Das Ausmaß der Cisplatinresistenz und das Kreuzresistenzmuster der Zellinien A2780 vs. A2780RCIS, D43/86 vs. D43/86RCIS und Mewo vs. MewoRCIS wurde unter Nutzung eines Proliferationsassays bestimmt. Als Grundlage für die Ermittlung von Resistenzfaktoren wurde der IC₅₀-Wert herangezogen, ein Verfahren, das allgemein anerkannt ist und häufig genutzt wird, Sensitivitäten von Zellinien gegenüber Zytostatika zu beurteilen (Perez et al., 1993; Kellner et al., 1997; Bergman et al., 2000). In die Kreuzresistenzbetrachtungen wurden die Zytostatika Carboplatin, Daunorubicin, Etoposid und Vincristin einbezogen. Der Vergleich der Sensitivitäten gegenüber Cisplatin zeigte, daß die Zellinie A2780RCIS die höchste Resistenz aufwies. Alle untersuchten Zellinien zeigten eine Kreuzresistenz gegenüber dem strukturell verwandten Carboplatin, was darauf hindeutet, daß bei diesem Zytostatikum ein ähnlicher Resistenzmechanismus vorliegt. Kreuzresistenzen gegenüber Daunorubicin und Etoposid traten nur in zwei der drei untersuchten Zellinienmodelle auf. Dies läßt darauf schließen, daß sich die untersuchten Zellinien hinsichtlich der Faktoren unterscheiden, die diese Resistenzen bewirken und/oder unterstützen. Eine Resistenz gegenüber Vincristin wurde in keiner der Zellinien festgestellt. Für die Zellinie MewoRCIS war aus anderen Untersuchungen bekannt, daß diese auch gegenüber Fotemustin, nicht aber gegenüber Doxorubicin, Vindesin und Mitomycin C kreuzresistent sind (Kern et al., 1997).

Die humanen Tumorzellinien A2780, A2780RCIS, D43/86, D43/86RCIS, Mewo und MewoRCIS wurden mittels RT-PCR hinsichtlich der Expression verschiedener Gene untersucht, die aufgrund der Assoziation mit Chemoresistenz bekannt waren (Kool et al., 1997; Doyle et al., 1998; Lage et al., 1999). Für die vergleichenden Expressionsanalysen wurden die ABC-Transporter MDR1, MRP1, MRP2 und BCRP, die zum MMR-System gehörenden Faktoren hMLH1, hMSH2 und hPMS2, sowie das Strukturprotein LRP ausgewählt.

Die Genexpression des ABC-Transporters MDR1, welcher für die klassische Multidrug-Resistenz verantwortlich ist, zeigte in diesen Expressionsvergleichen kein einheitliches Bild. Die Zellinien A2780RCIS, D43/86, D43/86RCIS und Mewo wiesen in den RT-PCR-Analysen eine deutliche Expression von MDR1 auf. In den Zellinien A2780 und MewoRCIS war die MDR1-Expression nur schwach nachzuweisen. Obwohl aus anderen Untersuchungen bekannt ist, daß P-Glykoprotein nicht im Zusammenhang mit Cisplatinresistenz steht (Lincke et al., 1990; Minemura et al., 1999), hilft dieser Expressionvergleich bei der Bewertung der gefunden Kreuzresistenzen in den Zellinien. So kann die Kreuzresistenz gegenüber Daunorubicin und Etoposid in der Zellinie A2780RCIS zumindest anteilig auf P-Glykoprotein zurückgeführt werden. Die Sensitivität gegenüber Vincristin, welches von P-Glykoprotein ebenfalls transportiert werden kann, wurde trotz der differentiellen Expression von MDR1 in den Zellinien nicht beeinflußt.

Die cisplatinresistente Zellinie A2780RCIS zeigte eine verminderte Expression von hMLH1. Eine verringerte Expression von Genen des MMR-Systems für chemoresistente Varianten der Zellinie A2780 wurde auch von anderen Abeitsgruppen beschrieben. So zeigten doxorubicin- und cisplatinresistente Varianten dieser Zellinie einen Verlust der Expression von hMLH1 und hPMS2, aber keine veränderte Expression von hMSH2 (Drummond et al. , 1996). Für eine chlorambucilresistente Variante der Zellinie A2780 konnte keine Expressionsveränderung für hMLH1 nachgewiesen werden (Roy et al. , 2000). Für die Zellinie MewoRCIS konnte unter Nutzung von Northern- und Western-Blot gezeigt werden, daß eine um 35 % für hMLH1 und um 70 % für hMSH2 verminderte Expression vorliegt (Lage et al. , 1999; Helmbach et al. , 2002). Durch die in dieser Arbeit verwendete RT-PCR, ohne Optimierung für die exponentielle Phase der PCR, war jedoch dieser Unterschied für die Zellinie MewoRCIS nicht detektierbar. Diese Untersuchungen lassen vermuten, daß die verminderte Expression der MMR-Gene in den Zellinien A2780RCIS und MewoRCIS anteilig an der Cisplatinresistenz beteiligt sind. Für LRP, hMSH2 und hPMS2 wurden mit der angewandten RT-PCR-Methode in den sechs Tumorzellinien keine Expressionsunterschiede gefunden. Es ist jedoch nicht auszuschließen, daß bei einer genauen Quantifizierung mittels real-time RT-PCR Unterschiede nachgewiesen werden könnten.

Die chemosensitive Ovarialkarzinomzellinie A2780 zeigte in den RT-PCR-Analysen eine deutliche Expression von BCRP-mRNA, wohingegen sie in der cisplatinresistenten Variante A2780RCIS kaum nachzuweisen war (Abb. 3.6). Aus anderen Untersuchungen in unserem Labor ist bekannt, daß sich die Zellinie A2780RCIS sehr sensitiv gegenüber dem Zytostatikum Mitoxantron verhält und bei Konzentrationen abstirbt, bei denen die parentale Zellinie noch wachsen kann (persönliche Kommunikation, Helga Kemmer). Dies ist möglicherweise auf die höhere Expression von BCRP zurückzuführen (Ross et al. , 1999; Allen et al. , 1999), das neben der Resistenzentwicklung gegenüber Mitoxantron auch mit der Resistenz gegenüber Anthrazyklinen und Topotecan in Zusammenhang gebracht wird (Doyle et al. , 1998; Rocchi et al. , 2000). Der Grund für die verminderte Expression von BCRP in der Zellinie A2780RCIS unter Selektionsdruck von Cisplatin ist nicht bekannt. In den anderen beiden Zellinienpaaren – D43/86 vs. D43/86RCIS sowie Mewo vs. MewoRCIS – wurde eine solche Veränderung nicht beobachtet. Es ist jedoch nicht anzunehmen, daß die auftretende Cisplatinresistenz in der Zellinie A2780RCIS auf die verminderte BCRP-Expression zurückzuführen ist. Die durch den Einsatz eines Anti-BCRP-Ribozyms erreichte Verringerung der BCRP-Expression verursachte keine Sensitivitätsveränderung gegenüber Cisplatin (Kowalski et al. , 2002).

Der ABC-Transporter MRP1 ist durch die Vermittlung der Resistenz gegenüber Doxorubicin, Vincristin und Etoposid bekannt geworden (Grant et al., 1994). In Lungenkrebspatienten konnte eine Erhöhung der MRP1-Expression nach platinbasierter Chemotherapie festgestellt werden (Oguri et al., 1998). Durch Transfektionsexperimente wurde aber ein funktioneller Zusammenhang von MRP1 mit der Cisplatinresistenz weitgehend ausgeschlossen (Cole et al., 1994; Sharp et al., 1998). In den RT-PCR-Analysen der vorliegenden Arbeit zeigte sich ebenfalls keine Assoziation von erhöhter MRP1-Expression und der Resistenz gegenüber Cisplatin.

In den cisplatinresistenten Zellinien A2780RCIS, D43/86RCIS und MewoRCIS zeigte sich eine erhöhte MRP2-Expression im Vergleich zu ihrer jeweiligen parentalen Zellinie, wobei die Expression in der Zellinie A2780RCIS am höchsten war. Die zunächst mittels RT-PCR gefundenen Expressionsunterschiede konnten durch Northern-Blot- und Western-Blot-Analyse bestätigt und mittels real-time-RT-PCR quantifiziert werden. Die erhöhte Expression von MRP2 wurde auch in weiteren cisplatinresistenten Zellinien beschrieben (Kool et al., 1997; Narasaki et al., 1997). Das deutet darauf hin, daß es sich hierbei um einen generellen Resistenzmechanismus handelt. Aufgrund des größten Expressionsunterschieds für MRP2 und der höchsten Resistenz gegenüber Cisplatin wurden die Zellinien A2780 und A2780RCIS für die funktionellen Analysen der MRP2-vermittelten Cisplatinresistenz ausgewählt.

Es wurden zwei Hammerhead -Ribozyme, RzM1 und RzM2, konstruiert, um die mit Cisplatinresistenz assoziierte MRP2-mRNA zu spalten. Die Effizienz der ribozymvermittelten Spaltung wurde im zellfreien System untersucht. Hammerhead -Ribozyme wurden bisher erfolgreich benutzt um u. a. die chemoresistenz-vermittelnden Faktoren P-Glykoprotein (Kobayashi et al. , 1994; Holm et al. , 1995), BCRP (Kowalski et al. , 2001 und 2002), LRP (Kitazono et al ., 1999) und γ -Glutamylcystein-Synthetase (Iida et al., 2001) zu modulieren. Die in dieser Arbeit beschrieben Hammerhead -Ribozyme RzM1 und RzM2 sind die ersten Ribozyme, die die mRNA des ABC-Transporters MRP2 spalten können.

Nicht alle durch computergestützte Methoden ausgewählten Schnittstellen für ein Hammerhead -Ribozyms erweisen sich auch als geeignet für den katalytischen Angriff (Wichert et al. , 1999; Kowalski et al. , 2001). Der Grund für diese Diskrepanz besteht in der lediglichen Annäherung des Computermodells an die tatsächlich vorhandene mRNA-Sekundärstruktur. Selbst Ribozyme, die sich in vitro als wirksam erweisen, können sich danach in der Zelle als unwirksam herausstellen, da die tatsächlichen Bedingungen in der Zelle, wie lokale Ionenkonzentrationen, pH-Wert und Temperatur, nicht genau bekannt sind. Außerdem können z. B. RNA-bindende Proteine Einfluß auf die Faltung der mRNA und die Zugänglichkeit der Bindungstelle für das Ribozym haben (Lee et al. , 1997). Für die in vitro -Schnittversuche wurden die Reaktionsbedingungen so gewählt, daß sie sich den physiologischen Bedingungen weitesgehend annähern (10 mM Mg ²⁺ , pH 7,5 und 37 °C), obwohl aus kinetischen Versuchen bekannt ist, daß sich die Spaltaktivität mit steigender Mg ²⁺ -Konzentration erhöht, bei 37 °C und 10 mM Mg ²⁺ ein pH-Optimum bei ca. 9,5 besteht und Ribozyme bei 42 °C höhere kinetische Parameter aufweisen (Hendry et al. , 1995; Holm et al. , 1995). Durch diese Maßnahme wurde die Vorhersagefähigkeit der in vitro -Schnittversuche für die Anwendung in der Zellkultur erhöht. Die Anti-MRP2-Ribozyme RzM1 und RzM2 wurden mittels computergestützter RNA-Sekundärstruktur-Analyse ausgewählt. Die wesentlichen Kriterien dabei waren die Nutzung von 5’-GUC-3’-Tripletts als nutzbare Spaltstellen und die Lage dieser Tripletts in vermutlich einzelsträngigen Bereichen der RNA-Sekundärstruktur. Es konnte gezeigt werden, daß man durch diesen Ansatz katalytisch aktive Hammerhead -Ribozyme generieren kann.

Ein weiteres Problem bei der Ribozym-Konstruktion stellt die Beobachtung dar, daß häufig Ribozyme kurze RNA-Substrate sehr gut spalten können, jedoch bei längeren Substraten eine geringere katalytische Aktivität zeigen (Heidenreich und Eckstein, 1992; Bertrand et al. , 1994). Große RNA-Moleküle können komplexe Sekundär- und Tertiärstrukturen bilden, die die Zugänglichkeit der Spaltstelle für das Ribozym beeinträchtigen können. Die Assoziation des Ribozyms an seine Zielsequenz stellt sehr wahrscheinlich den geschwindigkeits-bestimmenden Schritt im Spaltprozeß dar. Außerdem können durch tertiäre Interaktionen die Dissoziation des Ribozyms von seinen gespaltenen Produkten behindert werden, so daß das Ribozym nicht für weitere Spaltreaktionen zur Verfügung steht (Hendry und McCall, 1995). Spaltversuchen mit längeren Substraten eignen sich daher besser, um die Spalteffizienz eines Ribozyms zu beurteilen. Um diesem Problemen Rechnung zu tragen, wurden für die in vitro -Charakterisierung der Ribozyme in dieser Arbeit längere Substrate von 200 und 233 nt verwendet.

Die Initialgeschwindigkeit v _ini sowie die Reaktionsparameter k _cat /k _M und k _obs der Anti-MRP2- Hammerhead -Ribozyme, RzM1 und RzM2, zeigen vergleichbare Werte zu denen anderer Ribozyme (Tab. 4.1). Die katalytischen Parameter zeigen große Ähnlichkeiten zu denen des Anti-GPC3- Hammerhead -Ribozyms (Wichert et al. , 1999). Die nach den beiden Berechnungsmethoden ermittelten k _cat /k _M -Werte (Heidenreich und Eckstein, 1992; Hendry et al. , 1995) der Ribozyme RzM1 und RzM2 unterscheiden sich jedoch weniger voneinander. Das deutet darauf hin, daß bei den Anti-MRP2-Ribozymen insgesamt mehr von dem angebotenen Substrat umgesetzt werden konnte als bei dem Anti-GPC3-Ribozym (80 %, Abb.3.14 vs. 40 %, Wichert et al. , 1999). Bisher ist nicht geklärt, weshalb Ribozyme bei diesen in vitro -Schnittversuchen nicht das gesamte angebotene Substrat umsetzen können. Die vergleichbaren katalytischen Parameter zu anderen Ribozymen lassen darauf schließen, daß sich die ausgewählten Schnittstellen in der MRP2-mRNA für die Spaltung durch die konstruierten Ribozyme eignen und beide Ribozyme eine hohe katalytische Aktivität aufzeigen. Bei Vergleich der katalytischen Parameter der beiden Anti-MRP2-Ribozyme scheint RzM1 der bessere Kandidat für einen Einsatz in der Zelle zu sein.

^a Berechnung nach Heidenreich und Eckstein, 1992; ^b Berechnung nach Hendry et al., 1995; ^c Berechnung nach Heidenreich et al., 1994.

Zielsequenz

Zitat

Substratlänge
[nt]

v _ini
[fmol·s ^-1 ]

k _cat /k _M
[M ^-1 ·s ^-1 ]

k _obs
[s ^-1 ]

MRP2 (RzM1)

Materna et al., 2001

233

0,127

7719^a;
9307^b

7,66*10^{-4 c};
8,73*10^{-4 b}

MRP2 (RzM2)

Materna et al., 2001

200

0,086

3671^a;
4478^b

4,81*10^{-4 c};
5,79*10^{-4 b}

GPC3

Wichert et al., 1999

234

0,155

4700^a;
10600^b

n. a.

BCRP

Kowalski et al., 2001

343

2,21

24180^a;
55000^b

1,17*10^{-2 c};
2,68*10^{-2 b}

HIV-1 LTR

Heidenreich und Eckstein, 1992

985

n. a.

22-500^a

n. a.

Pit-950

Bertrand et al., 1994

950

n. a.

500^a

n. a.

Krüppel

Hendry und McCall, 1995

13

n. a.

166667^b

1,48*10^{-1 b}

TAT

Hendry und McCall, 1995

13

n. a.

5333^b

4,0*10^{-3 b}

Tab. 4.1 : Katalytische Parameter verschiedener Hammerhead-Ribozyme.

Die vollständige Sequenz des humanen MRP2 wurde durch Sequenzierung überlappender cDNA-Klone ermittelt (Taniguchi et al. , 1996). Nachfolgend wurden chemoresistente Tumorzellinien auf MRP2-Expression untersucht, jedoch beschrieb man lange Zeit nur Assoziationen der Expression und dem Auftreten von Resistenz (Kool et al. , 1997; Chen et al. , 1998; Narasaki et al. , 1999). Zu Beginn dieser Arbeit war der funktionelle Zusammenhang von MRP2-Expression und Chemoresistenz noch nicht nachgewiesen worden. Nachdem die vollständige MRP2-cDNA-Sequenz kloniert war, wurden erste Transfektionsexperimente mit dem humanen MRP2 durchgeführt (Kawabe et al. , 1999; Cui et al. , 1999; Chen et al. , 1999; Übersicht in König et al. , 1999), wobei eine Resistenzerhöhung gegenüber Cisplatin, Doxorubicin, Epirubicin, Vincristin, Vinblastin und gelegentlich Etoposid, sowie Methotrexat (Hooijberg et al. , 1999) erreicht wurde.

Die Zellinien A2780 und A2780RCIS besitzen mutiertes MRP2, wobei diese Mutation in keinem konservierten Bereich liegt. In den ebenfalls untersuchten Zellinien D43/86, D43/86RCIS, Mewo und MewoRCIS war MRP2 im untersuchten Sequenzabschnitt nicht mutiert. Da sich die Zellinien A2780 und A2780RCIS hinsichtlich ihrer Expression dieses mutierten MRP2 und ihrer Sensitivität gegenüber Cisplatin unterschieden, wurde davon ausgegangen, daß sich diese Mutation nicht nachteilig auf den Transport auswirkt. Der offene Leserahmen des mutierten MRP2 wurde für die Transfektion in die Zellinie A2780 benutzt, um den Mutationsstatus von MRP2 in diesem Zellsystem nicht zu verändern. Es konnte eine geringe Überexpression von MRP2 in der Zellinie A2780 erreicht werden, wobei die MRP2-mRNA-Expression in den Transfektanten nicht an die Expressionshöhe in der Zellinie A2780RCIS heranreichte.

Entsprechend der geringen Überexpression in den MRP2-transfizierten A2780-Zellen wurde in den Transfektanten nur eine leichte Resistenzerhöhung gegenüber Cisplatin und Carboplatin erreicht, wobei der Unterschied zur untransfizierten Ausgangzellinie A2780 dennoch statistisch signifikant war (P<0,05). Die MRP2-Transfektanten zeigten keine Kreuzresistenz gegenüber Daunorubicin, gegenüber Etoposid und Vincristin war das Verhalten uneinheitlich. Es konnte somit der Zusammenhang von MRP2-Expression und Resistenz gegenüber Cisplatin und Carboplatin funktionell bestätigt werden.

Die in vitro charakterisierten Anti-MRP2- Hammerhead Ribozyme RzM1 und RzM2 wurden in die cisplatinresistenten Zellinie A2780RCIS transfiziert und so auf ihre Wirksamkeit im Zellinienmodell getestet. Die untersuchten Ribozym-Transfektanten beider Ribozyme zeigten eine Reduktion von MRP2 auf mRNA- und Proteinebene, in einigen Klonen bis auf das MRP2-Expressionsniveau der chemosensitiven A2780. Obwohl das Ribozym RzM1 bei den vorangegangenen in vitro-Test die höheren kinetischen Werte aufwies, ließ sich bei dem Einsatz in der Zellkultur kein Unterschied in der Wirksamkeit der Ribozyme RzM1 und RzM2 feststellen. Beide Ribozyme waren in der Lage, die MRP2-Expression in den Tumorzellen zu verringern. Die Transfektanten mit katalytisch inaktiven Ribozymen, RzM1/mut und RzM2/mut zeigten ebenfalls eine Reduktion der MRP2-Expression und eine verminderte Resistenz gegenüber Cisplatin und Carboplatin. Antisense-Effekte der 5’- und 3’-flankierenden Sequenzen der katalytisch inaktiven Ribozyme könnten dieses Verhalten erklären. Ebenfalls mitgeführte Leervektortransfektanten stellten sicher, daß es sich bei den gefundenen Effekten nicht um Transfektionsartefakte handelt. Durch Applikation der Anti-MRP2-Ribozyme, RzM1 und RzM2, konnte eine Sensitivierung gegenüber Cisplatin bis zu 63 % erreicht werden. Es konnte somit ebenfalls der Zusammenhang von MRP2-Expression und der Sensitivität gegenüber Cisplatin und Carboplatin durch die Anwendung von Anti-MRP2-Ribozymen demonstriert werden. Die veränderte Sensitivität gegenüber Daunorubicin und Etoposid darauf hin, daß MRP2 an weiteren Resistenzen beteiligt sein kann. Da diese Kreuzresistenzen jedoch nicht in der Zellinie D43/86RCIS und den A2780-MRP2-Transfektanten auftraten, kann man darauf schließen, daß bei der durch MPR2-vermittelten Resistenz gegenüber Daunorubicin und Etoposid weitere Faktoren beteiligt sind. Gegenüber Vincristin ergab sich kein einheitliches Resistenzerhalten; die Hälfte der Klone zeigte eine Sensitivierung, die andere Hälfte nicht. Da sich die Zellinien A2780 und A2780RCIS nicht in ihrer Sensitivität gegenüber Vincristin unterscheiden, wohl aber deutlich in der MRP2-Expression, ist davon auszugehen, daß diese klonal auftretenden Sensitivitätsunterschiede nicht (bzw. nicht allein) auf MRP2 zurückzuführen sind. In anderen MRP2-Transfektionsexperimenten konnte eine Kreuzresistenz gegenüber Vincristin festgestellt werden (Keppler et al., 1999; Kawabe et al., 1999; Chen et al., 1999; Cui et al., 1999). In diesem Zusammenhang wäre denkbar, daß MRP2 einen weiteren Faktor für die Ausschleusung von Vincristin benötigt, der in den Zellinien A2780 und A2780RCIS heterogen exprimiert wird.

Obwohl in einigen Anti-MRP2-Ribozym-Transfektanten die MRP2-Expression auf mRNA und Proteinebene auf das Level der sensiblen Ausgangszellinie A2780 vermindert wurde, konnte die Sensitivität gegenüber Cisplatin nicht vollständig wiederhergestellt werden. Das deutet daraufhin, daß in der Zellinie A2780RCIS mehrere Mechanismen bei der Cisplatinresistenz zusammenwirken.Der Mutationsstatus von p53 wurde in den sechs Tumorzellinien bestimmt. Nur in der Ovarialkarzinomzellinie A2780 lag Wildtyp-p53 vor. In den Zellinien A2780RCIS, D43/86, D43/86RCIS, Mewo und MewoRCIS war p53 mutiert, wobei die Mutationen in der für die Funktion wichtigen DNA-Bindungs- oder Oligomerisierungsdomäne lagen. Das mutierte p53-Gen, sowie die festgestellte Reduktion der hMLH1-Expression könnten somit in der Zellinie A2780RCIS bei der Cisplatinresistenz eine Rolle spielen. Beide Faktoren wurden auch von anderen Arbeitsgruppen im Zusammenhang mit Cisplatinresistenz beschrieben (Aebi et al., 1996; Drummond et al., 1996; Brown et al., 1997; Siddik et al., 1998; Fink et al., 1998; Giaccone, 2000). Es wurde ebenfalls gezeigt, daß Selektion mit Cisplatin zu Mutationen in p53 und Reduktion der cisplatin-induzierten Apoptose führt (Perego et al., 1996). Darüberhinaus gibt es weitere Faktoren, die die Resistenz gegenüber Cisplatin vermitteln können. So wurde durch den Einsatz von Ribozymen gegen c-fos (Funato et al., 1997), K-ras (Funato et al., 2000) und γ-Glutamylcystein-Synthetase (Nagata et al., 2001; Iida et al., 2001) eine Sensitivierung gegenüber Cisplatin erreicht.