Bedeutung des ABC-Transporters MRP2/cMOAT/ABCC2 bei der Cisplatinresistenz humaner Tumorzellen von Verena Waltraut Materna111.121.1.1110#963141#1331.1.24260#2401.1.35237#300313#25561.21.2.17458#34681.2.2910431#4541.2.311121.3131.41.4.114605#3141.4.2151.4.316256#66171.5182192.12.1.120212.1.22.1.3222.1.42324252.1.5262.1.6272.1.7282.1.8292.1.9302.2312.2.12.2.2322.2.3332.2.42.2.5342.2.62.2.72.2.8352.2.92.2.10362.2.112.2.122.2.13372.2.142.2.153839402.2.16412.2.172.2.182.2.19422.2.202.2.212.2.22432.2.23442.2.24452.2.2580#684693#60164#642.2.26472.2.27109#6448605#55127#67605#5549143#67129#64191#3150251#642.2.28512.2.29522.2.30532.2.312.2.32542.2.33552.2.34562.2.352.2.36573583.13.1.159605#697603.1.2613.1.362436#50763337#2906465360#24066557#2183.23.2.167596#323683.2.269453#2287071627#67572593#208733.33.3.174621#389761#2093.3.275605#402763.3.377605#36578605#67979605#35380605#54881605#5563.4823.4.13.4.283595#50984853.4.386521#35787488#7588889492#3543.4.490525#7709192594#2084934.14.29495964.397984.4991001011024.51034.6104 AbkürzungsverzeichnisVIIVIIIIX Literaturverzeichnis105106107108109110111112113114115116 Danksagung117 Curriculum vitae118119120 Selbständigkeitserklärung121deInhaltsverzeichnisHilfeBedeutung des ABC-Transporters MRP2/cMOAT/ABCC2 bei der Cisplatinresistenz humaner TumorzellenDISSERTATIONzur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

im Fach Biologie
eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin von Verena Waltraut Materna, geb. Schaub geboren am 7. Oktober 1973 in Bautzen

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Prof. Dr. Michael Linscheid


Prof. Dr. Andreas Herrmann PD Dr. Hermann Lage PD Dr. Wolfgang Dreier eingereicht am: 16.08.2002Tag der mündlichen Prüfung: 27.11.2002 Zusammenfassung

Tumorzellen können vielfältige Resistenzmechanismen gegenüber Zytostatika entwickeln. Untersuchungen an drei humanen Tumorzellinien und ihren cisplatinresistenten Varianten zeigten eine Assoziation von erhöhter MRP2-Expression und dem Auftreten von Cisplatinresistenz. Darüberhinaus waren die cisplatinresistenten Zellinien gegenüber Carboplatin kreuzresistent. Um weitere Faktoren im Zusammenhang mit der Cisplatinresistenz zu untersuchen, wurde der Mutationsstatus von p53 und der zelluläre Glutathiongehalt in den Zellinien bestimmt. Der offene Leserahmen von MRP2 aus der cisplatinresistenten Ovarialkarzinomzellinie A2780RCIS wurde für die Transfektion in die cisplatinsensitive Zellinie A2780 genutzt. Die Transfektanten zeigten eine Überexpression von MRP2 und wiesen eine Resistenz gegenüber Cisplatin und Carboplatin auf. Dies konnte in Zellzyklus- und Apoptose-Untersuchungen unter Cisplatinbehandlung gestätigt werden. Durch computergestützte Faltungsanalysen von Abschnitten der MRP2-mRNA wurden zwei potentielle Ribozymschnittstellen ausgewählt. Die konstruierten Anti-MRP2-Hammerhead-Ribozyme RzM1 und RzM2 wurden im zellfreien System auf ihre Schnittaktivität getestet und erwiesen sich als katalytisch aktiv. Es wurden verschiedene kinetische Parameter für RzM1 und RzM2 ermittelt und mit anderen Ribozymen verglichen. Die Ribozyme zeigten eine gute Effektivität bei der Spaltung ihres Zielmoleküls, wobei RzM1 die höhere Effektivität aufwies. Beide Ribozyme wurden auf ihre Wirksamkeit durch Transfektion in die Zellinie A2780RCIS getestet. Die untersuchten Transfektanten zeigten eine geringere Expression von MRP2 auf mRNA- und Proteinebene und wiesen eine verminderte Resistenz gegenüber Cisplatin, Carboplatin, Daunorubicin und Etoposid auf. Die Ribozyme RzM1 und RzM2 waren gleichermaßen für die Expressionsregulierung von MRP2 in Tumorzellen geeignet. In Zellzyklus- und Apoptose-Untersuchungen wurde funktionell bestätigt, daß die A2780RCIS-Anti-MRP2-Ribozym-Transfektanten auf eine Cisplatinbehandlung stärker ansprechen als die cisplatinresistente Ausgangszellinie A2780RCIS. Die Anwendung der Ribozyme RzM1 und RzM2 zur Unterstützung der Chemotherapie von Tumorzellen scheint daher vielversprechend.

 MRP2 cMOAT ABCC2 Cisplatin Ribozym Chemoresistenz Abstract

Tumour cells can develop a lot of resistance mechanisms against cytostatic drugs. Examinations of three human tumour cell lines and their cisplatinresistant variants showed an association of elevated MRP2 expression and the occurrance of cisplatinresistance. Moreover, the cisplatinresistant cell lines were crossresistant against carboplatin. To examine further factors in context of cisplatinresistance the mutation status of p53 and the cellular glutathione content of the cell lines were determined. The MRP2-open reading frame of the cisplatinresistant ovarian carcinoma cell line A2780RCIS was used for transfection into the cisplatinsensitive cell line A2780. The transfectants showed an overexpression of MRP2 and a resistance against cisplatin and carboplatin. This could be confirmed with analysis of the cell cycle and apoptosis induction after treatment with cisplatin. Using computer aided folding analysis of MRP2 mRNA parts two possible ribozyme cleavage sites were selected. The constructed anti-MRP2 hammerhead ribozymes RzM1 and RzM2 were tested in a cell-free system with respect to their cleavage activities and were found to be catalytic active. Various kinetic parameters of RzM1 and RzM2 were determined and compared with other ribozymes. The ribozymes showed a good effectivity for the substrate cleavage, although RzM1 had the better effectivity. Both ribozymes were tested for their effectiveness after transfection into the cell line A2780RCIS. The transfectants showed a lower MRP2 expression on mRNA and protein level and also a reduced resistance against cisplatin, carboplatin, daunorubicin, and etoposide. The ribozymes RzM1 and RzM2 were both equally suitable for the regulation of MRP2 expression in tumour cells. Analysis of cell cycle and apoptosis induction could confirm functionally the higher sensitivity of the A2780RCIS-anti-MRP2 ribozyme transfectants after treatment with cisplatin in comparison to the cisplatinresistant cell line A2780RCIS. Therefore, the application of the ribozymes RzM1 and RzM2 for the support of cancer chemotherapy seems to be promising.

 MRP2 cMOAT ABCC2 cisplatin ribozyme chemoresistance







Das Sonnenstäubchen fern im Raume,
das Tröpfchen, das im Grase blinkt,
das dürre Blättchen, das vom Baume
im Hauch des Windes niedersinkt –
Ein jedes wirkt an seinem Örtchen
still weiter, wie es muß und mag,
ja, selbst ein leises Flüsterwörtchen
klingt fort bis an den Jüngsten Tag.

Wilhelm Busch

Inhaltsverzeichnis

  • 1  Einleitung

    • 1.1  Chemotherapie

      • 1.1.1  Cisplatin und Carboplatin

      • 1.1.2  Daunorubicin

      • 1.1.3  Etoposid

    • 1.2 Mechanismen der Chemoresistenz

      • 1.2.1  Überblick

      • 1.2.2  Bedeutung von ABC-Transportern

      • 1.2.3  Der ABC-Transporter MRP2/cMOAT/ABCC2

    • 1.3 Tumorzellinien zur Untersuchung von Resistenzmechanismen

    • 1.4 Ribozyme

      • 1.4.1  Hammerhead -Ribozyme

      • 1.4.2  Ribozymdesign

      • 1.4.3  Kinetische Parameter von Ribozymen

    • 1.5 Zielstellungen der vorliegenden Arbeit

  • 2  Material und Methoden

    • 2.1 Material

      • 2.1.1  Chemikalien

      • 2.1.2  Radiochemikalien

      • 2.1.3  Enzyme (inklusive Puffer) und Inhibitoren

      • 2.1.4  Nukleinsäuren

      • 2.1.5  Kits, Fertiglösungen und Antikörper

      • 2.1.6  Geräte

      • 2.1.7  Verbrauchsmaterial

      • 2.1.8  Biologisches Material

      • 2.1.9  Computer und Software

    • 2.2  Methoden

      • 2.2.1  Zellkultur

      • 2.2.2  Einfrieren und Auftauen von eukaryotischen Zellen

      • 2.2.3  Transfektion der Zellinien A2780 und A2780RCIS

      • 2.2.4  Kultur von Bakterien

      • 2.2.5  Transformation von E. coli

      • 2.2.6  Mini-Präparation von Plasmid-DNA aus E.coli

      • 2.2.7  Behandlung von Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen

      • 2.2.8  Präparation von RNA

      • 2.2.9  Agarosegel-Elektrophorese von RNA

      • 2.2.10  Bestimmung von Nukleinsäure-Konzentrationen

      • 2.2.11  Northern-Blot

      • 2.2.12  Markierung von DNA-Sonden

      • 2.2.13  Northern-Hybridisierung

      • 2.2.14  Reverse Transkription

      • 2.2.15  Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

      • 2.2.16  Agarosegel-Elektrophorese von DNA

      • 2.2.17  Elution von DNA-Fragmenten

      • 2.2.18  Ligation von DNA-Fragmenten

      • 2.2.19  Sequenzierung von DNA

      • 2.2.20  Identifikation potentieller Ribozym-Schnittstellen in der MRP2-mRNA

      • 2.2.21  Ribozym-DNA-Matrizen für die in vitro -Transkription

      • 2.2.22  in vitro -Transkription

      • 2.2.23  Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) von RNA

      • 2.2.24 Elution und Fällung von RNA aus Polyacrylamidgelen

      • 2.2.25 Bestimmung der Stoffmenge radioaktiv markierter RNA

      • 2.2.26  in vitro -RNA-Prozessierung

      • 2.2.27 Berechnung der Reaktionsparameter der ribozymatischen Spaltung

      • 2.2.28  Präparation von Membranproteinen

      • 2.2.29  Bestimmung von Protein-Konzentrationen

      • 2.2.30 Polyacrylamidgel-Elektrophorese von Proteinen

      • 2.2.31 Western-Blot

      • 2.2.32 Antikörper-Reaktion und Detektion mittels Chemolumineszenz

      • 2.2.33 Proliferationsassay mittels SRB

      • 2.2.34 Glutathion-Assay

      • 2.2.35 Caspase-3-Assay

      • 2.2.36 Zellzyklus-Analyse mittels Durchflußzytometrie

  • 3  Ergebnisse

    • 3.1 Charakterisierung der Zellinien und ihrer cisplatinresistenten Varianten

      • 3.1.1  Wachstumsverhalten der Zellinien unter Zytostatikabehandlung

      • 3.1.2  Mutationsstatus von p53 in den Zellinien

      • 3.1.3 Expression von Genen mit Relevanz für Chemoresistenz in den Zellinien

    • 3.2 Überexpression von MRP2 in der Zellinie A2780

      • 3.2.1  Klonierung von MRP2 aus der Zellinie A2780RCIS

      • 3.2.2 Transfektion von MRP2 in die Ovarialkarzinomzellinie A2780

    • 3.3 Entwicklung und Applikation von Ribozymen gegen die MRP2-mRNA in vitro

      • 3.3.1 Auswahl potentieller Ribozymschnittstellen

      • 3.3.2  Ribozymatische Spaltung von Fragmenten der MRP2-mRNA durch die Ribozyme RzM1 und RzM2

      • 3.3.3  Charakterisierung der Ribozyme RzM1 und RzM2 in vitro

    • 3.4  Inhibition von MRP2 in der Zellinie A2780RCIS durch RzM1 und RzM2

      • 3.4.1 Klonierung der Ribozyme und Transfektion in die Zellinie A2780RCIS

      • 3.4.2 Resistenzverhalten in den A2780RCIS-Ribozym-Transfektanten

      • 3.4.3 MRP2-Expression in den A2780RCIS-Ribozym-Transfektanten

      • 3.4.4 Zellzyklus und Apoptose in den A2780RCIS-Ribozym-Transfektanten

  • 4  Diskussion

    • 4.1 Resistenzuntersuchungen an humanen Tumorzellinien

    • 4.2 Expression von chemoresistenzassoziierten Genen

    • 4.3 Charakterisierung von Anti-MRP2-Hammerhead-Ribozymen in vitro

    • 4.4 Rolle von MRP2/cMOAT/ABCC2 bei der Cisplatinresistenz

    • 4.5 Veränderungen in Zellzyklus und Apoptose nach MRP2-Modulation

    • 4.6 Praxisrelevanz und Ausblick

  • Abkürzungsverzeichnis
  • Literaturverzeichnis
  • Danksagung
  • Curriculum vitae
  • Selbständigkeitserklärung
Tabellen

  • Tab. 2.1 : Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide.

  • Tab. 2.2 : Humane Karzinomzellinien.

  • Tab. 2.3 : Primer-Hybridisierungstemperaturen (T H ) der durchgeführten PCRs.

  • Tab. 2.4 : Reaktionsbedingungen bei der RNA-Prozessierung.

  • Tab. 3.1 : IC 50 -Werte für Cisplatin, Carboplatin, Daunorubicin, Vincristin und Etoposid der untersuchten Zellinien.

  • Tab. 3.2 : TP53-Status in den untersuchten Zellinien.

  • Tab. 3.3 : Real-time -RT-PCR zur Quantifizierung der MRP2-Expression in denZellinien.

  • Tab. 3.4 : IC 50 -Werte für Cisplatin, Carboplatin, Daunorubicin, Vincristin und Etoposid der A2780-MRP2-Klone.

  • Tab. 3.5 : Real-time -RT-PCR zur Quantifizierung der MRP2-Expression in den A2780-MRP2-Klonen.

  • Tab. 3.6 : IC 50 -Werte für Cisplatin, Carboplatin, Daunorubicin, Vincristin und Etoposid der A2780RCIS-RzM-Klone.

  • Tab. 3.7 : Real-time -RT-PCR zur Quantifizierung der MRP2-Expression in den A2780RCIS-RzM-Klonen.

  • Tab. 4.1 : Katalytische Parameter verschiedener Hammerhead-Ribozyme.

Bilder

  • Abb. 1.1: Strukturformel von Cisplatin

  • Abb. 1.2 : Strukturformel von Carboplatin

  • Abb. 1.3 : Strukturformel von Daunorubicin

  • Abb. 1.4 : Strukturformel von Etoposid

  • Abb. 1.5 : Strukturformel von Vincristin

  • Abb. 1.6 : Chemoresistenzmechanismen

  • Abb. 1.7 : Membrantopologie von ABC-Transportern

  • Abb. 1.8 : Hammerhead -Struktur eines Ribozyms

  • Abb. 3.1 : Sensitivität der untersuchten Zellinien gegenüber Cisplatin, Carboplatin, Daunorubicin, Etoposid und Vincristin

  • Abb. 3.2 : mRNA-Expressionsanalyse mittels RT-PCR in den untersuchten Zellinien

  • Abb. 3.3 : Expression der MRP2-mRNA in den untersuchten Zellinien

  • Abb. 3.4 : MRP2-Protein-Expression in den untersuchten Zellinien

  • Abb. 3.5 : Glutathion-Gehalt in den untersuchten Zellinien

  • Abb. 3.6 : Amplifikation des ORFs von MRP2 mittels RT-PCR aus A2780RCIS

  • Abb. 3.7 : Sensitivität der A2780-MRP2-Klone gegenüber Cisplatin

  • Abb. 3.8 : Zellzyklusanalysen in den A2780-MRP2-Klonen

  • Abb. 3.9 : Caspase-3-Aktivität nach Cisplatinbehandlung in den MRP2-Klonen.

  • Abb. 3.10 : Sekundärstruktur von einem Auschnitt der MRP2-mRNA

  • Abb. 3.11 : S equenzen der Anti-MRP2- Hammerhead -Ribozyme RzM1 und RzM2

  • Abb. 3.12 : Spaltung der Substrate sub1 und sub2 durch die Hammerhead -Ribozyme RzM1 und RzM2

  • Abb. 3.13 : Zeitabhängigkeit der Spaltung durch RzM1 und RzM2

  • Abb. 3.14 : Produkt-Zeit-Diagramm zur Bestimmung der Initialgeschwindigkeit v ini

  • Abb. 3.15 : Abhängigkeit der Spaltung von der Konzentration der Ribozyme

  • Abb. 3.16 : Bestimmung des Parameters k cat /k M

  • Abb. 3.17 : Bestimmung des Parameters k obs

  • Abb. 3.18 : Se nsitivität der A2780RCIS-RzM-Klone gegenüber Cisplatin

  • Abb. 3.19 : Insertkontrolle mittels RT-PCR der Transfektanten A2780RCIS-RzM2

  • Abb. 3.20 : Expression der MRP2-mRNA in den A2780RCIS-RzM-Klonen

  • Abb. 3.21 : E xpression von MRP2 in den A2780RCIS-RzM2-Klonen

  • Abb. 3.22 : Zellzyklusanalysen in den A2780RCIS-RzM-Klonen

  • Abb. 3.23 : Ca spase-3-Aktivität nach Cisplatinbehandlung in den Anti-MRP2-Ribozym-Klonen