de Andrade , Manuel Vieira Dias Pinto : ”Identifizierung von Candida-Spezies und -Stämmen durch den Nachweis von polymorphen DNA-Regionen in der PCR”

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Kapitel 1. EINLEITUNG

Das Krankheitspanorama ist einem ständigem Wechsel unterworfen. Dies wird oft zu wenig beachtet, obwohl es sehr wichtig ist. Man denke nur an die großen Seuchenzüge früherer Zeiten, an die wechselnden Prävalenzen der Syphilis und anderer sexuell übertragbarer Krankheiten, an die Zunahme der Allergien, das weltweite Verschwinden der Pocken, das "Auf und Ab" der Krätzeerkrankungen oder das fast völlige Aussterben der Malaria und der Lepra in Mitteleuropa - oder gar an die epidemiologische Situation im Falle vom AIDS ( Göttlicher 1997 ).

Pilzinfektionen haben in den letzten zwei Jahrzehnten erheblich zugenommen. Bei Patienten ohne schwere Grunderkrankungen oder Immunschwäche treten, insbesondere in warmen Ländern, Hautinfektionen auf. Candida-Infektionen von Oropharynx oder Ösophagus kommen bei HIV-positiven Patienten häufig als erste Manifestation von AIDS vor. Moderne, hochpotente Antimykotika konnten die Inzidenz der Mykosen nicht entscheidend verringern, im Gegensatz zu den zumindest in Mitteleuropa durch den Einsatz von Antibiotika sowie durch die notwendigen antiepidemischen Maßnahmen weitgehend ausgerotteten bakteriellen Infektionskrankheiten wie Lepra, Pest u.a.. Das liegt offensichtlich nicht daran, daß sich Resistenzen gegen Antimykotika entwickelt hätten, wie sie bei Bakterien leider beobachtet wurden. Vielmehr ist anzunehmen, daß verschiedene Faktoren, die zum Anstieg von Pilzinfektionen führen, in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen haben. So z.B. scheint sich die Prävalenz der Vulvovaginalmykose trotz des effizienten Einsatzes der Antimykotika bei ca. 10 Prozent zu stabilisieren (Göttlicher 1997).

Während die Bäcker- und Bierhefe Saccharomyces cerevisiae, als das eukaryontische Äquivalent des Bakteriums Escherichia coli, eine hervorragende Stellung im Hinblick auf die Kenntnisse zur Biologie, zur Genetik und zur potentiell möglichen biotechnologischen Nutzung bei Pilzen einnimmt, besteht kaum ein Zweifel darüber, welcher Organismus diese Stelle unter den medizinisch relevanten Pilzen besetzt. Die Hefe Candida albicans ist eindeutig der wichtigste Erreger von Humanmykosen, wobei die Krankheitsbilder von unkomplizierten Hautinfektionen, wie z.B. der Windeldermatitis, bis hin zu fatalen, systemischen Infektionen bei immungeschwächten Patienten reichen ( Merlino et al. 1998 , Shepherd et al. 1985 ).

C. albicans ist vor allem als Haupterreger der Vaginitis bekannt, die bei großen Teilen


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der weiblichen Population irgendwann im Laufe des Lebens einmal auftritt. Die Tatsache, daß die Sterblichkeitsrate von Infektionen, die durch diese Hefe bei Tumorpatienten und insbesondere bei neutropenischen Patienten verursacht werden, unakzeptierbar hoch bleibt, ist ein großes Problem bei der medizinischen Versorgung dieser Patienten. Neuerdings ist C. albicans als ernstzunehmender Erreger von Infektionen der Schleimhäute von HIV-Infizierten und AIDS-Patienten bekannt geworden.

Mehr als über jeden anderen humanpathogenen Pilz ist in der medizinischen Literatur über C. albicans geschrieben worden, über seine Biologie, seine Pathogenität, seine Virulenzfaktoren sowie über seine Wechselwirkungen mit den Abwehrmechanismen des Wirts. Studien, die die Wirt-Parasit-Beziehungen untersuchen, haben einerseits zu einem besseren Verständnis der Pathophysiologie dieser Mykosen und anderseits der Abwehrmechanismen des Wirts geführt.

Gegenwärtig wird eine steigende Inzidenz von Mykosen, die von anderen Candida-Spezies wie z.B. C. tropicalis, C. lusitaniae und C. krusei verursacht sind, beobachtet ( Hazen 1995 ). Diese Hefen sind ebenfalls wichtige Erreger von ”opportunistischen“ Mykosen bei immunsupprimierten Patienten.

Bedingt durch die allgemeine Zunahme von Pilzinfektionen wächst einerseits das Interesse an der Entwicklung von leistungsfähigen, nichttoxischen Antimykotika. Andererseits besteht nach wie vor ein großer Bedarf an der Entwicklung von diagnostischen Techniken, die Candida, auch bei invasiven Erkrankungen, einfach, genau, schnell und reproduzierbar nachweisen können.


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1.1. Biologie der Candida-Spezies

Neben C. albicans, als dem wichtigsten humanpathogenen Vertreter der Gattung Candida, sind auch andere Spezies dieser Gattung als Erreger von Infektionen bei Mensch und Tier beschrieben. Die Tabelle 1 zeigt eine Liste der medizinisch relevanten Candida-Spezies.

Tabelle 1: Medizinisch relevanten Candida-Arten (nach M. G. Rinaldi, modifiziert)

Candida albicans (Robin) Berkhout 1923

Candida albicans var. stellatoidea (Jones et Martin 1938) Langeron et Guerra

Candida catenulata Diddens et Lodder

Candida ciferrii Kreger-van Rij

Candida (Torulopsis) glabrata (Anderson) Meyer et Yarrow 1978

Candida guilliermondii (Castellani) Langeron et Guerra 1938

Candida haemuloni (van Uden et Kolipinski) Meyer et Yarrow 1978

Candida kefyr (Beijerinck) van Uden et Buckley 1970

Candida krusei (Castellani) Berkhout 1923

Candida lipolytica (Harrison) Diddens et Lodder

Candida lusitaniae van Uden et do Carmo-Sousa 1959

Candida norvegensis (Dietrichson) van Uden et Farinha ex van Uden et Buckley

Candida parapsilosis (Ashford) Langeron et Talice 1932

Candida pulcherrima (Lindner) Windisch

Candida rugosa (Anderson) Diddens et Lodder

Candida tropicalis (Castellani) Berkhout 1923

Candida utilis (Heneberg) Lodder et Kreger-van Rij

Candida viswanathii Sandhu et Randhawa 1962

Candida zeylanoides (Castellani) Langeron et Guerra

Die Spezies der Gattung Candida, für die keine sexuellen Vermehrungsformen bekannt sind, werden zu den Fungi imperfecti geordnet. Für einige Candida-Spezies sind die entsprechenden teleomorphen (sexuelle/perfekte) Partner bekannt ( Tabelle 2 ). Sie gehören zu den Ascomyzeten.


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Tabelle 2. Anamorph-teleomorphe Verwandtschaften für medizinisch relevante Candida-Spezies (nach M. G. Rinaldi)

Anamorph

Teleomorph

Candida ciferrii

Candida guilliermondii

Candida kefyr

Candida lipolytica

Candida krusei

Candida lusitaniae

Candida norvegensis

Candida pulcherrima

Candida famata

Candida utilis

Stephanoascus ciferrii

Yamadazyma guilliermondii

Kluyveromyces marxianus var. Marxianus

Yarrowia lipolytica

Issatchenkya orientalis

Clavispora lusitaniae

Pichia norvegensis

Metschnikowia pulcherrima

Debaryomyces hansenii

Pichia jadinii

Nicht alle Mykologen werden mit dieser Nomenklatur einverstanden sein. Einige Autoren z.B. bevorzugen Pichia guilliermondii anstelle von Yamadazyma guilliermondii sowie Hansenula jadinii statt Pichia jadinii.

Durch Candida-Spezies hervorgerufene Krankheiten haben unterschiedliche Bezeichnungen erhalten. Eine angemessene Terminologie ist Candidose oder Candida-Mykose. Der letzte Begriff gilt allgemein für durch Candida spp. verursachte Infektionen, während für den Befall eines bestimmten Organs der Begriff ”Candidose“ in Verbindung mit der Bezeichnung des Organes (z.B. Oralcandidose) oder der allgemeine Begriff ”itis“ zusammen mit dem befallenen Organ (z.B. Candida-Vaginitis) verwendet wird. Der früher verwendete Begriff ”Moniliasis“ sollte nicht mehr für durch Candida-Organismen verursachte Infektionen verwendet werden, da es eine eigene Pilzgattung Monilia gibt , welche nichts mit Candida spp. oder mit Candidose zu tun hat.

Bei Candida-Spezies findet man sowohl Hefezellen mit typischen Sproßungen (Blastokonidien oder Blastosporen genannt) als auch fadenförmige Strukturen. Bei den letzteren handelt es sich um elongierte Sproßzellen (Blastokonidien), die aneinander gereiht


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bleiben und dadurch echten Hyphen ähneln. Ein Geflecht von Pseudohyphen bezeichnet man als Pseudomyzel. Im klinischen Material findet man bei den meisten Candida-Spezies sowohl Hefeformen als auch Pseudohyphen. Manche Candida Arten sind auch in der Lage echtes Myzel zu bilden wie z. B. C. albicans . Es wird angenommen, daß die Anwesenheit von fadenförmige Strukturen in den Geweben für eine Invasion des Pilzes spricht, während die Beobachtung von nur bzw. vorwiegend Sproßzellen auf eine reine Kolonisation hindeutet. Wie immer bei allen biologischen Phänomenen, ist dieses Kriterium nicht völlig zuverlässig und sollte nicht als unantastbare Regel angesehen werden.

C. albicans, C. stellatoidea und C. dubliniensis sind als einzige Spezies in der Lage, bei Inkubation in humanem oder tierischem Serum sehr schnell (1 bis 2 Stunden bei 37 ºC) Keimschläuche zu bilden, was vermutlich mit ihrer Fähigkeit zur Gewebeinvasion korreliert. Mutanten, die diese Eigenschaft verloren haben, können im Mausmodell im Gegensatz zu Wildstämmen keine experimentelle Vaginitis erzeugen ( Sobel et al. 1984 ). Bei anderen Spezies werden die Keimschläuche erst nach längerer Bebrütung (mehr als 2 Stunden) beobachtet. Die Fähigkeit, im Serum Keimschläuche bilden zu können, beweist einmal mehr den bei C. albicans beobachteten Dimorphismus, d.h. die Möglichkeit der Umwandlung von der Hefe- zur Myzelphase.

Eine typische Eigenschaft von Candida albicans ist die Fähigkeit, in-vitro sogenannte Chlamydosporen zu bilden. Diese werden meistens größer als die Sproßzellen und besitzen eine widerstandsfähige Zellwand. Man nimmt an, daß Chlamydosporen ruhende Wachstumsformen sind, da sie bei Nährstoffmangel gebildet werden. Die Eigenschaft von C. albicans, bei Anzucht in einem halbanaeroben Milieu auf geeigneten Nährböden, z.B. Reisagar unter Deckglas, Chlamydosporen zu produzieren, wird von klinischen Laboratorien als zusätzlicher Test für die Identifizierung dieser Spezies verwendet. Nur Candida albicans var. stellatoidea und auch die neu beschriebene Spezies C. dubliniensis, die phänotypisch C. albicans stark ähnelt, bilden unter diesen Bedingungen ebenfalls Chlamydosporen aus ( Sullivan et al. 1995 , Timmins et al. 1988 ). Andere medizinisch relevante Candida-Arten sind dazu nur sehr selten in der Lage. Bei C. tropicalis wurden unter den entsprechenden Bedingungen manchmal ovale Chlamydosporen beobachtet, die sich von den abgerundeten bei C. albicans unterschieden.

C. albicans-Isolate sind diploid und heterozygot. Obwohl C. albicans die Fähigkeit zur sexuellen Vermehrung verloren hat, zeichnet sich diese Spezies durch eine hohe gene-


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tische Variabilität und phänotypische Instabilität aus, was auf mitotische Rekombinationen, chromosomale Rearrangements oder auch auf Mutationen zurückgeführt wird ( Scherer & Magee 1990 ).

1.2. Epidemiologie der Candida-Infektionen

Candida-Spezies sind auf menschliche und tierische Reservoire begrenzt, obwohl sie gelegentlich auch aus der Umwelt, z.B. aus dem Boden und aus Lebensmitteln, isoliert werden.

Die Ausbreitung der Pilze auf Menschen, Tiere, Lebensmittel, Boden und die gesamte Umwelt geht wahrscheinlich von humanen und tierischen Quellen aus. Candida-Organismen sind Bestandteil der Normalflora im Magen-Darm-Trakt, welcher beim Menschen vermutlich das hauptsächliche Habitat von Candida spp. darstellt. Die Prävalenz der Hefen scheint bei gesunden Menschen geringer als bei aus verschiedenen Gründen stationär aufgenommenen Patienten zu sein. Die Isolierungsrate von Hefen aus dem Mund gesunder Menschen variiert z.B. in 9 verschiedenen Studien zwischen 2 bis 37% (Mittelwert 6%) im Vergleich zu 13 bzw. 76% (Mittelwert 47%) bei stationären Patienten ( Odds, 1987 ). Der weibliche Genitaltrakt und auch Katheterurin sind häufig mit Candida-Spezies kolonisiert. Die gesunde Haut wird dagegen nur sehr selten besiedelt, kleine Verletzungen oder Läsionen der Haut können dieses Prozeß allerdings fördern.

Von den ca. 150 bis 200 bekannten Candida-Spezies ( Odds, 1987 ) wurden bisher 17 als Erreger von Mykosen beim Menschen beschrieben. Sowohl bei mukokutanen als auch bei tief lokalisierten Infektionen wird Candida albicans am häufigsten isoliert. In Abhängigkeit vom Patientengut findet man in verschiedenen Kliniken zunehmend häufiger auch andere Spezies von Candida, insbesondere als Erreger von Organmykosen. Je stärker das zelluläre Immunsystem des Patienten (insbesondere T-Lymphozyten) beeinträchtigt ist, desto häufiger treten solche Candida-Arten, wie C. tropicalis, C. parapsilosis, C. lusitaniae, C. krusei und C. glabrata, auf. Dabei ist die Letalität bei Infektionen durch diese Spezies (z.B. C. lusitaniae) manchmal höher als die bei C. albicans-Infektionen.

Non-C. albicans-Arten sind oft weniger empfindlich gegenüber Antimykotika ( Tietz and Czaika 1999 ,


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Rex et al. 1995 ). Es kann daher während der antimykotischen Therapie zur Selektion derartiger Spezies kommen, die dann therapeutische Probleme bereiten. Eine Spezies-Differenzierung ist deshalb nicht nur aus epidemiologischer Sicht sondern auch für die Auswahl einer geeigneten Therapie von Bedeutung. ( Gräser et al. 1997 , Kunzelmann et al. 1996 )

Obwohl C. albicans die am häufigsten isolierte Spezies in praktisch allen epidemiologischen Studien ist ( Pfaller 1995 , 1989 ), ist erst wenig über den Grad der Stammvariation und über die Beziehungen zur Fähigkeit, eine spezifische Körperregion zu besiedeln, bekannt. Vermutet werden intraspezies Unterschiede in:

Candida-Infektionen werden meist endogen erworben. Für die Ausprägung des Krankheitsbildes sind in erster Linie Wirtsfaktoren verantwortlich, aber vermutlich ist auch die vorhandene Keimzahl von Bedeutung ( Boerlin et al. 1995a , Van Belkum et al. 1994 , Clemons et al. 1991 , Reagan et al. 1990 , Whelan et al. 199 0, Scherer & Stevens 1987 ). Bei der epidemiologischen Charakterisierung von klinischen Isolaten fanden diese Autoren keine Zusammenhänge zwischen Candida-Stämmen, die bei verschiedenen Patienten isoliert wurden. Diese Ergebnisse sprechen für eine endogene Ursache der Infektion, obwohl sich in der letzten Zeit Berichte über nosokomiale (exogene) Übertragungen, insbesondere auf Intensivstationen, mehren ( D’Antonio et al. 1998 , Robert et al. 1995 , Schmid et al. 1995 , Voss et al. 1995 ). Die wichtigste Rolle spielen dabei kontaminierte Hände von Ärzten und Pflegepersonal. Bauer et al. (1990 ) haben die relative Bedeutung verschiedener Übertragungsmechanismen für Mikroorganismen in Intensivstationen untersucht. Dabei waren Luftproben immer negativ für Candida-Organismen. 9% der Kulturen, die von 53 Patienten erhalten wurden, waren positiv für C. albicans. Außerdem wurden kulturelle Untersuchungen, gezielt für Candida-Spezies, von den Händen von 39 Mitarbeitern durchgeführt. Bei den Ärzten wurden dabei fast doppelt so


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häufig Candida isoliert wie beim Pflegepersonal (2,7% gegen 1,4%). Die Vermutung, daß Ärzte ein wichtiges Reservoir für Erreger nosokomialer Infektionen in Intensivstationen darstellen, wird durch diese Daten unterstützt. Es ist bekannt, daß Ärzte ihre Hände nach Kontakt mit Patienten seltener desinfizieren und daß sie während ihrer Arbeit einen direkteren Kontakt zu den Patienten haben als Pflegepersonal.

Unsere Arbeitsgruppe fand bei einer epidemiologischen Studie von C. albicans-Stämmen, die von Patienten verschiedener Intensivstationen der Charité sowie von gesunden stomatologischen Patienten (Kontrollgruppe) stammten, eine höhere genetische Ähnlichkeit der Isolate von den Intensivpatienten ( Schönian et al. 1993a ). Die meisten Isolate hatten jedoch individuelle Phänotypen, was wieder für eine endogene Ursache der Infektion oder der Kolonisation durch C. albicans bei diesen Patienten sprach. Es wurden jedoch auch drei Gruppen zu je zwei Patienten der gleichen Station mit identischen C. albicans-Stämmen gefunden. Bei einigen der stomatologischen Patienten, die Zahnimplantate erhalten hatten, konnte ein interessanter Befund erhoben werden. Obwohl normalerweise die C. albicans-Stämme innerhalb dieser Gruppe immer sehr heterogen waren, wurden bei mehreren Patienten, die dieselbe Sprechstunde meist in der gleichen Reihenfolge besuchten, auch identische Stämme gefunden. Als Ursache dieser Übertragung in der Zahnarztpraxis wurde die mangelhafte Desinfektion einer stomatologischen Fräse, die bei allen Patienten verwendet wurde, vermutet ( Schönian et al. 1996 ). Auch diese Ergebnisse lassen die Schlußfolgerung zu, daß iatrogene Faktoren eine Rolle bei Übertragung von Candida spielen können.

Verschiedene epidemiologische Studien lieferten Hinweise dafür, daß es einerseits viele verschiedene Stämme von C. albicans gibt, daß aber die einzelnen Individuen häufig nur mit einem Stamm besiedelt sind, welcher über die Zeit persistiert. Invasive Erkrankungen werden in der Regel durch den besiedelnden Stamm verursacht. Besiedlungs- und Invasivstämme vom gleichen Patient können bei identischem Genotyp morphologisch unterschiedliche Kolonien aufweisen. Die letzten Daten stimmen mit dem Konzept des ”phenotypic switching“ überein, welches eine Rolle beim Übergang von Besiedlung zur Invasion spielen kann.

Das ”phenotypic switching“ zeigt sich als Änderungen der Koloniemorphologie (rauh, strahlenförmig, knöpfchenförmig, u.a.), in der Bildung des Myzels, der Zellform und im Stoffwechsel, unter bestimmten Bedingungen, wie z.B. unter Antimykotika-Druck bei der Resistenztestung oder nach einer Inkubation bei 25º C ( Soll 1996 , Soll 1992 , Slutsky 1985 ).


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Bisher konnte noch keine Korrelation zwischen einem speziellen genetischen Typ oder einer Gruppe von Genotypen und der Virulenz von C. albicans-Stämmen gefunden werden ( Lunel et al. 1998 , McCullough et al. 1996 , Meusel 1996 , Schönian et al. 1993a - b ).

Weitere Studien sind notwendig, um grundlegende Fragen zu der Epidemiologie von Pilzkrankheiten zu klären. Es wäre wünschenswert, daß bestimmte phänotypische oder genetische Marker gefunden werden, die mit dem Fortschreiten der Krankheit korrelieren und Ansatzpunkte für die Diagnostik und Therapie liefern, um dem Kliniker bei der Behandlung der schwersten Formen der Candidose helfen zu können.

1.3. Verfahren zur Identifizierung von Candida-Spezies in der Routinediagnostik

Die Strategien zur Identifizierung von Candida spp. sind in verschiedenen Laboratorien unterschiedlich. Für die Diagnostik der Candida-Infektionen stehen eine Reihe etablierter Methoden, von einfachen bis hin zu zeit- und kostenintensiven Verfahren, zur Verfügung, von denen nicht alle routinemäßig angewendet werden. Insbesondere für die neusten Methoden wie z. B. PCR-Techniken steht noch eine allgemeine Standardisierung aus. Die Identifizierung von Candida spp. ist notwendig, da die klinischen Manifestationen sowohl bei Schleimhautinfektion als auch bei invasiver Candidose nicht spezifisch für Candida spp. sind und auch von anderen Erregern verursacht sein können.

Die Bestimmung der betreffenden Candida-Spezies hat therapeutische und prognostische Bedeutung. Die dazu benutzten Labormethoden wurden in den letzen zwei Jahrzehnten weiterentwickelt, um einen schnelleren Nachweis von invasiven Candidosen und die rasche Einleitung einer effektiven antimykotischen Therapie zu gewährleisten. Zu diesen Methoden gehören Mikroskopie, Kultur, Biochemotypie, Serologie, Spaltung der genomischen DNA mit Restriktionsenzymen und Amplifizierung von Candida-Genom-Sequenzen mittels PCR.


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1.3.1. Mikroskopie

Die traditionellen älteren Methoden wie die Direktmikroskopie von ungefärbten Präparaten aus flüssigen Materialien (z.B. Urine) bzw. von Gram- oder Methylenblau-gefärbten Präparaten nach Vorbehandlung mit Kaliumhydroxid, bei der alle anderen Zellen zerstört werden, haben bisher ihre Wertigkeit noch nicht verloren. Diese einfachen, schnellen und kostengünstigen Verfahren für den Nachweis von Candida-Hefen versagen allerdings bei niedrigen Keimzahlen und sind nicht in der Lage, zwischen verschiedenen Candida-Arten zu differenzieren.

Für eine Identifizierung von Candida albicans-Isolaten wird häufig der Keimschlauchtest angewendet. Keimschläuche entstehen bei kurzzeitiger Inkubation von C. albicans in humanem oder tierischem Serum durch kontinuierliche (ohne Einkerbungen) parallele Verlängerung der Zellwand und stellen eine Übergangsphase zwischen der Hefe- und der Myzelform dar. Dieser Test kann sehr schnell durchgeführt werden; Probleme bereiten jedoch falschpositive Resultate bedingt durch die Fehlinterpretation von langgezogenen Blastokonidien oder auch bedingt durch verlängerte Inkubationszeiten. Falschnegative Ergebnisse können durch ein zu großes Inokulum zustande kommen. Das macht diesen Test, zusammen mit dem Zeitfaktor, der bei genauen mikroskopischen Untersuchungen von Bedeutung ist, in Laboratorien anfällig für Fehler. Es wurde außerdem berichtet, daß bis zu 5% der C. albicans-Isolate im Keimschlauchtest negativ sind ( Quindos et al. 1997 , Salkin et al. 1987 ).

In der Tabelle 3 sind einige Methoden für die Direktuntersuchung von Proben zum Nachweis von Candida spp. dargestellt.


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Tabelle 3: Methoden für die Direktuntersuchung von Proben zum Nachweis von Candida spp. im mikrobiologischen Routinelabor

Methode

Anwendung

Bemerkungen

Direkter Abstrichstupfer

Für praktisch alle Schleimhaut-, Flüssig- und Gewebeproben

Pilzelemente erscheinen hyalin unter dem Lichtmikroskop und können bei Phasenkontrast- oder Dunkelfeldbelichtung besser beobachtet werden.

Gramfärbung

Besonders geeignet für Schleimhautproben

Pilzelemente werden grampositiv gefärbt, wodurch sie sich kontrastreich vom umliegenden Material abheben, was eine einfache Identifizierung erlaubt.

Calcofluor white

Geeignet für praktisch alle Schleimhaut-, Flüssig- und Gewebeproben

Sehr sensitiv zur Identifizierung von Pilzelementen in geringen Keimzahlen; fluoreszierende Organismen sind im Kontrast zum dunklen Hintergrund leicht zu erkennen; Hintergrundtrümmer stellen einen Störfaktor dar, können aber durch Vorbehandlung mit KOH beseitigt werden. Fluoreszenzmikroskop notwendig.

Methylenblau

Haut-, Nägel- und Schleimhautproben

Gute tiefblaue Färbung der Pilzelemente, färbt aber auch die Hintergrundtrümmer. Vorbehandlung mit KOH ist notwendig.

1.3.2. Kultur

Für die Anzucht von Candida stehen verschiedene feste und flüssige Nährmedien zur Verfügung.

Bewährt haben sich für die primäre Anzucht die klassischen Medien Sabouraud 2-%-Glukose-Agar (mit oder ohne Antibiotika) und Kimmig-Agar. Auf ihnen wachsen alle Hefen der Gattung Candida als elfenbeinfarbene, meist glatte Kolonien ohne Luftmyzel. Bei einer Inkubation bei 25ºC werden jedoch auch Veränderungen in der Koloniemorphologie beobachtet, die als ”phenotypic switching“ bezeichnet werden ( Soll 1996 , 1992 , Slutsky 1985 ).


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Differentialnährmedien, die eine Differenzierung unterschiedlicher Candida-Arten gestatten, werden von verschiedenen Herstellern angeboten.

Bei dem ALBICANS ID-Agar handelt es sich um einen kommerziell erhältlichen Nährboden, welcher ein chromogenes Substrat für das für C. albicans-spezifische Enzym Hexosaminidase enthält. Kolonien von C. albicans und der engverwandten Spezies C. dubliniensis können durch ihre blaue Färbung direkt identifiziert werden aber nur, wenn man diese als einheitliche Spezies ansieht.

Auf CHROM-Agar-Platten können C. albicans/C. dubliniensis, C. krusei und C. tropicalis aufgrund ihrer Pigmentbildung voneinander unterschieden werden. Andere Spezies, wie z.B. C. guilliermondii und C. famata, werden nicht in ihrem Wachstum gehemmt, können aber nicht diskriminiert werden, da ihre Kolonien die gleiche Färbung aufweisen ( Sullivan & Coleman 1998 , Baumgartner et al. 1996 , San-Milán et al. 1996 , Odds & Bernaerts 1994 ). Solche Differentialnährmedien eignen sich besonders für die Primäridentifizierung von Candida-Stämmen und die Erkennung von Mischkulturen.

Wie bereits schon vorher beschrieben ( S. 5 ), gilt die Bildung von Chlamydosporen bei Anzucht auf Reisagar-Platten als spezifischer Nachweis für C. albicans. Andere Candida-Spezies, wie z.B. C. guilliermondii, C. kefyr, C. krusei, C. lipolytica, C. tropicalis, C. parapsilosis bilden auf Reisagar Pseudohyphen, was ebenfalls für ihre Diagnostik genutzt wird. Durch ihre typische Chlamydosporenbildung auf dem Reisagar können bereits die Biotypen 1 und 2 (C. stellatoidea) von C. albicans sowie die C. albicans sehr eng verwandte Spezies C. dubliniensis von anderen Candida-Spezies unterschieden werden.

1.3.3. Biochemische Diagnostik

Candida-Isolate, bei denen keine Chlamydosporen nachweisbar sind, werden einer weiteren Differenzierung mit biochemischen Methoden unterzogen.

Die biochemische Identifizierung von Candida-Spezies beruht auf unterschiedlicher Assimilation bzw. Fermentation von Kohlenhydratsubstraten. Die Assimilation ist die Fähigkeit eines Organismus (nachgewiesen durch Wachstum) bestimmte Komponenten als einzige Energiequelle für sein Wachstum in Anwesenheit von Sauerstoff zu nutzen. Fermentation ist die Fähigkeit eines Organismus definierte Komponenten in Abwesen-


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heit von Sauerstoff mit dem Ziel der Energiegewinnung zu verwerten (durch Gasbildung und pH-Veränderung nachgewiesen). Die Kohlenhydratassimilationsteste API-20C und -32C sind die am häufigsten eingesetzten Identifizierungssyteme für Hefen. Es gibt zwar andere schnell durchführbaren Systeme von verschiedenen Herstellern, die für den Nachweis der häufig isolierten Hefen auch geeignet sind, bei denen aber Probleme mit seltener vorkommenden Hefen auftreten.

1.3.4. Serologische Methoden

Mit Hilfe des indirekten Hämagglutinations-Testes, der Immunfluoreszenz, des Enzymimmunoassays oder des Radioimmunoassays lassen sich Antikörper gegen C. albicans nachweisen. Die Bewertung der Ergebnisse ist allerdings schwierig, da auch Gesunde grenzwertige Antikörpertiter gegen Candida bilden können. Somit ist es nicht immer möglich, Besiedlung und Infektion voneinander zu unterscheiden. Bei immunkompetenten Patienten ist ein Titeranstieg am ehesten diagnostisch verwertbar. Aber gerade bei den immunsupprimierten Patienten, die besonders von einer invasiven Candidose bedroht sind, läßt sich in der Regel keine adäquate Immunantwort erwarten. In solchen Fällen, können serologische Tests für die Antigen-Bestimmung nützlicher sein.

Die neuesten Fortschritte in der Antigenreinigung, in der Produktion monoklonaler Antikörper, beim Epitop-Mapping, wie auch in DNA-Rekombinationstechniken und in der PCR-Methodologie haben neue Möglichkeiten für die Diagnostik invasiver Pilzinfektionen eröffnet. Potentielle Marker für eine invasive Candidose sind z.B. Zellwandantigene, wie die Mannane, Candida-Metabolite, insbesondere d-Arabinitol und zytoplasmatische Candida-Antigene wie beispielsweise eine immundominante Candida-Enolase.

Große Hoffnungen haben Tests geweckt, mit deren Hilfe Pilz-Antigene oder Metabolite in Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden können. Aufgrund der niedrigen Konzentration zirkulierender Antigene bei vielen Infizierten, sind hoch sensitive Tests erforderlich.

Die Zellwände von Candida albicans, der am besten untersuchten Spezies, enthalten die Polysaccharide Mannane und Glukan, Mannoproteine, Chitin und Proteine. Glukan, der wichtigste Bestandteil und die Mannoproteine stellen mindestens 80% und Chitin ca. 0,6% der Zellwand dar. Weder Glukan noch Chitin wirken als Antigen. Die Zellwandproteine sind wichtig für die Adhärenz an verschiedenen Oberflächen und sind


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differenzierter bei C. albicans als bei anderen Hefespezies und bei Pseudohyphen als bei Blastosporen ( Kwon-Chung & Bennett 1992 ).

Candida-Mannan, ein für die Adhäsion wichtiges Polysaccharid der Zellwand, ist ein potentielles Immunogen. Praktisch alle Humanseren enthalten IgG-Antikörper gegen dieses Antigen, bereits seit dem passiven Transfer von mütterlichen Antikörpern. Daher sind serologische Tests für den Nachweis von Anti-Mannan-Antikörper, wie allgemein die meisten serologischen Testverfahren in der Mykologie, in ihrer Sensitivität und Spezifität sehr eingeschränkt ( Sander 1997 ). Außerdem muß bei der Bestimmung von Anti-Candida-Antikörpern in Abhängigkeit vom Alter ein normaler Durchseuchungstiter berücksichtigt werden und die relative Insensitivität und die Notwendigkeit an seriellen Bestimmungen haben die diagnostische Nützlichkeit dieses Tests erheblich limitiert ( Greenfield et al. 1983 ). Der alleinige Einsatz der Serologie zur Diagnostik einer Candidose ist sicherlich nicht möglich. Bei Immunsupprimierten ist der Antikörpernachweis oft nicht zuverlässig. Hier sollte besonders auf den Nachweis von Candida-Antigen geachtet werden. Bei Patienten mit disseminierter Candidose wurden zirkulierende Mannan-Antigene in der Regel als Präfinalereignisse nachgewiesen, d.h. zu spät um von diagnostischem Wert zu sein. Außerdem die ELISA- und Latextests zur Bestimmung des Mannanantigens im Serum mangeln an Sensitivität was genauso wie bei der Antikörperbestimmung auch die diagnostische Nützlichkeit dieses Tests erheblich limitiert.

Verschiedene oberflächliche Proteine von Candida albicans wurden charakterisiert. Unter diesen hebt man

Der Cand-Tec®-Test (Ramco Laboratories, Houston) ist ein kommerziell verfügbarer Latex-Agglutinationstest zum Nachweis von hitzelabilen Glykoproteinen. In der Literatur findet man unterschiedliche Angaben, was die Empfindlichkeit betrifft; sie schwankt zwischen 50% und 70% wenn als Grenzwert die Serumverdünnung von 1:4 herangezogen


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wird. Erhöht man den Grenzwert auf 1:8, sinkt die Empfindlichkeit auf 30% oder 40%, die Spezifität wird dadurch allerdings verbessert. Falsch-positive Resultate werden durch den Rheumafaktor und auch eine Kolonisierung der Schleimhaut verursacht. So geht aus verschiedenen Studien hervor, daß 42% bis 44% der kolonisierten Patienten einen Titer von 1:4 oder mehr und 15% einen Titer von 1:8 hatten ( Sanchez et al. 1992 ). Gesamtbeurteilung: Gerade in letzter Zeit stellen die Ergebnisse verschiedener Studien den verhältnismäßig teuren Test in Frage.

1.3.5. Molekularbiologische Methoden

Für den molekularbiologischen Nachweis der unterschiedlichen Infektionserreger werden vor allem spezifische DNA- oder RNA-Sonden, die an komplementäre Abschnitte in der zu untersuchenden DNA hybridisieren und durch geeignete Markierungen sichtbar gemacht werden können, und die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), bei der ausgewählte Sequenzen in der DNA amplifiziert und detektiert werden, genutzt. Eine für den Direktnachweis der Erreger im biologischen Material ausreichende Empfindlichkeit wird allerdings mit der PCR erreicht. Fluoreszenzmarkierte DNA- oder RNA-Sonden haben meist Bedeutung für den mikroskopischen Nachweis der Erreger in Gewebsproben nach in situ-Hybridisierung ( Lischewski 1995 ).

Die Tabelle 4 zeigt eine Liste von verwendeten molekularbiologischen Methoden für die Identifizierung von Candida-Spezies.


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Tabelle 4: Molekularbiologische Methoden für die Identifizierung von Candida-Spezies.

Anwendung

Technik

Allgemein

PCR

Hybridisierung

Direkt aus Material

PCR

Nachweis der spezifischen Amplifikation

. Sequenzierung

. Hybridisierung

. Restriktionsverdau

. PCR-EIA

Stammtypisierung / Differenzierung ausgehend von Reinkultur

PCR

Sequenzierung

Hybridisierung

RAPD

Restriktionsverdau

Die PCR basiert auf wiederholten Zyklen von Denaturierung der Doppelstrang-DNA, der Anlagerung definierter Startermoleküle (Primer) und der Synthese neuer DNA-Stränge durch das Enzym Taq-Polymerase. Die so erfolgte Amplifikation der zu testenden Sequenz führt zu einer im Vergleich zu anderen Methoden deutlich höheren Sensitivität des Nachweises.

Die bisher beschriebenen PCR-Verfahren für den Nachweis von Candida spp. nutzen unterschiedliche Zielsequenzen, wie beispielsweise Abschnitte der nukleären wie auch der mitochondrialen ribosomalen DNA, multi-copy-Genen, die für das Aktin oder das Hitzeschockprotein 90 kodieren, und das single-copy-Gens für das Enzym Cytochrom P-450-Lanosterol-a-Demethylase ( Morace et al. 1997 , Van Deventer et al. 1995 , Holmes et al. 1994 , Maiwald et al. 1994 , Makimura et al. 1994 , Crampin & Matthews 1993 , Hopfer et al. 1993 , Kann 1993 , Miyakawa et al. 1993 , Niesters et al. 1993 , Olsson et al. 1993 , Burgener-Kairuz et al. 1994 , Miyakawa et al. 1992 , Buchman et al. 1990 ). Nur wenige dieser Nachweissysteme sind jedoch in der Lage, andere Candida-Spezies als C. albicans nachzuweisen. Candida-PCR-Nachweise wurden bisher aus unter-


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schiedlichen klinischen Materialien, wie Blut, Liquor, Pleura, Galle, Bronchiallavage, Trachealsekret, Sputum, Urin, Eiter, Peritonealflüssigkeit, Wundflüssigkeit, und Vaginalabstrich, berichtet. In Tabelle 5 sind bisher publizierte PCR-Nachweisverfahren für Candida einschließlich ihrer Spezifität und der erreichten Sensitivitäten aufgeführt.

Tabelle 5: PCR-Verfahren für den direkten Nachweis von Candida spp. aus Patientenmaterial.

Zielsequenz

Spezifität

Sensitivität

KBE/ ml

Quelle

Cytochrom P-450-Lanosterol-a-Demethylase

Candida spp.

C. neoformans

Trichosporon beigelii

100 - 200*

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 70 ]

Aktin

Candida spp.

100 ?

[ 35 ]

HSP 90

C. albicans

C. krusei

C. glabrata

C. guilliermondii

C. parapsilosis

100

[ 15 ]

mt DNA repeat EO3

C. albicans

100

[ 68 , 69 ]

18 S rDNA

Pilze

150

10

[ 53 , 54 , 74 , 148 ]

[ 32 ]

non-transcribed spacer

C. albicans

20

[ 31 ]

5 S rDNA

alle Hefen

4

[ 146 ]

SAP-Gene

C. albicans

1-4

[ 20 ]

18 S rDNA

Candida spp.

Aspergillus spp.

1

[ 18 ]

mt DNA: mitochondriale DNA; rDNA: ribosomale RNA-Gene; HSP: heat shock protein; SAP: secreted aspartic proteinase.

Dieses Ergebnis wurde mit einer ”nested“ PCR erzielt, bei der das Amplifikat einer ersten PCR dann in einem zweiten Ansatz nochmals amplifiziert wird.


18

Jeder PCR-Nachweis besteht aus drei wesentlichen Arbeitsschritten:

  1. a) der Probenaufbereitung (DNA-Extraktion),
  2. b) der Amplifizierung geeigneter Zielsequenzen und
  3. c) der Charakterisierung (Detektion) des amplifizierten Produkts.

Die Angaben zur Empfindlichkeit in Tabelle 5 beziehen sich immer auf das detektierte Amplikon, d.h. nach Überprüfung der Identität des amplifizierten Produkts bzw. nach erfolgter Speziesidentifizierung bei einer PCR mit universellen Primern. Diese Detektion der Amplifikationsprodukte erfolgte meist durch eine Spaltung mit unterschiedlichen Restriktionsendonukleasen ( Maiwald et al. 1994 , Niesters et al. 1993 , Miyakawa et al. 1992 ), oder durch eine meistens nicht radioaktiv Hybridisierung mit spezifischen internen Oligonukleotidsonden ( Van Deventer et al. 1995 , Makimura et al. 1994 , Burgener-Kairuz et al. 1994 , Hopfer et al. 1993 ). Bei der letzten Methode wird nochmals eine Steigerung der Empfindlichkeit um etwa einen Faktor von 10 bis 100 erreicht. Holmes et al. (1994) nutzten eine Kopplung von zwei PCR-Reaktionen mit unterschiedlicher Spezifität für die Identifizierung von C. albicans.

Der Einsatz der PCR-Technik ist sinnvoll insbesondere für den Nachweis von schwer bzw. nicht anzüchtbaren oder sehr langsam wachsenden Erregern wie auch für den Nachweis von Erregern bei immunsupprimierten Patienten, bei denen konventionelle serologische Verfahren häufig versagen. Die bisher publizierten PCR-Methoden für den Direktnachweis von Candida spp. geben berechtigten Anlaß zu der Hoffnung, daß mit dem Nachweis einer geringen Anzahl von Erregern direkt in klinischen Materialien die Grenzen der bisher zur Verfügung stehenden kulturellen und serologischen Verfahren überwunden werden können. Vor einem Einsatz im mykologischen Routinelabor sind jedoch noch umfangreiche Optimierungen und Evaluierungen dieser Technologie erforderlich.

Die zur Zeit erreichten Sensitivitäten sind meist noch nicht zufriedenstellend. Durch die Auswahl einer geeigneten Zielsequenz, durch Optimierung der PCR-Bedingungen sowie durch verbesserte Techniken zur DNA-Extraktion aus klinischen Proben und zur spezifischen Detektion des amplifizierten Produkts sollten Nachweisgrenzen von unter 100 KBE/ml (möglichst 1-10 KBE/ml) erreicht werden. Umfassende klinische Testungen der PCR-Nachweise, die die Fragen nach der tatsächlichen Sensitivität und Spezifität der PCR im Routineeinsatz, auch im Vergleich mit den bisher etablierten Nachweisverfahren (Antigenserologie), nach der Bedeutung PCR-positiver und Kultur-negativer Ergebnisse, nach dem Einfluß abgestorbener Erreger oder persistierender Erreger-DNA


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nach Chemotherapie usw. beantworten könnten, stehen noch aus. Bisher ist auch noch ungeklärt, ob mittels Quantifizierung der PCR-Ergbisse zwischen einer Kolonisierung und einer invasiven Infektion unterschieden werden kann.

1.4. Verfahren zur Stammtypisierung bei Candida

Um Fragen nach der Infektionsquelle, der Übertragung, der Persistenz bzw. der Reinfektion bei C. albicans-Infektionen beantworten zu können, ist eine sichere und reproduzierbare Identifizierung der klinischen Isolate notwendig. Die ideale epidemiologische Typisierungsmethode ist einfach, schnell, sensitiv und hoch spezifisch ( Pfaller et al. 1990 ). Außerdem wären standardisierte Methoden wünschenswert, um die Reproduzierbarkeit und den Vergleich der Ergebnisse zwischen den verschiedenen Laboratorien zu verbessern. Epidemiologische Studien an Candida-Infektionen sollten sowohl die Genotypen als auch die Phänotypen (Biotypen) von Stämmen aus klinischen Proben berücksichtigen, um die Stammidentität im Sinne der Infektkettenaufklärung nachweisen zu können.

Folgende Methoden wurden für die Charakterisierung und Feindifferenzierung von Candida-Stämmen entwickelt: Serotypie, Biotypie, Resistotypie, Typisierung der ”Killertoxine“, Morphotypie, Bestimmung der Isoenzymmuster, DNA Restriktions Fragment Analyse mit Southernhybridisierung (DNA-Fingerprinting), Karyotypie (Pulsfeldgelelektrophorese), PCR-Techniken und Sequenzierung definierter DNA-Abschnitte.

Serologisch werden C. albicans nur in die 2 Serogruppen A und B unterteilt, die unterschiedlich hinsichtlich der Mannanstruktur sind ( Hasenclever & Mitchell 1961 , Tsuchiya et al. 1961 ) wobei große Unstimmigkeiten in den Ergebnissen bei der Verwendung unterschiedlicher Methoden zur Serotypisierung festgestellt wurden. Diese Methode ist daher als epidemiologisches Werkzeug für die Typisierung von C. albicans-Stämmen ungeeignet ( McCullough et al. 1996 ). Unabhängige Studien haben bestätigt, daß die meisten klinischen Isolate vom Serotyp A sind ( Brawner et al. 1992 , Martin & Lamb 1982 , Auger et al. 1979 ). Stämme des Serotyp B scheinen eine Präferenz für den weibliche Genitaltrakt zu besitzen ( Nobre 1996 , Wade 1993 ) und zeigen eine erhöhte Resistenz gegenüber Flucytosin ( Auger et al. 1979 ). Die beiden für C. albicans beschriebenen Serotypen A und B basieren auf Unterschieden der Oberflächenpolysaccharide ( Hasenclever & Mitchell 1961 , Tsuchiya et al. 1961 ).


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Das Biotypisierungssystem von Odds und Abbott (1980) benutzt eine Reihe von biochemischen Tests, welche die Identifizierung von über 500 potentiellen Biotypen von C. albicans und anderen Candida-Spezies ermöglicht. Die von Williamson 1986 vorgeschlagene modifizierte Biotypisierung verwendete drei Tests, die API-ZYM- und API 20C-Systeme und einen Platten-Test zur Resistenztestung gegen Borsäure. Pfaller (1990) hat eine andere modifizierte Version verwendet, welche eine Reihe von insgesamt neun Testagarplatten benutzt: Wachstum bei pH 1,4, Proteinasebildung, 5-Fluorcytosin-Resistenz, Harnstoff-Assimilation, Sorbose-Assimilation, Salz-Toleranz, Zitrat-Assimilation, Resistenz gegen Natrium-Selenit und Resistenz gegen Borsäure. Diese 9 Reaktionen werden in Gruppen zu je 3 aufgeteilt und somit ergibt sich ein dreistelliger Code, der den Biotyp darstellt. Auf dem gleichen Prinzip basiert auch die Auswertung bei den Api-Systemen. Das Hauptproblem dieses Verfahrens (Biotypisierungssystem von Odds und Abbott) lag darin, daß eine große Anzahl von nicht verwandten Stämmen identische Biotypen hatten. Die Übereinstimmung der Daten zwischen verschiedenen Laboratorien war jedoch nicht zufriedenstellend, so daß die Methode, von einer idealen epidemiologischen Typisierungsmethode weit entfernt, nur für Forschungszwecke und nicht für Routinuntersuchungen empfohlen wird ( Odds et al. 1989 ).

Das Resistogramm von Warnock und Mitarbeitern basiert auf den Unterschieden in den Resistenzen gegenüber 5 ausgewählten Substanzen in 4 verschiedenen Konzentrationen und erlaubt eine Diskriminierung von 32 potentiellen Resistotypen bei C. albicans. Das Resistogramm hat jedoch keine direkte Beziehung zum pathogenetischen Potential der getesteten Stämme ( McCullough et al. 1996 ).

Polonelli und Mitarbeiter (1983) haben Killerfaktoren für die Typisierung von C. albicans-Isolaten benutzt. Killerfaktoren sind extrazelluläre Toxine, die von Hefen produziert werden, um andere Hefen innerhalb der gleichen Gattung bzw. von anderen Gattungen abzutöten, die diese Substanz selbst nicht produzieren. Trotz vielversprechender erster Ergebnisse, hat sich diese Methode für epidemiologische Zwecke nicht durchgesetzt.

Die Morphotypisierung nach Hunter, Mackenzie und Fraser ( Hunter et al. 1989 ) ist eine Differenzierungsmethode, die auf Unterschieden in der Form und Ausdehnung des Marginalrandes der auf Malz nach über 10tägiger Bebrütung gewachsenen Kolonien beruht (s. Abbildung 1 ). Die Autoren vermuteten einen Zusammenhang zwischen der Virulenz und dem Morphotyp der Stämme bei C. albicans


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Abbildung 1: Beispiele für Morphotypen von Candida albicans. Quelle: WWW-Server für C. albicans [ 160 ].


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Die Bestimmung der Isoenzymmuster basiert auf der Annahme, daß sie Veränderungen in den Genen, die diese Enzyme kodieren, widerspiegeln. Probleme entstehen dadurch, daß häufig mehr als ein Gen involviert ist und die molekulare Basis eines veränderten Profils meist unerkannt bleibt. In den meisten Fällen liegt den Isoenzymprofilen eher eine Gruppe verwandter Genotypen als ein unikaler Genotyp zugrunde, so daß diese Methode nur begrenzte Aussagen zur Identität von Stämmen gestattet. Außerdem sind die Isoenzymmuster durch Umweltfaktoren, wie z.B. veränderte Kulturbedingungen, beeinflußbar ( Tibayrenc 1995 ).

Neuere DNA-Typisierungsmethoden für die Untersuchung von Stammvariationen bei Candida-Spezies sind vielversprechender als die bisher diskutierten phänotypischen Verfahren. Scherer & Stevens führten als erste die Analyse von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP) für die Charakterisierung von C. albicans-Stämmen durch. Die genomische DNA der Hefen wurde mit Restriktionsendonukleasen gespalten und die erhaltenen DNA-Fragmente wurden elektrophoretisch aufgetrennt (1987). Innerhalb der Restriktionsmuster wurden 4 starke Banden, identifiziert. 3 davon, die vermutlich die ribosomalen DNA-Regionen repräsentierten, waren in allen Isolaten vorhanden. RFLPs in der rDNA von C. albicans haben sich als nützliches Kriterium für die Differenzierung verschiedener Isolaten erwiesen ( Magee et al. 1987 ). Die RFLP-Analyse benötigt relativ große DNA-Mengen und ist erst nach Hybridisierung mit spezifischen moderat repetitiven Sonden, wie z.B. der Ca3- und der 27A-Sonden ( Sadhu et al. 1991 , Scherer & Stevens 1988 ) oder mit ”simple repeat“-Sonden wie (GGAT)4 oder (GTG)5 ( Sullivan et al. 1993 ) gut auswertbar. Das DNA-Fingerprinting mit der für C. albicans spezifischen Ca3-Sonde, das in zahlreichen epidemiologischen Studien angewendet wurde ( Soll 1996 , Schmid et al. 1995 ), hat sich besonders bewährt für die Typisierung von klinischen C. albicans-Isolaten

Die Bestimmung des elektrophoretischen Karyotyps in der Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) wurde ebenfalls für Vergleiche klinischer Isolate von C. albicans benutzt. Bei dieser Methode werden die Candida-Chromosomen ihrer Größe nach aufgetrennt ( Merz et al. 1988 ). Die Aussagefähigkeit der Karyotypie wird durch die Hybridisierung mit chromosomenspezifischen Sonden entscheidend verbessert, weil homologe Chromosomen unterschiedliche Größen aufweisen können ( Chu et al. 1993 ). Insbesondere für das R-Chromosom wurde eine hohe Variabilität bei der Wanderung im Pulsfeldgel beschrieben, die zu einer im Vergleich zum benachbarten Chromosom 1 veränderten Po-


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sition im Gel führen kann ( Magee et al. 1992 , Wickes et al. 1991 ). Die RFLP-Analyse sowie, in noch stärkerem Ausmaß, die Karyotypie sind sehr zeit- und arbeitsaufwendig.

Reproduzierbare individuelle Muster von Amplifikationsprodukten, die eine Spezies- bzw. Subspeziesdifferenzierung erlauben, können bei verschiedenen Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- und Tierarten durch die Nutzung einzelner Primer in der PCR erhalten werden. Bei der bisher am häufigsten angewendeten Technik, der ”Random Amplified Polymorphic DNA“ (RAPD), werden kurze Zufallsprimer (10 mer) in der PCR zum Nachweis genetischer Unterschiede bei verschiedenen C. albicans-Stämmen benutzt ( Williams et al. 1990 ). Bei der ”Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction“ (AP-PCR) werden längere Zufallsprimer verwendet ( Welsh et al. 1990 ). Andere Bezeichnungen für diese bzw. ähnliche Methoden sind ”DNA Amplification Fingerprinting“ (DAF) oder PCR-Fingerprinting. Diese Verfahren sind sehr schnell durchführbar und ausreichend reproduzierbar. Verglichen mit der elektrophoretischen Karyotypisierung und RFLP-Analysen wurde bei Anwendung der RAPD-Technik für die Typisierung von C. albicans-Isolaten eine vergleichbare Diskriminierung beschrieben ( Bostock et al. 1993 ).

Polymorphe DNA-Abschnitte bei Pilzen wurden sowohl mit der RAPD-Technik ( Bostock et al. 1993 , Niesters et al. 1993 , Lehmann et al. 1992 ) als auch durch den Einsatz von Primern, die an Mini- oder Mikrosatelliten-DNA und andere repetitive Sequenzen anlagern, amplifiziert ( Thanos et al. 1996 , Lieckfeldt et al. 1993 , Meyer et al. 1993 ; Niesters et al. 1993 , Schönian et al. 1993a ). Dieses PCR-Fingerprinting, bei dem Polymorphismen nachgewiesen werden, die zufällig über das gesamte Genom verteilt sind ( Welsh et al. 1992 ), benötigt keine vorherige Sequenzinformation.

Das DNA-Fingerprinting hat auch Hinweise zur Unterstützung des Konzepts, daß nosokomiale Übertragungen stattfinden können geliefert. Allerdings konnte noch kein genetischer Typ oder eine Gruppe genetischer Typen in Zusammenhang zu der Virulenz gebracht werden ( Lunel et al. 1998 , McCullough et al. 1996 , Meusel 1996 , Schönian et al. 1993a - b ) und es gibt noch Unstimmigkeiten welche Methode für eine konkrete Untersuchung am besten geeignet ist. Weitere Untersuchungen mit den verschiedensten Methoden sollen dazu beitragen grundlegende Fragen zu der Epidemiologie von Pilzkrankheiten zu erklären. Es ist wünschenswert, wenn bestimmte Marker, sowohl phänotypisch als auch genetisch, gefunden und entschlüsselt werden könnten, welche routinemäßig mit dem Fortschreiten der Krankheit assoziiert sind und welche dem Kliniker bei der Behandlung der schlimmsten Formen dieser Infektion helfen werden.


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1.5. Aufgabenstellung

Die Vertreter der Gattung Candida werden bisher auf der Basis ihrer Unterschiede in vielen phänotypischen Merkmalen, wie in der Koloniemorphologie, in der Bildung von Keimschläuchen, Hyphen und Chlamydosporen, in der Resistenz gegenüber Antimykotika, in den Wachstumscharakteristika sowie in der Antigen- und Enzymausstattung differenziert.

Molekulare Vergleiche haben gezeigt, daß viele dieser phänotypischen Merkmale zu unzuverläßlich sind, um die Definition und Erkennung der Spezies zu gewährleisten. In letzter Zeit wurden vermehrt Candida-Isolate mit atypischer Morphologie und Biochemotypie beschrieben, bei denen die phänotypischen Methoden für die Speziesidentifizierung falsche Ergebnisse lieferten oder völlig versagten. In diesen Fällen konnte eine exakte Diagnose erst mit Hilfe molekularbiologischer Methoden gestellt werden.

Ein erstes Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, molekularbiologische Methoden für die Identifizierung konventionell schwer differenzierbarer Candida-Isolate einzusetzen.

Beispielsweise ist die Differenzierung zwischen den Spezies C. guilliermondii und C. famata sehr schwierig und gelingt nicht, wenn C. guilliermondii keine Pseudohyphen ausbildet. Im Gegensatz zu C. famata ist C. guilliermondii eine pathopotente und gegenüber vielen Antimykotika hochresistente Candida-Art, die besonders bei Diabetikern und Schwerverletzten häufig schwere Infektionen auslöst ( Tietz and Czaika 1999 ). Für eine Unterscheidung dieser Erreger von der weitgehend identischen, weniger pathogenen Spezies C. famata sollten in dieser Arbeit zwei verschiedene PCR-Verfahren eingesetzt werden. Zum einen sollte die PCR-Fingerprint-Technik, bei der mit Hilfe unspezifischer Primer weitgehend speziesspezifische PCR-Produkte erhalten werden ( Thanos et al. 1996 ) genutzt werden, zum anderen sollte bei den fraglichen Isolaten der “Internal Transcribed Spacer“ (ITS) im ribosomalen Operon amplifiziert und anschließend mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen gespalten werden. Mit beiden Techniken war die Speziesidentifizierung bei unterschiedlichen Patientenisolaten beabsichtigt.

Die PCR-Fingerprint-Technik sollte auch für die Charakterisierung vermutlicher C. albicans-Stämme genutzt werden, bei denen die konventionelle Diagnostik auf Grund atypischer morphologischer und biochemischer Eigenschaften fraglich war.


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Genotypische und phänotypische Analysen haben ein hohes Maß an Variabilität innerhalb der Art Candida albicans gezeigt. Wenig ist jedoch bisher über den Grad der Variabilität innerhalb der Spezies, über eine eventuell unterschiedliche geographische Verteilung bestimmter Isolate und über die Beziehungen zur Fähigkeit der Organismen, eine bestimmte Körperregion zu kolonisieren oder zu infizieren, bekannt.

Eine weitere Zielstellung in der vorliegenden Arbeit war deshalb eine vergleichende phänotypische und genotypische Charakterisierung von C. albicans-Vaginalisolaten aus Europa und Afrika. Dafür sollten einerseits die Biotypen mit dem Api 32C-System und andererseits die Genotypen mit der PCR-Fingerprint-Technik bestimmt werden. Wird die genomische DNA von Candida spp. mit unspezifischen Primern amplifiziert, erhält man neben speziesspezifischen auch eine Reihe von stammspezifischen PCR-Produkten. Auf der Basis der so erhaltenen PCR-Profile sollten die Genotypen der europäischen und afrikanischen Candida albicans-Isolate verglichen und die genetischen Distanzen ermittelt werden.

Epidemiologische Untersuchungen erfordern vor allem eine Klärung des Übertragungsmodus und -weges der Erreger und setzen Methoden voraus, die in der Lage sind Stammunterschiede aufzudecken. In früheren Arbeiten unserer Gruppe konnte bereits gezeigt werden, daß das PCR-Fingerprinting gut für Stammtypisierungen im Rahmen epidemiologischer Untersuchungen bei C. albicans geeignet ist ( Schönian et al. 1993a , Thanos et al. 1996 ). In der vorliegenden Arbeit war beabsichtigt diese Methode für einen Vergleich der Candida-Stämme von aus verschiedenen Körperregionen bei Frauen mit Vaginalcandidose und deren Partnern einzusetzen. Außerdem sollte geklärt werden, ob wiederholte Episoden der Candidose durch den gleichen Stamm oder durch unterschiedliche Stämme hervorgerufen werden.

Im Ergebnis dieser Studie werden Aussagen dazu erwartet, ob molekularbiologische Methoden eine sinnvolle Ergänzung der konventionellen mykologischen Diagnostik bei Problemfällen und bei epidemiologischen Studien darstellen können.


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