im Fach Biologie
eingereicht an der
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Prof. Dr. Jürgen Mlynek
Tumorzellen können vielfältige Resistenzmechanismen gegenüber Zytostatika entwickeln. Untersuchungen an drei humanen Tumorzellinien und ihren cisplatinresistenten Varianten zeigten eine Assoziation von erhöhter MRP2-Expression und dem Auftreten von Cisplatinresistenz. Darüberhinaus waren die cisplatinresistenten Zellinien gegenüber Carboplatin kreuzresistent. Um weitere Faktoren im Zusammenhang mit der Cisplatinresistenz zu untersuchen, wurde der Mutationsstatus von p53 und der zelluläre Glutathiongehalt in den Zellinien bestimmt. Der offene Leserahmen von MRP2 aus der cisplatinresistenten Ovarialkarzinomzellinie A2780RCIS wurde für die Transfektion in die cisplatinsensitive Zellinie A2780 genutzt. Die Transfektanten zeigten eine Überexpression von MRP2 und wiesen eine Resistenz gegenüber Cisplatin und Carboplatin auf. Dies konnte in Zellzyklus- und Apoptose-Untersuchungen unter Cisplatinbehandlung gestätigt werden. Durch computergestützte Faltungsanalysen von Abschnitten der MRP2-mRNA wurden zwei potentielle Ribozymschnittstellen ausgewählt. Die konstruierten Anti-MRP2-Hammerhead-Ribozyme RzM1 und RzM2 wurden im zellfreien System auf ihre Schnittaktivität getestet und erwiesen sich als katalytisch aktiv. Es wurden verschiedene kinetische Parameter für RzM1 und RzM2 ermittelt und mit anderen Ribozymen verglichen. Die Ribozyme zeigten eine gute Effektivität bei der Spaltung ihres Zielmoleküls, wobei RzM1 die höhere Effektivität aufwies. Beide Ribozyme wurden auf ihre Wirksamkeit durch Transfektion in die Zellinie A2780RCIS getestet. Die untersuchten Transfektanten zeigten eine geringere Expression von MRP2 auf mRNA- und Proteinebene und wiesen eine verminderte Resistenz gegenüber Cisplatin, Carboplatin, Daunorubicin und Etoposid auf. Die Ribozyme RzM1 und RzM2 waren gleichermaßen für die Expressionsregulierung von MRP2 in Tumorzellen geeignet. In Zellzyklus- und Apoptose-Untersuchungen wurde funktionell bestätigt, daß die A2780RCIS-Anti-MRP2-Ribozym-Transfektanten auf eine Cisplatinbehandlung stärker ansprechen als die cisplatinresistente Ausgangszellinie A2780RCIS. Die Anwendung der Ribozyme RzM1 und RzM2 zur Unterstützung der Chemotherapie von Tumorzellen scheint daher vielversprechend.
Tumour cells can develop a lot of resistance mechanisms against cytostatic drugs. Examinations of three human tumour cell lines and their cisplatinresistant variants showed an association of elevated MRP2 expression and the occurrance of cisplatinresistance. Moreover, the cisplatinresistant cell lines were crossresistant against carboplatin. To examine further factors in context of cisplatinresistance the mutation status of p53 and the cellular glutathione content of the cell lines were determined. The MRP2-open reading frame of the cisplatinresistant ovarian carcinoma cell line A2780RCIS was used for transfection into the cisplatinsensitive cell line A2780. The transfectants showed an overexpression of MRP2 and a resistance against cisplatin and carboplatin. This could be confirmed with analysis of the cell cycle and apoptosis induction after treatment with cisplatin. Using computer aided folding analysis of MRP2 mRNA parts two possible ribozyme cleavage sites were selected. The constructed anti-MRP2 hammerhead ribozymes RzM1 and RzM2 were tested in a cell-free system with respect to their cleavage activities and were found to be catalytic active. Various kinetic parameters of RzM1 and RzM2 were determined and compared with other ribozymes. The ribozymes showed a good effectivity for the substrate cleavage, although RzM1 had the better effectivity. Both ribozymes were tested for their effectiveness after transfection into the cell line A2780RCIS. The transfectants showed a lower MRP2 expression on mRNA and protein level and also a reduced resistance against cisplatin, carboplatin, daunorubicin, and etoposide. The ribozymes RzM1 and RzM2 were both equally suitable for the regulation of MRP2 expression in tumour cells. Analysis of cell cycle and apoptosis induction could confirm functionally the higher sensitivity of the A2780RCIS-anti-MRP2 ribozyme transfectants after treatment with cisplatin in comparison to the cisplatinresistant cell line A2780RCIS. Therefore, the application of the ribozymes RzM1 and RzM2 for the support of cancer chemotherapy seems to be promising.
Das Sonnenstäubchen fern im Raume,
das Tröpfchen, das im Grase blinkt,
das dürre Blättchen, das vom Baume
im Hauch des Windes niedersinkt –
Ein jedes wirkt an seinem Örtchen
still weiter, wie es muß und mag,
ja, selbst ein leises Flüsterwörtchen
klingt fort bis an den Jüngsten Tag.
Wilhelm Busch
In Deutschland erkranken jährlich schätzungsweise 350 000 Menschen neu an Krebs. Nach den Herz-Kreislauferkrankungen ist Krebs in der westlichen Welt die zweithäufigste Todesursache. Da sich die Bevölkerungsstruktur immer mehr in Richtung zu Menschen mit höherem Lebensalter verschiebt und das Krebsrisiko mit dem Alter zunimmt, wird in etwa 15 Jahren Krebs die Haupttodesursache sein (Becker und Wahrendorf, 1998).
25 bis 30 % aller Krebstodesfälle gehen auf das Rauchen zurück. Epidemiologische Untersuchungen der letzten Jahre weisen darauf hin, daß die Ernährungsgewohnheiten mit 20 bis 42 % an einer Krebsentstehung beteiligt sind (Willet, 1995). Weitere wichtige Risikofaktoren sind virale Infektionen, bestimmte genetische Prädispositionen, erhöhter Alkoholkonsum, sowie Expositionen mit bestimmten chemischen Stoffen oder Stahlungen, wie z. B. ionisierende und UV-Strahlung (Harvard Report on Cancer Prevention, 1996; Becker und Wahrendorf, 1998).
Tumorerkrankungen werden durch die Kombination von chirurgischer Entfernung, Radiotherapie, Chemotherapie und in einigen Fällen auch Hyperthermie behandelt. Die Heilungserfolge sind jedoch in Abhängigkeit von der Tumorart sehr unterschiedlich. Unter der Behandlung (Selektionsdruck) entwickeln sich sehr häufig Resistenzen, die dazu führen, daß sich die Tumore nach und nach der Wirkung dieser Therapieformen entziehen. Um Krebserkrankungen möglichst erfolgreich therapieren zu können, müssen die verursachenden genetischen Veränderungen bzw. die den Resistenzen zugrunde liegenden Mechanismen erkannt und in die Diagnostik miteinbezogen werden.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Suche nach einem generellen Mechanismus für Cisplatinresistenz anhand des Vergleichs von Modellzellinien. Der Zusammenhang eines solchen Mechanismus mit der Chemoresistenz soll funktionell belegt und näher untersucht werden. Außerdem soll versucht werden, aus den Ergebnissen Ansatzpunkte für die Diagnosik und Therapie von malignen Tumoren abzuleiten.
Neben der operativen Entferung und der Radiotherapie gehört die medikamentöse Behandlung trotz weiterer denkbarer Ansätze zu den heute am häufigsten verwendeten Therapien. Dabei werden strukturell verschiedenste natürliche, synthetische und halbsynthetische Substanzen eingesetzt, die auf sich teilende Zellen zytotoxisch oder zytostatisch wirken. Diese Stoffe werden unter dem Begriff Zytostatika oder Chemotherapeutika zusammengefaßt. Nach ihrem Wirkmechanismus werden diese Substanzen u. a. in DNA-alkylierende Agentien, Antimetabolite, Mitosehemmstoffe, Antibiotika, Enzyme und Hormone eingeteilt. Im Folgenden sollen die Zytostatika vorgestellt werden, die in dieser Arbeit Verwendung fanden.
Die zytostatische Wirkung von Cisplatin (cis-Diamindichloroplatin (II)) wurde durch Versuche mit Bakterien entdeckt (Rosenberg et al., 1965). In diesen Experimenten wurde beobachtet, daß sich E. coli im elektrischen Feld zwischen zwei Platinelektroden nicht mehr zu teilen vermag und nur noch durch Größenzunahme wachsen kann. In den folgenden Jahren wurde festgestellt, daß diese Wirkung auf Cisplatin (Abb. 1.1) zurückzuführen ist, das sich in der Lösung gebildet hatte. Heute ist Cisplatin eines der meist genutzten Zytostatika und wird u. a. bei der Behandlung von Ovarial- und Bronchialkarzinomen eingesetzt (Manetta et al., 1998; Oguri et al., 1999; Young et al., 1999). Seine Wirkung beruht hauptsächlich auf der Bildung von kovalenten Addukten von Cisplatin mit den Basen in der DNA, wodurch sich DNA-Inter- und -Intrastrang-Quervernetzungen bilden. Am häufigsten treten 1,2-d(GpG)- und 1,2-d(ApG)-Intrastrang-, sowie 1,3-d(GpNpG)-Interstrang-Addukte auf. Diese Addukte, die außerdem die DNA in ihrer Konformation verändern, behindern die Replikation und Transkription und führen im Folgenden zur Apoptose (Trimmer und Essigmann, 1999).
Das ebenfalls als Zytostatikum eingesetzte Carboplatin (cis-Diamin(1,1-Cyclobutan-dicarboxylato)platin (II)) zeigt einen ähnlichen Wirkmechanismus wie Cisplatin. Carboplatin reagiert (Abb. 1.2) wesentlich weniger und langsamer mit der DNA im Vergleich zu Cisplatin und muß in einer 20- bis 40-fach höheren Konzentration eingesetzt werden, um die gleiche Wirkung zu erreichen. Der Vorteil dieses Zytostatikums in der klinischen Praxis bezieht sich auf die geringeren auftretenden Nebenwirkungen und die daraus resultierende bessere Verträglichkeit (Übersicht in Zeller und zur Hausen, 1995).
Eine italienische und eine französische Arbeitsgruppe entdeckten ein Zytostatikum aus dem Mikroorganismus Streptomyces peuceticus und nannten diese Verbindung „daunomycina“ bzw. „rubidomycine“, woraus sich der heute gebräuchliche Name Daunorubicin zusammensetzt (Di Marco et al., 1963; Dubost et al., 1963). Es handelt sich hierbei um ein Anthrazyklin, bestehend aus dem tetrazyklischen Chromophor Daunomycinon und dem Aminozucker Daunosamin (Abb. 1.3). Es wird hauptsächlich bei akuten Leukämien eingesetzt und wirkt am stärksten bei exponentiell wachsenden Zellen, vorwiegend in der S- und G2-Phase des Zellzyklus (Pratt et al., 1994). Die Wirkmechanismen sind bis heute nicht vollständig verstanden, jedoch scheint die nichtkovalente Bindung (Interkalation) an die DNA ein wesentlicher Mechanismus für die Zytotoxizität zu sein, worauf im Folgenden DNA- und RNA-Polymerasen behindert werden. Durch Ein- oder Zwei-Elektronenreduktion bilden sich aus Daunorubicin reaktive Verbindungen, die Proteine, Lipide und DNA alkylieren können. Als weitere Mechanismen werden u. a. die Hemmung von Topoisomerasen, Helikasen, sowie
Etoposid (4’-Demethyl-epipodophyllotoxin-9-(4,6-O-2-ethyliden-β-D-glukopyranosid, Abb. 1.4) ist ein halbsynthetisches Derivat des Podophyllotoxins aus Podophyllum peltatum (Maiapfel). Es wird gewöhnlich in Kombination mit anderen Zytostatika z. B. bei der Behandlung des Hoden- und Ovarialkarzinoms eingesetzt (Williams et al., 1987; Zanetta et al., 1996; Rose et al., 1998). Etoposid wirkt zellzyklusphasenspezifisch und arretiert den Zellzyklus in der späten S- und frühen G2-Phase. Es wirkt dabei über die Hemmung der Topoisomerase II und scheint in dieser Funktion nicht an die DNA zu binden (Ross et al., 1984). Die Topoisomerase II führt Doppelstrangbrüche in die DNA ein, um sie entwinden zu können. An diesem Prozeß des Entwindens sind weitere Proteine beteiligt, die den sogenannten „cleavable complex“ bilden. Etoposid scheint diesen Komplex zu stabilisieren, was zu persistierenden DNA-Doppelstrangbrüchen führt. Da proliferierende Zellen einen höheren DNA-Topoisomerase II-Spiegel besitzen, sind diese Zellen empfindlicher für Epipodophyllotoxine. Durch den Metabolismus von Etoposid in der Zelle entstehen auch Derivate, die alkylierernd wirken können. Die gebildeten Chinone können außerdem zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies führen (Übersicht in Zeller und zur Hausen, 1995).
1.1.4Vincristin
Vincristin (Abb. 1.5) gehört zu den Vinca-Alkaloiden aus Catharanthus roseus syn. Vinca rosea (Madagaskar-Immergrün). Es wird in der Kombinationtherapie z. B. zur Behandlung des Non-Hodgkin-Lymphoms eingesetzt (Heim et al., 1987).
Die Vinca-Alkaloide sind sogenannte Spindelgifte, d. h. sie hemmen durch Bindung an Tubulin die Bildung der Mikrotubuli, die als Bestandteil des Zytoskeletts bei der Mitose, der Zellbewegung und beim intrazellulären Transport mitwirken. In der Zelle gibt es ein Gleichgewicht von polymerisiertem (mikrotubulärem) und gelösten Tubulin. Durch die
Unter Chemoresistenz versteht man die verminderte Empfindlichkeit einer Zelle gegenüber einem Zytostatikum im Vergleich zu einer anderen Zelle. Rund die Hälfte aller malignen Tumore spricht nicht auf eine zytostatische Therapie an. Man bezeichnet dies als primäre oder intrinsische Resistenz. Ein gutes Drittel der zunächst ansprechenden Tumore entwickelt im Laufe der medikamentösen Therapie eine sogenannte sekundäre Chemoresistenz. Diese Tumore lassen sich oftmals auch nicht durch andere, noch nicht angewendete Chemotherapeutika behandeln. Dieses Phänomen nennt man pleiotrope oder Multidrug-Resistenz (MDR). In diesen Tumoren haben sich Zellen in ihrem Wachstum durchgesetzt, die bestimmte Mechanismen entwickelt haben, um sich dem Zytostatikum oder dessen Auswirkungen zu entziehen. In diesem Abschnitt sollen einige dieser Mechanismen näher vorgestellt werden (Übersichten in Lage, 1999; Kaufmann und Earnshaw, 2000; Gottesman, 2002). Prinzipell kann man dabei die folgenden Möglichkeiten unterscheiden (Abb. 1.6):
verminderte Aufnahme bzw. verstärkter Auswärtstransport des Zytostatikums;
verändertes Zielmolekül, so daß das Zytostatikum nicht mehr binden kann;
vermehrtes Zielmolekül, um Funktion aufrecht zu erhalten;
Übernahme der Stoffwechselfunktion des Zielmoleküls durch einen alternativen Mechanismus (Tolerierung des Schadens);
biochemische Modifikation (Entgiftung) des Chemotherapeutikums;
räumliche Trennung des Zytostatikums vom Wirkort (Kompartimentierung);
verstärkte Reparatur der auftretenden Schäden;
Verhinderung des Zelltods durch Beeinflussung der Zellzyklus-Kontrolle und der Apoptose-Wege.
Ein häufig genutzter Resistenzmechanismus ist der Auswärtstransport der zytostatischen Substanzen, bei dem die Gruppe der ABC-Transporter eine wichtige Rolle spielt. Diese Proteine werden in den Kap. 1.2.2 und Kap. 1.2.3 ausführlich vorgestellt.
Das Strukturprotein LRP ( l ung r esistance-related p rotein) ist Hauptbestandteil eines Ribonukleoprotein-Komplexes, welcher in der Nähe der Kernporen lokalisiert ist. Da die LRP-Expression eine gewisse Assoziation mit Zytostatikaresistenz in Modellzellinien und Tumoren zeigt, wird eine Beteiligung am Kern-Zytoplasma-Transport bzw. am Transport über Vesikel diskutiert (Chugani et al., 1993; Izquierdo et al., 1996). LRP könnte somit an einem Multikomponenten-Resistenzmechanismus für Kompartmentierung und Exozytose beteiligt sein (Lage, 1999).
DNA-Topoisomerasen bewirken durch die von ihnen vermittelten DNA-Einzel- oder Doppelstrangbrüche die Entwindung der DNA, welches für die Replikation und Transkription benötigt wird. Einige Zytostatika inhibieren den Komplex mit der von ihnen bereits gespaltenen DNA und verhindern die Ligationsreaktion. Mutationen in den Topoisomerasen, die eine verminderte Affinität des Zytostatikums für sein Zielmolekül bewirken, können hier
Viele Zytostatika schädigen die sich teilende Zelle durch Wechselwirkungen mit der DNA (Beispiele unter Kap. 1.1.1 bis 1.1.3). Deshalb spielen Veränderungen in den Reparaturmechanismen eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Zytostatikaresistenzen. Durch Alkylierung auftretende Schäden können z. B. durch die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase direkt behoben werden. Andere Schäden – wie z. B. Cisplatin-DNA-Addukte – werden großräumiger durch das NER-System (NER = n ucleotide e xcision r epair) repariert (Übersicht in Crul et al., 1997). Im Zusammenhang mit Chemoresistenz wurde auch eine veminderte Expression der Gene des MMR-Systems (MMR = m is m atch r epair) in resistenten Tumorzellen beschrieben (Übersicht in Lage und Dietel, 1999). Möglicherweise führt die verringerte Expression über die im Folgenden gestörte Verbindung zum Zellzyklus und den Apoptosewegen zu einem Überleben der geschädigten Zelle (Hawn et al., 1995).
Viele der am Apoptose-Prozeß beteiligten Faktoren wurden in zytostatikaresistenten Zellen als verändert exprimiert beschrieben (Übersicht in Kaufmann und Earnshaw, 2000). Ob in einer Zelle Apoptose ausgelöst wird oder nicht, hängt davon ab, wie stark die Zelle geschädigt ist bzw. ob diese Schäden von Kontrollmechanismen wahrgenommen werden. Das Tumorsuppressorgen p53 spielt bei diesen Prozessen eine zentrale Rolle. Je nach Ausmaß der Schädigung löst TP53 als Transkriptionsfaktor oder durch direkte Wechselwirkung Reparaturprozesse oder Apoptose aus. Aus einer Vielzahl von Untersuchungen ist bekannt, daß TP53 in Tumoren häufig mutiert auftritt, wodurch die Funktion des Proteins teilweise oder komplett verloren gehen kann (Übersicht in Camplejohn und Rutherford, 2001).
In den siebziger Jahren wurde das MDR1-Gen (MDR =
m
ulti
d
rug
r
esistance) beschrieben, welches für das sogenannte P-Glykoprotein (P=Permeabilität) kodiert (Juliano und Ling, 1976). Das 170 kDa große Protein befindet sich in der Plasmamembran und ist für die Multidrug-Resistenz im klassischen Sinne zuständig. Es gehört zur Familie der ABC-Transporter, die sich durch das Vorhandensein von membrandurchspannenden Domänen und
In den frühen neunziger Jahren wurde ein weiterer, für Chemoresistenz wichtiger ABC-Transporter beschrieben (Cole et al., 1992), der sich durch ein etwas anderes Kreuzresistenzmuster unterschied. Es handelte sich hierbei um das MRP ( M D R -associated p rotein), welches ebenfalls Anthrazykline, Epipodophyllotoxine und Vinca-Alkaloide transportieren kann, jedoch nicht die Spindelgifte Colchicin und Taxol. Die transportierten Substanzen sind in diesem Kontext keine „Substrate“, da sie vom Transporter nicht biochemisch umgewandelt werden. Young und Holland (1999) prägten daher den Begriff Allocrite für dem Transport unveränderter Verbindungen. Die Allocrite des 190 kDa großen, ubiquitär in der Plasmamembran exprimierten Proteins werden hauptsächlich als Konjugate mit Glutathion, Glukuronsäure oder als Sulfate transportiert. In diesem Zusammenhang können auch Alterationen im Glutathionstoffwechsel, wie z. B. Überexpressionen der Glutathion-S-Transferasen, bedeutsam werden, die die Übertragung des Tripeptids Glutathion auf Zytostatika katalysieren können. Dabei kann die Konjugation selbst schon einen Entgiftungmechanismus darstellen (Übersicht in Keppler, 1999; Strange et al., 2000). In den folgenden Jahren wurden weitere Mitglieder der MRP-Familie entdeckt, die nach Abschluß des humanen Genomprojekts 10 Mitglieder umfaßt, von denen aber nur 6 bisher näher charakterisiert wurden (Übersichten in Dean et al., 2001; Efferth, 2001; Gottesman, 2002).
Im Zusammenhang mit Chemoresistenz sind neben den bisher genannten ABC-Transportern sogenannte Halbtransporter beschrieben worden. Diese besitzen im Gegensatz zu den Volltransportern mit zwei ATP-Bindungs- und mindestens zwei Transmembrandomänen nur jeweils eine davon (Abb. 1.7) und bilden für den Transport Homo-oder Heterodimere. Beispiele hierfür sind die Proteine TAP1 und TAP2 (TAP =
t
ransporter
a
ssociated with antigen
p
rocessing), die außer ihrer Funktion bei der Antigenpräsentation auch durch ihr Zusammenwirken beim Transport eine Resistenzerhöhung gegenüber Mitoxantron vermitteln können (Lage et al., 2001). Ende der neunziger Jahre wurde der Halbtransporter BCRP beschrieben (BCRP =
b
reast
c
ancer
r
esistance
p
rotein), welcher Resistenz gegenüber
Mitglieder der ABC-Transportfamilie findet man sowohl in Pro- und Eukaryoten. Für den Menschen wurden bisher 48 Voll- und Halbtransporter beschrieben. Da für viele dieser Transporter mehrere alternative Namen benutzt werden, wurde in den letzten Jahren der Versuch unternommen, eine einheitliche Nomenklatur zu entwerfen. Dazu wurden die Transporter in 7 Gruppen eingeteilt (Subfamilie A bis G), wobei sie nach ihren Ähnlichkeiten in der Sequenz gruppiert wurden (http://www.med.rug.nl/mdl/humanabc.htm und http://www.ucl.ak.uk).
Der ABC-Transporter MRP2, auch cMOAT (canalicular multispecific organic anion transporter) genannt, gehört zur MRP-Familie. Er wurde als zweites Mitglied dieser Familie von Membrantransportern identifiziert und erhielt daher die Bezeichung MRP2. Nach der neuen Nomenklatur (Kap. 1.2.2) wurde er zur ABC-Transporter-Subfamilie C, der CFTR/MRP-ähnlichen Proteine, mit der Bezeichnung ABCC2 zugeordnet. Das humane Homolog wurde aufgrund seiner Sequenzähnlichkeit zu seinem aus der Ratte verwandten Gen kloniert (Taniguchi et al., 1996; Büchler et al., 1996). Das Gen ist auf Chromosom 10q24 lokalisiert und liefert eine mRNA von ca. 5 kb Länge. Die genomische Struktur von MRP2 besteht aus 32 Exons, deren Größe zwischen 56 und 255 bp liegt (Toh et al., 1999; Tsuji et al., 1999). Der Promotor von MRP2 enthält u. a. Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren AP1, AP2, TBP und C/EBPβ, wobei die beiden letztgenannten Bedeutung für die basale Expression von MRP2 besitzen(Tanaka et al., 1999; Stöckel et al., 2000). Das human Protein besteht aus 1545 Aminosäuren und wird hauptsächlich in der apikalen Membran von Hepatozyten exprimiert. Eine geringere Expression wurde auch für die Niere und den Dünndarm beschrieben (Kool et al., 1997). MRP2 besteht aus drei transmembranen und zwei nukleotidbindenen Domänen (Abb. 1.7) und besitzt damit eine Transmembrandomäne (am N-Terminus) mehr das das P-Glykoprotein. Durch Mutationsanalyse wurde festgestellt, daß der C-Terminus des Proteins besonders wichtig für die Lokalisation in der apikalen Membran und somit für die Ausscheidungsfunktion dieses Proteins ist (Harris et al., 2001).
Die biologische Funktion dieses Transporters besteht in der Ausscheidung von Bilirubin, das bei dem Abbau des Hämoglobins entsteht. In diesem Zusammenhang wurde auch das humane Krankheitsbild bei defektem oder fehlendem MRP2 beschrieben. Es handelt sich hierbei um das Dubin-Johnson-Syndrom, bei dem sich dunkel pigmentierte Ablagerungen in der Leber bilden und erhöhte Bilirubin-Spiegel im Blut gemessen werden. Da die Patienten im allgemeinen keine Beeinträchtigungen aufweisen, wird diese Krankheit nur sehr selten diagnostiziert (Übersicht in Zimniak, 1993). Einige Patienten wurden bereits auf Mutationen in MRP2 untersucht, wobei sowohl Punktmutationen als auch Deletionen gefunden wurden (Kamisako et al., 2000; Mor-Cohen et al., 2001).
Für pharmakologische Untersuchungen haben sich zwei Tiermodelle der Ratte durchgesetzt, welche durch Mutation in MRP2 transportdefizient sind (Paulusma et al., 1996; Ito et al., 1997). Das Spektrum der transportierten Konjugate ist ähnlich dem von MRP (Kap. 1.2.2), jedoch mit unterschiedlichen Spezifitäten für einzelne Substanzen. So transportiert MRP1 17β-Glukuronosyl-Östradiol bevorzugt vor Monoglukuronosyl-Bilirubin, wohingegen sich die Präferenzen bei MRP2 umkehren(Übersicht in Keppler et al., 1997). In jüngerer Zeit ist man dazu übergegangen, die MRP2-Expression in Tumorpatienten zu untersuchen (Nies et al., 2001; Soini et al., 2001). Jedoch ist die Bedeutung der MRP2-Expression im Zusammenhang mit dem Ansprechen auf eine Chemotherapie bzw. dem Überleben der Tumorpatienten noch nicht ausreichend verstanden. Desweiteren wurden genetische Polymorphismen für MRP2 beschrieben (Itoda et al., 2002), deren mögliche Auswirkungen auf die Funktion des Proteins noch nicht untersucht worden sind.
Häufig benutzt man zur Aufklärung von Resistenzmechanismen Zellinienmodelle, von denen die resistenten Varianten aus der parentalen Linie durch eine allmähliche Konzentrationserhöhung eines gewählten Zytostatikums herangezogen wurden. Das Ausmaß der Resistenz (Resistenzfaktoren) kann man mit Hilfe verschiedenster Methoden bestimmen. Man unterscheidet dabei zwischen Klonogenitätsassay und Proliferationsassay. Zu den am häufigsten benutzten Proliferationsassays gehören der Sulforhodamin B-Assay (SRB-Assay) und der MTT-Test, wobei der auf einer Proteinbestimmung basierende SRB-Assay am besten mit der Zellzahl korreliert (Perez et al., 1993).
Ribozyme sind katalytisch aktive, einzelsträngige RNA-Oligonukleotide, die als Antisense-Moleküle an ihr Zielmolekül binden und dieses endoribonukleolytisch spalten. Im Anschluß an diese Reaktion löst es sich von seinem Substrat und bindet an das nächste Zielmolekül. Diese Eigenschaft ist ein großer Vorteil gegenüber Antisense-Oligonukleotiden, die lediglich ein Zielmolekül binden und so inhibieren können. Gemäß dieser Definition gehören RNase P, Gruppe I- und II-Introns, das Spliceosom, das Hammerhead-Ribozym und das Hairpin-Ribozym in diese Gruppe (Übersicht in Lewin und Hauswirth, 2001). Natürlich vorkommende Ribozyme wurden außerdem im Hepatitis Delta-Virus und in Neurospora gefunden. Darüber hinaus wurden sogenannte DNA-Enzyme beschrieben, die in der Lage sind, RNA-Moleküle sequenzspezifisch zu spalten (Sen und Geyer, 1998).
Die Hammerhead-Ribozyme erhielten ihren Namen aufgrund der Tatsache, daß die zweidimensionale Struktur dieser Ribozyme an den Kopf eines Hammerhais erinnert (Abb. 1.8). Nach der Beschreibung der katalytischen Aktivität dieser kleinen RNA-Moleküle (Forster und Symons, 1987), wurden intensive Studien zur sekundären und tertiären Struktur durchgeführt. Dabei beschrieb man den Aufbau mit drei Stammstrukturen (Helix I, II und III), die den katalytischen Kern flankieren, und ermittelte hochkonservierte Einzelstrangbereiche
Hammerhead-Ribozyme wurden in den vergangenen Jahren häufig benutzt, um die Expression von Genen in Zusammenhang mit der Tumorigenese und der Chemoresistenzentwicklung zu modulieren (Übersicht in Bettinger und Read, 2001). So wurden u. a. Ribozyme gegen mdr1 (Holm et al., 1994 und 1995), GPC3 (Wichert et al., 1999), LRP (Kitazono et al., 1999), K-ras (Funato et al., 2000), BCRP (Kowalski et al., 2001 und 2002) und γ-Glutamylcystein-Synthetase (Iida et al., 2001) entwickelt und ihre Wirksamkeit erprobt.
Ribozyme katalysieren die sequenzspezifische Spaltung mittels alkalischer Hydrolyse in Gegenwart von Mg2+-Ionen. Diese Reaktion ist somit abhängig vom pH-Wert, der Temperatur und der Mg2+-Konzentration (Dahm und Uhlenbeck, 1991). Um die in vitro-Versuche weitgehend den Bedingungen in der Zelle anzupassen, wurden die Reaktionsbedingungen wie folgt gewählt: c(Mg2+) = 12 mM, pH = 7,5 und T = 37 °C (Kap. 2.2.26). Die ideale Länge der hybridisierenden Arme des Hammerhead-Ribozyms liegt bei 6 bis 8 Nukleotiden, was durch exprimentelle Erprobung festgestellt werden konnte (Lieber und Strauss, 1995).
In den letzten Jahren ist man dazu übergegangen, durch computergestützte Faltungsmethoden, die Sekundärstruktur einer gegebenen Ziel-mRNA zu berechnen. Man kann die Lage bestimmter schneidbarer Triplets nach unterschiedlichen Kriterien beurteilen und eine Vorauswahl treffen. Die Faltungsprogramme bieten im Allgemeinen mehrere Strukturvorschläge an, die sich in der freien Energie ΔG unterscheiden (z. B. mFOLD, http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/rna/form1.cgi). Man wählt solche Triplets, die an sogenannten „Schleifenstrukturen“ liegen (Stein und Cheng, 1993) bzw. Stellen, an denen die mRNA sterisch stark beansprucht wird. Die Hybridisierungssequenz der Ribozymarme muß nicht notwendigerweise an Einzelstrangbereichen der Ziel-mRNA liegen, da Ribozyme auch Tripel-Helix-Strukturen ausbilden können (Pieken et al., 1991). Diese Modelle bieten jedoch nur Ansatzpunkte. In jedem Fall ist das Ribozym im zellfreien System oder unter Nutzung von Zellinienmodellen auf seine Schnittaktivität zu testen.
Die ribozymkatalysierte Spaltung einer spezifischen mRNA erfolgt in drei Schritten:
Assoziation von Substrat und Ribozym;
Substratspaltung unter Stabilisierung des Übergangszustandes und
Destabilisierung und Dissoziation des Ribozym von seinen Schnittprodukten.
Die Bestimmung von Reaktionsparametern kann unter single turnover- oder multiple turnover-Bedingungen erfolgen. Bei single turnover-Bedingungen kann jedes Ribozym maximal nur einmal schneiden (Ribozymüberschuß). Hier spielt die Dissoziation des
Die Initialgeschwindigkeit vini der ribozymkatalysierten RNA-Spaltung beschreibt die Geschwindigkeit des Umsatzes von ungespaltetem RNA-Substrat S in die Spaltprodukte P. Sie wird aus dem Quotienten der Stoffmenge des Produkts n(Pt) zum Zeitpunkt t errechnet (Hendry et al., 1997; Kap. 2.2.27). Die experimentelle Bestimmung des Parameters erfolgt aus dem Produkt-Zeit-Diagramm unter Nutzung des Anstiegs im annähernd linearen Anfangsbereich des Graphen. Im Laufe der Reaktion stellt sich ein Gleichgewichtszustand ein, bei dem sich das Substrat-Produkt-Verhältnis nicht mehr weiter verändert.
Der Reaktionsparameter kcat/kM ist eine Reaktionskonstante 2. Ordnung und stellt die energetische Barriere dar, die zwischen dem Ausgangs- und dem höchsten Energieniveau der Reaktion liegt. Es handelt sich dabei um den Quotienten aus der Rate des chemischen Stoffumsatzes kcat (in s-1) und der Michaelis-Konstante kM (in M). Bei einer Reaktion in zwei Schritten nach dem Muster
wobei R das Ribozym, S das Substrat und P die Spaltprodukte darstellen, entspricht kcat der Konstanten k2 und kM dem Quotienten (k-1 + k-2)/k1. Die Assoziationskonstante k1 ist bei langen Substraten, z. B. mRNAs, aufgrund von Sekundärstrukturen deutlich geringer als für Oligonukleotide (Hertel et al., 1994). Aus diesem Grund sollte die Bestimmung der Reaktionskonstanten mit möglichst langen Substraten durchgeführt werden, um eine bessere Vorhersage für die Wirksamkeit des Ribozyms in der Zelle zu erreichen. Der Reaktionsparameter kobs ist eine Reaktionskonstante 1. Ordnung und beschreibt den beobachteten Stoffumsatz der gesamten Reaktion und setzt sich aus der Summe der Dissoziationskonstante k-1 und der Konstante für die Spaltreaktion k2 zusammen.
Um einen generellen Mechanismus für die Cisplatinresistenz in Tumorzellen zu finden, stehen die Ovarialkarzinomzellinie A2780, die Nebennierenrindenzellkarzinomzellinie D43/86, die Melanomzellinie Mewo und ihre jeweiligen cisplatinresistenten Varianten zur Verfügung. Mit Hilfe dieser Modellzellinien sind folgende Fragen zu beantworten:
Wir hoch ist die Resistenz der cisplatinresistenten im Vergleich zu ihren parentalen Zellinien?
Wie ist das Kreuzresistenzmuster in diesen Zellinien?
Wie unterscheiden sich die cisplatinresistenten von den parentalen Zellinien in der Expression bekannter Gene, die eine Bedeutung für die Chemoresistenz haben könnten?
Welche weiteren Faktoren könnten an der Chemoresistenz in diesen Zellinienmodellen beteiligt sein?
Gibt es in den Zellinien einen gemeinsamen Unterschied in der Genexpression?
Ist es möglich, mit Hilfe computergestützter Methoden und in vitro-Analysen, geeignete Ribozyme zu konstruieren, die die Expression des betreffenden Gens modulieren können?
Wie effektiv sind diese Ribozyme im Vergleich zu anderen Ribozymen?
Kann durch Überexpression/Ribozymeinsatz die Expression dieses Gens in Tumorzellen beeinflußt werden?
Wie verändert sich dadurch das Resistenzniveau gegenüber Cisplatin und weiterer ausgewählter Zytostatika?
Welche Möglichkeiten ergeben sich aus den Ergebnissen für die Therapie von malignen Tumoren?
Alle Chemikalien wurden mit dem Reinigungsgrad „zur Analyse“ erworben.
Die in dieser Arbeit verwendeten humanen Karzinomzellinien wurden freundlicherweise vom Zellkulturlabor des Instituts für Pathologie der Charité zur Verfügung gestellt (Tab. 2.2).
Bei dem verwendeten Bakterienstamm Escherichia coli TOP10F’ (Invitrogen) handelt es sich nach den Angaben des Herstellers um folgenden Genotyp:
F’ {lacIq Tn10 (TetR)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 deoR araD139 Δ(ara-leu)7697 galU gal/K rpsL (StrR) endA1 nupG.
Alle eukaryotischen Zellen wurden im Inkubator (BBD6220, Heraeus) bei 37 °C und 95 % Luftfeuchtigkeit in Gegenwart von 5 % CO2 in modifiziertem L-15-Medium angezogen. Den cisplatinresistenten Zellinien wurden folgende Mengen Cisplatin zugesetzt: A2780RCIS 10 µg/ml, D43/86RCIS 2 µg/ml und MewoRCIS 1 µg/ml Medium.
Zweimal wöchentlich wurde der Zustand der Zellen mikroskopisch beurteilt (Zelldichte, eventuelle Infektionen oder abgestorbene Zellen). Je nach den Erfordernissen wurden die Zellen trypsiniert (50-100 µl Trypsin-Lösung/cm2 Zellkulturgefäßboden; Inkubation bei 37 °C bis zum Ablösen der Zellen), um ihre Anzahl im Zellkulturgefäß zu verringern oder nur ein Mediumwechsel durchgeführt.
Trypsin-Lösung
Die Trypsin/EDTA-Lösung (Biochrom AG) enthält 0,5 % Trypsin und 0,2 % EDTA in 10 x PBS. Diese Lösung wurde vor Gebrauch 1:10 mit autoklaviertem A. bidest. verdünnt und sterilfiltriert.
Die Zellen wurden bei Konfluenz trypsiniert, 1:1 mit Medium versetzt, um das Trypsin zu inhibieren, und 5 min bei 950 rpm und 25 °C zentrifugiert (Zentrifuge: GS-6KR, Beckman-Coulter, 200 x g). Das Zellpellet wurde in 95 % FKS und 5 % DMSO resuspendiert (ca. 2 x 106 Zellen/ml). Diese Zellsuspension wurde in Aliquots von je 1 ml in Einfrierröhrchen überführt. Über Nacht wurden diese Röhrchen in einer mit Isopropanol gefüllter Einfrierbox langsam auf –80 °C abgekühlt. Danach wurden die Röhrchen in andere Boxen umgelagert und weiterhin bei –80 °C gelagert. Bei Bedarf wurden die Röhrchen aufgetaut und die Zellsuspension in ein Zellkulturgefäß mit modifiziertem L-15-Medium gegeben. Nach dem Anheften der Zellen, spätestens jedoch nach 24 h, wurde ein Mediumwechsel durchgeführt.
Die Transfektionen wurden mit Hilfe des DMRIE-C-Reagenzes (GibcoBRL) durchgeführt. Es wurden Zellen der Linie A2780 bzw. A2780RCIS (ohne Zytostatikum im Medium) in Zellkulturgefäßen mit 3,5 cm Durchmesser ausgesät und mindestens 24 h bis zu einer Konfluenz von 30-50 % kultiviert. Plasmid-DNA (Kap. 2.2.6) wurde mit 1/10 3 M Natriumazetat (pH 5,2) und 2,5 Volumen absolutem Ethanol 30 min bei –20 °C gefällt und anschließend 20 min bei 4 °C und 14 000 rpm (Zentrifuge: 5417R, Eppendorf) zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20 µl sterilem 10 x PCR-Puffer (inklusive 15 mM MgCl2, Perkin Elmer) aufgenommen, unter sterilen Bedingungen ein Aliquot abgenommen und die DNA-Menge spektrophotometrisch bestimmt. 2 µg Plasmid-DNA wurden zu 1 ml OPTI-MEM gegeben. 5 µl DMRIE-C-Reagenz wurden in einem zweiten Röhrchen in ebenfalls 1 ml OPTI-MEM aufgenommen. Die beiden Lösungen wurden zueinander gegeben und vorsichtig gemischt. Damit sich die Lipid-DNA-Komplexe bilden konnten, wurde die Lösung 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Zellrasen wurde 1 x mit 2 ml OPTI-MEM gewaschen und das Medium mit den Lipid-DNA-Komplexen zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden 5 h mit dieser Lösung bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank inkubiert. Die Transfektionslösung wurde entfernt, 2,5 ml modifiziertes L-15-Medium zu den Zellen gegeben und die Zellen wie gewohnt weiter kultiviert. Nach 24 h wurden die Zellen trypsiniert und auf Zellkulturschalen mit 10 cm Durchmesser umgesetzt. Gleichzeitig wurden die Zellen ab diesem Zeitpunkt unter einem Selektionsdruck von 800 µg/ml G418 gehalten. Nach ca. 2 Wochen konnten die
Plattenkulturen
E.coli-Kulturen wurden auf LB-Agar-Platten (Schalen mit 10 cm Durchmesser und 20 ml LB-Agar), die 100 µg/ml Ampicillin oder Carbenicillin enthielten, mittels Spatel ausplattiert und bei 37 °C im Brutschrank für 16-20 h angezogen.
LB-Agar
Schüttelkulturen
E. coli-Kulturen wurden in 5 ml-Ansätzen über Nacht in LB-Medium unter Zusatz von Ampicillin oder Carbenicillin (Endkonzentration: 100 µg/ml) bei 37 °C unter Schütteln bei 160 rpm angezogen.
LB-Medium
Anlage von Stammkulturen
Zur langfristigen Lagerung wurden Bakterien nach Schüttelkultur in LB-Medium mit 20 % (v/v) Glyzerin aufgenommen und bei –80 °C gelagert. Zur Reaktivierung wurden diese Stammkulturen aufgetaut und einige µl in LB-Medium unter Zusatz von 100 µg/ml Ampicillin oder Carbenicillin erneut als Schüttelkultur herangezogen.
Für die Transformationen wurde der One ShotTM Reagent-Kit (Invitrogen) verwendet. Zu 50 µl auf Eis aufgetauter Bakteriensuspension (TOP10F’-E.coli-Stamm) wurden 2 µl 0,5 M β-Mercaptoethanol gegeben, vorsichtig gemischt, 2 µl ligiertes Plasmid (Kap. 2.2.18) zugegeben und 30 min auf Eis inkubiert. Danach erfolgte ein Hitzeschock bei 42 °C für 30 s. Die Bakterien wurden erneut auf Eis gestellt und nach ca. 2 min unter sterilen Bedingungen 250 µl SOC-Medium zugegeben. Die transformierten Bakterien wurden 1 h bei 37 °C unter Schütteln von 170 rpm inkubiert, 100 µl Bakteriensuspension auf vorbereitete LB-Agar-Platten ausplattiert und über Nacht kultiviert (Kap. 2.2.4).
Die Plasmid-DNA wurde mit dem QIAprep-Spin-Plasmid-Kit (Qiagen) isoliert. 4 ml der Übernachtkulturen von E. coli wurden bei 3000 rpm und Raumtemperatur für 5 min pelletiert (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf) und nach Protokoll weiterbehandelt. Die Plasmid-DNA wurde mit 50 µl Elutionspuffer eluiert.
Die Restriktion der DNA mit Restriktionsendonukleasen erfolgte nach den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen für das jeweilige Restriktionsenzym in 20 µl-Ansätzen. Nach Zugabe der Restriktionsendonuklease (10 U) und dem dazu passenden Puffer wurden die Ansätze mit Plasmid-DNA bei 37 °C ca. 2 h oder über Nacht inkubiert.
Gesamt-RNA wurde aus eukaryotischen Zellen unter Verwendung von Trizol® (GibcoBRL) isoliert. Die Zellen wurden unter Zugabe von 1 ml Trizol®/10 cm2 bewachsene Fläche in ihrem Zellkulturgefäß lysiert und dieses Lysat in ein phenolbeständiges 15 ml-Röhrchen überführt. Pro ml Trizol wurden 0,2 ml Chloroform zugegeben, ca. 15 s intensiv geschüttelt
Der aufzutrennenden RNA wurde 1,8 Volumen RNA-Ladepuffer zugesetzt. Die Proben wurden bei 65 °C denaturiert, danach sofort auf Eis überführt und nach dem Abkühlen aufgetragen. Die gelchromatographische Auftrennung erfolgte bei 75 V in 1,0 %igen Agarosegelen in 1 x MOPS-Puffer und 6 % Formaldehyd. Als Laufpuffer wurde 1 x MOPS-Puffer verwendet. Zur Orientierung wurden in einer zusätzlichen Bahn 1 µl farbstoffenthaltender 6 x Blue/Orange Loading Dye (Promega) aufgetragen.
Die Konzentrationsmessung von Nukleinsäuren wurde am UV-Spektrophotometer (Hitachi) bei einer Wellenlänge von 260 nm durchgeführt. Für die Bestimmung der Konzentrationen wurden folgende Umrechnungsfaktoren berücksichtigt: 1 OD entpricht 50 µg/ml doppelsträngiger DNA bzw. 40 µg/ml RNA.
Nach der elektrophoretischen Auftrennung von RNA (Kap. 2.2.9) wurde das Agarosegel 30 min durch Schwenken in A. bidest. gewaschen. Die RNA wurde über Nacht unter Verwendung von 10 x SSC als Transferpuffer auf eine positiv geladene Nylonmembran (Amersham Pharmacia Biotech) transferiert (Kapillarblot nach Sambrook und Russell, 2001). Die Blot-Effektivität wurde durch Vergleich von Gel und Membran auf dem UV-Transilluminator (MWG-Biotech) kontrolliert. Im UV-Crosslinker (Hoefer) wurde die RNA mit der Nylonmembran quervernetzt (0,12 mJ/cm2). Diese Blots konnten entweder sofort verwendet oder trocken bei Raumtemperatur gelagert werden.
Für die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde das MegaprimeTM DNA Labelling System (Amersham) verwendet. 25 ng der zu markierenden DNA wurden in 28 µl A. bidest. aufgenommen und 5 µl Hexanukleotid-Zufallsprimer dazugegeben. Die DNA-Doppelstränge wurden bei 95 °C aufgeschmolzen. Während das Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur verblieb, wurden 10 µl 5 x Markierungspuffer, 5 µl 32P-dCTP (50 µCi) und 2 µl (1 U/µl) DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben und vorsichtig gemischt. Die Markierung erfolgte bei 37 °C für 30 min. Anschließend wurde die DNA erneut bei 95 °C denaturiert und auf Eis abgekühlt.
Die Blots (Kap. 2.2.11) wurden bei 58 °C für mindestens eine Stunde in ExpressHybTM Hybridisierungslösung (Clontech) prähybridisiert. Danach wurde die markierte Sonde (Kap. 2.2.12) zugegeben. Die Hybridisierung erfolgt über Nacht bei 58 °C. Die nicht gebundene DNA wurde am nächsten Tag in vier aufeinanderfolgenden Waschschritten entfernt: 2 x 15 min bei Raumtemperatur mit 2 x SSC (Kap. 2.2.12)/0,1 % SDS und 2 x 15 min bei 58 °C in 0,1 x SSC/0,1 % SDS. Die Exposition der Blots erfolgte auf Röntgenfilm (Kodak).
Entfernung von gebundenen Sonden
Eine 0,1 %ige SDS-Lösung in A. bidest. wurde hergestellt und aufgekocht. Die bereits benutzte Membran wurde in die Lösung gegeben und 30 bis 60 min in der sich abkühlenden Flüssigkeit inkubiert. Danach konnte sie erneut für eine Hybridisierung verwendet werden.
Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen wurde unter Verwendung des Superscript Preamplification System for First Stand cDNA Synthesis (GibcoBRL) in cDNA nach den Angaben des Herstellers umgeschrieben. Es wurden Hexanukleotide mit zufälliger Sequenz als Primer verwendet, um pro Ansatz 2 µg Gesamt-RNA umzuschreiben. Die cDNAs wurden 1:50 für RT-PCR bzw. 1:5 für die Quantifizierung mittels real-time-RT-PCR in A. bidest. verdünnt.
1. Thermische Aktivierung der Polymerase: 12 min, 94 °C;
2. DNA-Amplifikation in 36 Zyklen, bestehend aus
2.1 Denaturierung der Doppelstrang-DNA: 60 s, 94 °C;
2.2 Hybridisierung der Primer an die komplementären Sequenzen: 90 s, bei TH (Tab. 2.3);
2.3 Elongation der Primer: 90 s, 72 °C;
3. Extension: 5 min, 72 °C
4. Abkühlung: ohne Zeitvorgabe, 4 °C.
Der Advantage®-Polymerase-Mix (Clontech) enthält die KlenTaq-1-DNA-Polymerase, eine weitere Polymerase, die eine 3‘-5‘-Korrekturleseaktivität besitzt, und den TaqStartTM- Antikörper, damit eine automatische hot start-PCR ermöglicht wird. Dieser Polymerase-Mix bietet durch seine besondere Zusammensetzung u. a. die Möglichkeit, besonders lange PCR-Fragmente zu amplifizieren. Die PCR-Ansätze waren wie folgt zusammengesetzt:
Die Amplifikation erfolgte im PCR-Thermal Cycler (Biometra) nach folgendem Programm:
1. Initiale Denaturierung: 1 min, 94 °C;
2. DNA-Amplifikation in 36 Zyklen, bestehend aus
2.1 Denaturierung der Doppelstrang-DNA: 30 s, 94 °C;
2.2 Hybridisierung der Primer an die komplementären Sequenzen: 30 s, bei TH (Tab. 2.3);
2.3 Elongation der Primer: 6 min, 68 °C;
3. Extension: 6 min, 68 °C
4. Abkühlung: ohne Zeitvorgabe, 4 °C.
Real-time -RT-PCR im Lightcycler:
Die Lightcycler-Technologie (Roche) bietet die Möglichkeit, den Verlauf einer PCR am Computer-Monitor mitzuverfolgen und aufgrund einer mitlaufenden Standardreihe mittels mathematischen Methoden auf die Ausgangsmolekülzahl in einer Probe für eine bestimmte Matrize zu schließen. Die PCR-Ansätze waren wie folgt zusammengesetzt:
In einem Lauf konnten bis zu 32 PCRs gleichzeitig durchgeführt werden. Es wurden bei jedem Lauf eine Nullkontrolle (A. bidest.) und eine Standardreihe von 6 bis 8 Proben (in 2er oder 10er Verdünnungsstufen) mitgeführt. Vor jeder Quantifizierung wurde der spezifische Meßpunkt für eine PCR bestimmt. Dazu wurde eine Probe-PCR für die Matrize durchgeführt und die Schmelzkurve für das Produkt analysiert. Die Meßtemperatur (TMeß) wurde so ausgewählt, daß sie knapp vor dem Abschmelzen des PCR-Produktes lag. Bei dieser Temperatur liegen eventuelle Primer-Dimere bereits als DNA-Einzelstränge vor und werden somit nicht mitgemessen.
Die Amplifikation erfolgte im LightCycler (Roche) nach folgendem Programm:
1. Initiale Denaturierung: 10 min, 95 °C;
2. DNA-Amplifikation in 40-50 Zyklen, bestehend aus
2.1 Denaturierung der Doppelstrang-DNA: 15 s, 95 °C;
2.2 Hybridisierung der Primer an die komplementären Sequenzen: 5 s, bei TH (Tab. 2.3);
2.3 Elongation der Primer: 10 s, 72 °C;
2.4 Meßpunkt: ohne Zeit, TMeß, messen;
3. Schmelzkurve: ohne Zeit, 95 °C; 15 s, 65 °C; in 0,1 °C/s auf 95 °C, fortwährend messen;
4. Abkühlung: 30 s, 40 °C.
Die gelchromatographische Auftrennung von DNA erfolgte bei 85 V in 1,0-1,5 %igen Agarosegelen mit 1 x TAE als Laufpuffer. Die Gele enthielten 0,2 µg/ml Ethidiumbromid. Den Proben wurde anteilig 6 x Blue Orange Loading Dye (Promega) zugesetzt. Nach dem
Nach Agarosegel-Elektrophorese (Kap. 2.2.16) wurde die DNA-Fragmente unter UV-Licht mit einem Skalpell ausgeschnitten. Für die Gelelution wurde der QIAquick Gel Extraction-Kit (QIAGEN) verwendet und nach dem Herstellerprotokoll vorgegangen. Die DNA wurde in 30 oder 50 µl Elutionspuffer aufgenommen.
Ligation mit T4-DNA-Ligase:
Die Ligation erfolgt über Nacht bei 12 °C.
Ligation von PCR-Produkten:
Die Ligation erfolgte mit den Kits TOPO TA Cloning® (Vektor: pCR® 2.1 TOPO) und Eukaryotic TOPO TA Cloning® (Vektor: pcDNA3.1/V5/His-Topo) von Invitrogen nach den Angaben des Herstellers.
Die zu sequenzierende Plasmid-DNA wurde auf eine Konzentration von 0,1 µg/µl eingestellt. Anschließend wurde die Sequenzierung von Dr. Martin Meixner am Institut für Genetik der Humboldt-Universität zu Berlin durchgeführt. Es wurden der DNA-Sequenzierautomat ABI-373 und der ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit verwendet.
Um für Ribozyme gut zugängliche Sequenzen in der Ziel-mRNA zu identifizieren, wurden die Programme DNASIS 3.0 (Hitachi) und mFOLD 3.1 (http://bioinfo.math.rpi.edu) genutzt. Da die Gesamt-mRNA für eine Faltungsanalyse zu lang war (die vom Anbieter gesetzten Grenzen liegen bei 3000 nt), wurden innerhalb der MRP2-mRNA kürzere Bereiche (Größe 1000 bis 2000 nt) gewählt. Bei der Auswahl der Ribozyme wurde diejenige potentielle Sekundärstruktur betrachtet, die über die geringste freie Energie ΔG verfügt (Zarrinkar und Williamson, 1994; Zuker und Stiegler, 1981).
Um die ausgewählten Ribozyme in vitro mittels T7-Polymerase transkribieren zu können, müssen die Ribozym-DNA-Matrizen eine vorangestellte T7-Promotorsequenz besitzen. Die Einzelstrang-Oligonukleotide RcMAT7-fw/rev und RcMBT7-fw/rev wurden chemisch synthetisiert (Tab. 2.1). Je 2,5 nmol T7-Promotor-Ribozym-Oligonukleotid (fw und rev) wurden zusammengegeben und folgendes Temperaturprotokoll durchgeführt:
Denaturierung der ssDNA-Oligonukleotide: 2 min 94 °C;
Hybridisierung der ssDNA-Oligonukleotide: 8 min 70 °C;
Abkühlung der dsDNA-Oligonukleotidlösung: auf 4 °C.
Als Matrizen für die in vitro-Transkription wurden die zu Doppelsträngen hybridisierten T7-Promotor-Ribozym-Oligonukleotide (Kap. 2.2.21) und PCR-Produkte für die Substrate mit vorangestelltem T7-Promotor verwendet (Kap. 2.2.15, Tab. 2.3). Die Reaktionsansätze waren wie folgt zusammengesetzt:
Die Ansätze wurden 2 h bei 37 °C inkubiert und anschließend die Reaktion durch Zugabe von 10 µl 3 x PAGE-Auftragepuffer abgestoppt.
Die Auftrennung der in vitro-Transkriptionsprodukte sowie die Charakterisierung der Ribozyme durch zeit- und substratabhängige Kinetiken erfolgte mittels PAGE in 1 x TBE als Laufpuffer. Das Gel setzte sich wie folgt zusammen:
Die Bestandteile wurden zusammengegeben, der Harnstoff gelöst und die Lösung durch Filtern entgast. Für die Polymerisierung wurden weiterhin zugegeben:
Die Auftrennung erfolgte bei kurzen Gelen (Länge: 20 cm) zunächst 20 min bei 15 W, anschließend bis zur kompletten Auftrennung bei 25 W. Bei langen Gelen (Länge: 42 cm) erfolgte der Lauf zuerst 30 min bei 20 W, danach bis zur vollständigen Auftrennung bei 40 W. Nach Exposition auf Röntgenfilm (Kodak) bei –80 °C konnten die in vitro-Transkriptionsprodukte nach ca. 15 min bzw. bei analytischen Gelen die Ausgangs- und Spaltprodukte eines Schnittversuchs nach 1-3 Tagen sichtbar gemacht werden.
Röntgenfilm und Polyacrylamidgel wurden zur Deckung gebracht. In Höhe der Banden auf dem Film wurde der entsprechende Gelbereich ausgeschnitten, die Probe in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt und mit einer Pipettenspitze zerkleinert. Nach Zugabe von 400 µl RNA-Elutionspuffer wurden die Proben durch sequenzielles Einfrieren mit flüssigem Stickstoff und anschließendem Auftauen bei 37 °C weiter aufgeschlossen. Die Proben wurden über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Proben 5 min
RNA-Elutionspuffer
Die Stoffmenge radioaktiv markierter RNA kann aus der im β–Counter gemessenen Stahlung berechnet werden.
In die Berechnung ging außerdem der Faktor W ein, der den Einbau von unmarkiertem UTP an einer beliebigen Position des transkribierten Moleküls beschreibt. Dieser Faktor wird aus dem Quotienten der Stoffmenge eingesetzten unmarkierten UTPs und der Anzahl von UMPs je transkribiertem Molekül berechnet:
Somit ergibt sich die Stoffmenge des Transkriptes nTranskript aus dem Produkt der gemessenen Radioaktivität der Probe Ameß und dem Quotienten W/A:
Die ribozymatische Spaltung der RNA in vitro wurde in einem Gesamtvolumen von 10 µl unter Anwesenheit von unterschiedlichen Mengen Substrat und Ribozym (Tab. 2.4) in 1 x Ribozym-Puffer bei 37 °C durchgeführt. Nach bis zu fünfstündiger Inkubation wurden die Ansätze mit 10 µl 3 x PAGE-Auftragepufffer (Kap. 2.2.22) versetzt.
Die Initialgeschwindigkeit vini der ribozymatischen RNA-Spaltung bezeichnet die Geschwindigkeit der Umsetzung des ungespaltenen RNA-Substrates S in die beiden Spaltprodukte P bei anfänglichem Substratüberschuß. Sie wird aus dem Quotienten der Stoffmenge des gebildeten Produktes P zum Zeitpunkt t errechnet (Hendry et al., 1997):
Die Initialgeschwindigkeit entspricht dabei dem Anstieg im angenommenen linearen Anfangsbereich des Graphen n(Pt) = f(t), da dieser Bereich die Reaktion unter Substratüberschuß widerspiegelt.
Der Reaktionsparameter kcat/kM (nach Heidenreich & Eckstein, 1992) wurde aus der ribozym-konzentrationsabhängigen Spaltung des RNA-Substrates nach folgender Gleichung berechnet:
Die Gültigkeit ist auf einen Bereich beschränkt, bei dem bei steigender Ribozymkonzentration auch eine Zunahme der Spaltprodukte zu verzeichnen ist. Der Parameter kcat/kM ist nach Umstellung der Heidenreich´schen Formel wie folgt definiert:
Der Parameter kcat/kM entspricht dem Anstieg im angenommenen linearen Teils des –ln Su/t = f(cRz)-Diagramms.
Eine weitere Berechnungsmöglichkeit (Hendry et al., 1995) berücksichtigt, daß die Reaktion nicht bis zum vollständigen Abbau des Substrates fortschreitet, sondern in der Praxis einen Maximalwert an gespaltenem Substrat bzw. entstandenem Produkt annimmt. Daher kann man den folgenden Zusammenhang definieren:
Der Parameter kcat/kM nach Hendry et al. (1995) entspricht dem Anstieg des angenommenen linearen Abschnitts des Graphen im –ln Smax/t = f(cRz)-Diagramm.
Der kinetische Parameter kobs beschreibt den beobachteten Stoffumsatz für die Gesamtreaktion aus Assoziation des Ribozyms mit seinem Zielmolekül und der Spaltung selbst. Er wurde nach seiner Definition (Heidenreich et al., 1994) aus der zeitabhängigen Kinetik ermittelt:
Der Parameter kobs nach Heidenreich et al. (1994) entspricht dem Anstieg des angenommenen linearen Abschnitts des Graphen im –ln Su = f(t)-Diagramm. Analog zu den Berechnungen von kcat/kM wurde berücksichtigt, daß die Reaktion nicht bis zum vollständigen Abbau des Substrates fortschreitet und kobs nach Hendry et al. (1995) berechnet:
Der Parameter kobs nach Hendry et al. (1995) entspricht dem Anstieg des angenommenen linearen Abschnitts des Graphen im –ln((P∞-Pt)/PΔ) = f(t)-Diagramm.
Eukaryotische Zellen wurden in Zellkulturschalen mit einem Durchmesser von 8 cm ausgesät. Bei einer Konfluenz von ca. 80 % wurde das Zellkulturmedium abgesaugt und die Zellen zweimal mit eiskaltem 1 x PBS gewaschen. Die Schalen wurden auf Eis gestellt, je 3 ml Hypolyse-Puffer zugegeben, kurz geschwenkt und 5 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden abgeschabt, die Suspension in einen Homogenisator überführt und durch 10-12maliges Hochziehen und Runterdrücken des Pistills geschert. Die Suspension wurde in 15 ml-Röhrchen überführt und 10 min bei 4 °C und 2200 rpm (Zentrifuge: GS-6KR, Beckman-Coulter, 1100 x g) zentrifugiert. Der Überstand wurde in Ultrazentrifugen-Röhrchen gegeben und 30 min bei 4 °C und 60 000 rpm (Zentrifuge: OptimaTM TL, Beckman-Coulter, 153 000 x g) zentrifugiert. Das Pellet wurde in einer geeigneten Menge 4 x Proben-Puffer (50-200 µl) resuspendiert, 10 min bei 95 °C inkubiert und erneut 5 min bei 14 000 rpm und 4°C und zentrifugiert. Der Überstand wurde aliquotiert und bei –80 °C gelagert.
1 Cocktail-Tablette mit Proteinase-Inhibitoren (Roche) wird in 2 ml A. bidest. vollständig aufgelöst. Diese 2 ml werden zu 48 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) gegeben. Die Lösung ist ca. 2 Wochen bei 4 °C lagerbar.
In 2 ml Reaktionsgefäßen wurde je 1 ml Elutionslösung für Protein-Färbung vorgelegt. Auf einer Nitrozellulosemembran wurden nebeneinander 2 µl-Tröpfchen von den zu bestimmenden Proteinlösungen gesetzt (Doppelbestimmung). Außerdem wurde - ebenfalls als Doppelbestimmung - BSA in 1 x PBS (Kap. 2.2.28) in bekannter Proteinkonzentration als Eichreihe mitgeführt. Die Membran wurde für 60-90 s mit einer Amidoschwarzlösung gefärbt. Nach Abkippen der Färbelösung wurde die Membran mittels Entfärber-Lösung so lange entfärbt, bis die Nitrozellulosemembran des Hintergrundes wieder fast weiß war. Die Protein-Punkte waren nun blau. Mit einem Skalpell wurden die Punkte samt Hintergrund in annähernd gleich großen Quadraten ausgeschnitten und in die vorbereiteten Reaktionsgefäße mit der Elutionslösung gegeben. Für den Referenzwert wurde ein Quadrat mit Hintergrund ausgeschnitten. Die Reaktionsgefäße wurden ca. 20 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Dabei ging die Blaufärbung auf den Elutionspuffer über. Diese gefärbte Lösung wird in Einmal-Küvetten gegeben. Unter Nutzung des Spektrophotometers (Pharmacia) und dem Programm VWSS (Pharmacia) wurde der Referenzwert Null gesetzt und die Extinktion der Proben bei einer Wellenlänge von 630 nm bestimmt. Nach Auftragen der Eichkurve konnte die Proteinkonzentration der Proben ermittelt werden.
30 µg Membranproteine wurden mit 2 x Probenpuffer (Kap. 2.2.28) auf 15 µl eingestellt und 5-10 min bei 95 °C denaturiert. Die Proben wurden 1 min bei 14 000 rpm (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf) zentrifugiert und der Überstand aufgetragen. Die Auftrennung der Membranproteine erfolgte mittels PAGE in 1 x Laufpuffer zunächst 30 min bei 65 V, danach für weitere 1,5 bis 2 h bei 95 V.
7,5 %iges Trenngel
10 x Laufpuffer
Nach der PAGE für Proteine wurden das Sammelgel abgetrennt. Trenngel, Zellulosenitrat-Membran und 6 Lagen Whatman-Papier gleicher Größe wurden in 1 x Transfer-Puffer äquilibriert. Der Transfer erfolgte in einer Semi-dry-Blotapparatur (Biometra), wobei die sandwich-artige Übereinanderschichtung von Whatman-Papier, Membran und Gel nach den Angaben des Herstellers ausgeführt wurde, bei 3 mA/cm2 Blotfläche für 90 min.
1 x Transferpuffer
Nachdem die nach ihrer Größe aufgetrennten Proteine auf Nitrozellulose-Membranen transferiert wurden, schloß sich der Nachweis von Proteinen an, die sich auf diesen Membranen befanden. Das MRP2-Protein wurde gleichzeitig mit Aktin (Kontrolle der
0,05% TBST
Der Zellproliferationsassay basierend auf einer Färbung mittels SRB bietet eine Möglichkeit, behandelte und unbehandelte Zellen hinsichtlich ihrer Zellzahl zu vergleichen, die mit der gefärbten Proteinmenge korreliert (Perez et al., 1993).
Es wurden auf einer 96-Kaviditäten-Mikrotiterplatte 3 x 10 Kaviditäten pro Testreihe mit je 800 Zellen/Vertiefung in je 100 µl modifiziertem L-15-Medium ausgesät. Auf diese Weise konnten zwei Tests pro Platte durchführt werden. Der verbleibende Rand wurden als Verdunstungsschutz mit je 200 µl sterilem 1 x PBS belegt (Kap. 2.2.28). Nach 24 h wurden 100 µl zytostatikahaltiges Medium zugegeben und die Zellen für weitere 5 Tage kultiviert. Danach wurde das Medium abgenommen und die Zellen mit 10 % Trichloressigsäure 1 h bei 4 °C fixiert. Der Zellrasen wurde 5 x mit Wasser gewaschen und eine Proteinfärbung für 10 min mittels SRB-Färbelösung (100 µl/Kavidität) durchgeführt. Die Färbelösung wurde mittels fünfmaliger Waschungen mit 1 %iger Essigsäure entfernt und die Mikrotiterplatten
SRB-Färbelösung
Eukaryotische Zellen wurden in Kulturschalen mit 3,5 cm Durchmesser ausgesät (Dreifachbestimmung) und bis zu 80 % Konfluenz kultiviert. Die Zellen wurden trypsiniert und 1:1 mit Medium versetzt, um das Trypsin zu inhibieren. Nach der Bestimmung der Zellzahl wurden die Zellen bei Raumtemperatur und 950 rpm 5 min pelletiert (Zentrifuge: GS-6KR, Beckman-Coulter, 200 x g) und in 100 µl 6 %iger Trichloressigsäure resuspendiert. Durch starkes Vortexen wurden die Zellen aufgeschlossen, die Zelltrümmer 4 min bei 12 000 rpm (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf) abzentrifugiert und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Mit diesem Zelllysat wurde die zweistufige Glutathionbestimmung (modifiziert, Tietze, 1969) durchgeführt. Durch Mitführung von Standardreihen für GSH und GSSG konnten die Glutathionmengen in den Lysaten quantifiziert werden.
Bestimmung von reduziertem Glutathion (GSH)
40 µl Zelllysat wurden in eine 96-Kaviditäten-Mikrotiterplatte pipettiert, 80 µl Ellman´s Puffer (0,3 M Dinatriumhydrogenphosphat in A. bidest.) und 10 µl Ellman´s Reagenz (0,04 % (w/v) 5,5‘-Dithiobis-(2-nitrobenzoe)-säure in 0,1 % (w/v) Trinatriumzitrat, in A. bidest.) zugegeben. Die Platte wurde kurz geschüttelt und sofort im Plattenlesegerät EL 340 bei 405 nm gegen 690 nm Referenzwellenlänge gemessen.
Bestimmung von Gesamt-Glutathion (GSH und GSSG)
Eukaryotische Zellen wurden in Zellkulturgefäßen mit 75 cm2 Kulturfläche ausgesät (Doppelbestimmung) und bei ca. 60 % Konfluenz für 24 h mit Cisplatin (0, 25 oder 100 µM) behandelt. Die Zellen wurden trypsiniert und 1:1 mit modifiziertem L-15-Medium versetzt. Die Zellzahl wurde bestimmt, 2 x 106 Zellen abgenommen, pelletiert, mit eiskaltem 1 x PBS (Kap. 2.2.28) gewaschen und erneut pelletiert (Zentrifuge: GS-6KR, Beckman-Coulter, 200 x g). Für die Bestimmung der Caspase-3-Aktivität wurde der Caspase 3 Activity Assay (Roche) verwendet und die Prozedur nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Proben wurden im Plattenlesegerät SPECTRA-FLUOR (Tecan) mit einem Excitation-Filter von 405 nm und einem Emission-Filter von 535 nm gemessen. Anhand der mitgeführten Standardreihe für den Fluoreszenzfarbstoff AFC konnte die Caspase-3-Aktivität quantifiziert werden.
Eukaryotische Zellen wurden in Zellkulturgefäßen mit 3,5 cm Durchmesser ausgesät und bei einer Konfluenz von ca. 60 % mit Cisplatin (0, 25 oder 100 µM) für 2 bis 72 h behandelt. Die Zellen wurden trypsiniert, mit eiskaltem 1 x PBS (Kap. 2.2.28) gewaschen, pelletiert (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf, 3000 rpm) und in 1 ml 70 %igem Ethanol aufgenommen. Bis zum Tag der Messung wurden die Zellen bei 4 °C aufbewahrt. Vor der Messung wurden die Zellen pelletiert (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf, 3000 rpm), in 1 ml Lösung A aufgenommen
Um einen generellen Mechanismus für die Cisplatinresistenz zu finden, wurden drei verschiedene humane Karzinomzellinien und ihre jeweiligen cisplatinresistenten Varianten ausgewählt. Es handelte sich um die Ovarialkarzinomzellinien A2780 und A2780RCIS, die Nebennierenrindenzellkarzinomzellinien D43/86 und D43/86RCIS, sowie die Melanomzellinien Mewo und MewoRCIS. Unter Nutzung eines Zellproliferationsassays (Kap. 2.2.33) wurde das Ausmaß der Resistenz durch Ermittlung der IC50 bestimmt. Die IC50 gibt die Konzentration des Zytostatikums an, bei welcher nur noch die Hälfte aller Zellen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle im Untersuchungsgefäß vorliegt. Es wurden IC50-Bestimmungen für die Zytostatika Cisplatin, Carboplatin, Daunorubicin, Vincristin und Etoposid durchgeführt (Abb. 3.1 und Tab. 3.1). Alle drei cisplatinresistenten Varianten waren kreuzresistent gegenüber Carboplatin. Die höchsten Resistenzfaktoren (Rf) im Vergleich zur Ausgangszellinie wies die Zellinie A2780RCIS mit einem Rf von 16,8 gegenüber Cisplatin und Rf von 21,6 gegenüber Carboplatin auf. Die Zellinie A2780RCIS war ebenfalls resistenter gegenüber Daunorubicin und Etoposid. Die Zellinie D43/86RCIS zeigte gegenüber diesen beiden Zytostatika jedoch keine Kreuzresistenz. In der Zellinie MewoRCIS wurde eine geringe Resistenzerhöhung gegenüber Daunorubicin und Etoposid festgestellt. In keinem der drei untersuchten Zellinienpaare wurde eine Kreuzresistenz gegenüber Vincristin beobachtet.
Es sollte der p53-Status in den Zellinien ermittelt werden, um den möglichen Einfluß auf die Zytostatikaresistenz in den Zellinien abschätzen zu können. Aus den Zellinien A2780, A2780RCIS, D43/86, D43/86RCIS, Mewo und MewoRCIS wurde Gesamt-RNA isoliert (Kap. 2.2.8), cDNA synthetisiert (Kap. 2.2.14) und der offene Leserahmen von p53 mittels RT-PCR (Kap. 2.2.15) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in den prokaryotischen Vektor pCR®2.1 kloniert (Kap. 2.2.18), in E. coli transformiert (Kap. 2.2.4 und 2.2.5), die Plasmide isoliert (Kap. 2.2.6) und mittels Restriktionsanalyse auf ein bestehendes Insert kontrolliert (Kap. 2.2.7 mit EcoRI). Die Plasmide mit vorhandenem Insert wurden unter Nutzung von M13-Primern sequenziert (Kap. 2.2.19).
Nach Abgleich der ermittelten Sequenz mit der Referenzsequenz für p53 (NM_000546.2) unter Nutzung von Standard-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) wurde die RT-PCR, Klonierung und Sequenzierung wiederholt, um die Ergebnisse zu verifizieren. Die Resultate sind in der Tab. 3.2 zusammengefaßt. Die Zellinie A2780 besitzt Wildtyp-TP53 mit einem genetischen Polymorphismus für die Aminosäure 72. Von einem genetischen Polymorphismus spricht man, wenn eine genetische Variante mit einer Häufigkeit von mehr als 1 % (bei Heterozygosität 2 %) in der Bevölkerung auftritt. In TP53 tritt wahlweise die
Nachdem das Ausmaß der Resistenz in den Zellinien A2780RCIS, D43/86RCIS und MewoRCIS im Vergleich zu ihren parentalen Ausgangslinien bekannt war, sollte im folgenden geklärt werden, wodurch sich diese Zellinien in der Expression bestimmter Gene unterscheiden. Es wurden eine Reihe von Genen ausgewählt, von denen aus vorangegangenen Untersuchungen bekannt war, daß sie im Rahmen des Erwerbs von Chemoresistenz verändert exprimiert werden können (Kap. 1.2). Dabei sollte möglichst ein Gen gefunden werden, welches in allen drei Zellinien gleichermaßen differenziell exprimiert wird, um einen generellen Mechanismus für Cisplatinresistenz zu finden.
Es wurde Gesamt-RNA aus den sechs Zellinien isoliert (Kap. 2.2.8), cDNA synthetisiert (Kap. 2.2.10 und 2.2.14) und RT-PCRs (Kap. 2.2.15) für LRP, die ABC-Transporter MRP1, MRP2, MDR1 und BCRP, sowie für Komponenten des MMR-Systems (
m
is
m
atch
r
epair system) hMLH1, hMSH2 und hPMS2 durchgeführt. Die Gleichmäßigkeit der cDNA-Menge der verschiedenen Zellinien wurde durch RT-PCR für das house-keeping Gen GAPDH kontrolliert (Abb. 3.2). Für LRP, hMSH2 und hPMS2 konnten keine Unterschiede zwischen den sechs verschiedenen Zellinien festgestellt werden. Die Expression von hMLH1 und
Abb.
3.3
:
Expression der MRP2-mRNA in den untersuchten Zellinien
Dieser Unterschied konnte im Northern-Blot (Kap. 2.2.8 bis 2.2.13) für A2780RCIS und MewoRCIS bestätigt werden (Abb. 3.3). Die Länge der MRP2-mRNA im Northern-Blot betrug 5 kb. Die Expression von MRP2 in den Zellinien D43/86 und D43/86RCIS war jedoch zu niedrig, um sie mit dieser Methode beurteilen zu können. Aus diesem Grund und um die
Um zu überprüfen, ob auch auf Proteinebene ein Unterschied in der MRP2-Expression besteht, wurden aus den Zellinien Membranproteine isoliert und diese im Western-Blot mit einem MRP2-Antikörper analysiert (Kap. 2.2.28 bis 2.2.32). Auch hier bestätigte sich die erhöhte Expression von MRP2 in den cisplatinresistenten Zellinien (Abb. 3.4), wobei die jeweiligen Unterschiede im Northern-Blot, Western-Blot und der real-time-RT-PCR vergleichbar waren.
MRP2 gehört zu einer Reihe von ABC-Transportern, die Konjugate mit Glutathion transportieren können. In diesem Zusammenhang spielt der Gehalt von Glutathion in der Zelle, besonders der Gehalt von reduziertem Glutathion, bei Transportprozessen eine Rolle (Kap. 1.2). Um die Möglichkeiten des Transports von Zytostatika, diskutieren zu können, wurde der Glutathion-Gehalt in den Zellinien A2780, A2780RCIS, D43/86, D43/86RCIS, Mewo und MewoRCIS bestimmt (Kap. 2.2.34). Es zeigte sich, daß die cisplatinresistenten Zellinien A2780RCIS und D43/86RCIS einen signifikant höheren Gehalt an reduziertem Glutathion aufwiesen als die parentalen Zellinien A2780 bzw. D43/86. Der Unterschied zwischen den Zellinien A2780 und A2780RCIS war für reduziertes Glutathion am größten und die Zellinie A2780 zeigte den niedrigsten Wert innerhalb der sechs untersuchten Zellinien. Die Zellinie D43/86RCIS zeigte außerdem einen signifikant höheren Wert für oxidiertes Glutathion. Die Zellinien Mewo und MewoRCIS zeigten keinen Unterschied in ihrem Glutathion-Gehalt, auch nicht innerhalb der Subgruppen.
Nach dem Vergleich der drei verschiedenen Zellinien und ihrer cisplatinresistenten Varianten (Kap. 3.1) wurde die Ovarialkarzinomzellinie A2780 und ihre resistente Sublinie für die weiteren Untersuchungen ausgewählt, da hier sowohl das Resistenzniveau als auch die Expression von MRP2 die größten Unterschiede gezeigt hatte. Im nächsten Schritt sollte MRP2 in der sensibleren Zellinie A2780 überexprimiert werden, um nach Analyse der entstehenden Klone, den Zusammenhang zwischen MRP2-Expression und Resistenz gegenüber Cisplatin (und eventuell weiteren Zytostatika) nachweisen zu können.
Aus der Zellinie A2780RCIS wurde Gesamt-RNA isoliert (Kap. 2.2.8), cDNA synthetisiert (Kap. 2.2.10 und 2.2.14) und der gesamte offene Leserahmen ( o pen r eading f rame, ORF) von MRP2 durch RT-PCR (Kap. 2.2.15) amplifiziert. Da der ORF mit ca. 4,6 kb sehr groß ist, wurde eine besondere Polymerase ausgewählt, die auch lange Bereiche amplifizieren kann und eine Korrekturlese-Aktivität besitzt. Trotzdem konnte erst durch PCR-Zusatzreagenzien, wie Betain und DMSO, ein PCR-Produkt erhalten werden (Abb. 3.6). Diese beiden Reagenzien bewirken eine Erhöhung der Ausbeute und der Spezifität für das gegebene PCR-Produkt.
Der amplifizierte ORF von MRP2 wurde in den Expressionsvektor pcDNA3.1 kloniert, der einen CMV-Promotor enthält (Kap. 2.2.18). Dieser Vektor wurde in E. coli vermehrt (Kap. 2.2.5), die Plasmide präpariert (Kap. 2.2.6) und durch Restriktionsanalyse mit KpnI das Vorhandensein und die Orientierung des Inserts überprüft (Kap. 2.2.7). Mehrere Klone wurden komplett sequenziert (Kap.2.2.19), um nach Sequenzvergleich mit der Datenbank
Es wurde überprüft, ob die bereits untersuchten Zellinien ebenfalls diese Mutation aufweisen. Der entsprechende Abschnitt von MRP2 wurde in den Zellinien A2780, D43/86, D43/86RCIS, Mewo und MewoRCIS ebenfalls mittels RT-PCR amplifiziert (Kap. 2.2.15). Die Produkte wurden in den prokaryotischen Vektor pCR2.1® kloniert, in E. coli vermehrt und sequenziert. Es stellte sich heraus, daß die parentale Zellinie A2780 diese Mutation ebenfalls aufweist, jedoch keine der anderen vier untersuchten Zellinien.
Nachdem der ORF von MRP2 in einem eukaryotischen Expressionsvektor vorlag, wurde dieses Konstrukt in die sensitivere Zellinie A2780 transfiziert (Kap. 2.2.3), die im Vergleich zu ihrer resistenten Variante A2780RCIS nur wenig eigenes MRP2 besitzt (Kap. 3.1.3). Zur Kontrolle des Experiments wurde parallel dazu die A2780 mit dem Expressionsvektor ohne MRP2-ORF (Leervektor, LV) transfiziert. Nach Selektion mit G418 bildeten sich in den Zellkulturschalen Klone, von denen 36 vereinzelt und propagiert wurden. Sie wurden im Proliferationsassay gegenüber Cisplatin getestet (Kap. 2.2.33). Lediglich 2 Klone zeigten eine Resistenzerhöhung gegenüber Cisplatin (Abb. 3.7) und wurden weiter untersucht.
Diese beiden Klone wurden auch auf ihre Kreuzresistenz gegenüber Carboplatin, Etoposid, Daunorubicin und Vincristin im Proliferationsassay mittels SRB getestet. Beide Klone zeigten eine erhöhte Resistenz gegenüber Carboplatin, die sogar höher ausfiel als gegenüber Cisplatin. Gegenüber Daunorubicin und Vincristin konnte keine veränderte Sensitivität in den MRP2-Transfektanten festgestellt werden, wobei die IC50-Werte gegenüber Vincristin bei Vergleich der untersuchten Zellinien starken Schwankungen unterlagen. Ein Klon zeigte eine Erhöhung der Resistenz gegenüber Etoposid, der andere Klon verhielt sich ähnlich wie die Leervektor-Transfektante (Tab. 3.4).
Es sollte untersucht werden, ob und wie sich die MRP2-Transfektanten hinsichtlich ihres Verhaltens gegenüber Cisplatin von der Ausgangslinie A2780 unterscheiden. Die Zellen wurden mit 25 µM Cisplatin kontinuierlich über mehrer Tage behandelt und die adhärenten Zellen nach verschiedenen Zeitpunkten geerntet. Nach Färbung mit Propidiumiodid und Messung der Zellen im Durchflußzytometer wurde der Anteil der Zellen in bestimmten Zellzyklusphasen prozentual im Vergleich zu allen im Zellzyklus befindlichen Zellen bestimmt (Kap. 2.2.36 und Abb. 3.8). In unbehandelten Zellen befanden sich die meisten Zellen in der G1-Phase. Im zeitlichen Verlauf unter Cisplatin-Behandlung nahm in den A2780 der Anteil der Zellen in der G1-Phase ab. Die Zellen befanden sich vermehrt in der S- und der G2-Phase. Außerdem wurden sehr viele tote Zellen im Zellkulturüberstand festgestellt, die nicht in diese Untersuchung einbezogen wurden. Im Vergleich dazu reagierte die cisplatinresistente Zellinie A2780RCIS nach 24 h mit einer verstärkten S-Phase. Danach normalisierte sich der Zellzyklus bis zum 3. Tag nach Behandlungsbeginn, obwohl das Zellkulturmedium weiterhin Cisplatin enthielt. Tote Zellen im Zellkulturüberstand wurden kaum beobachtet.
Im Folgenden sollte untersucht werden, ob sich die MRP2-Transfektanten in bezug auf ihr Apoptoseverhalten unterscheiden. Da sich in den Zellen im Agarosegel und nach Analyse mittels Durchflußzytometrie nach Cisplatin-Behandlung keine typische DNA-Fragmentierung nachweisen ließ (Daten nicht gezeigt), die Zellen jedoch nach Cisplatin-Behandlung (je nach Dosis) abstarben, stellte sich die Frage, wie in der Zellinie A2780 Apoptose ausgelöst wird bzw. ob sich die Klone im Ausmaß der Apoptose-Induktion unterscheiden. Die Zellinien A2780 und A2780RCIS, sowie eine MRP2-Transfektante und eine Leervektor-Transfektante wurden mit unterschiedlichen Cisplatin-Konzentrationen für 24 h behandelt und die hergestellten Zellysate auf ihre Caspase-3-Aktivität untersucht (Kap. 2.2.35).
In den vorangegangenen Experimenten (Kap. 3.1 und 3.2) zeigte sich bereits ein Zusammenhang zwischen MRP2-Expression und der Resistenz gegenüber Cisplatin und Carboplatin. Im Folgenden sollte untersucht werden, ob sich die Resistenz gegenüber diesen Zytostatika durch den Einsatz von Anti-MRP2- Hammerhead-Ribozymen verringern läßt.
Mit Hilfe der Computerprogramme DNASIS und mFOLD wurden Teilabschnitte der MRP2-mRNA auf Sekundärstruktur und die Lage der Zielsequenz 5’-GUC-3’ untersucht. Als potentielle Schnittstellen wurden diejenigen GUC-Motive betrachtet, die sich in einzelsträngigen Bereichen der berechneten Sekundärstrukturen mit der niedrigsten freien Energie ΔG befanden (Kap. 2.2.20). Die Faltungsanalysen wurden mit Nukleotidsequenzen der MRP2-mRNA von 200 bzw. 233 nt Länge durchgeführt, die im weiteren als Substrate für die in vitro-Untersuchungen verwendet werden sollten (Abb. 3.10). Für die folgenden Untersuchungen wurden Schnittstellen für zwei Anti-MRP2-Ribozyme, RzM1 und RzM2, ausgewählt. Die Struktur der Hammerhead-Ribozyme mit ihren Bindungssequenzen in der MRP2-mRNA ist in Abb. 3.11 dargestellt.
Die Matrizen für die Substrate sub1 und sub2 wurden mittels PCR hergestellt (Kap. 2.2.15), die sich nur durch ihre Länge am 3’-Ende unterscheiden (200 nt bzw. 233 nt ohne T7-Promotor-Sequenz). Für die Ribozyme wurden die T7-Promotor-enthaltenden Oligonukleotide RcMAT7-fw und RcMAT7-rev (für RzM1) sowie RcMBT7-fw und RcMBT7-rev (für RzM2) hybridisiert. Die Substrate und die Ribozyme wurden in vitro-transkribiert, nach PAGE aus dem Gel aufgereinigt und die entstandenen Stoffmengen quantifiziert (Kap. 2.2.21 bis 2.2.25), um in den folgenden Versuchen defininierte Mengen einsetzen zu können.
Um die Eigenschaften der Spaltung durch die Ribozyme RzM1 und RzM2 näher zu untersuchen und mit anderen Ribozymen aus der Fachliteratur vergleichen zu können, wurden mit Hilfe kinetischer Analysen die Initialgeschwindigkeit vini, sowie die Reaktionsparameter kcat/kM und kobs (nach Heidenreich & Eckstein, 1992; Heidenreich et al., 1994 und Hendry et al., 1995) bestimmt. Aufgrund der besseren Unterscheidbarkeit der Spaltprodukte im Polyacrylamidgel (Abb. 3.12) wurden die Spaltversuche für RzM1 durch Inkubation mit Substrat 2 und für RzM2 durch Inkubation mit Substrat 1 durchgeführt.
Es wurde eine zeitabhängige Reaktionskinetik aufgenommen, wobei das jeweilige Ribozym in einem Überschuß in einem Verhältnis von 5:1 eingesetzt wurde (Kap. 2.2.26). Die Spaltungen wurden nach unterschiedlichen Zeitpunkten abgestoppt, die Reaktionsprodukte mittels PAGE aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht (Abb. 3.13, Kap. 2.2.23). Die Bandenintensitäten wurden densitometrisch ausgemessen und für die Erstellung der kinetischen Kurven genutzt. Die Initialgeschwindigkeit vini wurde aus dem jeweiligen Anstieg im angenommenen linearen Anfangsbereich der Produktbildung in Abhängigkeit von der Zeit errechnet (Abb. 3.14, Kap. 2.2.27). Aus der Abb. 3.13 ist ersichtlich, daß auch nach fünf Stunden maximal beobachteter Reaktionszeit das Substrat nicht vollständig umgesetzt wurde und sich ein Gleichgewicht bei ca. 80 % einstellt. Dies trifft gleichermaßen auf die Ribozyme RzM1 und RzM2 zu. Die Initialgeschwindigkeit vini beträgt für Ribozym RzM1 0,127 ± 0,006 fmol/s und für Ribozym RzM2 0,086 ± 0,005 fmol/s (Materna et al., 2001). RzM1 zeigte in diesem Vergleich mit RzM2 die höhere Initialgeschwindigkeit.
Um die Reaktionsparameter kcat/kM (nach Heidenreich & Eckstein, 1992; nach Hendry et al., 1995) zu bestimmen, wurden für die beiden Ribozyme RzM1 und RzM2 konzentrationsabhängige Kinetiken durchgeführt. Das jeweilige Substrat wurde in der gleichen Konzentration eingesetzt und die Ribozymkonzentration variierte in jedem Ansatz (Kap. 2.2.26). Nach einer Inkubationszeit von 15 min wurde die Reaktion abgestoppt, die Produkte mittels PAGE aufgetrennt und durch Exposition auf Röntgenfilm sichtbar gemacht (Abb. 3.15, Kap. 2.2.23). Die Röntgenfilme wurden densitometrisch ausgewertet und die Werte nach den Berechnungen von Heidenreich & Eckstein (1992) bzw. nach Hendry et al. (1995) graphisch aufgetragen. Aus dem jeweiligen Anstieg des angenommenen linearen Bereichs zu Beginn der konzentrationsabhängigen Kinetiken wurden die Parameter kcat/kM berechnet (Abb. 3.16, Kap. 2.2.27).
Der Unterschied zwischen den beiden Berechnungsarten besteht darin, daß Heidenreich & Eckstein (1992) das eingesetzte Substrat als Maß in die Berechnung einfließen lassen, Hendry et al. (1995) dagegen berücksichtigen, daß nicht das gesamte Substrat abgebaut wird. Aus diesem Grund sind die kcat/kM-Werte nach Hendry et al. (1995) der Ribozyme RzM1 und RzM2 (9307 bzw. 4478 M-1 s-1; Materna et al., 2001) höher als die dazugehörigen kcat/KM-Werte (7719 bzw. 3671 M-1 s-1; Materna et al., 2001) nach Heidenreich & Eckstein (1992). Ein höherer kcat/kM-Wert macht deutlich, daß für den tatsächlich schneidbaren Anteil eingesetzten Substrates der katalytische Stoffumsatz kcat größer und/oder die Dissoziationskonstante kM kleiner als für das insgesamt eingesetzte Substrat ist. Als weiterer katalytischer Parameter wurde kobs aus den zeitabhängigen Kinetiken bestimmt (Kap. 2.2.27 und Abb. 3.17), wobei ebenfalls unterschieden wurde, ob das gesamte eingesetzte Substrat als abbaubar gilt (Heidenreich et al., 1994) oder nicht (Hendry et al., 1995). Die kobs-Werte
Die Ergebnisse aus den in vitro-Untersuchungen der Hammerhead-Ribozyme RzM1 und RzM2 (Kap. 3.3) haben gezeigt, daß beide Ribozyme in der Lage sind, in MRP2-Substraten im zellfreien System zu schneiden. Beide Ribozyme sind dabei ähnlich aktiv, wobei die katalytischen Parameter für RzM1 höher waren als für RzM2. Im Folgenden sollte die Wirksamkeit dieser Ribozyme in eukaryotischen Zellen getestet werden.
Als Modell wurde die humane Ovarialkarzinomzellinie A2780RCIS ausgewählt, da diese bereits in den Resistenz- und Expressionsanalysen (Kap. 3.1) den größten Unterschied in bezug auf Cisplatinresistenz und MRP2-Expression im Vergleich zu ihrer parentalen Zellinie A2780 gezeigt hatte. Die Ribozyme RzM1 und RzM2 wurden in den eukaryotischen Expressionsvektor pcDNA3.0 kloniert. Zusätzlich zu den funktionell aktiven Ribozymen, wurden auch katalytisch inaktive Punktmutanten zu RzM1 und RzM2 kloniert. Das für die Funktion wichtige Adenin A14 in der Hammerhead-Struktur des Ribozyms (Abb. 1.8) wurde durch ein Cytosin ersetzt. Die Oligonukleotide RibcMA-fw/rev (für RzM1), RibcMB-fw/rev (für RzM2), PMRibcMA-fw/rev (für RzM1/mut) und PMRibcMB-fw/rev (für RzM2/mut) wurden hybridisiert (Kap. 2.2.21) und gerichtet in den Expressionsvektor zwischen die Restriktionstellen KpnI/XbaI kloniert (Kap. 2.2.7. und 2.2.18). Die Plasmide wurden in E. coli vermehrt (Kap. 2.2.5 und 2.2.6) und zur Kontrolle der korrekten Sequenz und Orientierung sequenziert (Kap. 2.2.19). Die Zellinie A2780RCIS wurde mit RzM1, RzM2, RzM1/mut, RzM2/mut im Expressionsvektor oder dem unveränderten Expressionsvektor pcDNA3.0 transfiziert (Kap. 2.2.3). Nach der Selektion mit G418 wurden für RzM1 und RzM2 je 36 Klone, für RzM1/mut, RzM2/mut je 12 und den Leervektor (LV) 18 Klone vereinzelt und propagiert.
Die durch Transfektion erhaltenen Klone (Kap. 3.4.1) wurden im Proliferationsassay gegenüber Cisplatin getestet (Kap. 2.2.33). Für Ribozym RzM1 wurden 5 Klone und für Ribozym RzM2 6 Klone mit verändertem IC50-Wert gegenüber Cisplatin gefunden (Beispiele
Die ausgewählten Klone wurden auf ihr Kreuzresistenzmuster gegenüber den Zytostatika Carboplatin, Etoposid, Daunorubicin und Vincristin im Proliferationsassay mittels SRB getestet. Die Transfektanten für die Ribozyme RzM1 und RzM2 zeigten ebenfalls eine
Bei Behandlung mit Vincristin zeigte die Hälfte der Transfektanten eine sensitiveres Verhalten mit einer Halbierung der IC50. Diesen Unterschied gibt es aber nicht bei Vergleich der parentalen sensiblen Zellinie A2780 und ihrer cisplatinresistenten Variante A2780RCIS. Deswegen ist davon auszugehen, daß dieser Effekt nicht von der Expressionshöhe von MRP2 abhängt.
Die Leervektortransfektanten zeigten in Resistenzbestimmungen gegenüber Carboplatin, Daunorubicin, Vincristin und Etoposid keine Veränderungen im Vergleich zur untransfizierten Ausgangslinie A2780RCIS. Die Klone, die mit einem katalytisch inaktivem Ribozym transfiziert wurden, zeigten ähnliche Effekte wie die Transfektanten mit den Ribozymen RzM1 und RzM2. Die Ergebnisse dieser Kreuzresistenzuntersuchungen sind in der Tabelle 3.6 zusammengefaßt.
Es wurde zunächst überprüft, ob die Transfektanten wirklich den Expressionsvektor enthalten und das Ribozym exprimieren. Zu diesem Zweck wurde Gesamt-RNA aus den Klonen isoliert (Kap. 2.2.8), cDNA synthetisiert (Kap. 2.2.10 und 2.2.14) und RT-PCR mit den Primern vector-fw/rev durchgeführt, welche im Expressionsvektor binden (Kap. 2.2.15). Das PCR-Produkt enthielt somit Teile des Vektors und die Ribozym-Sequenz. Da das Ribozym gerichtet zwischen die Restriktionsschnittstellen für KpnI und XbaI kloniert wurde, und der dafür entfernte Vektorbereich länger war als die inserierte Ribozym-Sequenz, ist das PCR-Produkt aus den Leervektortransfektanten größer als aus den Ribozym-Transfektanten. Alle untersuchten Klone enthielten den Expressionsvektor. Das Ergebnis für die Transfektanten von RzM2 in A2780RCIS ist in der Abbildung 3.19 dargestellt.
Abb.
3.19
:
Insertkontrolle mittels RT-PCR der Transfektanten A2780RCIS-RzM2
Mittels Northern-Blot sollte untersucht werden, ob sich die Expression der MRP2-mRNA in den Transfektanten für die Anti-MRP2-Ribozyme RzM1 und RzM2 verändert d. h. vermindert hat (Kap. 2.2.8 bis 2.2.13). Es zeigte sich, daß die Expression der MRP2-mRNA in allen Klonen mit funktionsfähigem Ribozym im Vergleich zu der untransfizierten cisplatinresistenten Zellinie A2780RCIS und den Leervektortransfektanten geringer war. Die meisten dieser Ribozym-Transfektanten wiesen eine MRP2-mRNA-Expression auf, die mit der in der cisplatinsensitiven parentalen Zellinie A2780 vergleichbar war (Abb. 3.20). Die Klone, die mit katalytisch inaktivem Ribozym transfiziert wurden, zeigten eine ähnliche Expression von MRP2-mRNA wie die Zellinie A2780RCIS und die Leervektortransfektanten.
Abb.
3.21
: E
xpression von MRP2 in den A2780RCIS-RzM2-Klonen
Im Folgenden sollte untersucht werden, ob und wie sich die A2780RCIS-Ribozym-Transfektanten hinsichtlich ihres Verhaltens gegenüber Cisplatin von der untransfizierten resistenten Ausgangszellinie A2780RCIS unterscheiden. Die Zellen wurden mit 100 µM Cisplatin kontinuierlich über mehrere Tage behandelt und die adhärenten Zellen nach
Es sollte untersucht werden, ob sich die Ribozym-Transfektanten in bezug auf Apoptose-Induktion von der Ausgangslinie A2780RCIS unterscheiden. Die Zellinien A2780 und A2780RCIS, sowie die Ribozym-Transfektante A2780RCIS-RzM2 Klon 9 und die Leervektortransfektante A2780RCIS-LV Klon 13 wurden ausgewählt und mit unterschiedlichen Konzentrationen von Cisplatin für 24 h behandelt. Es wurden Zellysate hergestellt und auf ihre Caspase-3-Aktivität untersucht (Kap. 2.2.35). Die gefundenen Aktivitäten wurde auf die Grundaktivität der Zellinie A2780 (ohne Cisplatin-Behandlung) normalisiert und miteinander verglichen (Abb. 3.23). Mit steigender Konzentration von Cisplatin stieg die Caspase-3-Aktivität in allen Zellinien an, was auf ein vermehrtes Auslösen von Apoptose schließen läßt. Die Ribozymtransfektante RzM2 Klon 9 zeigte eine höhere Induktion im Vergleich zur Ausgangszellinie A2780RCIS und der Leervektortransfektante (A2780RCIS-LV Klon 13). Bei einer Konzentration von 100 µM Cisplatin war die Induktion sogar größer als in der sensiblen parentalen Zellinie A2780.
Das Ausmaß der Cisplatinresistenz und das Kreuzresistenzmuster der Zellinien A2780 vs. A2780RCIS, D43/86 vs. D43/86RCIS und Mewo vs. MewoRCIS wurde unter Nutzung eines Proliferationsassays bestimmt. Als Grundlage für die Ermittlung von Resistenzfaktoren wurde der IC50-Wert herangezogen, ein Verfahren, das allgemein anerkannt ist und häufig genutzt wird, Sensitivitäten von Zellinien gegenüber Zytostatika zu beurteilen (Perez et al., 1993; Kellner et al., 1997; Bergman et al., 2000). In die Kreuzresistenzbetrachtungen wurden die Zytostatika Carboplatin, Daunorubicin, Etoposid und Vincristin einbezogen. Der Vergleich der Sensitivitäten gegenüber Cisplatin zeigte, daß die Zellinie A2780RCIS die höchste Resistenz aufwies. Alle untersuchten Zellinien zeigten eine Kreuzresistenz gegenüber dem strukturell verwandten Carboplatin, was darauf hindeutet, daß bei diesem Zytostatikum ein ähnlicher Resistenzmechanismus vorliegt. Kreuzresistenzen gegenüber Daunorubicin und Etoposid traten nur in zwei der drei untersuchten Zellinienmodelle auf. Dies läßt darauf schließen, daß sich die untersuchten Zellinien hinsichtlich der Faktoren unterscheiden, die diese Resistenzen bewirken und/oder unterstützen. Eine Resistenz gegenüber Vincristin wurde in keiner der Zellinien festgestellt. Für die Zellinie MewoRCIS war aus anderen Untersuchungen bekannt, daß diese auch gegenüber Fotemustin, nicht aber gegenüber Doxorubicin, Vindesin und Mitomycin C kreuzresistent sind (Kern et al., 1997).
Die humanen Tumorzellinien A2780, A2780RCIS, D43/86, D43/86RCIS, Mewo und MewoRCIS wurden mittels RT-PCR hinsichtlich der Expression verschiedener Gene untersucht, die aufgrund der Assoziation mit Chemoresistenz bekannt waren (Kool et al., 1997; Doyle et al., 1998; Lage et al., 1999). Für die vergleichenden Expressionsanalysen wurden die ABC-Transporter MDR1, MRP1, MRP2 und BCRP, die zum MMR-System gehörenden Faktoren hMLH1, hMSH2 und hPMS2, sowie das Strukturprotein LRP ausgewählt.
Die cisplatinresistente Zellinie A2780RCIS zeigte eine verminderte Expression von hMLH1. Eine verringerte Expression von Genen des MMR-Systems für chemoresistente Varianten der Zellinie A2780 wurde auch von anderen Abeitsgruppen beschrieben. So zeigten doxorubicin- und cisplatinresistente Varianten dieser Zellinie einen Verlust der Expression von hMLH1 und hPMS2, aber keine veränderte Expression von hMSH2 (Drummond et al. , 1996). Für eine chlorambucilresistente Variante der Zellinie A2780 konnte keine Expressionsveränderung für hMLH1 nachgewiesen werden (Roy et al. , 2000). Für die Zellinie MewoRCIS konnte unter Nutzung von Northern- und Western-Blot gezeigt werden, daß eine um 35 % für hMLH1 und um 70 % für hMSH2 verminderte Expression vorliegt (Lage et al. , 1999; Helmbach et al. , 2002). Durch die in dieser Arbeit verwendete RT-PCR, ohne Optimierung für die exponentielle Phase der PCR, war jedoch dieser Unterschied für die Zellinie MewoRCIS nicht detektierbar. Diese Untersuchungen lassen vermuten, daß die verminderte Expression der MMR-Gene in den Zellinien A2780RCIS und MewoRCIS anteilig an der Cisplatinresistenz beteiligt sind. Für LRP, hMSH2 und hPMS2 wurden mit der angewandten RT-PCR-Methode in den sechs Tumorzellinien keine Expressionsunterschiede gefunden. Es ist jedoch nicht auszuschließen, daß bei einer genauen Quantifizierung mittels real-time RT-PCR Unterschiede nachgewiesen werden könnten.
Die chemosensitive Ovarialkarzinomzellinie A2780 zeigte in den RT-PCR-Analysen eine deutliche Expression von BCRP-mRNA, wohingegen sie in der cisplatinresistenten Variante
Der ABC-Transporter MRP1 ist durch die Vermittlung der Resistenz gegenüber Doxorubicin, Vincristin und Etoposid bekannt geworden (Grant et al., 1994). In Lungenkrebspatienten konnte eine Erhöhung der MRP1-Expression nach platinbasierter Chemotherapie festgestellt werden (Oguri et al., 1998). Durch Transfektionsexperimente wurde aber ein funktioneller Zusammenhang von MRP1 mit der Cisplatinresistenz weitgehend ausgeschlossen (Cole et al., 1994; Sharp et al., 1998). In den RT-PCR-Analysen der vorliegenden Arbeit zeigte sich ebenfalls keine Assoziation von erhöhter MRP1-Expression und der Resistenz gegenüber Cisplatin.
In den cisplatinresistenten Zellinien A2780RCIS, D43/86RCIS und MewoRCIS zeigte sich eine erhöhte MRP2-Expression im Vergleich zu ihrer jeweiligen parentalen Zellinie, wobei die Expression in der Zellinie A2780RCIS am höchsten war. Die zunächst mittels RT-PCR gefundenen Expressionsunterschiede konnten durch Northern-Blot- und Western-Blot-Analyse bestätigt und mittels real-time-RT-PCR quantifiziert werden. Die erhöhte Expression von MRP2 wurde auch in weiteren cisplatinresistenten Zellinien beschrieben (Kool et al., 1997; Narasaki et al., 1997). Das deutet darauf hin, daß es sich hierbei um einen generellen Resistenzmechanismus handelt. Aufgrund des größten Expressionsunterschieds für MRP2
Es wurden zwei Hammerhead -Ribozyme, RzM1 und RzM2, konstruiert, um die mit Cisplatinresistenz assoziierte MRP2-mRNA zu spalten. Die Effizienz der ribozymvermittelten Spaltung wurde im zellfreien System untersucht. Hammerhead -Ribozyme wurden bisher erfolgreich benutzt um u. a. die chemoresistenz-vermittelnden Faktoren P-Glykoprotein (Kobayashi et al. , 1994; Holm et al. , 1995), BCRP (Kowalski et al. , 2001 und 2002), LRP (Kitazono et al ., 1999) und γ -Glutamylcystein-Synthetase (Iida et al., 2001) zu modulieren. Die in dieser Arbeit beschrieben Hammerhead -Ribozyme RzM1 und RzM2 sind die ersten Ribozyme, die die mRNA des ABC-Transporters MRP2 spalten können.
Nicht alle durch computergestützte Methoden ausgewählten Schnittstellen für ein
Hammerhead
-Ribozyms erweisen sich auch als geeignet für den katalytischen Angriff (Wichert
et al.
, 1999; Kowalski
et al.
, 2001). Der Grund für diese Diskrepanz besteht in der lediglichen Annäherung des Computermodells an die tatsächlich vorhandene mRNA-Sekundärstruktur. Selbst Ribozyme, die sich
in vitro
als wirksam erweisen, können sich danach in der Zelle als unwirksam herausstellen, da die tatsächlichen Bedingungen in der Zelle, wie lokale Ionenkonzentrationen, pH-Wert und Temperatur, nicht genau bekannt sind. Außerdem können z. B. RNA-bindende Proteine Einfluß auf die Faltung der mRNA und die Zugänglichkeit der Bindungstelle für das Ribozym haben (Lee
et al.
, 1997). Für die
in vitro
-Schnittversuche wurden die Reaktionsbedingungen so gewählt, daß sie sich den physiologischen Bedingungen weitesgehend annähern (10 mM Mg
2+
, pH 7,5 und 37 °C), obwohl aus kinetischen Versuchen bekannt ist, daß sich die Spaltaktivität mit steigender Mg
2+
-Konzentration erhöht, bei 37 °C und 10 mM Mg
2+
ein pH-Optimum bei ca. 9,5 besteht und Ribozyme bei 42 °C höhere kinetische Parameter aufweisen (Hendry
et al.
, 1995; Holm
et al.
, 1995). Durch diese Maßnahme wurde die Vorhersagefähigkeit der
in vitro
-Schnittversuche für die Anwendung in der Zellkultur erhöht. Die Anti-MRP2-Ribozyme RzM1 und RzM2 wurden mittels computergestützter RNA-Sekundärstruktur-Analyse ausgewählt. Die wesentlichen Kriterien dabei waren die Nutzung von 5’-GUC-3’-Tripletts als nutzbare Spaltstellen und die Lage dieser Tripletts in vermutlich einzelsträngigen Bereichen
Ein weiteres Problem bei der Ribozym-Konstruktion stellt die Beobachtung dar, daß häufig Ribozyme kurze RNA-Substrate sehr gut spalten können, jedoch bei längeren Substraten eine geringere katalytische Aktivität zeigen (Heidenreich und Eckstein, 1992; Bertrand et al. , 1994). Große RNA-Moleküle können komplexe Sekundär- und Tertiärstrukturen bilden, die die Zugänglichkeit der Spaltstelle für das Ribozym beeinträchtigen können. Die Assoziation des Ribozyms an seine Zielsequenz stellt sehr wahrscheinlich den geschwindigkeits-bestimmenden Schritt im Spaltprozeß dar. Außerdem können durch tertiäre Interaktionen die Dissoziation des Ribozyms von seinen gespaltenen Produkten behindert werden, so daß das Ribozym nicht für weitere Spaltreaktionen zur Verfügung steht (Hendry und McCall, 1995). Spaltversuchen mit längeren Substraten eignen sich daher besser, um die Spalteffizienz eines Ribozyms zu beurteilen. Um diesem Problemen Rechnung zu tragen, wurden für die in vitro -Charakterisierung der Ribozyme in dieser Arbeit längere Substrate von 200 und 233 nt verwendet.
Die Initialgeschwindigkeit v ini sowie die Reaktionsparameter k cat /k M und k obs der Anti-MRP2- Hammerhead -Ribozyme, RzM1 und RzM2, zeigen vergleichbare Werte zu denen anderer Ribozyme (Tab. 4.1). Die katalytischen Parameter zeigen große Ähnlichkeiten zu denen des Anti-GPC3- Hammerhead -Ribozyms (Wichert et al. , 1999). Die nach den beiden Berechnungsmethoden ermittelten k cat /k M -Werte (Heidenreich und Eckstein, 1992; Hendry et al. , 1995) der Ribozyme RzM1 und RzM2 unterscheiden sich jedoch weniger voneinander. Das deutet darauf hin, daß bei den Anti-MRP2-Ribozymen insgesamt mehr von dem angebotenen Substrat umgesetzt werden konnte als bei dem Anti-GPC3-Ribozym (80 %, Abb.3.14 vs. 40 %, Wichert et al. , 1999). Bisher ist nicht geklärt, weshalb Ribozyme bei diesen in vitro -Schnittversuchen nicht das gesamte angebotene Substrat umsetzen können. Die vergleichbaren katalytischen Parameter zu anderen Ribozymen lassen darauf schließen, daß sich die ausgewählten Schnittstellen in der MRP2-mRNA für die Spaltung durch die konstruierten Ribozyme eignen und beide Ribozyme eine hohe katalytische Aktivität aufzeigen. Bei Vergleich der katalytischen Parameter der beiden Anti-MRP2-Ribozyme scheint RzM1 der bessere Kandidat für einen Einsatz in der Zelle zu sein.
Die vollständige Sequenz des humanen MRP2 wurde durch Sequenzierung überlappender cDNA-Klone ermittelt (Taniguchi
et al.
, 1996). Nachfolgend wurden chemoresistente Tumorzellinien auf MRP2-Expression untersucht, jedoch beschrieb man lange Zeit nur Assoziationen der Expression und dem Auftreten von Resistenz (Kool
et al.
, 1997; Chen
et al.
, 1998; Narasaki
et al.
, 1999). Zu Beginn dieser Arbeit war der funktionelle Zusammenhang von MRP2-Expression und Chemoresistenz noch nicht nachgewiesen worden. Nachdem die vollständige MRP2-cDNA-Sequenz kloniert war, wurden erste Transfektionsexperimente mit dem humanen MRP2 durchgeführt (Kawabe
et al.
, 1999; Cui
et al.
, 1999; Chen
et al.
, 1999; Übersicht in König
et al.
, 1999), wobei eine Resistenzerhöhung
Die Zellinien A2780 und A2780RCIS besitzen mutiertes MRP2, wobei diese Mutation in keinem konservierten Bereich liegt. In den ebenfalls untersuchten Zellinien D43/86, D43/86RCIS, Mewo und MewoRCIS war MRP2 im untersuchten Sequenzabschnitt nicht mutiert. Da sich die Zellinien A2780 und A2780RCIS hinsichtlich ihrer Expression dieses mutierten MRP2 und ihrer Sensitivität gegenüber Cisplatin unterschieden, wurde davon ausgegangen, daß sich diese Mutation nicht nachteilig auf den Transport auswirkt. Der offene Leserahmen des mutierten MRP2 wurde für die Transfektion in die Zellinie A2780 benutzt, um den Mutationsstatus von MRP2 in diesem Zellsystem nicht zu verändern. Es konnte eine geringe Überexpression von MRP2 in der Zellinie A2780 erreicht werden, wobei die MRP2-mRNA-Expression in den Transfektanten nicht an die Expressionshöhe in der Zellinie A2780RCIS heranreichte.
Entsprechend der geringen Überexpression in den MRP2-transfizierten A2780-Zellen wurde in den Transfektanten nur eine leichte Resistenzerhöhung gegenüber Cisplatin und Carboplatin erreicht, wobei der Unterschied zur untransfizierten Ausgangzellinie A2780 dennoch statistisch signifikant war (P<0,05). Die MRP2-Transfektanten zeigten keine Kreuzresistenz gegenüber Daunorubicin, gegenüber Etoposid und Vincristin war das Verhalten uneinheitlich. Es konnte somit der Zusammenhang von MRP2-Expression und Resistenz gegenüber Cisplatin und Carboplatin funktionell bestätigt werden.
Die in vitro charakterisierten Anti-MRP2- Hammerhead Ribozyme RzM1 und RzM2 wurden in die cisplatinresistenten Zellinie A2780RCIS transfiziert und so auf ihre Wirksamkeit im Zellinienmodell getestet. Die untersuchten Ribozym-Transfektanten beider Ribozyme zeigten eine Reduktion von MRP2 auf mRNA- und Proteinebene, in einigen Klonen bis auf das MRP2-Expressionsniveau der chemosensitiven A2780. Obwohl das Ribozym RzM1 bei den vorangegangenen in vitro-Test die höheren kinetischen Werte aufwies, ließ sich bei dem Einsatz in der Zellkultur kein Unterschied in der Wirksamkeit der Ribozyme RzM1 und RzM2 feststellen. Beide Ribozyme waren in der Lage, die MRP2-Expression in den Tumorzellen zu verringern. Die Transfektanten mit katalytisch inaktiven Ribozymen, RzM1/mut und RzM2/mut zeigten ebenfalls eine Reduktion der MRP2-Expression und eine
Obwohl in einigen Anti-MRP2-Ribozym-Transfektanten die MRP2-Expression auf mRNA und Proteinebene auf das Level der sensiblen Ausgangszellinie A2780 vermindert wurde, konnte die Sensitivität gegenüber Cisplatin nicht vollständig wiederhergestellt werden. Das deutet daraufhin, daß in der Zellinie A2780RCIS mehrere Mechanismen bei der Cisplatinresistenz zusammenwirken.Der Mutationsstatus von p53 wurde in den sechs Tumorzellinien bestimmt. Nur in der Ovarialkarzinomzellinie A2780 lag Wildtyp-p53 vor. In den Zellinien A2780RCIS, D43/86, D43/86RCIS, Mewo und MewoRCIS war p53 mutiert, wobei die Mutationen in der für die Funktion wichtigen DNA-Bindungs- oder Oligomerisierungsdomäne lagen. Das mutierte p53-Gen, sowie die festgestellte Reduktion der hMLH1-Expression könnten somit in der Zellinie A2780RCIS bei der Cisplatinresistenz eine
MRP2 ist ein ABC-Transporter, der Konjugate mit Glutathion und Glukuronsäure oder als Sulfate transportieren kann (Kawabe et al., 1999). Aus Untersuchungen war bekannt, daß MRP2 Cisplatin gemeinsam mit Glutathion in einem Verhältnis von 1:2 transportieren kann (Ishikawa und Ali-Osman, 1993) und cisplatinresistente Zellinien häufig erhöhte Mengen an Glutathion besitzen(Parekh et al., 1996; Kool et al., 1997). Außerdem konnten resistente Tumorzellen durch Senkung des Glutathiongehalts oder durch Beeinflussung des Glutathionstoffwechsels resensitiviert werden (Chen
et al.
, 1998; Ban
et al.
, 1996). Um die Cisplatinresistenz durch den Transport über MRP2 näher zu untersuchen, wurden die Glutathiongehalte der Zellinien A2780, A2780RCIS, D43/86, D43/86RCIS, Mewo und MewoRCIS bestimmt und miteinander verglichen. Die Zellinie A2780RCIS wies dabei den höchsten Gehalt an reduziertem Glutathion auf, welches für die Konjugation von Cisplatin die entscheidende Fraktion ist. Welche Stoffwechselveränderungen zu diesem erhöhten Glutathiongehalt in der Zellinie A2780RCIS führen, wurde in dieser Arbeit nicht untersucht, wobei eine veränderte Expression und/oder Aktivität von Glutathion-S-Transferasen und der γ-Glutamylcystein-Synthetase (γ-GCS) denkbar sind. Für eine andere cisplatinresistente Variante der Zellinie A2780 wurde die Überexpression einer Untereinheit der γ-GCS beschrieben (Yao et al., 1995). Es wurde auch gezeigt, daß eine erhöhte γ-GCS-Expression zu einem erhöhten Transport von Glutathionkonjugaten und Resistenz gegenüber Cisplatin führt (Kurokawa et al., 1995). Die Zellinie D43/86RCIS enthielt ebenfalls mehr Glutathion, jedoch waren die Unterschiede nicht so groß wie für die Zellinie A2780RCIS. Die Zellinie MewoRCIS zeigte keinen veränderten Glutathiongehalt. Durch den erhöhten Gehalt an reduziertem Glutathion im Zusammenhang mit der erhöhten Expression von MRP2 ist die
ABC-Transporter, die Glutathionkonjugate transportieren können, wurden häufig im Zusammenhang mit der Entgiftung von Schwermetallen beschrieben (Ishikawa et al., 1997). MRP2-homologe Proteine wurden in vielen Organismen gefunden, so z. B. in Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans und Rattus norvegicus. Diese MRP2-verwandten Proteine zeigen häufig Assoziationen und funktionelle Zusammmenhänge mit der Resistenz gegenüber Metallen, z. B. Arsen, Cadmium, Quecksilber und Kupfer (Dijkstra et al., 1996; Broeks et al., 1996; Sugawara et al., 1997 und 1998; Bauer et al., 1999; Kala et al., 2000; Theodoulou, 2000; Liu et al., 2001). In dieser Arbeit wurde MRP2 in seiner Bedeutung für die Cisplatin- und Carboplatinresistenz beschrieben. Man kann MRP2 deshalb auch als Metalltransporter bezeichnen.
Cisplatin schädigt die Zellen hauptsächlich durch Cisplatin-DNA-Addukte, was zu verstärkter Reparatur und einer Arretierung des Zellzykluses in der G2-Phase führt. Sind die auftretenden DNA-Schäden zu umfangreich gehen die Zellen in die Apoptose (Jordan und Carmo-Fonseca, 2000). Die beschrittenen Wege sind je nach zellulärem Hintergrund und Abhängigkeit vom Zytostatikum verschieden (Jones et al., 1998; Gonzalez et al., 2001; Lu et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit wurden die Zellinien A2780 und A2780RCIS, sowie die A2780-MRP2-Transfektanten und die A2780RCIS-Anti-MRP2-Ribozymtransfektanten unter Cisplatinbehandlung auf die Veränderungen der Apoptoseinduktion und ihres Zellzykluses untersucht.
In Tumorzellen kommt es nach der Behandlung mit Zytostatika häufig zum programmierten Zelltod (Debatin, 2000), wobei man die beschrittenen Signalwege im Wesentlichen der rezeptor- und der mitochondrienvermittelten Apoptose zuordnen kann (Kaufmann und Earnshaw, 2000). Beide Wege münden in der Aktivierung der Effektor-Caspasen 3, 6 und 7, wobei vor allem die Aktivierung von Caspase-3 als Maß für das Auslösen von Apoptose herangezogen werden kann (Lage
et al.
, 2001b, Helmbach
et al.
, 2002). In dieser Arbeit konnte mittels Caspase-3-Aktivitätsbestimmung gezeigt werden, daß MRP2-Transfektion in
Für die Untersuchung des Zusammenhangs von Cisplatinresistenz und MRP2-Expression wurde in dieser Arbeit die Ovarialkarzinomzellinie A2780 als Modell ausgewählt. Da in der Therapie des Ovarialkarzinoms häufig Cisplatin verwendet wird, besitzen die Ergebnisse aus den Zellinien A2780 und A2780RCIS auch Bedeutung für diese Tumorerkrankung. Das Ovarialkarzinom ist die Haupttodesursache bei den gynäkologischen Tumoren in der westlichen Welt (Parker et al., 1997). Platinverbindungen zeigen bei der Behandlung dieser Karzinome die beste Wirksamkeit (Ozols und Young, 1991), wobei der p53-Mutationsstatus eine entscheidende Rolle für den Therapieerfolg spielt (Righetti et al., 1996). Überexpression von p53 ist meist mit dem Vorhandensein von Mutationen in p53 assoziert. 30 bis 60 % aller Ovarialkarzinome sind in der Immunhistochemie positiv für TP53 (Levesque et al., 1995; van der Zee et al., 1995). Die Therapie des Ovarialkarzinoms stellt nach wie vor ein Problem dar. Die meist auftretenden Rezidive werden u. a. mit Taxol, Topotecan und Etoposid behandelt, zeigen aber nur ein Ansprechen von ca. 20 % (Dunton, 1997).
Untersuchungen zur Expression von Reparaturgenen, Glutathion-S-Transferase-π und Topoisomerasen in Ovarialkarzinompatientinnen erbrachten keine Korrelationen von Expression und Ansprechen auf eine platinbasierende Chemotherapie (Codegoni et al., 1997). Aus immunhistochemischen Untersuchungen an mehr als 100 Ovarialkrebspatientinnen für P-Glykoprotein, MRP1, MRP2 und LRP ließen sich keine Vorhersagen für den Therapieerfolg ableiten (Arts et al., 1999), wobei hier nur der Zustand vor der Therapie betrachtet wurde. Expressionsveränderungen während der Therapie, die das Überleben der Patientinnen beeinflussen könnten, wurden nicht untersucht. Für das Ovarialkarzinom konnte außerdem gezeigt werden, daß Patienten mit einer hohen Glutathion-S-Transferase-π-Expression und hohem Glutathionlevel, der u. a. den Transport von Cisplatin begünstigt, schlechter auf eine Therapie mit Cisplatin und Etoposid ansprechen im Vergleich zu jenen mit niedrigen Werten für die beiden genannten Faktoren (Kigawa et al., 1998). Da die Bedeutung von MRP2 für die Cisplatinresistenz in Patienten noch nicht ausreichend geklärt ist, sind weitere Untersuchungen an Patientenkollektiven nötig.
Eine Reihe von Tumoren zeigen eine Überexpression für mehrere Transporter, die Zytostatika aus der Zelle hinaus transportieren können (Soini et al., 2001). Somit gestaltet sich die Auswahl für die Therapie geeigneter Zytostatika als schwierig.MRP2 wird nur in wenigen gesunden Geweben exprimiert (Kool et al., 1997). Zudem bleiben Dubin-Johnson-Syndrom-Patienten, bei denen MRP2 defekt ist, durch das Fehlen von Beeinträchtigungen häufig unerkannt (Zimniak, 1993). Bei einer Gentherapie mittels Hammerhead-Ribozymen gegen MRP2-mRNA wären daher nur wenige Nebenwirkungen zu erwarten. Da außerdem die häufig exprimierten ABC-Transporter MDR1 und MRP1 nicht für die Cisplatinresistenz verantwortlich sind (Lincke et al. , 1990; Cole et al. , 1994; Sharp et al. , 1998; Minemura et al. , 1999), könnte die Unterdrückung der MRP2-Expression in Kombination mit einer Cisplatin/Carboplatin-Behandlung so zu einer verbesserten Therapie maligner Tumoren führen.
Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Pathologie der Charité, Medizinische Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin, angefertigt. Herrn PD Dr. Lage danke ich für die Überlassung dieses interessanten und praxisrelevanten Themas, sowie für seine Betreuung während der gesamten Bearbeitungszeit. Seine unermüdlichen Bemühungen um die Finanzierung des Projektes halfen, diese Arbeit zu einem erfolgreichen Ende zu bringen. Ich erhielt ebenfalls die Möglichkeit, einen Teil meiner Experimente am Research Institute for Biological Sciences (Chiba, Japan) bei Prof. Hozumi durchzuführen. Mein Dank gilt daher auch meinen japanischen Kollegen und Freunden, die mich während meines Aufenthaltes sowohl im Labor als auch im Alltag sehr unterstützt haben.
Veröffentlichungen in Fachzeitschriften
Neilan, B. A., Dittmann, E., Rouhiainen, L., Bass, A., Schaub, V., Sivonen, K., Börner, T. (1999). Nonribosomal Peptide Synthesis and Toxicity of Cyanobacteria. Journal of Bacteriology 181, 4089-4097.
Materna, V., Holm, P. S., Dietel, M., Lage, H. (2001). Kinetic characterization of ribozymes directed against the cisplatin resistance-associated ABC transporter cMOAT/MRP2/ABCC2. Cancer Gene Therapy 8, 176-184.
Vorträge
Eingeladener Vortrag am 13.04.2001:
Reseach Institute for Biological Sciences, Science University of Tokyo (Japan) zum Thema: “Examinations on cMOAT-dependent cisplatin resistance in human tumour cell lines”
Poster
Schaub, V., Hoffmann, U., Blohmer, J. U., Grottke, C., Mantwill, K., Wichert, A., Dietel, M., Lage, H. (1997). Quantitative Expression Analysis of Genes Involved in Development of Chemoresistance in Ovarian Carcinoma in vitro and in vivo. 4th International Symposium on Cytostatic Drug Resistance, Berlin. Band of Abstracts, 96.
Grottke, C., Mantwill, K., Schaub, V., Wichert, A., Dietel, M., Lage, H., Schadendorf, D. (1997). Searching for Novel Drug Resistance Associated Genes in Human Melanoma Cells by Differential Display RT-PCR. 4th International Symposium on Cytostatic Drug Resistance, Berlin. Band of Abstracts, 58.
Mantwill, K., Grottke, C., Schaub, V., Wichert, A., Dietel, M., Lage, H. (1997). Search for Genes Playing a Role in Atypical Multidrug Resistance in Gastrointestinal Tumours by a Differential Display Technique (DDRT-PCR). 4th International Symposium on Cytostatic Drug Resistance, Berlin. Band of Abstracts, 78
Wichert, A., Kirch, B., Holm, P. S., Grottke, C., Mantwill, K., Schaub, V., Dietel, M., Lage, H. (1997). Towards Reversion of Atypical Multidrug Resistance: Development of Two Hammerhead Ribozymes Against the Resistance Associated MXR7/GPC3-Gene. 4th International Symposium on Cytostatic Drug Resistance, Berlin. Band of Abstracts, 113.
Grottke, C., Kern, M., Mantwill, K., Schaub, V., Wichert, A., Dietel, M., Lage, H., Schadendorf, D. (1998). Novel Potential Drug Resistance Associated Genes in Human Melanoma Cells. J. Mol. Med. 76, B13, P-44.
Mantwill, K., Grottke, C., Schaub, V., Wichert, A., Dietel, M., Lage, H. (1998). Detection of Genes Related to Apical Multidrug Resistance in Gastrointestinal Tumours by Differential Display Technique (DDRT-PCR). J. Mol. Med. 76, B16, P-54
Wichert, A., Grottke, C., Holm, P. S., Mantwill, K., Perlitz, C., Schaub, V., Dietel, M., Lage, H. (1998). Efficient Selection of a High Activity Ribozyme Against the Cytostatic Drug Resistance Associated MXR7 mRNA. J. Mol. Med. 76, B22, P-78
Schaub, V., Hoffmann, U., Blohmer, J. U., Dietel, M., Lage, H. (1998). Different Methods for Quantitative Expression Analysis of Genes Involved in Chemoresistance in Ovarian Carcinoma. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 124 (Suppl.), R130, P2.15.02.
Hoffmann, U., Materna, V., Blohmer, J.-U., Sehouly, J., Lichtenegger, W., Dietel, M., Lage, H. (2000). Quantitative expression analysis of genes involved in the development of chemoresistance in ovarian carcinoma. Pathol. Res. Pract. 196, 235.
Hiermit erkläre ich, daß die vorliegende Dissertation von mir selbständig und nur unter Verwendung der angegebenen Hilfsmittel angefertigt wurde.
Verena Materna