Alle eukaryotischen Zellen wurden im Inkubator (BBD6220, Heraeus) bei 37 °C und 95 % Luftfeuchtigkeit in Gegenwart von 5 % CO₂ in modifiziertem L-15-Medium angezogen. Den cisplatinresistenten Zellinien wurden folgende Mengen Cisplatin zugesetzt: A2780RCIS 10 µg/ml, D43/86RCIS 2 µg/ml und MewoRCIS 1 µg/ml Medium.

Zweimal wöchentlich wurde der Zustand der Zellen mikroskopisch beurteilt (Zelldichte, eventuelle Infektionen oder abgestorbene Zellen). Je nach den Erfordernissen wurden die Zellen trypsiniert (50-100 µl Trypsin-Lösung/cm² Zellkulturgefäßboden; Inkubation bei 37 °C bis zum Ablösen der Zellen), um ihre Anzahl im Zellkulturgefäß zu verringern oder nur ein Mediumwechsel durchgeführt.

modifiziertes L-15-Medium

FKS

10 %

Die sterilen Substanzen wurden

L-Glutamin

1,0 mM

500 ml L-15-Medium zugegeben.

Transferrin

1,25 mg

Fetuin

3,75 mg

Insulin

40 IE

Trasylol^® (Aprotinin)

0,002 % (v/v)

NaHCO₃

0,1125 % (w/v)

Glukose

0,05 % (w/v)

MEM-Vitamine

1 x

Trypsin-Lösung

Die Trypsin/EDTA-Lösung (Biochrom AG) enthält 0,5 % Trypsin und 0,2 % EDTA in 10 x PBS. Diese Lösung wurde vor Gebrauch 1:10 mit autoklaviertem A. bidest. verdünnt und sterilfiltriert.

Die Transfektionen wurden mit Hilfe des DMRIE-C-Reagenzes (GibcoBRL) durchgeführt. Es wurden Zellen der Linie A2780 bzw. A2780RCIS (ohne Zytostatikum im Medium) in Zellkulturgefäßen mit 3,5 cm Durchmesser ausgesät und mindestens 24 h bis zu einer Konfluenz von 30-50 % kultiviert. Plasmid-DNA (Kap. 2.2.6) wurde mit 1/10 3 M Natriumazetat (pH 5,2) und 2,5 Volumen absolutem Ethanol 30 min bei –20 °C gefällt und anschließend 20 min bei 4 °C und 14 000 rpm (Zentrifuge: 5417R, Eppendorf) zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20 µl sterilem 10 x PCR-Puffer (inklusive 15 mM MgCl₂, Perkin Elmer) aufgenommen, unter sterilen Bedingungen ein Aliquot abgenommen und die DNA-Menge spektrophotometrisch bestimmt. 2 µg Plasmid-DNA wurden zu 1 ml OPTI-MEM gegeben. 5 µl DMRIE-C-Reagenz wurden in einem zweiten Röhrchen in ebenfalls 1 ml OPTI-MEM aufgenommen. Die beiden Lösungen wurden zueinander gegeben und vorsichtig gemischt. Damit sich die Lipid-DNA-Komplexe bilden konnten, wurde die Lösung 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Zellrasen wurde 1 x mit 2 ml OPTI-MEM gewaschen und das Medium mit den Lipid-DNA-Komplexen zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden 5 h mit dieser Lösung bei 37 °C und 5 % CO₂ im Brutschrank inkubiert. Die Transfektionslösung wurde entfernt, 2,5 ml modifiziertes L-15-Medium zu den Zellen gegeben und die Zellen wie gewohnt weiter kultiviert. Nach 24 h wurden die Zellen trypsiniert und auf Zellkulturschalen mit 10 cm Durchmesser umgesetzt. Gleichzeitig wurden die Zellen ab diesem Zeitpunkt unter einem Selektionsdruck von 800 µg/ml G418 gehalten. Nach ca. 2 Wochen konnten die heranwachsenden Klone gepickt und auf Zellkulturgefäße mit 1 cm Durchmesser umgesetzt werden. Die Zellen wurden im Folgenden dauerhaft unter Selektionsdruck gehalten. Die Zellen auf einer Kontrollplatte, die mit einer Lipid-Lösung ohne DNA transfiziert wurde, starben innerhalb einer Woche nach der Transfektion unter Selektionsdruck vollständig ab.

Plattenkulturen

E.coli-Kulturen wurden auf LB-Agar-Platten (Schalen mit 10 cm Durchmesser und 20 ml LB-Agar), die 100 µg/ml Ampicillin oder Carbenicillin enthielten, mittels Spatel ausplattiert und bei 37 °C im Brutschrank für 16-20 h angezogen.

LB-Agar

Bacto^® Agar

1,5 % (w/v)

Die Komponenten wurden in

Bacto^® Trypton

1,0 % (w/v)

A. bidest. gelöst und autoklaviert.

Bacto^® Hefeextrakt

0,5 % (w/v)

NaCl, pH 7,0

170 mM

Schüttelkulturen

E. coli-Kulturen wurden in 5 ml-Ansätzen über Nacht in LB-Medium unter Zusatz von Ampicillin oder Carbenicillin (Endkonzentration: 100 µg/ml) bei 37 °C unter Schütteln bei 160 rpm angezogen.

LB-Medium

Bacto^® Trypton

1 % (w/v)

Die Komponenten wurden in

Bacto^® Hefeextrakt

0,5 % (w/v)

A. bidest.gelöst und autoklaviert.

NaCl, pH 7,0

170 mM

Anlage von Stammkulturen

Zur langfristigen Lagerung wurden Bakterien nach Schüttelkultur in LB-Medium mit 20 % (v/v) Glyzerin aufgenommen und bei –80 °C gelagert. Zur Reaktivierung wurden diese Stammkulturen aufgetaut und einige µl in LB-Medium unter Zusatz von 100 µg/ml Ampicillin oder Carbenicillin erneut als Schüttelkultur herangezogen.

Die Plasmid-DNA wurde mit dem QIAprep-Spin-Plasmid-Kit (Qiagen) isoliert. 4 ml der Übernachtkulturen von E. coli wurden bei 3000 rpm und Raumtemperatur für 5 min pelletiert (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf) und nach Protokoll weiterbehandelt. Die Plasmid-DNA wurde mit 50 µl Elutionspuffer eluiert.

Die Restriktion der DNA mit Restriktionsendonukleasen erfolgte nach den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen für das jeweilige Restriktionsenzym in 20 µl-Ansätzen. Nach Zugabe der Restriktionsendonuklease (10 U) und dem dazu passenden Puffer wurden die Ansätze mit Plasmid-DNA bei 37 °C ca. 2 h oder über Nacht inkubiert.

Gesamt-RNA wurde aus eukaryotischen Zellen unter Verwendung von Trizol^® (GibcoBRL) isoliert. Die Zellen wurden unter Zugabe von 1 ml Trizol^®/10 cm² bewachsene Fläche in ihrem Zellkulturgefäß lysiert und dieses Lysat in ein phenolbeständiges 15 ml-Röhrchen überführt. Pro ml Trizol wurden 0,2 ml Chloroform zugegeben, ca. 15 s intensiv geschüttelt und für weitere 2-3 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden 15 min bei 4 °C und 3000 rpm (Zentrifuge: GS-6KR, Beckman-Coulter, 2060 x g) zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wurde abgenommen und in ein neues 15 ml-Röhrchen überführt. Unter Zugabe von 0,5 ml Isopropanol (pro ml zu Beginn eingesetztes Trizol^®) wurde die RNA bei –20 °C über Nacht gefällt. Danach wurde sie durch Zentrifugation bei 3000 rpm und 4 °C innerhalb von 10 min pelletiert. Das Pellet wurde in 70 %igem Ethanol in DEPC-Wasser (0,2 % DEPC in A. bidest., autoklaviert) gewaschen, in ein 2 ml-Reaktionsgefäß überführt und nochmals 5 min bei 4 °C und 9500 rpm (Zentrifuge: 5417R, Eppendorf) abzentrifugiert. Das Pellet wurde luftgetrocknet und in DEPC-Wasser aufgenommen. Die Proben wurden bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Der aufzutrennenden RNA wurde 1,8 Volumen RNA-Ladepuffer zugesetzt. Die Proben wurden bei 65 °C denaturiert, danach sofort auf Eis überführt und nach dem Abkühlen aufgetragen. Die gelchromatographische Auftrennung erfolgte bei 75 V in 1,0 %igen Agarosegelen in 1 x MOPS-Puffer und 6 % Formaldehyd. Als Laufpuffer wurde 1 x MOPS-Puffer verwendet. Zur Orientierung wurden in einer zusätzlichen Bahn 1 µl farbstoffenthaltender 6 x Blue/Orange Loading Dye (Promega) aufgetragen.

25 x MOPS-Puffer

MOPS, pH 7,0

5 M

Der Puffer wurde im Dunkeln

Natriumazetat

12,5 M

gelagert. Der pH-Wert wurde

Na₂EDTA

0,25 M

mit 1 M Essigsäure eingestellt.

in A. bidest.

RNA-Auftragepuffer

Formamid

570 µl

Formaldehyd (37%ig)

170 µl

25 x MOPS

60 µl

Ethidiumbromid-Lösung

4 µl

Nach der elektrophoretischen Auftrennung von RNA (Kap. 2.2.9) wurde das Agarosegel 30 min durch Schwenken in A. bidest. gewaschen. Die RNA wurde über Nacht unter Verwendung von 10 x SSC als Transferpuffer auf eine positiv geladene Nylonmembran (Amersham Pharmacia Biotech) transferiert (Kapillarblot nach Sambrook und Russell, 2001). Die Blot-Effektivität wurde durch Vergleich von Gel und Membran auf dem UV-Transilluminator (MWG-Biotech) kontrolliert. Im UV-Crosslinker (Hoefer) wurde die RNA mit der Nylonmembran quervernetzt (0,12 mJ/cm²). Diese Blots konnten entweder sofort verwendet oder trocken bei Raumtemperatur gelagert werden.

20 x SSC

NaCl

3,0 M

Der pH-Wert wurde mit 1 M

Na₃-Zitrat, pH 7,0

0,3 M

Essigsäure eingestellt.

in A. bidest.

Für die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde das Megaprime^TM DNA Labelling System (Amersham) verwendet. 25 ng der zu markierenden DNA wurden in 28 µl A. bidest. aufgenommen und 5 µl Hexanukleotid-Zufallsprimer dazugegeben. Die DNA-Doppelstränge wurden bei 95 °C aufgeschmolzen. Während das Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur verblieb, wurden 10 µl 5 x Markierungspuffer, 5 µl ³²P-dCTP (50 µCi) und 2 µl (1 U/µl) DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben und vorsichtig gemischt. Die Markierung erfolgte bei 37 °C für 30 min. Anschließend wurde die DNA erneut bei 95 °C denaturiert und auf Eis abgekühlt.

Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen wurde unter Verwendung des Superscript Preamplification System for First Stand cDNA Synthesis (GibcoBRL) in cDNA nach den Angaben des Herstellers umgeschrieben. Es wurden Hexanukleotide mit zufälliger Sequenz als Primer verwendet, um pro Ansatz 2 µg Gesamt-RNA umzuschreiben. Die cDNAs wurden 1:50 für RT-PCR bzw. 1:5 für die Quantifizierung mittels real-time-RT-PCR in A. bidest. verdünnt.

PCR mit AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase:

in µl

im Ansatz

10 x PCR-Puffer (inklusive 15 mM MgCl₂)

2, 5

1 x

dNTPs (je 10 mM)

0,5

200 µM

5‘-Oligonukleotidprimer (5 µM)

1

200 nM

3‘-Oligonukleotidprimer (5 µM)

1

200 nM

Matrix-DNA (cDNA 1:50)

10

50-100 ng

AmpliTaq Gold^TM

0,2

1 U

A. bidest.

auf 25

Die Amplifikation erfolgte im PCR-Thermal Cycler (Biometra) nach folgendem Programm:

1. Thermische Aktivierung der Polymerase: 12 min, 94 °C;

2. DNA-Amplifikation in 36 Zyklen, bestehend aus

2.1 Denaturierung der Doppelstrang-DNA: 60 s, 94 °C;

2.2 Hybridisierung der Primer an die komplementären Sequenzen: 90 s, bei T_H (Tab. 2.3);

2.3 Elongation der Primer: 90 s, 72 °C;

3. Extension: 5 min, 72 °C

4. Abkühlung: ohne Zeitvorgabe, 4 °C.

^a PCR mit AmpliTaq-Gold-DNA-Polymerase
^b RT-PCR mit Advantage^®-Polymerase-Mix
^c real-time-RT-PCR im Lightcycler
^dZusatz von Betain (Endkonzentration: 1 M) und DMSO (Endkonzentration: 5 %)

5’-Primer

3’-Primer

T_H (°C)

Zweck der PCR

cMOAT-a1

cMOAT-b1

55

Expressionsvergleich^a, Einsatz als Sonde im Northern-Blot^a, Quantifizierung der Expression^c

9-MOAT-fw

11-MOAT-rev

52

Amplifikation des offenen Leserahmens von MRP2/cMOAT/ABCC2^b,d

2-MOAT-fw

3-MOAT-rev

55

Punktmutationsanalyse in MRP2^a,d

GAPDH-fw

GAPDH-rev

55

Quantifizierung der Expression^c, Einsatz als Sonde im Northern Blot^a

G3PDH-a1

G3PDH-b1

55

Expressionsvergleich^a

Pgp-fw

Pgp-rev

50

Expressionsvergleich^a

PMS2-fw

PMS2-fw

60

Expressionsvergleich^a

hMLH1-fw

hMLH1-rev

55

Expressionsvergleich^a

hMSH2-fw

hMSH2-rev

55

Expressionsvergleich^a

LRP-a3

LRP-a3

60

Expressionsvergleich^a

BCRP-fw

BCRP-rev

50

Expressionsvergleich^a

MRP-a

MRP-b

60

Expressionsvergleich^a

TP53-fw

TP53-rev

56

Mutationsanalyse^a,d

T7MOAT-fw3

MOAT-rev2

62

Matrix-DNA für in-vitro-Transkription^a

T7MOAT-fw3

MOAT-rev3

62

Matrix-DNA für in-vitro-Transkription^a

vector-fw

vector-rev

55

Insertkontrolle nach Klonierung in pcDNA3.1^a,d

Tab. 2.3 : Primer-Hybridisierungstemperaturen (T _H ) der durchgeführten PCRs.

RT-PCR mit Advantage ® -Polymerase-Mix:

Der Advantage^®-Polymerase-Mix (Clontech) enthält die KlenTaq-1-DNA-Polymerase, eine weitere Polymerase, die eine 3‘-5‘-Korrekturleseaktivität besitzt, und den TaqStart^TM- Antikörper, damit eine automatische hot start-PCR ermöglicht wird. Dieser Polymerase-Mix bietet durch seine besondere Zusammensetzung u. a. die Möglichkeit, besonders lange PCR-Fragmente zu amplifizieren. Die PCR-Ansätze waren wie folgt zusammengesetzt:

in µl

im Ansatz

10 x PCR-Puffer

2,5

1 x

dNTPs (je 10 mM)

1,0

400 µM

5‘-Oligonukleotidprimer (5 µM)

1

200 nM

3‘-Oligonukleotidprimer (5 µM)

1

200 nM

Betain (5 M)

5

1 M

DMSO (50 %ig)

2,5

5 %

Matrix-DNA (cDNA 1:50)

10

50-100 ng

50 x Advantage^®-Polymerase-Mix

1,0

2 x

A. bidest.

auf 25

Die Amplifikation erfolgte im PCR-Thermal Cycler (Biometra) nach folgendem Programm:

1. Initiale Denaturierung: 1 min, 94 °C;

2. DNA-Amplifikation in 36 Zyklen, bestehend aus
2.1 Denaturierung der Doppelstrang-DNA: 30 s, 94 °C;
2.2 Hybridisierung der Primer an die komplementären Sequenzen: 30 s, bei T_H (Tab. 2.3);
2.3 Elongation der Primer: 6 min, 68 °C;

3. Extension: 6 min, 68 °C

4. Abkühlung: ohne Zeitvorgabe, 4 °C.

Real-time -RT-PCR im Lightcycler:

Die Lightcycler-Technologie (Roche) bietet die Möglichkeit, den Verlauf einer PCR am Computer-Monitor mitzuverfolgen und aufgrund einer mitlaufenden Standardreihe mittels mathematischen Methoden auf die Ausgangsmolekülzahl in einer Probe für eine bestimmte Matrize zu schließen. Die PCR-Ansätze waren wie folgt zusammengesetzt:

in µl

im Ansatz

MgCl₂ (25 mM)

2,4

4 mM

5‘-Oligonukleotidprimer (10 µM)

1,0

500 nM

3‘-Oligonukleotidprimer (10 µM)

1,0

500 nM

DNA Master SYBR Green I

2,0

1 x

A. bidest.

auf 18

Matrix-DNA (cDNA 1:5)

2,0

100-200 ng

In einem Lauf konnten bis zu 32 PCRs gleichzeitig durchgeführt werden. Es wurden bei jedem Lauf eine Nullkontrolle (A. bidest.) und eine Standardreihe von 6 bis 8 Proben (in 2er oder 10er Verdünnungsstufen) mitgeführt. Vor jeder Quantifizierung wurde der spezifische Meßpunkt für eine PCR bestimmt. Dazu wurde eine Probe-PCR für die Matrize durchgeführt und die Schmelzkurve für das Produkt analysiert. Die Meßtemperatur (T_Meß) wurde so ausgewählt, daß sie knapp vor dem Abschmelzen des PCR-Produktes lag. Bei dieser Temperatur liegen eventuelle Primer-Dimere bereits als DNA-Einzelstränge vor und werden somit nicht mitgemessen.

Die Amplifikation erfolgte im LightCycler (Roche) nach folgendem Programm:

1. Initiale Denaturierung: 10 min, 95 °C;

2. DNA-Amplifikation in 40-50 Zyklen, bestehend aus
2.1 Denaturierung der Doppelstrang-DNA: 15 s, 95 °C;
2.2 Hybridisierung der Primer an die komplementären Sequenzen: 5 s, bei T_H (Tab. 2.3);
2.3 Elongation der Primer: 10 s, 72 °C;
2.4 Meßpunkt: ohne Zeit, T_Meß, messen;

3. Schmelzkurve: ohne Zeit, 95 °C; 15 s, 65 °C; in 0,1 °C/s auf 95 °C, fortwährend messen;

4. Abkühlung: 30 s, 40 °C.

Die gelchromatographische Auftrennung von DNA erfolgte bei 85 V in 1,0-1,5 %igen Agarosegelen mit 1 x TAE als Laufpuffer. Die Gele enthielten 0,2 µg/ml Ethidiumbromid. Den Proben wurde anteilig 6 x Blue Orange Loading Dye (Promega) zugesetzt. Nach dem Gellauf wurden die Banden durch UV-Beleutung sichtbar gemacht und photographisch dokumentiert.

50 x TAE

Tris-Azetat, pH 8,0

2,0 M

Der pH-Wert wurde mit 1 M

Na₂EDTA

50 mM

Essigsäure eingestellt

in A. bidest.

Nach Agarosegel-Elektrophorese (Kap. 2.2.16) wurde die DNA-Fragmente unter UV-Licht mit einem Skalpell ausgeschnitten. Für die Gelelution wurde der QIAquick Gel Extraction-Kit (QIAGEN) verwendet und nach dem Herstellerprotokoll vorgegangen. Die DNA wurde in 30 oder 50 µl Elutionspuffer aufgenommen.

Ligation mit T4-DNA-Ligase:

im Ansatz

Plasmid pcDNA3.0, geschnitten KpnI/XbaI (Kap. 2.2.7),

nach Gelelution (Kap. 2.2.17)

0,3-0,4 pmol

Ribozym-DNA, hybridisiert (Kap. 2.2.21)

100 pmol

10 x One-Phor-All Buffer PLUS

1 x

T4-DNA-Ligase FPLCpure^®

12 U

ATP

1 mM

A. bidest.

auf 20 µl

Die Ligation erfolgt über Nacht bei 12 °C.

Ligation von PCR-Produkten:

Die Ligation erfolgte mit den Kits TOPO TA Cloning^® (Vektor: pCR^® 2.1 TOPO) und Eukaryotic TOPO TA Cloning^® (Vektor: pcDNA3.1/V5/His-Topo) von Invitrogen nach den Angaben des Herstellers.

Um für Ribozyme gut zugängliche Sequenzen in der Ziel-mRNA zu identifizieren, wurden die Programme DNASIS 3.0 (Hitachi) und mFOLD 3.1 (http://bioinfo.math.rpi.edu) genutzt. Da die Gesamt-mRNA für eine Faltungsanalyse zu lang war (die vom Anbieter gesetzten Grenzen liegen bei 3000 nt), wurden innerhalb der MRP2-mRNA kürzere Bereiche (Größe 1000 bis 2000 nt) gewählt. Bei der Auswahl der Ribozyme wurde diejenige potentielle Sekundärstruktur betrachtet, die über die geringste freie Energie ΔG verfügt (Zarrinkar und Williamson, 1994; Zuker und Stiegler, 1981).

Um die ausgewählten Ribozyme in vitro mittels T7-Polymerase transkribieren zu können, müssen die Ribozym-DNA-Matrizen eine vorangestellte T7-Promotorsequenz besitzen. Die Einzelstrang-Oligonukleotide RcMAT7-fw/rev und RcMBT7-fw/rev wurden chemisch synthetisiert (Tab. 2.1). Je 2,5 nmol T7-Promotor-Ribozym-Oligonukleotid (fw und rev) wurden zusammengegeben und folgendes Temperaturprotokoll durchgeführt:

1. Denaturierung der ssDNA-Oligonukleotide: 2 min 94 °C;

2. Hybridisierung der ssDNA-Oligonukleotide: 8 min 70 °C;

3. Abkühlung der dsDNA-Oligonukleotidlösung: auf 4 °C.

Die Auftrennung der in vitro-Transkriptionsprodukte sowie die Charakterisierung der Ribozyme durch zeit- und substratabhängige Kinetiken erfolgte mittels PAGE in 1 x TBE als Laufpuffer. Das Gel setzte sich wie folgt zusammen:

Menge

im Ansatz

Harnstoff

42 g

7 M

Acrylamid/Bisacrylamid (40 %ig)

20 ml

8 % (v/v)

10 x TBE

10 ml

1 x

in A. bidest.

Die Bestandteile wurden zusammengegeben, der Harnstoff gelöst und die Lösung durch Filtern entgast. Für die Polymerisierung wurden weiterhin zugegeben:

APS (10 %ig in A. bidest.)

800 µl

TEMED

80 µ

10 x TBE

Tris/HCl, pH 8,0

0,9 M

Der pH-Wert wurde mit 1 M

Borsäure

0,9 M

HCl eingestellt

Na₂EDTA

25 mM

in A. bidest.

Die Auftrennung erfolgte bei kurzen Gelen (Länge: 20 cm) zunächst 20 min bei 15 W, anschließend bis zur kompletten Auftrennung bei 25 W. Bei langen Gelen (Länge: 42 cm) erfolgte der Lauf zuerst 30 min bei 20 W, danach bis zur vollständigen Auftrennung bei 40 W. Nach Exposition auf Röntgenfilm (Kodak) bei –80 °C konnten die in vitro-Transkriptionsprodukte nach ca. 15 min bzw. bei analytischen Gelen die Ausgangs- und Spaltprodukte eines Schnittversuchs nach 1-3 Tagen sichtbar gemacht werden.

Röntgenfilm und Polyacrylamidgel wurden zur Deckung gebracht. In Höhe der Banden auf dem Film wurde der entsprechende Gelbereich ausgeschnitten, die Probe in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt und mit einer Pipettenspitze zerkleinert. Nach Zugabe von 400 µl RNA-Elutionspuffer wurden die Proben durch sequenzielles Einfrieren mit flüssigem Stickstoff und anschließendem Auftauen bei 37 °C weiter aufgeschlossen. Die Proben wurden über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Proben 5 min bei 14 000 rpm (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf) zentrifugiert und der Überstand in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Die eluierte RNA wurde durch Zugabe von 0,1 Volumen 3 M Natriumazetat, 2,5 Volumen Ethanol und 5 µg Glykogen für 3 h bei –70 °C gefällt. Die RNA wurde 1 h bei 14 000 rpm (Zentrifuge: 5415C, Eppendorf) pelletiert, kurz mit 70 %igem Ethanol in DEPC-Wasser (Kap. 2.2.8) gewaschen und erneut für 15 min zentrifugiert. Das Pellet wurde getrocknet und im β-Counter Wallac 1409 (Wallac) vermessen.

RNA-Elutionspuffer

Tris/HCl, pH 8,0

500 mM

Der Puffer wurde vor Gebrauch

Na₂EDTA

1 mM

sterilfiltriert. Der pH-Wert wurde mit

MgCl₂

0,1 mM

1 M HCl eingestellt.

SDS

0,1 % (w/v)

in A. bidest.

Die Stoffmenge radioaktiv markierter RNA kann aus der im β–Counter gemessenen Stahlung berechnet werden.

A

= eingesetzte Aktivität [Bq]

A_kal

= eingesetzte Aktivität zum Zeitpunkt der Kalibrierung [Bq]

t_kal

= Zeit der Kalibrierung [d]

t_1/2

= Halbwertzeit des eingesetzten Isotopes [d]

In die Berechnung ging außerdem der Faktor W ein, der den Einbau von unmarkiertem UTP an einer beliebigen Position des transkribierten Moleküls beschreibt. Dieser Faktor wird aus dem Quotienten der Stoffmenge eingesetzten unmarkierten UTPs und der Anzahl von UMPs je transkribiertem Molekül berechnet:

W

= Faktor für zufälligen Einbau unmarkierten UTPs [nmol]

n_UTP

= eingesetztes unmarkiertes UTP [nmol]

N_UMP

= Anzahl der UMPs im transkribierten Molekül

Somit ergibt sich die Stoffmenge des Transkriptes nTranskript aus dem Produkt der gemessenen Radioaktivität der Probe Ameß und dem Quotienten W/A:

n_Transkript

= Stoffmenge des Transkriptes [nmol]

A_meß

= gemessene Radioaktivität [Bq]

W

= Faktor für zufälligen Einbau unmarkierten UTPs [nmol]

A

= eingesetzte Aktivität [Bq]

Die ribozymatische Spaltung der RNA in vitro wurde in einem Gesamtvolumen von 10 µl unter Anwesenheit von unterschiedlichen Mengen Substrat und Ribozym (Tab. 2.4) in 1 x Ribozym-Puffer bei 37 °C durchgeführt. Nach bis zu fünfstündiger Inkubation wurden die Ansätze mit 10 µl 3 x PAGE-Auftragepufffer (Kap. 2.2.22) versetzt.

10 x Ribozym-Puffer

Tris/HCl, pH 7,5

400 mM

Der Puffer wurde vor Gebrauch

MgCl₂

120 mM

sterilfiltriert. Der pH-Wert wurde

in A. bidest.

mit 1 M HCl eingestellt

Nachweis der

Aktivität

Bestimmung von v_ini

und k_obs

Bestimmung von k_cat/k_M

c[Substrat]

200 nM

20 nM

40 nM

c[Ribozym]

200 nM

100 nM

0; 20; 40; 80; 120; 200; 300; 400 nM

t

120 min

0; 0,5; 1; 2; 3; 5; 10; 20; 30; 60; 120; 180; 300 min

15 min

Tab. 2.4 : Reaktionsbedingungen bei der RNA-Prozessierung.

Die Initialgeschwindigkeit v_ini der ribozymatischen RNA-Spaltung bezeichnet die Geschwindigkeit der Umsetzung des ungespaltenen RNA-Substrates S in die beiden Spaltprodukte P bei anfänglichem Substratüberschuß. Sie wird aus dem Quotienten der Stoffmenge des gebildeten Produktes P zum Zeitpunkt t errechnet (Hendry et al., 1997):

v_ini

= Initialgeschwindigkeit [mol·s^-1]

n(P_t)

= Stoffmenge der Spaltprodukte zum Zeitpunkt t [mol]

t

= Reaktionszeit [s]

Die Initialgeschwindigkeit entspricht dabei dem Anstieg im angenommenen linearen Anfangsbereich des Graphen n(P_t) = f(t), da dieser Bereich die Reaktion unter Substratüberschuß widerspiegelt.

Der Reaktionsparameter k_cat/k_M (nach Heidenreich & Eckstein, 1992) wurde aus der ribozym-konzentrationsabhängigen Spaltung des RNA-Substrates nach folgender Gleichung berechnet:

S_u

= Anteil des ungespaltenen am eingesetzen Substrat zum Zeitpunkt t

P_t

= Produktanteil zum Zeitpunkt t

k_cat/k_M

= Reaktionsparameter nach Heidenreich & Eckstein (1992)

t

= Reaktionszeit [s]

c_Rz

= Ribozymkonzentration [M]

Die Gültigkeit ist auf einen Bereich beschränkt, bei dem bei steigender Ribozymkonzentration auch eine Zunahme der Spaltprodukte zu verzeichnen ist. Der Parameter k_cat/k_M ist nach Umstellung der Heidenreich´schen Formel wie folgt definiert:

Der Parameter k_cat/k_M entspricht dem Anstieg im angenommenen linearen Teils des –ln S_u/t = f(c_Rz)-Diagramms.

Eine weitere Berechnungsmöglichkeit (Hendry et al., 1995) berücksichtigt, daß die Reaktion nicht bis zum vollständigen Abbau des Substrates fortschreitet, sondern in der Praxis einen Maximalwert an gespaltenem Substrat bzw. entstandenem Produkt annimmt. Daher kann man den folgenden Zusammenhang definieren:

S_max

= Anteil des ungespaltenen am maximal spaltbaren Substrat zum

Zeitpunkt t

P_t

= Produktanteil zum Zeitpunkt t

P_∞

= Produkt zum Zeitpunkt t=∞

P_Δ

= Differenz zwischen dem Prozentsatz des Produktes bei t=∞ und t=0

k_cat/k_M

= Reaktionsparameter nach Hendry et al. (1995)

t

= Reaktionszeit [s]

c_Rz

= Ribozymkonzentration [M]

Auch diese Formel ist in dem Bereich definiert, in dem bei steigender Ribozymkonzentration auch eine Zunahme der Spaltprodukte zu verzeichnen ist. Für den Parameter k_cat/k_M nach Hendry et al. (1995) ergibt sich nach Umformung der folgende Zusammenhang:

Der Parameter k_cat/k_M nach Hendry et al. (1995) entspricht dem Anstieg des angenommenen linearen Abschnitts des Graphen im –ln S_max/t = f(c_Rz)-Diagramm.

Der kinetische Parameter k_obs beschreibt den beobachteten Stoffumsatz für die Gesamtreaktion aus Assoziation des Ribozyms mit seinem Zielmolekül und der Spaltung selbst. Er wurde nach seiner Definition (Heidenreich et al., 1994) aus der zeitabhängigen Kinetik ermittelt:

k_obs

= Konstante für die beobachtete Spaltung nach Heidenreich et al. (1994)

S_u

= Anteil des ungespaltenen am eingesetzten Substrat zum Zeitpunkt t

t

= Reaktionszeit [s]

Der Parameter k_obs nach Heidenreich et al. (1994) entspricht dem Anstieg des angenommenen linearen Abschnitts des Graphen im –ln S_u = f(t)-Diagramm. Analog zu den Berechnungen von k_cat/k_M wurde berücksichtigt, daß die Reaktion nicht bis zum vollständigen Abbau des Substrates fortschreitet und k_obs nach Hendry et al. (1995) berechnet:

k_obs

= Konstante für die beobachtete Spaltung nach Hendry et al. (1995)

P_t

= Produkt zum Zeitpunkt t

P_∞

= Produkt zum Zeitpunkt t=∞

P_∆

= Differenz zwischen dem Prozentsatz des Produktes bei t=∞ und t=0

t

= Reaktionszeit [s]

Nach Umformung ergibt sich:

Der Parameter k_obs nach Hendry et al. (1995) entspricht dem Anstieg des angenommenen linearen Abschnitts des Graphen im –ln((P_∞-P_t)/P_Δ) = f(t)-Diagramm.

Eukaryotische Zellen wurden in Zellkulturschalen mit einem Durchmesser von 8 cm ausgesät. Bei einer Konfluenz von ca. 80 % wurde das Zellkulturmedium abgesaugt und die Zellen zweimal mit eiskaltem 1 x PBS gewaschen. Die Schalen wurden auf Eis gestellt, je 3 ml Hypolyse-Puffer zugegeben, kurz geschwenkt und 5 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden abgeschabt, die Suspension in einen Homogenisator überführt und durch 10-12maliges Hochziehen und Runterdrücken des Pistills geschert. Die Suspension wurde in 15 ml-Röhrchen überführt und 10 min bei 4 °C und 2200 rpm (Zentrifuge: GS-6KR, Beckman-Coulter, 1100 x g) zentrifugiert. Der Überstand wurde in Ultrazentrifugen-Röhrchen gegeben und 30 min bei 4 °C und 60 000 rpm (Zentrifuge: Optima^TM TL, Beckman-Coulter, 153 000 x g) zentrifugiert. Das Pellet wurde in einer geeigneten Menge 4 x Proben-Puffer (50-200 µl) resuspendiert, 10 min bei 95 °C inkubiert und erneut 5 min bei 14 000 rpm und 4°C und zentrifugiert. Der Überstand wurde aliquotiert und bei –80 °C gelagert.

10 x PBS

NaCl

1,37 M

Der Puffer wurde vor Gebrauch

Na₂HPO₄

43 mM

autoklaviert. Der pH-Wert 7,3 ergibt

KCl

27 mM

sich aus der Zusammensetzung der

KH₂PO₄

14 mM

Lösung.

Hypolyse-Puffer

1 Cocktail-Tablette mit Proteinase-Inhibitoren (Roche) wird in 2 ml A. bidest. vollständig aufgelöst. Diese 2 ml werden zu 48 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) gegeben. Die Lösung ist ca. 2 Wochen bei 4 °C lagerbar.

4 x Proben-Puffer

1 M Tris-HCl, pH 6,8

1,2 ml

150 mM DTT

247 mg

20 % SDS

2 ml

Glyzerin

2 ml

Bromphenolblau, gesättigt in 0,1 % Ethanol

1-2 Tropfen

In 2 ml Reaktionsgefäßen wurde je 1 ml Elutionslösung für Protein-Färbung vorgelegt. Auf einer Nitrozellulosemembran wurden nebeneinander 2 µl-Tröpfchen von den zu bestimmenden Proteinlösungen gesetzt (Doppelbestimmung). Außerdem wurde - ebenfalls als Doppelbestimmung - BSA in 1 x PBS (Kap. 2.2.28) in bekannter Proteinkonzentration als Eichreihe mitgeführt. Die Membran wurde für 60-90 s mit einer Amidoschwarzlösung gefärbt. Nach Abkippen der Färbelösung wurde die Membran mittels Entfärber-Lösung so lange entfärbt, bis die Nitrozellulosemembran des Hintergrundes wieder fast weiß war. Die Protein-Punkte waren nun blau. Mit einem Skalpell wurden die Punkte samt Hintergrund in annähernd gleich großen Quadraten ausgeschnitten und in die vorbereiteten Reaktionsgefäße mit der Elutionslösung gegeben. Für den Referenzwert wurde ein Quadrat mit Hintergrund ausgeschnitten. Die Reaktionsgefäße wurden ca. 20 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Dabei ging die Blaufärbung auf den Elutionspuffer über. Diese gefärbte Lösung wird in Einmal-Küvetten gegeben. Unter Nutzung des Spektrophotometers (Pharmacia) und dem Programm VWSS (Pharmacia) wurde der Referenzwert Null gesetzt und die Extinktion der Proben bei einer Wellenlänge von 630 nm bestimmt. Nach Auftragen der Eichkurve konnte die Proteinkonzentration der Proben ermittelt werden.

Elutionslösung

 

 

Ethanol

50 ml

50 % (v/v)

0,5 M EDTA, pH 8,0

10 µl

500 µM

0,5 M NaOH

5 ml

25 mM

A. bidest.

45 ml

auf 100 ml

 

 

 

Amidoschwarz-Färbelösung

 

 

Amidoschwarz

 

0,1 % (w/v)

Methanol

 

45 % (v/v)

Essigsäure

 

10 % (v/v)

in A. bidest.

 

 

 

 

 

Entfärber-Lösung

 

 

Methanol

 

45 % (v/v)

Essigsäure

 

1 % (v/v)

in A. bidest.