Aus der Klinik für Neurologie
der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Untersuchungen zur Epileptogenese
nach experimentellem Status epilepticus in vivo

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

von
Julia Matzen
aus München

Dekan: Prof. Dr. med. Joachim W. Dudenhausen

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. PD Dr. med H. Meierkord, Berlin
2. Prof. Dr. med. E.-J. Speckmann, Münster
3. Prof. Dr. med A. Draguhn, Heidelberg

Datum der Promotion: 19.07.2004

Für meine Eltern

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Epilepsien und Status epilepticus
    • 1.1.1 Versuchstiermodelle
  • 1.2 Die Hippocampusformation
    • 1.2.1  Anatomie
      • 1.2.1.1 Synaptische Verschaltung
    • 1.2.2  Funktion
  • 1.3 Prinzipien der Hemmung
    • 1.3.1 Interneurone des Gyrus dentatus
    • 1.3.2 GABA und GABA-Rezeptoren
  • 1.4 Theorien zur Epileptogenese
  • 1.5 Fragestellung der Arbeit und Hypothesen
• 2  Material und Methoden
  • 2.1 Versuchstiere
  • 2.2 Versuchsprotokoll und -gruppen: Überblick
  • 2.3 Elektrodenimplantation
    • 2.3.1 Elektroden
    • 2.3.2  Operation
  • 2.4  Induktion eines selbsterhaltenden Status epilepticus
  • 2.5 Video-Telemetrie
  • 2.6  Elektrophysiologie
    • 2.6.1 Evozierte Potenziale
    • 2.6.2 Datenanalyse
      • 2.6.2.1 Einzelreize
      • 2.6.2.2 Paired pulse (Doppelpuls) -Paradigma
  • 2.7 Statistik
• 3  Ergebnisse
  • 3.1 Induktion des Status epilepticus
  • 3.2 Klinische und elektrophysiologische Charakteristika des SSSE
  • 3.3 Spontane Anfälle
    • 3.3.1 Anfallszahlen in den Versuchsgruppen
    • 3.3.2 Zahl der Anfälle pro Tier
    • 3.3.3 Schweregrad
    • 3.3.4 Dauer
    • 3.3.5 Tageszeitliche Verteilung
  • 3.4 Elektrophysiologische Messungen
    • 3.4.1 Einzelreizparameter
      • 3.4.1.1 Summenaktionspotenzial: Amplitude
        • 3.4.1.1.1 Versuchsgruppe 3 Stunden SSSE
        • 3.4.1.1.2 Versuchsgruppe 5 Minuten SSSE
        • 3.4.1.1.3  Stimulationskontrollen
        • 3.4.1.1.4 Elektrodenkontrollen
      • 3.4.1.2  Summenaktionspotenzial: Latenz
        • 3.4.1.2.1 Versuchsgruppe 3 Stunden SSSE
        • 3.4.1.2.2 Versuchsgruppe 5 Minuten SSSE
        • 3.4.1.2.3 Stimulationskontrollen
        • 3.4.1.2.4 Elektrodenkontrollen
    • 3.4.2 Paired pulse-Messung
      • 3.4.2.1 Vor Statusinduktion
      • 3.4.2.2 Zeitverlauf nach Status epilepticus
        • 3.4.2.2.1 Versuchsgruppe 3 Stunden SSSE
        • 3.4.2.2.2 Versuchsgruppe 5 Minuten SSSE
        • 3.4.2.2.3 Stimulationskontrollen
        • 3.4.2.2.4 Elektrodenkontrollen
    • 3.4.3 Vergleich der Versuchs- und Kontrollgruppen
  • 3.5 Korrelation Anfälle/Inhibitionsverlust
• 4  Diskussion
  • 4.1 Induktion eines Status epilepticus durch elektrische Stimulation
  • 4.2 Entwicklung einer Epilepsie in Folge des Status epilepticus
    • 4.2.1 Auswirkung der Dauer des Status epilepticus
    • 4.2.2  Zeitlicher Verlauf
      • 4.2.2.1 Latenzperiode
    • 4.2.3 Tageszeitliche Verteilung der Anfälle
  • 4.3 Veränderungen der Inhibition und Exzitabilität im Gyrus dentatus
    • 4.3.1 Charakterisierung der verwendeten elektrophysiologischen Parameter
    • 4.3.2 Einordnung der Ergebnisse
    • 4.3.3 Interpretation der Ergebnisse anhand der Literatur
      • 4.3.3.1 Veränderungen der Exzitabilität der Körnerzellen
      • 4.3.3.2 Verlust der Inhibition nach Status epilepticus
        • 4.3.3.2.1 Veränderungen auf zellulärer bzw. Netzwerkebene
        • 4.3.3.2.2 Veränderungen auf synaptischer Ebene
      • 4.3.3.3 Erholung der Inhibition im weiteren Verlauf
  • 4.4 Vergleich der zeitlichen Entwicklung der Epilepsie und der elektrophysiologischen Messdaten
  • 4.5 Zusammenfassende Betrachtung der vier Versuchsgruppen
    • 4.5.1  Einführung einer Stimulationskontrollgruppe
• 5 Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Abkürzungsverzeichnis
• Danksagung
• Lebenslauf
• Wissenschaftliche Beiträge
• Erklärung an Eides statt

Tabellen

• Tab.1: Klassifikation epileptischer Anfälle bei Ratten, nach Racine 1972. Anfälle der Schweregrade 1 und 2 werden als fokal, Anfälle der Schweregrade 3-5 als generalisiert bezeichnet (Löscher, 2002).
• Tab.2: Anteil von Tieren mit spontanen Anfällen zu den drei Überwachungszeitpunkten nach 3 Stunden bzw. 5 Minuten SSSE in Prozent

Bilder

• Abb.1:(A) Schematische Darstellung der räumlichen Lage der hippocampalen Formation sowie der Fornices und Corpora mamillaria im Rattengehirn (nach Amaral und Witter, 1989). (B) Ausschnitt aus einem Koronarschnitt durch das Rattengehirn. Die hippocampale Formation mit Cornu ammonis (CA) und Gyrus dentatus (GD) ist aufgrund ihres charakteristischen schichtförmigen Aufbaus gut zu erkennen (nach Paxinos und Watson, 1986). (C) Schemazeichnung des synaptischen Schaltkreises innerhalb der hippocampalen Formation. Durch den Tractus perforans (Tp) erreichen Axone aus dem entorhinalen Kortex die Dendriten der Körnerzellen (Kz). Die Axone der Körnerzellen, die Moosfasern (Mf), ziehen zu den Pyramidenzellen (Pz) der CA3. Deren Axone, die Schafferschen Kollateralen (Sk), projizieren zu den Pyramidenzellen der CA1. Die Axone der CA1-Pyramidenzellen ziehen u.a. zurück zum entorhinalen Kortex.
• Abb.2: Schematische Darstellung der Vorwärts- und Rückwärtshemmung, englisch „feedforward-“ und „feedbackinhibition“.
• Abb.3: Überblick über die Gruppeneinteilung und den zeitlichen Ablauf der Experimente.
• Abb.4 : Entwicklung des Feldpotenzials während des schrittweisen Absenkens der Elektroden bei der Implantation.
• Abb. 5 : Versuchsanordnung zur Durchführung der kontinuierlichen elektrischen Stimulation und der elektrophysiologischen Messungen an der frei beweglichen Ratte.
• Abb.6: Intrazerebral aus der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus abgeleitete EEGs von jeweils 10 Sekunden Dauer. A) Vor Stimulation. B) Im selbsterhaltenden Status epilepticus nach zweistündiger Stimulation.
• Abb.7: Originalbild aus der zur Anfallsbeobachtung verwendeten Schwarz-Weiß-Kamera. Bis zu vier Tiere in separaten Boxen wurden von oben über 48 Stunden gefilmt. Am oberen Rand der Boxen waren Etiketten mit der Identifikationsnummer der Tiere angebracht. Die Bilder wurden einem Zeitraffer-Videorekorder zugeführt und mit einer Frequenz von 6 Bildern pro Sekunde auf VHS-Videokassetten aufgezeichnet.
• Abb.8: Evoziertes Feldpotenzial, abgeleitet in der Körnerzellschicht des rechtsseitigen Gyrus dentatus nach Applikation eines Einzelreizes (8 mA, 150 µs) im gleichseitigen Tractus perforans.
• Abb.9: Paired pulse-Paradigma.
• Abb.9: Zahl der Anfälle pro beobachtetem Tier in der 3 Stunden-SSSE-Gruppe. Ein Balken entspricht jeweils einem Tier, Tiere ohne Anfälle sind nicht berücksichtigt.
• Abb.10: Zahl der Anfälle pro beobachtetem Tier in der 5 Minuten-SSSE-Gruppe. Ein Balken entspricht jeweils einem Tier, Tiere ohne Anfälle sind nicht berücksichtigt.
• Abb.11: Durchschnittliche Dauer der Anfälle zu den beiden späteren Überwachungszeitpunkten nach Status epilepticus.
• Abb.12: Anzahl spontaner Anfälle bezogen auf die Tageszeit. Dargestellt sind alle in beiden Versuchsgruppen zu den drei untersuchten Zeitpunkten aufgetretenen Anfälle.
• Abb.13: SAP-Amplitude vor und eine, vier und acht Wochen nach dreistündigem SSSE. Da die SAP-Amplitude zwischen den einzelnen Tieren erheblich variierte, wurde der Ausgangswert vor SSSE in jedem Tier gleich 100 % gesetzt und nachfolgende Messwerte in Prozent des Ausgangswertes dargestellt. Dargestellt sind Mittelwerte mit SD aller zum jeweiligen Zeitpunkt gemessenen Tiere.
• Abb.14: SAP-Amplitude vor und eine, vier und acht Wochen nach fünfminütigem SSSE. Da die SAP-Amplitude zwischen den einzelnen Tieren erheblich variierte, wurde der Ausgangswert vor SSSE in jedem Tier gleich 100 % gesetzt und nachfolgende Messwerte in Prozent des Ausgangswertes dargestellt. Dargestellt sind die Mittelwerte mit SD aller zum jeweiligen Zeitpunkt gemessenen Tiere. Man beachte, dass die Skalierung der y-Achse anders ist als in Abb.13 (3 Stunden-SSSE-Gruppe).
• Abb.15: SAP-Amplitude vor und eine, vier und acht Wochen nach Stimulation unter Pentobarbital. Da die SAP-Amplitude zwischen den einzelnen Tieren erheblich variierte, wurde der Ausgangswert vor SSSE in jedem Tier gleich 100 % gesetzt und nachfolgende Messwerte in Prozent des Ausgangswertes dargestellt. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte mit SD aller zum jeweiligen Zeitpunkt gemessenen Tiere.
• Abb.16: SAP-Amplitude in der Elektrodenkontrollgruppe vor und eine, vier und acht Wochen nach Pentobarbital-Applikation. Da die SAP-Amplitude zwischen den einzelnen Tieren erheblich variierte, wurde der Ausgangswert vor SSSE in jedem Tier gleich 100 % gesetzt und nachfolgende Messwerte in Prozent des Ausgangswertes dargestellt. Gezeigt sind jeweils die Mittelwerte mit SD aller zum jeweiligen Zeitpunkt gemessenen Tiere.
• Abb.17: SAP-Latenz in der 3 Stunden-SSSE-Gruppe vor und eine, vier und acht Wochen nach SSSE. Gezeigt sind die Mittelwerte mit SD aller zum jeweiligen Zeitpunkt gemessenen Tiere. Es ist zu beachten, dass die y-Achse nicht bei 0 beginnt.
• Abb.18: SAP-Latenz in der 5 Minuten-SSSE-Gruppe vor und eine, vier und acht Wochen nach SSSE a) Mittelwerte mit SD aller zum jeweiligen Zeitpunkt gemessenen Tiere. b) Einzeldarstellung für jedes Tier. Die Messwerte eines Tieres sind jeweils durch Linien verbunden, gestrichelte Linien verbinden Messwerte, die nicht direkt aufeinander folgen. Es ist zu beachten, dass die y-Achse nicht bei 0 beginnt.
• Abb.19: SAP-Latenz in der Stimulationskontrollgruppe vor und eine, vier und acht Wochen nach Stimulation in Pentobarbital-Narkose. Gezeigt sind die Mittelwerte mit SD aller zum jeweiligen Zeitpunkt gemessenen Tiere. Man beachte, dass die y-Achse nicht bei 0 beginnt.
• Abb.20: SAP-Latenz in der Elektrodenkontrollgruppe vor und eine, vier und acht Wochen nach Injektion von Pentobarbital. Gezeigt sind die Mittelwerte mit SD aller zum jeweiligen Zeitpunkt gemessenen Tiere. Man beachte, dass die y-Achse nicht bei 0 beginnt.
• Abb.21: Paired pulse-Kurven der vier Versuchsgruppen vor der Stimulation bzw. Barbituratinjektion. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurde auf die Darstellung der Standardabweichung verzichtet, diese ist dem Text zu entnehmen. Die pp Ratio ist das Verhältnis der Amplitude der zweiten Reizantwort zur Amplitude der ersten (SAP2 (mV)/SAP1 (mV)). Werte kleiner 1 entsprechen einer Inhibition, Werte größer 1 einer Fazilitierung der zweiten Reizantwort.
• Abb.22: Paired pulse-Inhibition bei 20, 25, 30, 40, 100, 300 und 1000 ms Interpulsintervall (IPI) vor der Stimulation am Beispiel eines Tieres.
• Abb.23: Paired pulse-Inhibition in der 3 Stunden-SSSE-Gruppe vor (dunkle Balken) und eine Woche nach SSSE (helle Balken), gezeigt sind die Mittelwerte mit SD. Die Inhibition des zweiten Pulses war bei 20-30 ms Interpulsintervall (IPI) hochsignifikant, bei 300 ms und 1000 ms Interpulsintervall signifikant reduziert.
• Abb.24: Paired pulse-Inhibition in der 3 Stunden-SSSE-Gruppe vor (dunkle Balken) und vier Wochen nach SSSE (helle Balken), gezeigt sind die Mittelwerte mit SD.
• Abb.25: Paired pulse-Inhibition in der 3 Stunden-SSSE-Gruppe vor (dunkle Balken) und acht Wochen nach SSSE (helle Balken), gezeigt sind die Mittelwerte mit SD. Die Inhibition des zweiten Pulses war zu keinem der gemessenen Interpulsintervalle (IPI) signifikant unterschiedlich zu den Ausgangswerten. Es sind nur die Ausgangswerte der fünf Tiere dargestellt, die nach acht Wochen gemessen wurden.
• Abb.26: Zeitlicher Verlauf der maximalen Inhibition bei 20 ms Interpulsintervall in der 3 Stunden-SSSE-Gruppe.
• Abb.27: Paired pulse-Inhibition in der 5 Minuten-SSSE-Gruppe vor (dunkle Balken) und eine Woche nach SSSE (helle Balken), gezeigt sind die Mittelwerte mit SD. Die Inhibition des zweiten Pulses war bei 20 ms und 25 ms Interpulsintervall (IPI), sowie bei 300 ms und 500 ms Interpulsintervall signifikant reduziert.
• Abb.28: Paired pulse-Inhibition in der 5 Minuten-SSSE-Gruppe vor (dunkle Balken) und vier Wochen nach SSSE (helle Balken), gezeigt sind die Mittelwerte mit SD. Die Inhibition des zweiten Pulses war bei 25 ms Interpulsintervall (IPI) signifikant reduziert.
• Abb.29: Paired pulse-Inhibition in der 5 Minuten-SSSE-Gruppe vor (dunkle Balken) und acht Wochen nach SSSE (helle Balken), gezeigt sind die Mittelwerte mit SD. Die Inhibition des zweiten Pulses war bei 20 ms Interpulsintervall (IPI) signifikant unterschiedlich zu den Ausgangswerten. Es sind nur die Ausgangswerte der sieben Tiere dargestellt, die nach acht Wochen gemessen wurden.
• Abb.30: Zeitlicher Verlauf der maximalen Inhibition bei 20 ms Interpulsintervall in der 5 Minuten-SSSE-Gruppe. Gezeigt sind die Mittelwerte ± SD von sechs Tieren, von denen zu allen drei Zeitpunkten nach SSSE Messwerte existieren. Die Paired pulse-Inhibition war eine Woche nach SSSE maximal beeinträchtigt, näherte sich vier Wochen nach SSSE den Ausgangswerten an und blieb danach konstant.
• Abb.31: Paired pulse-Inhibition in der Stimulationskontrollgruppe vor (dunkle Balken) und eine Woche nach Stimulation (helle Balken), gezeigt sind die Mittelwerte mit SD. Die Inhibition des zweiten Pulses war bei keinem der Interpulsintervalle (IPI) signifikant unterschiedlich zu den Ausgangswerten.
• Abb.32: Paired pulse-Inhibition in der Stimulationskontrollgruppe vor (dunkle Balken) und vier Wochen nach Stimulation (helle Balken), gezeigt sind die Mittelwerte mit SD. Die Inhibition des zweiten Pulses war bei 1000 ms Interpulsintervall (IPI) im Vergleich zu den Ausgangswerten signifikant vergrößert. Es sind nur die Ausgangswerte der sieben Tiere dargestellt, die nach vier Wochen gemessen wurden.
• Abb.33: Paired pulse-Inhibition in der Stimulationskontrollgruppe vor (dunkle Balken) und acht Wochen nach Stimulation (helle Balken), gezeigt sind die Mittelwerte mit SD. Bei einem IPI von 500 ms trat acht Wochen nach der Stimulation statt einer Inhibition eine leichte Fazilitierung der zweiten Reizantwort auf, der Unterschied war signifikant. Es sind nur die Ausgangswerte der sechs Tiere dargestellt, die nach acht Wochen gemessen wurden.
• Abb.34: Zeitlicher Verlauf der maximalen Inhibition bei 20 ms Interpulsintervall in der Stimulationskontrollgruppe. Gezeigt sind die Mittelwerte ± SD von sechs Tieren, von denen zu allen drei Zeitpunkten nach Stimulation Messwerte existieren. Die Paired pulse-Inhibition war zu keinem der drei Zeitpunkte nach Stimulation in Barbiturat-Narkose nennenswert beeinträchtigt.
• Abb.35: Paired pulse-Inhibition in der Elektrodenkontrollgruppe vor (dunkle Balken) und eine Woche nach Pentobarbitalinjektion (helle Balken), gezeigt sind die Mittelwerte mit SD. Die Inhibition des zweiten Pulses war bei keinem der Interpulsintervalle (IPI) signifikant unterschiedlich zu den Ausgangswerten.
• Abb.36: Paired pulse-Inhibition in der Elektrodenkontrollgruppe vor (dunkle Balken) und vier Wochen nach Barbituratinjektion (helle Balken), gezeigt sind die Mittelwerte mit SD. Die Inhibition zeigte bei keinem der Interpulsintervalle (IPI) signifikante Unterschiede zu den Ausgangswerten. Es sind nur die Ausgangswerte der acht Tiere dargestellt, die nach vier Wochen gemessen wurden. Ein fehlender Balken bedeutet eine komplette Inhibition der zweiten Reizantwort in allen gemessenen Tieren.
• Abb.37: Paired pulse-Inhibition in der Elektrodenkontrollgruppe vor (dunkle Balken) und acht Wochen nach Barbituratinjektion (helle Balken), gezeigt sind die Mittelwerte mit SD. Die Inhibition des zweiten Pulses unterschied sich bei keinem der verwendeten Interpulsintervalle (IPI) in signifikantem Maße von den Ausgangswerten. Es sind nur die Ausgangswerte der sechs Tiere dargestellt, die nach acht Wochen gemessen wurden. Ein fehlender Balken bedeutet eine komplette Inhibition der zweiten Reizantwort in allen gemessenen Tieren.
• Abb.38: Zeitlicher Verlauf der maximalen Inhibition bei 20 ms Interpulsintervall in der Elektrodenkontrollgruppe. Gezeigt sind die Mittelwerte ± SD von sechs Tieren, von denen zu allen drei Zeitpunkten nach SSSE Messwerte existieren. Vier Wochen nach SSSE zeigten alle Tiere eine komplette Inhibition der zweiten Reizantwort. Die maximale Paired pulse-Inhibition zeigte über den beobachteten Zeitraum nur geringfügige Veränderungen.
• Abb.39: Zeitlicher Verlauf der maximalen Inhibition bei IPI 20 ms in allen vier Gruppen.
• Abb.40: Ausmaß des Inhibitionsverlustes (∆ Ratio) bei IPI 25 ms (linke Ordinate) und des prozentualen Anteils epileptischer Tiere (rechte Ordinate) zu den drei untersuchten Zeitpunkten (Abszisse) in der 3 Stunden-SSSE-Gruppe.