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2  Material und Methoden

2.1 Versuchstiere

Für die Versuche wurden männliche Wistar-Ratten (Charles River, bezogen über Tierzucht Schönwalde, Deutschland) im Alter von 6-8 Wochen mit einem Gewicht von 220-460 g verwendet. Vor der Operation wurden die Tiere in Gruppen zu fünf bis sechs in Kunststoffboxen („Typ 4“, 55 x 33 x 20 cm, Ebeco, Deutschland) mit Gitterdeckeln („Typ 4 Standard“, 55,7 x 33,2 x 0,5 cm, Ebeco, Deutschland) gehalten, nach der Operation einzeln in kleineren Kunststoffboxen („Typ 3“, 37,5 x 21,5 x 15 cm, Ebeco, Deutschland) mit erhöhten Deckeln („Typ 3-erhöht“, 37,9 x 21,7 x 5 cm, Ebeco, Deutschland). Die Tiere hatten freien Zugang zu Wasser und Futter („Altromin 1326 Standard-Diät Ratten-Mäuse“, Altromin, Lage, Deutschland). Die Haltung der Tiere erfolgte in Räumen mit konstant gehaltener Temperatur (19-23°C) und Luftfeuchtigkeit (55-60%) bei einem 12stündigen Hell-Dunkel-Wechsel. Die Käfigstreu („Altromin animal bedding“, Altromin, Lage, Deutschland) wurde wenigstens einmal wöchentlich gewechselt.

Die Haltung und Behandlung der Versuchstiere erfolgte gemäß dem in Deutschland geltenden Tierschutzgesetz (TierSchG, 5. Abschnitt, §7-§9 Tierversuche). Sämtliche Eingriffe und Prozeduren waren vom Landesamt für Arbeitsschutz, Gesundheitsschutz und technische Sicherheit Berlin genehmigt (Genehmigungsnummer G 0226/00).

2.2 Versuchsprotokoll und -gruppen: Überblick

Nach Implantation von Elektroden in den Hippocampus und der nachfolgenden elektrischen Induktion eines selbsterhaltenden Status epilepticus durch Tractus perforans-Stimulation wurden das Auftreten von spontanen Anfällen sowie elektrophysiologische Parameter im Gyrus dentatus zu drei verschiedenen Zeitpunkten untersucht. Die Untersuchungszeitpunkte waren: 7-11 Tage, 28-32 Tage und 56-60 Tage nach Status epilepticus. Zur Vereinfachung werden die Messzeitpunkte im Folgenden als eine Woche, vier Wochen und acht Wochen nach Status epilepticus bezeichnet. Zusätzlich wurden die elektrophysiologischen Messungen [Seite 31↓]zum Erhalt von individuellen Kontrollwerten auch direkt vor der Induktion des Status epilepticus durchgeführt. Die Untersuchungen erfolgten an zwei verschiedenen Versuchsgruppen mit unterschiedlich langer Statusdauer: selbsterhaltender Status epilepticus nach Stimulationsende 5 Minuten und selbsterhaltender Status epilepticus nach Stimulationsende 3 Stunden, (im Folgenden 5 Minuten- bzw. 3 Stunden-SSSE-Gruppe genannt). Um den Einfluss der implantierten Elektroden und des zur Statusinduktion applizierten Stromes auf die Epileptogenese und die elektrophysiologischen Veränderungen einschätzen zu können, wurden zwei Kontrollgruppen gebildet: Operierte Tiere, bei denen nach der Elektrodenimplantation kein Status induziert, sondern lediglich Pentobarbital appliziert wurde (Elektrodenkontrollen), und Schein-stimulierte Tiere, die nach Applikation von Pentobarbital elektrisch stimuliert wurden, woraufhin sich kein Status epilepticus entwickelte (Stimulationskontrollen). Kontrolltiere wurden zu den gleichen Zeitpunkten gemessen bzw. überwacht wie Statustiere. Einen Überblick über den zeitlichen Versuchsablauf zeigt Abbildung 3.

2.3 Elektrodenimplantation

2.3.1 Elektroden

Als Ableitelektrode diente eine 0,28 mm dicke, Polymide-isolierte Edelstahl-Elektrode mit Sockel (intracranial electrode with socket, E363/1, Plastics One Inc., USA), für die bipolare Stimulationselektrode wurden zwei 0.15 mm dicke Formvar-isolierte Edelstahlelektroden mit Sockel (intracranial electrode with socket, E363/3, Plastics One Inc., USA) eng verdrillt. Für die Erdeelektrode wurden zwei ca. 3 cm lange Silberdrähte (Silberdraht, 0,2 mm Durchmesser, hart, Allgemeine Gold- und Silberscheideanstalt AG, Pforzheim, Deutschland) an einen Elektrodensockel (socket contact, E363/0, Plastics One Inc., USA) gelötet. Alle drei Elektrodensockel hatten die gleiche Größe.


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Abb.3: Überblick über die Gruppeneinteilung und den zeitlichen Ablauf der Experimente.

Acht bis zehn Tage nach der Implantation der Elektroden, am Tag 0, wurden bei allen Tieren Einzelreiz- und Paired pulse-Messungen durchgeführt, um Ausgangswerte zu erhalten. Ein Teil der Tiere wurde daraufhin im wachen Zustand über zwei Stunden kontinuierlich stimuliert und danach für 5 Minuten oder 3 Stunden im Status epilepticus belassen. Um Kontrollgruppen zu bilden, wurde ein weiterer Anteil von Tieren entweder nach vorangehender Verabreichung von Pentobarbital stimuliert (Stimulationskontrollen) oder nur mit Pentobarbital behandelt (Elektrodenkontrollen). Im weiteren Verlauf wurde bei den Tieren zu denselben drei Zeitpunkten (im Bild links) das Auftreten spontaner Anfälle durch Videoüberwachung über 48 Stunden dokumentiert, sowie Einzelreiz- und Paired pulse-Messungen durchgeführt.


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2.3.2  Operation

Die Versuchstiere wurden durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (4 g Pentobarbital/500 ml Aqua dest. +500 ml Propylenglykol) in einer Dosierung von 52 mg Pentobarbital/kg Körpergewicht anästhesiert. Mit dem Beginn der Operation wurde abgewartet, bis auf das Setzen von Schmerzreizen keine Abwehrreaktion („tail pinch response“) mehr erfolgte. In gleicher Weise wurde die Narkosetiefe während der Operation kontrolliert, gegebenenfalls wurde in 1 ml-(entsprechend 4 mg Wirkstoff) Dosen nachanästhesiert. Zum Schutz vor Austrocknung wurden die Augen mit Panthenol-Salbe (Bepanthen Augen-und Nasensalbe, Roche, Deutschland) bestrichen. Nach Rasur des Kopffelles mit einem handelsüblichen Elektrorasierer wurde der Kopf der Tiere in einen stereotaktischen Rahmen eingespannt. Hierbei wurde der Schädel zunächst seitlich über Ohrhalterungen, danach in Längsrichtung mit Hilfe eines Nasenbügels fixiert. Mittels eines alkoholischen Hautdesinfizienz (Frekaderm®, Fresenius AG, Bad Homburg, Deutschland) wurde die Kopfhaut desinfiziert und hierauf mit Hilfe von Schere und Pinzette kreisförmig eröffnet. Die nun sichtbare Kalotte wurde mittels eines Knochenschabers aufgeraut, um eine bessere Haftfläche für den später zu applizierenden Dentalkunststoff zu schaffen, und mit 3 % H2O2 und Zellstofftupfern gereinigt und getrocknet. Die Fixierung des Schädels in der Halterung wurde nun durch Höhenverstellung des Nasenbügels so angepasst, dass Lambda, die Kreuzungsstelle der sagittalen und hinteren Koronarnaht, 1 mm tiefer als das Bregma, die Kreuzungsstelle der sagittalen und vorderen Koronarnaht, zu liegen kam. Um die Positionen der Bohrlöcher für die Elektroden zu markieren, wurde eine an ihrer Öffnung begradigte, in Tinte getauchte Kanüle in die Halterung eines der Stereotaxiearme eingespannt und auf das Bregma aufgesetzt. Die Bregma-Koordinaten wurden abgelesen, und relativ zu diesen Werten die Koordinaten der Bohrlöcher für die Stimulations- und Ableitelektrode berechnet, eingestellt und mit Tinte markiert. Die Koordinaten für die Stimulations- und Ableitelektrode bzw. die Bohrlöcher waren: Bregma +6,9 mm posterior, +4,1 mm lateral (Stimulation) bzw. Bregma +3,1 mm posterior, +1,9 mm lateral (Ableitung). Die Auswahl der Koordinaten für die Elektrodenpositionierung im Angular bundle des Tractus perforans bzw. der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus erfolgte nach dem stereotaktischen Atlas [Seite 34↓]des Rattengehirns von Paxinos und Watson (Paxinos & Watson, 1998). Mit einer Bohrmaschine (Proxxon FBS 230/E, Proxxon, Niersbach, Deutschland), Bohrerdurchmesser 0,8 mm, wurde die Kalotte unter Schonung der Dura an den markierten sowie an drei weiteren, möglichst weit auseinander liegenden Stellen durchbohrt. In die drei zusätzlichen Bohrlöcher wurden Edelstahlschrauben (Schließblockschrauben VI-076/C, Optotec, Rathenow, Deutschland) eingedreht, von denen zwei mit den beiden Schenkeln der Erdeelektrode umwickelt wurden. Alle drei Schrauben dienten außerdem zur besseren Fixierung des später zu applizierenden Dentalkunststoffs. Zur exakten Positionierung der Stimulations- und Ableitelektrode wurden diese nach Einspannen in die Stereotaxiearme auf das Bregma aufgesetzt und nach erneuter Koordinatenberechnung innerhalb der Bohrlöcher auf die Dura aufgesetzt. Es wurde auf eine möglichst exakt vertikale Einstellung geachtet. Von dieser Position aus wurden die Elektroden initial um 2 mm abgesenkt. Über Kabel wurden die Elektroden mit einem Vorverstärker (NeuroLog System, A.C. Preamplifier NL104, Digitimer LTD., Hertfortshire, UK) und Oszilloskop (TDS 210 Two Channel Digital Real Time Oscilloscope, Tektronix, Beaverton, USA) bzw. einem Stimulusgenerator (NeuroLog System, Pulse Generator NL 301, Digitimer LTD., Hertfortshire, UK) und -isolator (NeuroLog System, Stimulus Isolator NL 800, Digitimer LTD., Hertfortshire, UK) verbunden und danach für 15 Minuten unmanipuliert in ihrer Anfangsposition belassen. Die optimale vertikale Positionierung der Elektroden im Tractus perforans bzw. Gyrus dentatus erfolgte anhand des durch Einzelreize evozierten Feldpotenzials: Ein Test-Stimulus (Rechteckpuls, 8 mA, 150 µsec) erzeugte ein Feldpotenzial, von dessen Kriterien auf die schichtbezogene Lage der Elektroden geschlossen werden konnte (siehe Abbildung 4). In der Ausgangslage der Elektroden wurde normalerweise ein kleinamplitudiges (1-2 mV) negatives Potenzial mit übergelagerter positiver Summenaktionspotenzial-Komponente (ca. 2 mV) ausgelöst. Die Amplitude des Summenaktionspotenzials (SAP) diente als Kriterium für die Position der Stimulationselektrode: Diese wurde in ca. 50 µm-Schritten unter Einzelreizgabe abgesenkt, bis sich die Amplitude des Summenaktionspotenzials nicht mehr weiter vergrößerte. Dabei wurde nach jeweils zehn Reizgaben zur Erholung des Gewebes zwei Minuten abgewartet. Nach Erreichen des maximalen Summenaktionspotenzials wurde die [Seite 35↓]Stimulationselektrode in ihrer Position belassen, und die Ableitelektrode in der gleichen Weise abgesenkt. Das in der Dendritenzellschicht (Stratum moleculare) abgeleitete negative exzitatorische postsynaptische Feldpotenzial (fEPSP) nahm zunächst an Amplitude zu, verringerte sich dann mit weiterem Absenken bis zum Erreichen eines Umkehrpunktes. Ab diesem war ein positives fEPSP abzuleiten, welches die Lage der Ableitelektrode in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus anzeigte (Lomo, 1971a). Von einer optimalen Positionierung beider Elektroden wurde ausgegangen, wenn ein maximal grosses positives EPSP mit einem annähernd gleich grossen übergelagerten negativ gerichteten Summenaktionspotenzial ausgelöst werden konnte. Die Veränderung des Feldpotenzials während des Vorgangs der Elektrodenabsenkung zeigt Abbildung 4. Im Idealfall wurden fEPSP- und Summenaktionspotenzialamplituden von 12-15 mV erreicht. Tiere, bei denen die Amplitude des Summenaktionspotenzials weniger als 2 mV betrug, wurden von den weiteren Messungen ausgeschlossen.

Nach Erreichen der endgültigen Elektrodenposition wurde die Kalotte erneut mit Hilfe von 3 % H2O2 gesäubert und getrocknet. Die Bohrlöcher wurden mit Sekundenkleber (UHU® Sekundenkleber, UHU GmbH & Co. KG, Bühl, Deutschland) verschlossen. Die Elektrodensockel wurden in einen Elektrodenhalter (electrode pedestal, MS363, Plastics One Inc., USA) eingefügt, und die gesamte Anordnung mit kaltpolymerisierendem Dentalkunststoff (Paladur®, Heraeus Kulzer, Hanau, Deutschland) an der Kalotte fixiert. Um postoperativen Wundschmerz zu vermeiden, wurden die Wundränder mit Lidocainspray (Xylocain® Pumpspray, AstroZeneca GmbH, Wedel, Deutschland) anästhesiert. Sobald die Kunststoffmasse ausgehärtet war, wurden die Tiere aus der stereotaktischen Halterung ausgespannt und in den mit Hilfe eines Heizkissens vorgewärmten Käfig gelegt. Im Bereich des Nackens wurden 5 ml Ringer-Lösung subkutan injiziert. Die Tiere blieben unter Überwachung, bis aus lebhaften spontanen Bewegungen auf ein Nachlassen der Narkosewirkung geschlossen werden konnte (ca. 1 Stunde nach Operationsende).


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Abb.4 : Entwicklung des Feldpotenzials während des schrittweisen Absenkens der Elektroden bei der Implantation.

A zeigt ein typisches Startpotenzial in der Ausgangsposition der Elektroden jeweils 2 mm unter der Kortexoberfläche. Zunächst wird die Stimulationselektrode (Stim) in den medialen Tractus perforans abgesenkt, wodurch sich der erste positiv gerichtete Potenzialanteil vergrößert (B). Wird daraufhin die Ableitelektrode (Rec) abgesenkt, vergrößert sich die Amplitude des negativ gerichteten Potenzialanteils (B-D). Die maximale negative Amplitude entspricht der Positionierung der Ableitelektrode im Bereich der Endigung des Tractus perforans auf den Dendriten der Körnerzellen. Ab dem Erreichen eines Umkehrpunktes (E) führt ein weiteres Absenken der Ableitelektrode zu einer konstanten Amplitudenvergrößerung des positiv gerichteten EPSPs sowie des übergelagerten negativ gerichteten Summenaktionspotenzials (F). Schließlich zeigt das Erreichen eines Maximums beider Amplituden eine optimale Elektrodenposition im medialen Tractus Perforans bzw. der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus an (G). Im linken Teil der Abbildung ist die Tiefe der Elektroden im Bezug auf die Ausgangsposition wiedergegeben, diese ist mit 0 mm angegeben.
kennzeichnet das Stimulationsartefakt (verkürzt dargestellt).


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2.4  Induktion eines selbsterhaltenden Status epilepticus

Nach einer Regenerationszeit von 8-10 Tagen nach der Implantation der
Elektroden wurde durch kontinuierliche elektrische Stimulation des Tractus perforans ein selbsterhaltender Status epilepticus induziert. Hierfür wurden die wachen, frei beweglichen Tiere mittels des Kopfsteckers über ein Kabel (Six Channel Connector Cable, 363-363 6TCS, Plastics One Inc, USA) und eine drehbare Halterung (Swivel Commutator, SL6C, Plastics One Inc, USA) an die Stimulations- und Messeinrichtung angeschlossen (siehe Abbildung 5).

Abb. 5 : Versuchsanordnung zur Durchführung der kontinuierlichen elektrischen Stimulation und der elektrophysiologischen Messungen an der frei beweglichen Ratte.

Die intrazerebralen Elektroden ragen in den Kopfstecker, von dem aus über Kabel die Verbindung zum Verstärker bzw. zur Stimulationseinheit hergestellt wird. Ein flexibles Kabel von 80 cm Länge sowie eine drehbare Halterung gewährleisten die freie Beweglichkeit der Ratte. Im Gyrus dentatus abgeleitete fEPSPs und EEGs werden nach Durchlaufen eines Verstärkers auf einem Oszilloskop dargestellt sowie unter Verwendung des Programms WinTida mit einer Abtastfrequenz von 20 kHz auf einem PC gespeichert. Die Einstellung der Reizparameter erfolgt manuell am Stimulusgenerator bzw. -isolator. Das Gerät erlaubt ein Umschalten zwischen der Abgabe von einzelnen oder seriellen Reizen, letzteres zur Durchführung der kontinuierlichen zweistündigen Stimulation. Für die Paired pulse-Stimulation mit unterschiedlich langen Interpulsintervallen wird die Stimulationseinheit vom PC angesteuert, das Stimulationsprotokoll wurde in WinTida programmiert.


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Über eine Dauer von zwei Stunden wurden ohne Unterbrechung Einzelreize abgegeben (Rechteckpulse, 3 mA, 150 µsec, 20 Hz). Unter dieser Stimulation zeigten die Tiere zunächst im Abstand von 1-2 Minuten einzelne Anfälle mit Kauen, Zittern der Schnurrhaare und ein- und beidseitigem Lidzucken (Anfallsstadien 1 und 2 nach Racine (Racine1972), siehe Tabelle 1), die jeweils von „Wet Dog Shakes“, kurzem, heftigem Schütteln des ganzen Körpers, beendet wurden. Mit zunehmender Stimulationsdauer traten schwerere Anfälle mit Kloni der Vorderextremitäten, Aufrichten und Umfallen auf. Nach einer durchschnittlichen Stimulationsdauer von 48 Minuten (Spanne 23-83 Minuten) ging die epileptische Aktivität in einen Status epilepticus über. Dieser war elektrographisch definiert durch
hochamplitudige (8-10 mV) Entladungen mit einer Frequenz > 1 Hz (siehe Abbildung 6). Klinisch zeichnete sich der Status epilepticus aus durch stereotype, Explorieren ähnelnde Bewegungen mit Gesichtsbewegungen (Kauen, Grimassieren) und Kopfnicken, im Abstand von einigen Minuten unterbrochen von generalisierten motorischen Anfällen mit Vorderextremitätenkloni, Aufrichten und Umfallen (Anfallsschweregrade 4 und 5 nach Racine). Beide Parameter, klinische und elektrographische, hielten über das Ende der Stimulation hinaus für mehrere Stunden an, so dass von einem selbsterhaltenden Status epilepticus, nach der englischen Bezeichnung „self sustaining status epilepticus“ im Folgenden als SSSE abgekürzt, gesprochen werden kann. Um den möglicherweise durch die Stromapplikation entstehenden Schaden in allen Versuchstieren konstant zu halten, wurden alle Tiere über zwei Stunden stimuliert, auch wenn ein Status epilepticus schon nach deutlich kürzerer Stimulationszeit erreicht war. Nach einer Dauer von 5 Minuten bzw. 3 Stunden nach Stimulationsende wurde der SSSE durch intraperitoneale Injektion von 30 mg Pentobarbital/kg Körpergewicht beendet. Hierbei sistierten zunächst die motorischen Entäußerungen, gefolgt von einer Abnahme der Spikeamplitude und -frequenz im EEG. Bis zu einem völligen Sistieren der Spikeaktivität als Kriterium der definitiven Statusunterbrechung vergingen nach der Injektion etwa 5-10 Minuten. Anschließend wurden die Tiere über drei Stunden auf das Wiederauftreten von epileptischer Aktivität überwacht, was bei keinem der Tiere der Fall war. Tieren beider Kontrollgruppen wurde zum gleichen Zeitpunkt nach Elektrodenimplantation, 8-10 Tage, dieselbe Dosis Pentobarbital (30 mg/kg Kör[Seite 39↓]pergewicht) intraperitoneal injiziert wie den Tieren der Versuchsgruppen zur Beendigung des SSSE. Tiere der Simulationskontrollgruppe wurden, sobald die Narkosewirkung eingetreten war, unter EEG-Kontrolle mit den gleichen Parametern wie wache Tiere über zwei Stunden stimuliert. Bei keinem der Tiere entwickelte sich darauf, weder klinisch noch nach EEG-Kriterien, ein Status epilepticus. Tiere der Elektrodenkontrollgruppe erhielten die gleiche Dosis Pentobarbital und wurden nicht weiter behandelt.

Tab.1: Klassifikation epileptischer Anfälle bei Ratten, nach Racine 1972. Anfälle der Schweregrade 1 und 2 werden als fokal, Anfälle der Schweregrade 3-5 als generalisiert bezeichnet (Löscher, 2002).


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Abb.6: Intrazerebral aus der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus abgeleitete EEGs von jeweils 10 Sekunden Dauer. A) Vor Stimulation. B) Im selbsterhaltenden Status epilepticus nach zweistündiger Stimulation.

Ein SSSE ist definiert durch hochamplitudige (8-10 mV) Spikes mit einer Frequenz > 1Hz. C) Slow-Wave-Aktivität nach Beendigung des SSSE durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital.

2.5 Video-Telemetrie

Alle vier Versuchsgruppen wurden zu drei Zeitpunkten, eine Woche, vier Wochen und acht Wochen nach Status epilepticus über jeweils 48 Stunden per Videoüberwachung auf das Auftreten spontaner Anfälle untersucht. Das Filmen der Tiere in den oben geschilderten Käfigen erwies sich als problematisch, da zum einen die Gitterstäbe die Sicht behinderten, zum anderen sich die Tiere zu einem grossen Teil der Zeit unter den Futterluken aufhielten und so der Sicht entzogen waren. Daher wurden die Tiere während der Videoaufzeichnung in eigens angefertigten Plexiglasboxen gehalten. Die vier Boxen waren 55 cm hoch, 40 cm lang und 30 cm breit, nach oben offen und auf eine 1cm dicke Spanplatte montiert. In eine der Seitenwände war jeweils in für die Tiere gut erreichbarer Höhe eine Wasserflaschenhalterung angeschraubt. Der Boden der Boxen wurde mit Streu bedeckt, Futter wurde lose ausgelegt. Mittels einer mittig über den Boxen angebrachten digitalen Kamera (Schwarz-Weiß-System CF8/4 DX, Kappa, Gleichen, Deutschland) wurden jeweils bis zu vier Tiere gleichzeitig über 48 Stunden gefilmt. Die Kamera war an einen Zeitraffer-Videorekorder (Time Lapse Video Cassette Recorder, JVC, Japan) angeschlossen, mit dessen Hilfe die Bilder mit einer Frequenz von 6/s auf VHS-Videokassetten aufgezeichnet wurden. Aufgrund der [Seite 41↓]Spektralsensitivität der Kamera, 270-1050 nm, und einer hohen Lichtempfindlichkeit konnten die Tiere auch nachts bei geringer Beleuchtung (durch eine rote Glühbirne) gefilmt werden. Ein konstanter 12stündiger Hell-Dunkel-Wechsel war während der Videoaufnahmen nicht gewährleistet. Bei der Auswertung der Videofilme wurden auftretende Anfälle nach Schweregrad, Dauer und Uhrzeit dokumentiert. Nicht alle Tiere wurden zu allen drei Zeitpunkten auf das Auftreten von Anfällen untersucht. Dies lag zum Teil daran, dass Tiere aus dieser Studie im Rahmen einer weiteren Promotionsarbeit (Elsner, 2003) zu denselben drei Zeitpunkten in vitro untersucht wurden und somit für spätere in vivo Analysen nicht mehr zur Verfügung standen. Das Auftreten von Anfällen der Schweregrade 1 und 2 nach Racine konnte mit der angewandten Methode nicht beurteilt werden.

Abb.7: Originalbild aus der zur Anfallsbeobachtung verwendeten Schwarz-Weiß-Kamera. Bis zu vier Tiere in separaten Boxen wurden von oben über 48 Stunden gefilmt. Am oberen Rand der Boxen waren Etiketten mit der Identifikationsnummer der Tiere angebracht. Die Bilder wurden einem Zeitraffer-Videorekorder zugeführt und mit einer Frequenz von 6 Bildern pro Sekunde auf VHS-Videokassetten aufgezeichnet.


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2.6  Elektrophysiologie

2.6.1 Evozierte Potenziale

Die elektrophysiologischen Messungen wurden in allen vier Versuchsgruppen direkt vor der Stimulation bzw. Pentobarbitalinjektion und zu den gleichen Zeitpunkten nach SSSE wie die Videoüberwachung durchgeführt. Als Einschlusskriterium für die Messung galt zu allen Zeitpunkten ein Summenaktionspotenzial größer als 2 mV. Es wurden jeweils zunächst fünf Feldpotenziale (fEPSPs) aufgezeichnet. Zur Auslösung der Potenziale wurde der Tractus perforans über die bipolare Stimulationselektrode mit einzelnen Rechteckpulsen von 150 µs Dauer gereizt. Es wurde die kleinste Stromstärke, die noch ein maximales Summenaktionspotenzial auslöste (3-8 mA) gewählt, zwischen den Einzelreizen wurde jeweils 40 Sekunden abgewartet. Unter Beibehaltung der Stimulationsparameter wurden als nächstes Einzelreizpaare (Paired pulse) abgegeben. Die Interpulsintervalle betrugen 20, 25, 30, 40, 50, 100, 300, 500 und 1000 ms. Für jedes Intervall wurde jeweils eine Messung aufgezeichnet. Der zeitliche Abstand zwischen den Reizpaaren betrug 40 Sekunden.

2.6.2 Datenanalyse

2.6.2.1 Einzelreize

Zur Beurteilung der Exzitabilität der Körnerzellen wurden folgende Parameter ausgewertet: Als Maß für die Geschwindigkeit der Depolarisation wurde die Latenz des Summenaktionspotenzials (SAP) gemessen. Die SAP-Latenz wurde definiert als die Zeit zwischen dem Stimulationsartefakt und dem negativen Umkehrpunkt des Summenaktionspotenzials in Millisekunden (ms). Für die Berechnung der Amplitude des Summenaktionspotenzials als Kriterium für die Menge gleichzeitig entladender Körnerzellen wurde der Mittelwert aus dem absteigenden und dem aufsteigenden Schenkel des Summenaktionspotenzials gebildet. Abbildung 8 zeigt die verwendeten Messparameter am Beispiel eines typischen Feldpotenzials. Für beide genannten Einzelreizparameter wurden jeweils in einem Tier die Werte von fünf Einzelreizen gemittelt. Für die SAP-Amplitude wurden die Mittelwerte der Ba[Seite 43↓]seline-Messung vor Induktion eines SSSE aufgrund der großen interindividuellen Streuung für jedes Tier gleich 100 % gesetzt. Zu den verschiedenen Messzeitpunkten nach SSSE erhobene Werte wurden in Prozent der Ausgangswerte ausgedrückt. Für die SAP-Latenz erfolgte die Darstellung in absoluten Werten.

Abb.8: Evoziertes Feldpotenzial, abgeleitet in der Körnerzellschicht des rechtsseitigen Gyrus dentatus nach Applikation eines Einzelreizes (8 mA, 150 µs) im gleichseitigen Tractus perforans.

Eingezeichnet sind die gemessenen Parameter SAP-Latenz und SAP-Amplitude. Als SAP-Latenz wurde die Zeit vom Beginn des Stimulationsartefakts ( ) bis zum negativen Umkehrpunkt des Summenaktionpotenzials gemessen. Für die SAP-Amplitude wurde der Mittelwert aus dem absteigenden und dem aufsteigenden Schenkel des Summenaktionspotenzials gebildet (a+b/2).

2.6.2.2 Paired pulse (Doppelpuls) -Paradigma

Die Paired pulse-Inhibition als Maß für die rekurrente Hemmung im synaptischen Schaltkreis des Gyrus dentatus wurde mittels der Paired pulse-Ratio quantifiziert: Hierfür wurde die Amplitude des Summenaktionspotenzials der zweiten Reizantwort zur Amplitude des Summenaktionspotenzials der ersten Reizantwort ins Verhältnis gesetzt. Werte kleiner 1 entsprachen einer Inhibition der 2. Reizantwort, Werte größer 1 einer Fazilitierung. Zur graphischen Darstellung des Paired pulse-Verhaltens wurde der Wert der Paired pulse-Ratio auf der y-Achse eines Diagramms gegen das jeweilige Interpulsintervall auf der x-Achse aufgetragen. Alle elektrophysiologischen Parameter wurden mit Hilfe der Softwareprogramme [Seite 44↓]WinTida (HEKA Elektronik, Lambrecht, Deutschland) und Signal (Cambridge Design, Cambridge, UK) aufgezeichnet und ausgewertet.

Abb.9: Paired pulse-Paradigma.

Die Abbildung zeigt zwei evozierte Feldpotenziale, abgeleitet in der Körnerzellschicht des rechtsseitigen Gyrus dentatus nach Applikation eines Paired pulses, d.h. zweier identischer Reize (8 mA, 150 µs), an den gleichseitigen Tractus perforans. Der Reizabstand in diesem Beispiel beträgt 30 ms. Es ist eine deutliche Inhibition der zweiten Reizantwort zu erkennen. Das Ausmaß dieser Inhibition wird durch Bildung des Verhältniswertes: Amplitude des 2.SAP/Amplitude des 1.SAP (Paired pulse-Ratio) quantifiziert.

2.7 Statistik

Die statistische Auswertung der Daten erfolgte unter Verwendung des Programms Winstat (Kalmia Co. Inc., Cambridge MA, USA). Für alle Daten wurde das arithmetische Mittel errechnet und in der Form Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Für die Beurteilung von Veränderungen innerhalb der einzelnen Gruppen vor und nach der Behandlung (SSSE/Stimulation in Narkose/Injektion von Barbiturat) wurde ein t-Test für gepaarte Daten eingesetzt. Unverbundene Daten wie die Anzahl der Anfälle in den verschiedenen Gruppen wurden unter Verwendung eines Kruskal-Wallis-Tests verglichen, nicht-parametrische Daten wie der Schweregrad der Anfälle mittels des Mann-Whitney-U-Tests. Für den Ver[Seite 45↓]gleich von Messwerten zwischen unterschiedlichen Gruppen wurde eine Multivarianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. Zur Korrelationsberechnung wurde die Methode nach Pearson verwendet. Unterschiede zwischen Messwerten wurden ab einem Signifikanzniveau von p < 0,05 als signifikant, ab einem Signifikanzniveau von p < 0,001 als hochsignifikant bezeichnet.


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17.01.2005