niedrigsten Wert innerhalb der sechs untersuchten Zellinien. Die Zellinie D43/86RCIS zeigte außerdem einen signifikant höheren Wert für oxidiertes Glutathion. Die Zellinien Mewo und MewoRCIS zeigten keinen Unterschied in ihrem Glutathion-Gehalt, auch nicht innerhalb der Subgruppen.


[Seite 66↓]

Abb. 3.5 : Glutathion-Gehalt in den untersuchten Zellinien

Die Zellinien wurden ohne Zytostatikum bis zu einer Konfluenz von 80 % kultiviert und die Zellysate auf ihren Gehalt von Glutathion mit einem photometrischen Assay untersucht (Kap. 2.2.34). Die Gehalte von reduziertem (Glutathion, red.) und Gesamt-Glutathion (Glutathion, ges.) wurden experimentell in zwei unabhängigen Meßreihen zu je drei Parallelwerten bestimmt und aus der jeweiligen Differenz der Gehalt an oxidiertem Glutathion (Glutathion, ox.) errechnet. Die gezeigten Werte sind Mittelwerte aus allen sechs Einzelmessungen mit ihrer Standardabweichung.Die Signifikanz der Unterschiede zur jeweiligen parentalen Zellinie wurde mit dem Student’s T-Test, 2-seitig, überprüft (n.s. = nicht signifikant; * = P<0,05; ** = P<0,01; *** = P<0,001).

3.2 Überexpression von MRP2 in der Zellinie A2780

Nach dem Vergleich der drei verschiedenen Zellinien und ihrer cisplatinresistenten Varianten (Kap. 3.1) wurde die Ovarialkarzinomzellinie A2780 und ihre resistente Sublinie für die weiteren Untersuchungen ausgewählt, da hier sowohl das Resistenzniveau als auch die Expression von MRP2 die größten Unterschiede gezeigt hatte. Im nächsten Schritt sollte MRP2 in der sensibleren Zellinie A2780 überexprimiert werden, um nach Analyse der entstehenden Klone, den Zusammenhang zwischen MRP2-Expression und Resistenz gegenüber Cisplatin (und eventuell weiteren Zytostatika) nachweisen zu können.


[Seite 67↓]

3.2.1  Klonierung von MRP2 aus der Zellinie A2780RCIS

Aus der Zellinie A2780RCIS wurde Gesamt-RNA isoliert (Kap. 2.2.8), cDNA synthetisiert (Kap. 2.2.10 und 2.2.14) und der gesamte offene Leserahmen ( o pen r eading f rame, ORF) von MRP2 durch RT-PCR (Kap. 2.2.15) amplifiziert. Da der ORF mit ca. 4,6 kb sehr groß ist, wurde eine besondere Polymerase ausgewählt, die auch lange Bereiche amplifizieren kann und eine Korrekturlese-Aktivität besitzt. Trotzdem konnte erst durch PCR-Zusatzreagenzien, wie Betain und DMSO, ein PCR-Produkt erhalten werden (Abb. 3.6). Diese beiden Reagenzien bewirken eine Erhöhung der Ausbeute und der Spezifität für das gegebene PCR-Produkt.

Abb. 3.6 : Amplifikation des ORFs von MRP2 mittels RT-PCR aus A2780RCIS

Mittels RT-PCR wurde aus der cDNA der Zellinie A2780RCIS der ORF von MRP2 amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden auf einem Agarosegel unter Zusatz von Ethidiumbromid aufgetrennt und unter UV-Beleuchtung sichtbar gemacht (Kap. 2.2.8, 2.2.10, 2.2.14 und 2.2.16). 1 = DNA-Leiter, 2 = RT-PCR unter Zusatz von Betain und DMSO, 3 = RT-PCR ohne Betain und DMSO.

Der amplifizierte ORF von MRP2 wurde in den Expressionsvektor pcDNA3.1 kloniert, der einen CMV-Promotor enthält (Kap. 2.2.18). Dieser Vektor wurde in E. coli vermehrt (Kap. 2.2.5), die Plasmide präpariert (Kap. 2.2.6) und durch Restriktionsanalyse mit KpnI das Vorhandensein und die Orientierung des Inserts überprüft (Kap. 2.2.7). Mehrere Klone wurden komplett sequenziert (Kap.2.2.19), um nach Sequenzvergleich mit der Datenbank [Seite 68↓](Kap. 2.1.9) einen geeigneten Klon für die Transfektion in die Zellinie A2780 auszuwählen. Es zeigte sich, daß MRP2 in der Zellinie A2780RCIS, verglichen mit der Referenzsequenz NM_000392.1, an der Nukleotidposition 2046 T→C eine Mutation besitzt, die zu einem Aminosäureaustausch an der Position 670 I→T führt.

Es wurde überprüft, ob die bereits untersuchten Zellinien ebenfalls diese Mutation aufweisen. Der entsprechende Abschnitt von MRP2 wurde in den Zellinien A2780, D43/86, D43/86RCIS, Mewo und MewoRCIS ebenfalls mittels RT-PCR amplifiziert (Kap. 2.2.15). Die Produkte wurden in den prokaryotischen Vektor pCR2.1® kloniert, in E. coli vermehrt und sequenziert. Es stellte sich heraus, daß die parentale Zellinie A2780 diese Mutation ebenfalls aufweist, jedoch keine der anderen vier untersuchten Zellinien.

3.2.2 Transfektion von MRP2 in die Ovarialkarzinomzellinie A2780

Nachdem der ORF von MRP2 in einem eukaryotischen Expressionsvektor vorlag, wurde dieses Konstrukt in die sensitivere Zellinie A2780 transfiziert (Kap. 2.2.3), die im Vergleich zu ihrer resistenten Variante A2780RCIS nur wenig eigenes MRP2 besitzt (Kap. 3.1.3). Zur Kontrolle des Experiments wurde parallel dazu die A2780 mit dem Expressionsvektor ohne MRP2-ORF (Leervektor, LV) transfiziert. Nach Selektion mit G418 bildeten sich in den Zellkulturschalen Klone, von denen 36 vereinzelt und propagiert wurden. Sie wurden im Proliferationsassay gegenüber Cisplatin getestet (Kap. 2.2.33). Lediglich 2 Klone zeigten eine Resistenzerhöhung gegenüber Cisplatin (Abb. 3.7) und wurden weiter untersucht.

Diese beiden Klone wurden auch auf ihre Kreuzresistenz gegenüber Carboplatin, Etoposid, Daunorubicin und Vincristin im Proliferationsassay mittels SRB getestet. Beide Klone zeigten eine erhöhte Resistenz gegenüber Carboplatin, die sogar höher ausfiel als gegenüber Cisplatin. Gegenüber Daunorubicin und Vincristin konnte keine veränderte Sensitivität in den MRP2-Transfektanten festgestellt werden, wobei die IC50-Werte gegenüber Vincristin bei Vergleich der untersuchten Zellinien starken Schwankungen unterlagen. Ein Klon zeigte eine Erhöhung der Resistenz gegenüber Etoposid, der andere Klon verhielt sich ähnlich wie die Leervektor-Transfektante (Tab. 3.4).


[Seite 69↓]

Abb. 3.7 : Sensitivität der A2780-MRP2-Klone gegenüber Cisplatin

Alle Zellen wurden kontinuierlich 5 Tage in cisplatinhaltigen Medien unterschiedlicher Konzentration kultiviert. Die am Ende der Inkubationszeit vorhandene Zellmenge wurde durch Färbung der membranständigen Proteine mittels SRB photometrisch bestimmt (Kap. 2.2.33). Die Menge der cisplatinfrei inkubierten Zellen wurde 100 % gesetzt und die weiteren Werte in Relation zu diesem Ausgangswert berechnet. Die gezeigten Werte sind Mittelwerte mit Standardabweichung einer repräsentativen Dreifachbestimmung. Bei den Bezeichnungen A2780-MRP2.3 und A2780-MRP2.32 handelt es sich um MRP2-Transfektanten mit ihrer Klon-Nummer und bei A2780-LV handelt es sich um eine Leervektor-Transfektante. A2780 ist die untransfizierte sensible Ausgangzellinie und A2780RCIS die untransfizierte cisplatinresistente Variante zur parentalen Linie A2780.

Tab. 3.4 : IC 50 -Werte für Cisplatin, Carboplatin, Daunorubicin, Vincristin und Etoposid der A2780-MRP2-Klone.

Zelllinie

IC 50 – (Rf)

 

Cisplatin

[µM]

Carboplatin

[µM]

Daunorubicin

[nM]

Vincristin

[pM]

Etoposid

[nM]

A2780

2,6 (1,0),**

10,8 (1,0), n. s.

5,0 (1,0), n. s.

832 (1,0),**

28,5 (1,0),**

A2780RCIS

43,7 (16,8),***

233,0 (21,6), ***

19,1 (3,8),***

724 (0,9), n. s.

493,5 (17,3),***

A2780-MRP2,
Klon 3

3,2 (1,2),**

(*)

27,5 (2,5),**

5,1 (1,0), n.s.

656 (0,8), n. s.

(**)

61,3 (2,2),***

(***)

A2780-MRP2,
Klon 32

3,4 (1,3),**

(*)

62,2 (5,8),***

5,7 (1,1), n.s.

792 (1,0),*

(n. s.)

39,0 (1,4), n. s.

(n. s.)

A2780-LV

2,0 (0,8)

10,0 (0,9)

5,7 (1,1)

698 (0,8)

43,0 (1,5)

Die angegebenen IC50-Werte wurden durch nichtlineare Regression mit einem sigmoidalen Kurvenverlauf unter Nutzung des Programms GraphPad PRISM ermittelt. In Klammern ist der Resistenzfaktor Rf relativ zur parentalen Zellinie A2780 angegeben. Die Signifikanz der Unterschiede wurde mit dem Student’s T-Test, 2-seitig, überprüft (n.s. = nicht signifikant; * = P<0,05; ** = P<0,01; *** = P<0,001) und bezieht sich auf die Leervektortransfektante A2780-LV. Für den Fall, daß sich A2780 und A2780-LV signifikant unterschieden, wurden das Signifikanzniveau im Vergleich zur Zellinie A2780 in Klammern angegeben.


[Seite 70↓]

Aus den beiden MRP2-Klonen und der Leervektor-Transfektante wurde Gesamt-mRNA (Kap. 2.2.8) isoliert, cDNA synthetisiert (Kap. 2.2.10 und 2.2.14) und die Expression von MRP2 im Vergleich zu GAPDH mittels real-time-RT-PCR quantifiziert (Kap. 2.2.15). Die beiden Klone zeigten eine 4- bzw. 7-fache Erhöhung der MRP2-Expression im Vergleich zur untransfizierten Zellinie A2780 (Tab. 3.5).

Tab. 3.5 : Real-time -RT-PCR zur Quantifizierung der MRP2-Expression in den A2780-MRP2-Klonen.

Zellinie

MRP2-mRNA-Expression

(normalisiert auf GAPDH) a

Faktor der Überexpression (x-fach) b

A2780

0,0028

1,0

A2780RCIS

0,0556

19,9

A2780-MRP2, Klon 3

0,0117

4,2

A2780-MRP2, Klon 32

0,0197

7,0

A2780-LV

0,0027

1,0

aDie Expression für GAPDH und MRP2 wurde in 3 unabhängigen Experimenten bestimmt. Es wurde der Mittelwert gebildet und die MRP2-Expression im Verhältnis zur GAPDH-Expression ausgedrückt. bDer Faktor der Überexpression bezieht sich auf die parentale Zellinie A2780.

Es sollte untersucht werden, ob und wie sich die MRP2-Transfektanten hinsichtlich ihres Verhaltens gegenüber Cisplatin von der Ausgangslinie A2780 unterscheiden. Die Zellen wurden mit 25 µM Cisplatin kontinuierlich über mehrer Tage behandelt und die adhärenten Zellen nach verschiedenen Zeitpunkten geerntet. Nach Färbung mit Propidiumiodid und Messung der Zellen im Durchflußzytometer wurde der Anteil der Zellen in bestimmten Zellzyklusphasen prozentual im Vergleich zu allen im Zellzyklus befindlichen Zellen bestimmt (Kap. 2.2.36 und Abb. 3.8). In unbehandelten Zellen befanden sich die meisten Zellen in der G1-Phase. Im zeitlichen Verlauf unter Cisplatin-Behandlung nahm in den A2780 der Anteil der Zellen in der G1-Phase ab. Die Zellen befanden sich vermehrt in der S- und der G2-Phase. Außerdem wurden sehr viele tote Zellen im Zellkulturüberstand festgestellt, die nicht in diese Untersuchung einbezogen wurden. Im Vergleich dazu reagierte die cisplatinresistente Zellinie A2780RCIS nach 24 h mit einer verstärkten S-Phase. Danach normalisierte sich der Zellzyklus bis zum 3. Tag nach Behandlungsbeginn, obwohl das Zellkulturmedium weiterhin Cisplatin enthielt. Tote Zellen im Zellkulturüberstand wurden kaum beobachtet.


[Seite 71↓]

Abb. 3.8 : Zellzyklusanalysen in den A2780-MRP2-Klonen

Die Zellen wurden kontinuierlich mit 25 µM Cisplatin behandelt und nach unterschiedlichen Zeitpunkten geerntet. Nach Färbung mit Propidiumiodid wurden die Zellen im Durchflußzytometer hinsichtlich ihres DNA-Gehalt vermessen und aus dem Profil der prozentuale Anteil der Zellen an den Zellzyklusphasen G1, S und G2 bestimmt (Kap. 2.2.36). Bei den Bezeichnungen A2780-MRP2.3 und A2780-MRP2.32 handelt es sich um MRP2-Transfektanten mit ihrer Klon-Nummer und bei A2780-LV handelt es sich um eine Leervektor-Transfektante. A2780 ist die untransfizierte sensible Ausgangzellinie und A2780RCIS die untransfizierte cisplatinresistente Variante zur parentalen Linie A2780.


[Seite 72↓]

Die MRP2-Transfektanten zeigten unter Cisplatinbehandlung eine Verteilung der Zellzyklus-Phasen, die zwischen der für die Zellinien A2780 und A2780RCIS lag. Die Transfektanten arretierten hauptsächlich in der G2-Phase und starben nicht so stark ab wie die Zellinie A2780. Die Leervektor-Transfektante verhielt sich vergleichbar zur untransfizierten Zellinie.

Im Folgenden sollte untersucht werden, ob sich die MRP2-Transfektanten in bezug auf ihr Apoptoseverhalten unterscheiden. Da sich in den Zellen im Agarosegel und nach Analyse mittels Durchflußzytometrie nach Cisplatin-Behandlung keine typische DNA-Fragmentierung nachweisen ließ (Daten nicht gezeigt), die Zellen jedoch nach Cisplatin-Behandlung (je nach Dosis) abstarben, stellte sich die Frage, wie in der Zellinie A2780 Apoptose ausgelöst wird bzw. ob sich die Klone im Ausmaß der Apoptose-Induktion unterscheiden. Die Zellinien A2780 und A2780RCIS, sowie eine MRP2-Transfektante und eine Leervektor-Transfektante wurden mit unterschiedlichen Cisplatin-Konzentrationen für 24 h behandelt und die hergestellten Zellysate auf ihre Caspase-3-Aktivität untersucht (Kap. 2.2.35).

Abb. 3.9 : Caspase-3-Aktivität nach Cisplatinbehandlung in den MRP2-Klonen.

Die Zellen wurden 24 h mit Cisplatin behandelt. In den Zellysaten wurde die Caspase-3-Aktivität bestimmt (Kap. 2.2.35). Die Aktivitäten wurden auf die unbehandelte parentale Zellinie A2780 normiert. Bei A2780-MRP2.3 handelt es sich um MRP2-Transfektante mit ihrer Klon-Nummer und bei A2780-LV handelt es sich um eine Leervektor-Transfektante. A2780 ist die untransfizierte sensible Ausgangzellinie und A2780RCIS die untransfizierte cisplatinresistente Variante zur parentalen Linie A2780. Die Signifikanz der Unterschiede wurde mit dem Student’s T-Test, 2-seitig, überprüft (n.s. = nicht signifikant; * = P<0,05; ** = P<0,01; *** = P<0,001) und bezieht sich auf die Ausgangszellinie A2780.


[Seite 73↓]

Die gefundenen Caspase-3-Aktivitäten wurden auf die geringe Grundaktivität in der Zellinie A2780 ohne Cisplatin-Behandlung normalisiert und miteinander verglichen (Abb. 3.9). Bei steigender Cisplatin-Konzentration im Zellkulturmedium stieg die Caspase-3-Aktivität an, was auf ein vermehrtes Auslösen von apoptotischen Ereignissen schließen läßt. Die MRP2-Transfektante zeigte weniger Caspase-3-Aktivität im Vergleich zur untransfizierten Ausgangslinie A2780 (P<0,05). Die geringste Caspase-3-Aktivität zeigte die cisplatinresistente Zellinie A2780RCIS. Die Leervektortransfektante zeigte im Vergleich zur untransfizierten A2780 mehr Aktivität bei 25 µM, was vermutlich auf einen klonalen Effekt zurückzuführen ist. Bei 100 µM gab es jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen der Leervektortransfektante und der Ausgangszellinie.

3.3 Entwicklung und Applikation von Ribozymen gegen die MRP2-mRNA in vitro

3.3.1 Auswahl potentieller Ribozymschnittstellen

In den vorangegangenen Experimenten (Kap. 3.1 und 3.2) zeigte sich bereits ein Zusammenhang zwischen MRP2-Expression und der Resistenz gegenüber Cisplatin und Carboplatin. Im Folgenden sollte untersucht werden, ob sich die Resistenz gegenüber diesen Zytostatika durch den Einsatz von Anti-MRP2- Hammerhead-Ribozymen verringern läßt.

Mit Hilfe der Computerprogramme DNASIS und mFOLD wurden Teilabschnitte der MRP2-mRNA auf Sekundärstruktur und die Lage der Zielsequenz 5’-GUC-3’ untersucht. Als potentielle Schnittstellen wurden diejenigen GUC-Motive betrachtet, die sich in einzelsträngigen Bereichen der berechneten Sekundärstrukturen mit der niedrigsten freien Energie ΔG befanden (Kap. 2.2.20). Die Faltungsanalysen wurden mit Nukleotidsequenzen der MRP2-mRNA von 200 bzw. 233 nt Länge durchgeführt, die im weiteren als Substrate für die in vitro-Untersuchungen verwendet werden sollten (Abb. 3.10). Für die folgenden Untersuchungen wurden Schnittstellen für zwei Anti-MRP2-Ribozyme, RzM1 und RzM2, ausgewählt. Die Struktur der Hammerhead-Ribozyme mit ihren Bindungssequenzen in der MRP2-mRNA ist in Abb. 3.11 dargestellt.


[Seite 74↓]

Abb. 3.10 : Sekundärstruktur von einem Auschnitt der MRP2-mRNA

Die Posititionen der 5’-GUC-3’-Tripletts als Schnittstellen für die Anti-MRP2-Ribozyme RzM1 und RzM2 sind gekennzeichnet. Die Numerierung der Nukleotide bezieht sich auf die Nukleotidnummer innerhalb des Substrates 2 mit 233 nt Länge (Nukleotid: +2014 bis +2246 in der Referenzsequenz NM_000392.1 für MRP2 bezogen auf das Startcodon).

Abb. 3.11 : S equenzen der Anti-MRP2- Hammerhead -Ribozyme RzM1 und RzM2

Die Basenpaarinteraktionen zwischen den Hammerhead-Ribozymen und der MRP2-mRNA sind angegeben. Die Numerierung der Nukleotide bezieht sich auf die Referenzsequenz NM_000392.1. Die Pfeile geben die potentiellen Schnittstellen in der mRNA an.


[Seite 75↓]

3.3.2  Ribozymatische Spaltung von Fragmenten der MRP2-mRNA durch die Ribozyme RzM1 und RzM2

Die Matrizen für die Substrate sub1 und sub2 wurden mittels PCR hergestellt (Kap. 2.2.15), die sich nur durch ihre Länge am 3’-Ende unterscheiden (200 nt bzw. 233 nt ohne T7-Promotor-Sequenz). Für die Ribozyme wurden die T7-Promotor-enthaltenden Oligonukleotide RcMAT7-fw und RcMAT7-rev (für RzM1) sowie RcMBT7-fw und RcMBT7-rev (für RzM2) hybridisiert. Die Substrate und die Ribozyme wurden in vitro-transkribiert, nach PAGE aus dem Gel aufgereinigt und die entstandenen Stoffmengen quantifiziert (Kap. 2.2.21 bis 2.2.25), um in den folgenden Versuchen defininierte Mengen einsetzen zu können.

Abb. 3.12 : Spaltung der Substrate sub1 und sub2 durch die Hammerhead -Ribozyme RzM1 und RzM2

Es wurden im in vitro-Schnittversuch äquimolare Mengen von radioaktiv markierter Ribozym- und Substrat-RNA eingesetzt (je 200 nM). Nach der Spaltung (2 h, 37 °C, Kap. 2.2.26) wurden die RNAs durch PAGE (Kap. 2.2.23) aufgetrennt und durch Exposition auf Röntgenfilm sichtbar gemacht. 1 = sub1 + RzM1, Spaltprodukte 99 und 101 nt; 2 = sub2 + RzM1, Spaltprodukte 99 und 134 nt; 3 = sub1 + RzM2, Spaltprodukte 110 und 90 nt; 4 = sub2 + RzM2, Spaltprodukte 110 und 123 nt.


[Seite 76↓]

Äquimolare Mengen von einem gegebenen Substrat und jeweils einem Ribozym wurden 2 h bei 37 °C inkubiert (je 200 nM, Kap. 2.2.26). Die Spaltungseffizienzen konnten nach Auftrennung in einem Polyacrylamidgel und Exposition auf Röntgenfilm beurteilt werden (Kap. 2.2.23). Es stellte sich heraus, daß beide Ribozyme in der Lage sind, die verkürzten MRP2-mRNA-Substrate sub1 und sub2 mit guter Effizienz zu spalten (Abb. 3.12).

3.3.3  Charakterisierung der Ribozyme RzM1 und RzM2 in vitro

Um die Eigenschaften der Spaltung durch die Ribozyme RzM1 und RzM2 näher zu untersuchen und mit anderen Ribozymen aus der Fachliteratur vergleichen zu können, wurden mit Hilfe kinetischer Analysen die Initialgeschwindigkeit vini, sowie die Reaktionsparameter kcat/kM und kobs (nach Heidenreich & Eckstein, 1992; Heidenreich et al., 1994 und Hendry et al., 1995) bestimmt. Aufgrund der besseren Unterscheidbarkeit der Spaltprodukte im Polyacrylamidgel (Abb. 3.12) wurden die Spaltversuche für RzM1 durch Inkubation mit Substrat 2 und für RzM2 durch Inkubation mit Substrat 1 durchgeführt.

Es wurde eine zeitabhängige Reaktionskinetik aufgenommen, wobei das jeweilige Ribozym in einem Überschuß in einem Verhältnis von 5:1 eingesetzt wurde (Kap. 2.2.26). Die Spaltungen wurden nach unterschiedlichen Zeitpunkten abgestoppt, die Reaktionsprodukte mittels PAGE aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht (Abb. 3.13, Kap. 2.2.23). Die Bandenintensitäten wurden densitometrisch ausgemessen und für die Erstellung der kinetischen Kurven genutzt. Die Initialgeschwindigkeit vini wurde aus dem jeweiligen Anstieg im angenommenen linearen Anfangsbereich der Produktbildung in Abhängigkeit von der Zeit errechnet (Abb. 3.14, Kap. 2.2.27). Aus der Abb. 3.13 ist ersichtlich, daß auch nach fünf Stunden maximal beobachteter Reaktionszeit das Substrat nicht vollständig umgesetzt wurde und sich ein Gleichgewicht bei ca. 80 % einstellt. Dies trifft gleichermaßen auf die Ribozyme RzM1 und RzM2 zu. Die Initialgeschwindigkeit vini beträgt für Ribozym RzM1 0,127 ± 0,006 fmol/s und für Ribozym RzM2 0,086 ± 0,005 fmol/s (Materna et al., 2001). RzM1 zeigte in diesem Vergleich mit RzM2 die höhere Initialgeschwindigkeit.


[Seite 77↓]

Abb. 3.13 : Zeitabhängigkeit der Spaltung durch RzM1 und RzM2

Die Ribozyme wurden mit ihren Substraten im Verhältnis 5:1 inkubiert (Kap. 2.2.26). Nach verschiedenen Zeiten wurde die Reaktion abgestoppt, die Produkte mittels PAGE aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht (Kap. 2.2.23). 1 = Ribozym; 2 = Substrat; 3 bis 15 = Ribozym + Substrat; 3 = 0 min; 4 = 0,5 min; 5 = 1 min; 6 = 2 min; 7 = 3 min; 8 = 5 min; 9 = 10 min; 10 = 20 min; 11 = 30 min; 12 = 60 min; 13 = 120 min; 14 = 180 min; 15 = 300 min; a) Reaktion von Ribozym RzM1 (38 nt) mit Substrat 2 (233 nt), Größe der Spaltprodukte 99 und 134 nt; b) Reaktion von Ribozym RzM2 (38 nt) mit Substrat 1 (200 nt), Größe der Spaltprodukte 110 und 90 nt.

Um die Reaktionsparameter kcat/kM (nach Heidenreich & Eckstein, 1992; nach Hendry et al., 1995) zu bestimmen, wurden für die beiden Ribozyme RzM1 und RzM2 konzentrationsabhängige Kinetiken durchgeführt. Das jeweilige Substrat wurde in der gleichen Konzentration eingesetzt und die Ribozymkonzentration variierte in jedem Ansatz (Kap. 2.2.26). Nach einer Inkubationszeit von 15 min wurde die Reaktion abgestoppt, die Produkte mittels PAGE aufgetrennt und durch Exposition auf Röntgenfilm sichtbar gemacht (Abb. 3.15, Kap. 2.2.23). Die Röntgenfilme wurden densitometrisch ausgewertet und die Werte nach den Berechnungen von Heidenreich & Eckstein (1992) bzw. nach Hendry et al. (1995) graphisch aufgetragen. Aus dem jeweiligen Anstieg des angenommenen linearen Bereichs zu Beginn der konzentrationsabhängigen Kinetiken wurden die Parameter kcat/kM berechnet (Abb. 3.16, Kap. 2.2.27).


[Seite 78↓]

Abb. 3.14 : Produkt-Zeit-Diagramm zur Bestimmung der Initialgeschwindigkeit v ini

Die Autoradiographien der Zeitkinetiken (Abb. 3.13) wurden densitometrisch ausgemessen und die Produktbildung in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen mit ihren Standardabweichungen. Die verkleinerten Abbildungen stellen einen Ausschnitt aus dem Anfangsbereich der Zeitkinetik dar. Der Anstieg in diesem angenommenen linearen Bereich diente zur Berechnung von vini (Kap. 2.2.27). a) Reaktion von Ribozym RzM1 mit Substrat 2 (vini = 0,127 ± 0,006 fmol/s); b) Reaktion von Ribozym RzM2 mit Substrat 1 (vini = 0,086 ± 0,005 fmol/s).


[Seite 79↓]

Abb. 3.15 : Abhängigkeit der Spaltung von der Konzentration der Ribozyme

Die Substrate (40 nM) wurden mit ihren Ribozymen in verschiedenen Verhältnissen inkubiert (Kap. 2.2.26). Nach 15 min wurden die Reaktionen abgestoppt, die Produkte mittels PAGE aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht (Kap. 2.2.23). 1 = Ribozym; 2 = Substrat; 3 bis 15 = Ribozym + Substrat; 3 = 80 nM Ribozym, 0 min; 4 = 20 nM Ribozym; 5 = 40 nM Ribozym; 6 = 80 nM Ribozym; 7 = 120 nM Ribozym; 8 = 200 nM Ribozym; 9 = 300 nM Ribozym; 10 = 400 nM Ribozym; a) Reaktion von Ribozym RzM1 (38 nt) mit Substrat 2 (233 nt), Größe der Spaltprodukte 99 und 134 nt; b) Reaktion von Ribozym RzM2 (38 nt) mit Substrat 1 (200 nt), Größe der Spaltprodukte 110 und 90 nt.

Der Unterschied zwischen den beiden Berechnungsarten besteht darin, daß Heidenreich & Eckstein (1992) das eingesetzte Substrat als Maß in die Berechnung einfließen lassen, Hendry et al. (1995) dagegen berücksichtigen, daß nicht das gesamte Substrat abgebaut wird. Aus diesem Grund sind die kcat/kM-Werte nach Hendry et al. (1995) der Ribozyme RzM1 und RzM2 (9307 bzw. 4478 M-1 s-1; Materna et al., 2001) höher als die dazugehörigen kcat/KM-Werte (7719 bzw. 3671 M-1 s-1; Materna et al., 2001) nach Heidenreich & Eckstein (1992). Ein höherer kcat/kM-Wert macht deutlich, daß für den tatsächlich schneidbaren Anteil eingesetzten Substrates der katalytische Stoffumsatz kcat größer und/oder die Dissoziationskonstante kM kleiner als für das insgesamt eingesetzte Substrat ist. Als weiterer katalytischer Parameter wurde kobs aus den zeitabhängigen Kinetiken bestimmt (Kap. 2.2.27 und Abb. 3.17), wobei ebenfalls unterschieden wurde, ob das gesamte eingesetzte Substrat als abbaubar gilt (Heidenreich et al., 1994) oder nicht (Hendry et al., 1995). Die kobs-Werte [Seite 80↓]betragen je nach Berechnungsmethode für Ribozym RzM1 7,66·10-4bzw. 8,73·10-4 s-1 und für Ribozym RzM2 4,81·10-4 bzw. 5,79·10-4 s-1 (Materna et al., 2001).

Abb. 3.16 : Bestimmung des Parameters k cat /k M

Die Autoradiographien der konzentrationsabhängigen Kinetiken (Abb. 3.15) wurden densitometrisch ausgemessen. Entsprechend der Berechnung nach Heidenreich & Eckstein (1992) bzw. nach Hendry et al. (1995) wurde der negative Logarithmus des relativen Anteils des ungeschnittenen Substrats pro Zeit in Abhängigkeit von der Konzentration des Ribozyms aufgetragen. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen mit ihren Standardabweichungen. Die verkleinerte Abbildung stellt einen Ausschnitt aus dem Anfangsbereich der konzentrationsabhängigen Kinetik dar. In diesem Bereich ist der Zusammenhang näherungsweise linear und der Anstieg diente zur Berechnung von kcat/kM (Kap. 2.2.27). a) und b) nach Heidenreich & Eckstein (1992); c) und d) nach Hendry et al. (1995); a) Reaktion von RzM1 mit sub2 (kcat/kM = 7719 ± 284 M-1 s-1); b) Reaktion von RzM2 mit sub1 (kcat/kM = 3671 ± 78 M-1 s-1); c) Reaktion von RzM1 mit sub2 (kcat/kM = 9307 ± 312 M-1 s-1); d) Reaktion von RzM2 mit sub1 (kcat/kM = 4478 ± 105 M-1 s-1).

[Seite 81↓]

Abb. 3.17 : Bestimmung des Parameters k obs

Die Autoradiographien der zeitabhängigen Kinetiken (Abb. 3.13) wurden densitometrisch ausgemessen. Entsprechend der Berechnung nach Heidenreich et al. (1994) bzw. nach Hendry et al. (1995) wurde der negative Logarithmus des relativen Anteils des ungeschnittenen Substrats in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen mit ihren Standardabweichungen. Die verkleinerte Abbildung stellt einen Ausschnitt aus dem Anfangsbereich der konzentrationsabhängigen Kinetik dar. In diesem Bereich ist der Zusammenhang näherungsweise linear und der Anstieg diente zur Berechnung von kobs (Kap. 2.2.27). a) und b) nach Heidenreich et al. (1994); c) und d) nach Hendry et al. (1995); a) Reaktion von RzM1 mit sub2 (kobs = 7,66·10-4± 0,29·10-4 s-1); b) Reaktion von RzM2 mit sub1 (kobs = 4,81·10-4± 0,23·10-4 s-1); c) Reaktion von RzM1 mit sub2 (kobs = 8,73·10-4± 0,33·10-4 s-1); d) Reaktion von RzM2 mit sub1 (kobs = 5,79·10-4± 0,27·10-4 s-1).


[Seite 82↓]

3.4  Inhibition von MRP2 in der Zellinie A2780RCIS durch RzM1 und RzM2

Die Ergebnisse aus den in vitro-Untersuchungen der Hammerhead-Ribozyme RzM1 und RzM2 (Kap. 3.3) haben gezeigt, daß beide Ribozyme in der Lage sind, in MRP2-Substraten im zellfreien System zu schneiden. Beide Ribozyme sind dabei ähnlich aktiv, wobei die katalytischen Parameter für RzM1 höher waren als für RzM2. Im Folgenden sollte die Wirksamkeit dieser Ribozyme in eukaryotischen Zellen getestet werden.

3.4.1 Klonierung der Ribozyme und Transfektion in die Zellinie A2780RCIS

Als Modell wurde die humane Ovarialkarzinomzellinie A2780RCIS ausgewählt, da diese bereits in den Resistenz- und Expressionsanalysen (Kap. 3.1) den größten Unterschied in bezug auf Cisplatinresistenz und MRP2-Expression im Vergleich zu ihrer parentalen Zellinie A2780 gezeigt hatte. Die Ribozyme RzM1 und RzM2 wurden in den eukaryotischen Expressionsvektor pcDNA3.0 kloniert. Zusätzlich zu den funktionell aktiven Ribozymen, wurden auch katalytisch inaktive Punktmutanten zu RzM1 und RzM2 kloniert. Das für die Funktion wichtige Adenin A14 in der Hammerhead-Struktur des Ribozyms (Abb. 1.8) wurde durch ein Cytosin ersetzt. Die Oligonukleotide RibcMA-fw/rev (für RzM1), RibcMB-fw/rev (für RzM2), PMRibcMA-fw/rev (für RzM1/mut) und PMRibcMB-fw/rev (für RzM2/mut) wurden hybridisiert (Kap. 2.2.21) und gerichtet in den Expressionsvektor zwischen die Restriktionstellen KpnI/XbaI kloniert (Kap. 2.2.7. und 2.2.18). Die Plasmide wurden in E. coli vermehrt (Kap. 2.2.5 und 2.2.6) und zur Kontrolle der korrekten Sequenz und Orientierung sequenziert (Kap. 2.2.19). Die Zellinie A2780RCIS wurde mit RzM1, RzM2, RzM1/mut, RzM2/mut im Expressionsvektor oder dem unveränderten Expressionsvektor pcDNA3.0 transfiziert (Kap. 2.2.3). Nach der Selektion mit G418 wurden für RzM1 und RzM2 je 36 Klone, für RzM1/mut, RzM2/mut je 12 und den Leervektor (LV) 18 Klone vereinzelt und propagiert.

3.4.2 Resistenzverhalten in den A2780RCIS-Ribozym-Transfektanten

Die durch Transfektion erhaltenen Klone (Kap. 3.4.1) wurden im Proliferationsassay gegenüber Cisplatin getestet (Kap. 2.2.33). Für Ribozym RzM1 wurden 5 Klone und für Ribozym RzM2 6 Klone mit verändertem IC50-Wert gegenüber Cisplatin gefunden (Beispiele [Seite 83↓]in Abb. 3.18). Diese Klone waren im Vergleich zur Ausgangslinie A2780RCIS sensibler und zeigten eine Verringerung der IC50 um 43 bis 63 Prozent gegenüber Cisplatin. Keiner der Leervektortransfektanten zeigte eine Veränderung gegenüber Cisplatin in diesem Assay. Bei den Klonen mit den katalytisch inaktiven Ribozymen zeigten einzelne Klone ebenfalls eine Sensibilisierung. Daher wurde je ein Effekt-Klon von RzM1/mut und RzM2/mut in den folgenden Untersuchungen mitgeführt.

Abb. 3.18 : Se nsitivität der A2780RCIS-RzM-Klone gegenüber Cisplatin

Alle Zellen wurden kontinuierlich 5 Tage in cisplatinhaltigen Medien unterschiedlicher Konzentration kultiviert. Die am Ende der Inkubationszeit vorhandene Zellmenge wurde durch Färbung der membranständigen Proteine mittels SRB photometrisch bestimmt (Kap. 2.2.33). Die Menge der cisplatinfrei inkubierten Zellen wurde 100 % gesetzt und die weiteren Werte in Relation zu diesem Ausgangswert berechnet. Die gezeigten Werte sind Mittelwerte mit Standardabweichungen einer repräsentativen Dreifachbestimmung. A2780 ist die untransfizierte sensible Ausgangslinie und A2780RCIS die untransfizierte cisplatinresistente Variante zur parentalen Line A2780. Die anderen untersuchten Zellinien sind Transfektanten der Zellinie A2780RCIS: mit Anti-MRP2-Ribozym (a) RzM1 oder (b) RzM2, mit Leervektor (LV) oder mit mutiertem Ribozym (RzM1/mut oder RzM2/mut).


[Seite 84↓]

Tab. 3.6 : IC 50 -Werte für Cisplatin, Carboplatin, Daunorubicin, Vincristin und Etoposid der A2780RCIS-RzM-Klone.

 

Zellinie

IC50 – (Rf)

Cisplatin

[µM]

Carboplatin

[µM]

Daunorubicin

[nM]

Etoposid

[nM]

Vincristin

[pM]

A2780

2,6 (1,0)

***

10,8 (1,0)

***

5,0 (1,0)

***

28,5 (1,0)

***

832 (1,0)

n.s.

A2780RCIS

43,7 (16,8)

n.s.

233,0 (21,6)

n.s.

19,1 (3,8)

n.s.

493,5 (17,3)

n.s.

724 (0,9)

n.s.

A2780RCIS-RzM1, Klon 12

16,1(6,2)

***

203,5 (18,8)

n.s.

14,9 (3,0)

n.s.

210,7 (7,4)

*

737 (0,9)

n.s.

A2780RCIS-RzM1, Klon 13

32,1 (12,3)

*

139,2 (12,9)

**

14,6 (2,9)

n.s.

189,2 (6,6)

**

841 (1,0)

n.s.

A2780RCIS-RzM1, Klon 14

18,3 (7,0)

***

181,7 (16,8)

n.s.

13,2 (2,6)

*

328,3 (11,5)

n.s.

837 (1,0)

n.s.

A2780RCIS-RzM1, Klon 22

24,1 (9,2)

**

90,4 (8,4)

***

14,8 (3,0)

n.s.

134,7 (4,7)

**

902 (1,1)

n.s.

A2780RCIS-RzM1, Klon 34

19,0 (7,3)

***

155,3 (14,4)

n.s.

12,9 (2,6)

n.s.

86,7 (3,0)

**

493 (0,6)

**

A2780RCIS-RzM2, Klon 9

20,3 (7,8)

***

126,2 (11,7)

**

9,7 (1,9)

**

145,5 (5,1)

**

871 (1,0)

n.s.

A2780RCIS-RzM2, Klon 12

23,2 (8,9)

**

190,1 (17,6)

n.s.

16,6 (3,3)

n.s.

391,9 (13,7)

n.s.

340 (0,4)

***

A2780RCIS-RzM2, Klon 27

21,7 (8,3)

***

136,3 (12,6)

**

12,6 (2,5)

*

222,5 (7,8)

*

423 (0,5)

***

A2780RCIS-RzM2, Klon 29

24,5 (9,4)

***

98,5 (9,1)

**

13,7 (2,7)

n.s.

139,6 (4,9)

**

294 (0,4)

***

A2780RCIS-RzM2, Klon 35

17,9 (6,2)

***

174,5 (16,2)

n.s.

11,1 (2,2)

**

109,3 (3,8)

**

300 (0,4)

***

A2780RCIS-RzM2, Klon 36

24,9 (9,6)

**

242,3 (22,4)

n.s.

12,4 (2,5)

*

238,9 (8,4)

*

445 (0,5)

***

A2780RCIS-RzM1/mut, Klon 5

25,4 (9,8)

***

141,2 (13,1)

**

10,3 (2,1)

**

251,7 (8,8)

*

998 (1,2)

**

A2780RCIS-RzM2/mut, Klon 12

27,1 (10,4)

**

72,5 (6,7)

***

17,7 (3,5)

n.s.

220,7 (7,7)

*

399 (0,5)

***

A2780RCIS-LV, Klon 7

36,7 (14,1)

n.s.

205,9 (19,1)

n.s.

18,2 (3,6)

#

548,7 (19,3)

#

666 (0,8)

*

A2780RCIS-LV, Klon 13

40,4 (15,4)

#

207,7 (19,2)

#

n. a.

n. a.

778 (0,9)

#

A2780RCIS-LV, Klon 14

45.6 (17.5)

n.s.

267.9 (24.8)

n.s.

n. a.

n. a.

643 (0.8)

**

n. a. = nicht analysiert. Die angegebenen IC50-Werte wurden durch nichtlineare Regression mit einem sigmoidalen Kurvenverlauf unter Nutzung des Programms GraphPad PRISM ermittelt. In Klammern ist der Resistenzfaktor Rf relativ zur Zellinie A2780 angegeben. Die Signifikanz der Unterschiede wurde mit dem Student’s T-Test, 2-seitig, überprüft (n.s. = nicht signifikant; * = P<0,05; ** = P<0,01; *** = P<0,001) und bezieht sich auf eine mit # gekennzeichnete Leervektortransfektante.

Die ausgewählten Klone wurden auf ihr Kreuzresistenzmuster gegenüber den Zytostatika Carboplatin, Etoposid, Daunorubicin und Vincristin im Proliferationsassay mittels SRB getestet. Die Transfektanten für die Ribozyme RzM1 und RzM2 zeigten ebenfalls eine [Seite 85↓]Resensitivierung gegenüber Carboplatin (Ausnahme: A2780RCIS-RzM2, Klon 36).Die IC50 verringerte sich hierbei um 13 bis 61 Prozent. Die Klone waren ebenfalls sensibler gegenüber Daunorubicin und Etoposid.Die IC50-Werte verringerten sich hier um 13 bis 50 bzw. 21 bis 83 Prozent. Die Verringerungen der IC50 gegenüber Carbpoplatin, Daunorubicin und Etoposid waren jedoch nicht in allen Fällen statistisch signifikant (Tab. 3.6).

Bei Behandlung mit Vincristin zeigte die Hälfte der Transfektanten eine sensitiveres Verhalten mit einer Halbierung der IC50. Diesen Unterschied gibt es aber nicht bei Vergleich der parentalen sensiblen Zellinie A2780 und ihrer cisplatinresistenten Variante A2780RCIS. Deswegen ist davon auszugehen, daß dieser Effekt nicht von der Expressionshöhe von MRP2 abhängt.

Die Leervektortransfektanten zeigten in Resistenzbestimmungen gegenüber Carboplatin, Daunorubicin, Vincristin und Etoposid keine Veränderungen im Vergleich zur untransfizierten Ausgangslinie A2780RCIS. Die Klone, die mit einem katalytisch inaktivem Ribozym transfiziert wurden, zeigten ähnliche Effekte wie die Transfektanten mit den Ribozymen RzM1 und RzM2. Die Ergebnisse dieser Kreuzresistenzuntersuchungen sind in der Tabelle 3.6 zusammengefaßt.

3.4.3 MRP2-Expression in den A2780RCIS-Ribozym-Transfektanten

Es wurde zunächst überprüft, ob die Transfektanten wirklich den Expressionsvektor enthalten und das Ribozym exprimieren. Zu diesem Zweck wurde Gesamt-RNA aus den Klonen isoliert (Kap. 2.2.8), cDNA synthetisiert (Kap. 2.2.10 und 2.2.14) und RT-PCR mit den Primern vector-fw/rev durchgeführt, welche im Expressionsvektor binden (Kap. 2.2.15). Das PCR-Produkt enthielt somit Teile des Vektors und die Ribozym-Sequenz. Da das Ribozym gerichtet zwischen die Restriktionsschnittstellen für KpnI und XbaI kloniert wurde, und der dafür entfernte Vektorbereich länger war als die inserierte Ribozym-Sequenz, ist das PCR-Produkt aus den Leervektortransfektanten größer als aus den Ribozym-Transfektanten. Alle untersuchten Klone enthielten den Expressionsvektor. Das Ergebnis für die Transfektanten von RzM2 in A2780RCIS ist in der Abbildung 3.19 dargestellt.


[Seite 86↓]


Abb. 3.19 : Insertkontrolle mittels RT-PCR der Transfektanten A2780RCIS-RzM2

Die Expression des Ribozyms RzM2 wurde nach Transfektion in A2780RCIS mittels RT-PCR überprüft (Kap. 2.2.15). Die Amplifikation erfolgte mit den Primern vector-fw/rev, welche im Vektor pcDNA3.0 binden. Zur Kontrolle der cDNA-Synthese wurde eine RT-PCR für GAPDH durchgeführt. Zu den unterschiedlichen PCR-Produktlängen siehe Text.

Mittels Northern-Blot sollte untersucht werden, ob sich die Expression der MRP2-mRNA in den Transfektanten für die Anti-MRP2-Ribozyme RzM1 und RzM2 verändert d. h. vermindert hat (Kap. 2.2.8 bis 2.2.13). Es zeigte sich, daß die Expression der MRP2-mRNA in allen Klonen mit funktionsfähigem Ribozym im Vergleich zu der untransfizierten cisplatinresistenten Zellinie A2780RCIS und den Leervektortransfektanten geringer war. Die meisten dieser Ribozym-Transfektanten wiesen eine MRP2-mRNA-Expression auf, die mit der in der cisplatinsensitiven parentalen Zellinie A2780 vergleichbar war (Abb. 3.20). Die Klone, die mit katalytisch inaktivem Ribozym transfiziert wurden, zeigten eine ähnliche Expression von MRP2-mRNA wie die Zellinie A2780RCIS und die Leervektortransfektanten.


[Seite 87↓]

Abb. 3.20 : Expression der MRP2-mRNA in den A2780RCIS-RzM-Klonen

Die aus den Zellinien isolierte Gesamt-mRNA wurde in einem formaldehydhaltigen Agarosegel aufgetrennt und auf Nylonmembran übertragen. Eine durch RT-PCR generierte MRP2-Sonde (453 bp) wurde radioaktiv markiert und mit der membrangebundenen MRP2-mRNA hybridisiert. Das Ausmaß der Expression wurde durch Exposition mit einem Röntgenfilm sichtbar gemacht. Zur Kontrolle der Beladung wurde mit einer GAPDH-Sonde hybridisiert (Kap. 2.2.8 bis 2.2.13).


[Seite 88↓]

Um die Expression von MRP2 zu quantifizieren, wurde für die Transfektanten real-time-RT-PCR durchgeführt (Kap. 2.2.15). Die cDNAs wurden hinsichtlich ihrer Molekülzahlen für MRP2 und GAPDH analysiert und die Expression von MRP2 auf GAPDH normalisiert. Auch diese Bestimmungen zeigten, daß die MRP2-mRNA-Menge in den Transfektanten für die Ribozyme RzM1 und RzM2 geringer war als in der Ausgangszellinie A2780RCIS und den Leervektortransfektanten. Wie auch schon in der Northern-Blot-Analyse festgestellt werden konnte, wurde in einigen Klonen die MRP2-mRNA auf das Level der sensiblen parentalen Zellinie A2780 gesenkt (Tab. 3.7). Im Gegensatz zum Northern-Blot wurde hier allerdings deutlich, daß auch das Level der MRP2-mRNA in den Transfektanten mit katalytisch

Tab. 3.7 : Real-time -RT-PCR zur Quantifizierung der MRP2-Expression in den A2780RCIS-RzM-Klonen.

Zellinie

MRP2-mRNA-Expression

(normalisiert auf GAPDH) a

Faktor der Über-expression (x-fach) b

A2780

0,0028

1,0

A2780RCIS

0,0556

19,9

A2780RCIS-RzM1, Klon 12

0,0062

2,2

A2780RCIS-RzM1, Klon 13

0,0022

0,8

A2780RCIS-RzM1, Klon 14

0,0038

1,4

A2780RCIS-RzM1, Klon 22

0,0202

7,2

A2780RCIS-RzM1, Klon 34

0,0433

15,5

A2780RCIS-RzM2, Klon 9

0,0077

2,8

A2780RCIS-RzM2, Klon 12

0,0002

0,1

A2780RCIS-RzM2, Klon 27

0,0097

3,5

A2780RCIS-RzM2, Klon 29

0,0028

1,0

A2780RCIS-RzM2, Klon 35

0,0027

1,0

A2780RCIS-RzM2, Klon 36

0,0145

5,2

A2780RCIS-RzM1/mut, Klon 5

0,0273

9,8

A2780RCIS-RzM2/mut, Klon 12

0,0290

10,4

A2780RCIS-LV, Klon 13

0,0609

21,8

A2780RCIS-LV, Klon 14

0,0565

20,2

aDie Expression für GAPDH und MRP2 wurde in 3 unabhägigen Experimenten bestimmt. Der Mittelwert wurde gebildet und die MRP2-Expression im Verhältnis zur GAPDH-Expression ausgedrückt. bDer Faktor der Überexpression bezieht sich auf die parentale Zellinie A2780.


[Seite 89↓]

inaktivem Ribozym gesenkt war, wenn auch nicht so stark wie in den meisten Klonen mit katalytisch aktivem Ribozym.Um zu überprüfen, ob die beiden Anti-MRP2-Ribozyme RzM1 und RzM2 in der Lage sind das Expressionslevel von MRP2 auch auf Proteinebene zu senken, wurde aus den Transfektanten-Zellinien Membranproteine isoliert und diese im Western-Blot mit einem MRP2-Antikörper analysiert (Kap. 2.2.28 bis 2.2.32). Es konnten die Senkung der MRP2-Expression in den RzM1- und RzM2-Transfektanten bestätigt werden (RzM2-Transfektanten als Beispiel in Abb. 3.21). Die Proteinexpression von MRP2 wurde in den Transfektanten mit katalytisch inaktivem Ribozym ebenfalls deutlich gesenkt.


Abb.
3.21 : E xpression von MRP2 in den A2780RCIS-RzM2-Klonen

Die aus den Zellinien isolierten Membranproteine wurden in einem denaturierenden SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und auf Nitrozellulose übertragen. Nach dem Blocken wurde die Membran gleichzeitig mit Anti-MRP2-Antikörper und Anti-Aktin-Antikörper inkubiert. Die Detektion erfolgte mit einem Chemolumineszenz-System (Kap. 2.2.28 bis 2.2.32).

3.4.4 Zellzyklus und Apoptose in den A2780RCIS-Ribozym-Transfektanten

Im Folgenden sollte untersucht werden, ob und wie sich die A2780RCIS-Ribozym-Transfektanten hinsichtlich ihres Verhaltens gegenüber Cisplatin von der untransfizierten resistenten Ausgangszellinie A2780RCIS unterscheiden. Die Zellen wurden mit 100 µM Cisplatin kontinuierlich über mehrere Tage behandelt und die adhärenten Zellen nach


[Seite 90↓]

Abb. 3.22 : Zellzyklusanalysen in den A2780RCIS-RzM-Klonen

Es ist der prozentuale Anteil der Zellen an den Zellzyklusphasen G1, S und G2 nach kontinuierlicher Behandlung mit 100 µM Cisplatin dargestellt (Kap. 2.2.36). Gezeigt ist die zeitliche Veränderung für die untrans-fizierte Zellinie A2780RCIS, die Leer-vektortransfektanten A2780RCIS-LV Klone 13 und 14 sowie für die RzM1-Transfektanten Klone 12 und 34 und für die RzM2-Transfektanten Klone 9 und 12.


[Seite 91↓]

verschiedenen Zeitpunkten geerntet. Es wurden eine Propidiumiodidfärbung durchgeführt und im Durchflußzytometer der DNA-Gehalt in den Zellen bestimmt (Kap. 2.2.36). Der prozentuale Anteil der Zellen in bestimmten Zellzyklusphasen wurde bestimmt und die transfizierten Zellen mit der untransfizierten Zellinie A2780RCIS und den Kontrolltransfektanten verglichen (Abb. 3.22). In den unbehandelten Zellpopulationen befanden sich die meisten Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus. Die cisplatinresistente Ausgangszellinie A2780RCIS reagierte nach 24-stündiger Cisplatinbehandlung mit einem Anstieg der Zellen in der S-Phase und einem sinkenden Anteil der Zellen in der G1-Phase. Nach 48 Stunden befanden sich die meisten Zellen in der G2-Phase. In den kommenden Stunden konnte sich ein Fraktion der Zellen teilen (Übergang in die G1-Phase), die anderen arretierten in der G2-Phase. Die Zellpopulationen der Leervektortransfektanten (Klone 13 und 14) verhielten sich wie die Zellinie A2780RCIS. Vergleicht man diese Profile mit jenen der Transfektanten für die Ribozyme RzM1 und RzM2, stellt man fest, daß die ribozymtransfizierten Zellen hauptsächlich in der G2-Phase arretieren und sich im zeitlichen Verlauf von 3 Tagen nur wenige Zellen teilen können. Außerdem wurden im Zellkulturüberstand mehr tote Zellen beobachtet als vergleichsweise in der A2780RCIS und den Leervektortransfektanten.

Es sollte untersucht werden, ob sich die Ribozym-Transfektanten in bezug auf Apoptose-Induktion von der Ausgangslinie A2780RCIS unterscheiden. Die Zellinien A2780 und A2780RCIS, sowie die Ribozym-Transfektante A2780RCIS-RzM2 Klon 9 und die Leervektortransfektante A2780RCIS-LV Klon 13 wurden ausgewählt und mit unterschiedlichen Konzentrationen von Cisplatin für 24 h behandelt. Es wurden Zellysate hergestellt und auf ihre Caspase-3-Aktivität untersucht (Kap. 2.2.35). Die gefundenen Aktivitäten wurde auf die Grundaktivität der Zellinie A2780 (ohne Cisplatin-Behandlung) normalisiert und miteinander verglichen (Abb. 3.23). Mit steigender Konzentration von Cisplatin stieg die Caspase-3-Aktivität in allen Zellinien an, was auf ein vermehrtes Auslösen von Apoptose schließen läßt. Die Ribozymtransfektante RzM2 Klon 9 zeigte eine höhere Induktion im Vergleich zur Ausgangszellinie A2780RCIS und der Leervektortransfektante (A2780RCIS-LV Klon 13). Bei einer Konzentration von 100 µM Cisplatin war die Induktion sogar größer als in der sensiblen parentalen Zellinie A2780.


[Seite 92↓]

Die Proliferationsuntersuchungen der Ribozymtransfektanten (Kap. 3.4.2) hatten gezeigt, daß sich die Zellen gegenüber verschiedener Zytostatika sensibler verhalten, jedoch konnte durch diese Tests nicht entschieden werden, ob die Zellen unter der Behandlung absterben oder nur im Wachstum gehemmt werden. Durch die Zellzyklusbetrachtungen und die Apoptose-Induktion über Caspase-3-Aktivierung konnte gezeigt werden, daß beide Vorgänge nebeneinander ablaufen und es wurde bestätigt, daß die Ribozymtransfektanten sensibler auf das Zytostatikum Cisplatin reagieren als die resistente untransfizierte Zellinie A2780RCIS. Beim Einsatz in der Zellkultur lassen sich insgesamt keine grundsätzlichen Unterschiede zwischen den beiden getesteten Anti-MRP2-Ribozymen RzM1 und RzM2 feststellen.

Abb. 3.23 : Ca spase-3-Aktivität nach Cisplatinbehandlung in den Anti-MRP2-Ribozym-Klonen

Die Zellen wurden 24 h mit Cisplatin behandelt. In den Zellysaten wurde die Caspase-3-Aktivität bestimmt (Kap. 2.2.35). Die Aktivitäten wurden auf die unbehandelte parentale Zellinie A2780 normalisiert. Bei A2780RCIS-RzM2.9 handelt es sich um eine Anti-MRP2-Ribozym-Transfektante mit ihrer Klon-Nummer und bei A2780RCIS-LV.13 handelt es sich um eine Leervektor-Transfektante. A2780 ist die untransfizierte sensible Ausgangslinie und A2780RCIS die untransfizierte cisplatinresistente Variante zur parentalen Linie A2780.Die Signifikanz der Unterschiede wurde mit dem Student’s T-Test, 2-seitig, überprüft (n.s. = nicht signifikant; ** = P<0,01; *** = P<0,001) und bezieht sich auf die Zellinie A2780RCIS.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
04.08.2004