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Kapitel 2. MATERIAL UND METHODEN

2.1. Material

2.1.1. Stämme

Tabelle 6: Herkunft der klinischen Stämme

Herkunft	Stämme	Anzahl	Material
Angola	C. albicans	49	Vaginalabstrich
	C. albicans (atypische Stämme)	8	Vaginalabstrich
Madagaskar	C. albicans (atypische Stämme)	14	Vaginalabstrich
Portugal	C. albicans	49	Vaginalabstrich
Berlin	C. albicans	47	Vaginalabstrich
	C. famata / C. guilliermondii	37	Vaginalabstrich / Haut
München	C. albicans	45	Vaginalabstrich
Frankfurt Oder	C. albicans	74	Vaginalabstrich
Prof. Korting	C. albicans (atypische Stämme)	4	Vaginalabstrich
Prof. Hantschke	C. albicans (atypische Stämme)	5	Vaginalabstrich

Die angolanischen Stämme wurden in der Hauptstadt Luanda von ambulanten Patientinnen isoliert, die die Klinik entweder zur Kontrolle vor/oder nach Einführung eines Intrauterinpessars oder wegen des Verdachts auf Vaginitis aufgesucht hatten. Alle auf Saboraud-Agar gewachsenen Hefen wurden ohne weitere Diskriminierung gesammelt, die Speziesidentifizierung wurde dann in Deutschland durchgeführt. Bei den Patientinnen, die zwischen 17 und 45 Jahre alt waren, handelte es sich ausschließlich um afrikanische Frauen, bei denen jedoch Kontakte zu Ein- und Auswanderern nicht ausgeschlossen werden konnten.

Die Stämme aus Madagaskar wurden im Rahmen einer Erhebung über das Vorkommen sexuell übertragbaren Krankheiten bei Prostituierten von Kollegen des Landestropeninstituts gesammelt.

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Vaginalisolate, die in Berlin, in Frankfurt/Oder und München gesammelt wurden, wurden uns freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. med. H.-J. Tietz, Herrn P.D. Dr. med. W. Mendling, Herrn Prof. Dr. med. D. Hantschke und von Herrn Prof. Dr. med. H. C. Korting zur Verfügung gestellt.

Zu den mit konventionellen Methoden schwer identifizierbaren Candida-Isolaten gehörten C. famata / C. guilliermondii-Isolate aus Berlin sowie Candida-Isolate mit atypischen morphologischen und biochemischen Eigenschaften aus Angola und Madagaskar sowie aus verschiedenen Städten Deutschlands, die wir von Prof. Dr. med. Tietz, von Prof. Dr. med. Korting und Prof. Dr. med. Hantschke erhielten.

Aus Frankfurt/Oder erhielten wir Candida-Isolate, die von verschiedenen Lokalisationen bei Frauen mit Vaginalcandidose und deren Partnern isoliert wurden.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Candida-Referenzstämme verwendet ( Tabelle 7 ), erhielten von dem Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande und von der American Type Cultures Collection.

Tabelle 7: Referenzstämme

CBS 562	C. albicans Serotyp A	CBS 1795	C. famata
CBS 5983	C. albicans Serotyp B	ATCC 6260	C. guilliermondii
CBS 1905	C. stellatoidea	NCYC 350	C. glabrata
CBS 159	C. sake	CBS 4413	C. lusitaniae

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2.1.2. Primer

Tabelle 8: Verwendete Primer. Hersteller: TIB MOLBIOL, Berlin

Primer	Sequenz
T3B (McClelland et al. 1992)	5` AGG TCG CGG GTT CGA ATC C 3`
M13core (Huey & Hall 1989)	5` GAG GGT GGC GGT TCT 3`
AP3 (Williams et al. 1990)	5` TCA CGA TGC A 3`
LR1 (White et al. 1990, / Vilgalys et al. 1990)	5` GGT TGG TTT CTT TTC CT 3`
SR6S (White et al. 1990, / Vilgalys et al. 1990)	5` AAG TAA AAG TCG TAA CAA GG 3`

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2.2. Methoden

2.2.1. Probengewinnung

Die klinischen Pilzisolate wurden in verschiedenen Kliniken mit den üblichen Methoden gesammelt:

Vaginalabstriche wurden mit sterilem Abstrichtupfer von der Vaginalwand entnommen und entweder sofort auf die entsprechenden Nährmedien überimpft, wenn die Probengewinnung im Labor stattfand, oder in Transportmedium gegeben, wenn die Proben auf den Stationen entnommen wurden.

Die Hautproben wurden fast alle im Labor entweder mit Skalpell oder mit Abstrichtupfer, gewonnen und direkt überimpft. Bei allen Hautproben wurde das Material für mikroskopische und kulturelle Untersuchungen geteilt.

2.2.2. Identifizierung mit konventionellen Methoden

2.2.2.1. Kulturelle Verfahren

Für die Primärkulturen wurden die Patientenmaterialien direkt auf Sabouraud-Dextrose-Agar überimpft. Die Ablesung der Platten erfolgte nach Bebrütung von bis zu 10 Tagen jeweils bei Raumtemperatur, 30º C und 37º C. Alle unterschiedlich aussehenden Hefekolonien wurden weiter bearbeitet. Die Aufbewahrung der Hefekulturen erfolgte auf Sabouraud-Schrägagar bei Raumtemperatur. Regelmäßige Überimpfungen auf frische Nährmedien wurden in Abständen von 3 bis 4 Monaten durchgeführt. Für längere Aufbewahrungszeiten wurden die Hefen lyophilisiert bzw. in destilliertem Wasser konserviert ( Rodrigues 1992 , Odds 1991 ).

2.2.2.2. Mikroskopie

Für den Nachweis von Chlamydosporen bzw. Pseudohyphen wurden die Candida-Isolate auf Reisextrakt-Agar angezüchtet. Die Platten wurden normalerweise 2 bis 3 Tage, in Zweifelsfällen bis zu 10 Tagen, bei Raumtemperatur inkubiert. Die Bewertung der Mikromorphologie erfolgte mittels Lichtmikroskop. Die Beobachtung erfolgte mit ei-

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Bei Anzucht auf ALBICANS ID-Agar wachsen C. albicans, C. stellatoidea und C. dubliniensis als blaue Kolonien, während alle anderen Kolonien keine Farbänderung zeigen. Die Bebrütung erfolgte über 24 Stunden, bei langsamwachsenden Hefen bis zu 10 Tagen, im Brutschrank bei 30 ºC.

2.2.2.3. Biochemische Differenzierung

Alle in dieser Arbeit untersuchten Candida-Isolate wurden durch Anzucht auf ALBICANS ID-Agar bzw. Reisagar sowie durch Biochemotypie mit dem Api ID 32 C-System konventionell identifiziert.

Weiterhin wurde das Api Zym-System getestet als zusätzliche Identifizierungsverfahren für ausgewählte Candida-Spezies. Mit diesem System können 19 verschiedene Enzymaktivitäten direkt nachgewiesen werden. Dabei wurden die entsprechenden Teststreifen nach den Vorschriften des Herstellers beimpft, bebrütet und abgelesen.

2.2.2.3.1. API-System

Das Api-System ist eine biochemische Reihe, mit der Mikroorganismen anhand von standardisierten und miniaturisierten Assimilations- und Fermentationsreaktionen identifiziert werden können. Für die Differenzierung von Hefen können die Systeme Api Auxacolor, Api 20 C und Api 32 C verwendet werden. Mit dem Auxonogramm werden die Hefearten über ein Schlüsselsystem bestimmt. Das Api-System 32 C benutzt 32 biochemische Reaktionen, die in Dreiergruppen eingeteilt werden. Jede positive Reaktion erhält den Wert 1, 2 oder 4, je nach Position innerhalb der Gruppe (erster, zweiter oder dritter Test). Die Addition der drei Werte (0 für negative Reaktionen) ergibt für jede Gruppe einen Wert zwischen 0 und 7. Die ersten 24 Tests ergeben einen achtstelligen Code. Die 8 anderen Reaktionen sind Zusatzreaktionen, die bei niedriger Selektivität zur weiteren Differenzierung verwendet werden, sowie eine Negativkontrolle als Referenz für die Ablesung der Assimilationsreaktionen. Das erhaltene Profil kann sowohl manuell als auch automatisch mit den im ”Analytischen Profil Index“ enthaltenen Profilen verglichen werden. Für die Identifizierung gibt es fünf verschiedene Möglichkeiten:

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1. Identifizierung eines Taxons: ein Taxon (Speziesgruppe) erscheint z.B. Candida albicans.
2. Identifizierung einer Spezies: 2, 3 oder 4 Taxa (Biotypen) der gleichen Spezies erscheinen. Ein Biotyp ist eine Untergruppe von Hefen innerhalb einer Spezies, welche im ID 32 C System dieselben biochemischen Reaktionen zeigen z.B. Candida albicans 1.
3. Identifizierung auf Genusebene: 2, 3 oder 4 Taxa des gleichen Genus erscheinen.
4. Niedere Selektivität: 2, 3 oder 4 Taxa verschiedener Genera erscheinen.
5. Das Profil ist nicht im Index. Dies ist möglich, wenn das Profil sehr atypisch oder sehr selten ist.

Alle Stämme wurden mit dem Api ID 32 C-System biochemisch differenziert. Dafür wurden die Streifen nach den Vorschriften des Herstellers beimpft und bis zu zwei Tagen bei 30 ºC oder für langsamwachsende Hefen bis zu 7 Tagen bei Raumtemperatur bebrütet. Die Auswertung erfolgte nach 24, 48 und 72 Stunden sowohl manuell unter Verwendung des entsprechenden Profilindexes bzw. über eine Prozenttabelle als auch automatisch mit dem ATB-Lesergerät und der entsprechenden Software. Zur Unterscheidung ähnlicher Profile wurde auch die Morphologie auf Reisagar hinzugezogen.

2.2.3. Identifizierung mit molekularbiologischen Methoden

2.2.3.1. DNA-Präparation

Die Isolierung der gesamten DNA erfolgte mit einem modifizierten Methode nach Monique Gardes (1993) .

3-5 Hefekolonien wurden mit 500 µl 2% CTAB-Puffer in Eppendorf-Tubes suspendiert. Der Zellaufschluß wurde durch 3x Frieren in flüssigem Stickstoff und Auftauen im Wasserbad bei 65° C erreicht. Anschließend erfolgte eine Inkubation bei 65 °C für 30-60'.

Dann wurde die Lösung mit 1 Vol. Chloroform versetzt, leicht geschüttelt und 15 min bei 13.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, erneut 1 Vol. Chloroform zugesetzt und zentrifugiert. Diese Prozedur wurde mindestens 3 Mal wiederholt bis keine Interphase mehr sichtbar war und der Überstand möglichst farblos war.

Zur Fällung der DNA wurden dem Überstand 600 µl eiskaltes Isopropanol zugegeben,

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Der Überstand wurde verworfen, das DNA-Sediment mit 70%-igen kaltem Äthanol gewaschen und anschließend in einer Speed-Vac bei 6.000 x g vakuumgetrocknet.

Das DNA- Pellet wurde je nach Menge in ca. 100-200 µl TE-Puffer über Nacht bei Raumtemperatur gelöst und bis zum weiteren Gebrauch bei -20° C gelagert.

2.2.3.2. DNA-Konzentrationsbestimmung und Lagerung der DNA-Proben

Ein Aliquot der zu messenden DNA-Lösung wurde mit Aqua bidest. oder TE-Puffer 1:20 bis 1:200 verdünnt. Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte spektrophotometrisch (Quarzküvette, 1 cm Schichtdicke) durch Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm. Die Extinktion von 1 entspricht bei doppelsträngiger DNA ungefähr einer Konzentration von 50 µg/ml ( Sambrook et al. 1989 ).

Um den Reinheitsgrad der DNA-Lösung zu ermitteln, wurde der Quotient der Extinktionen bei OD260/OD280 bestimmt. Der errechnete Wert sollte für eine reine DNA-Präparation, bei 1,8 - 2,0 liegen. Liegt der Wert darunter, so weist dies auf eine Kontamination der Probe durch Proteine oder Phenol hin, während ein Quotient > 2 für eine Verunreinigung durch RNA spricht.

Die konzentrierten DNA-Lösungen wurden bei -20º C aufbewahrt.

Die Arbeitslösungen mit einer Konzentration von 10 ng/µl wurden mit Aqua bidest. oder TE-Puffer hergestellt und bei 8º C gelagert.

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2.2.3.3. PCR-Fingerprinting (Polymerasekettenreaktion)

Bei den PCR-Fingerprinting-Reaktionen wurden 50 µl PCR-Ansätze verwendet, die wie folgt zusammengesetzt waren:

Tabelle 9: PCR-Ansätze

Reagenz	Menge
Reaktionspuffer	5 µl
Primer	25 pmol
Taq-DNA-Polymerase	3 U
dNTP's	jeweils 200 mM
DNA	25 ng
Wasser	Füllung auf 50 µl
Mineralöl	1 Tropfen

Folgende PCR-Parameter wurden benutzt:

Tabelle 10: PCR-Programme für das DNA-Fingerprint

Primer	T3B	M13c	AP3c
Initiale Denaturierung	2 min bei 95 ºC	2 min bei 95 ºC	2 min bei 95 ºC
Denaturierung*	20 sec bei 95 °C	20 sec bei 95 °C	1 min bei 95°C
Annealing *	30 sec bei 52 ºC	60 sec bei 50 ºC	30 sec bei 36 ºC
Primer-Extintion*	1’ 20’’ bei 72 °C	20‘’ bei 72 °C	2 min bei 72 °C
*Anzahl Zyklen	32	27	45
Inkubation	6 min bei 72 ºC	6 min bei 72 ºC	6 min bei 72 ºC
Abkühlung	4 ºC	4 ºC	4 ºC

Anschließend wurden die PCR-Produkte in der Speed Vac. auf 20 µl eingeengt und elektrophoretisch aufgetrennt.

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2.2.3.4. Amplifizierung und Restriktionsanalyse der ITS-Region

2.2.3.4.1. PCR zur Amplifizierung der ITS-Region

Die PCR zur Amplifizierung der gesamten ITS-Region wurde unter Verwendung der LR1- und SR6S-Primer (Seite 28) nach dem Ansatz wie in Tabelle 11 durchgeführt.

Der PCR-Ansatz wurde gemischt, mit 1 Tropfen PCR-Mineralöl überschichtet, und für 5 Sekunden zentrifugiert. Zur Initialdenaturierung der DNA wurde der Ansatz für 5 Minuten auf 95°C erhitzt, und das Zyklerprogramm gestartet. Ein Zyklus bestand aus folgenden 3 Schritten ( Tabelle 12

Tabelle 11: PCR Ansatz zur Amplifizierung der gesamten ITS-Region

Menge	Reagent
5 µl	Templat-DNA (= 50 ng)
5 µl	10X PCR-Puffer
4 µl	1,25 mM dNTPs (Endkonzentration je Nukleotid 200 µM)
1,5 µl	Primer-Lösung I (= 15 pmol)
1,5 µl	Primer-Lösung II (= 15 pmol)
0,4 µl	Taq-Polymerase (4 Units)
Mit Aqua bidest. auf 50 µl auffüllen

Tabelle 12: Zyklerprogramm der PCR zur Amplifizierung der gesamten ITS-Region

Schritt	Dauer
1. Denaturierung	1 min bei 95°C
2. Primer-Bindung	30 sec bei 54°C
3. Primer-Extension	1’ 20’’ bei 72 °C

Der Zyklus wurde 34 mal wiederholt. An den letzten Zyklus schloß sich eine 6-minütige Inkubation bei 72 °C und eine Abkühlung bis auf 4° C an.

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2.2.3.4.2. Restriktionsanalyse der ITS-Region

Prinzip:	Amplifizierung der ITS-Region einschließlich Elektrophorese Spaltung der amplifizierten ITS-Region mit Restriktionsenzymen einschließlich Elektrophorese Fotografie Auswertung
Schritte:	Die Verfahren zur Amplifizierung der ITS-Region sind bereits in der Tabelle 11 und Tabelle 12 erwähnt. Die enzymatische Spaltung der amplifizierten ITS-Region erfolgte wie in der Tabelle 13 dargestellt.

Tabelle 13: Ansatz zur enzymatischen Spaltung der amplifizierten ITS-Region mit den Restriktionsenzymen Hae III und Dde I

Reagenz	Menge
PCR-Produkte	10,0 µl
Puffer	1,5 µl
H2O	2,5 µl
Enzym	je 1,0 µl (10 units)
Inkubation	37º C x 2 Std. Brutschrank

2.2.3.5. Nachweis der PCR-Produkte

2.2.3.5.1. Elektrophorese für das Fingerprinting

Für die Auftrennung der PCR-Produkte wurde 1,2%-iges Agarosegel (0,5 x 25 x 20 cm) verwendet. Die Agarose wurde durch Erhitzen in der Mikrowelle in 1 X TBE-Puffer vollständig gelöst und nach leichter Abkühlung in eine Gelschale gegossen.

Als Laufpuffer wurde 0,5 X TBE-Puffer verwendet. Vor dem Auftragen der Proben wurden diese mit 1/8 Volumen Stoplösung ( Seite 40 ) versetzt und aufgetragen. Als Molekulargewichtsmarker wurde die 1 kb Leiter, benutzt.

Die Trennung der DNA-Fragmente erfolgte bei konstanter Spannung von 100 Volt für 5 h.

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2.2.3.5.2. Elektrophorese des ITS-PCR-Produkts und des Restriktionsfragments

Für den Nachweis der PCR-Produkte nach Amplifikation der ITS-Region wurde 1,3%-iges MetaPhor-Agarosegel. (12 x 13 x 0,5 cm) verwendet und als Molekulargewichtsmarker die 100 bp Leiter benutzt.

Zunächst wurden die DNA-Fragmente bei konstanter Spannung 80 Volt, für 3 h separiert.

Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel für 5-10 Minuten in einem Ethidiumbromidbad gefärbt. Zur Reduzierung der Hintergrundfluoreszenz durch freies Ethidiumbromid wurde das Gel in Wasser entfärbt und noch mal 15’ bei 100 V laufen gelassen.

2.2.3.5.3. Fotografie

Nach den Elektrophoresen wurden die Banden auf den Gelen unter UV-Licht bei einer Wellenlänge von 305 nm sichtbar gemacht und mit einer "Polaroid MP-4-Land Camera" Sofortbild Kamera mit Polaroid Instant Film #667 oder #100 fotografiert.

2.2.3.6. Computergestützte Analyse der PCR-Fingerprints

Zur Auswertung der Fingerprint-Muster wurde zunächst mit Hilfe einer scannerverbundenen Hard- und Software für den Computer (RFLPscan, Version 2.01, Scanalytics, CSP Inc., Billerica, USA) das Molekulargewicht jeder auftretenden Bande bestimmt. Es wurde dann eine binäre Datenmatrix für jeden der untersuchten C. albicans-Stämme erstellt. Banden, die im jeweiligen Stamm vorhanden waren, wurden mit 1 und fehlende Banden mit 0 kodiert.

Zur Ermittlung der genetischen Verwandtschaft der C. albicans-Vaginalstämme verschiedener geographischer Herkunft wurde eine phylogenetische Analyse mit Hilfe der UPGMA-Methode (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Mean) durchgeführt

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2.2.3.7. Computergestützte Auswertung der ITS-RFLP-Analysen

Für die Bestimmung der Molekulargewichte der Restriktionsfragmente wurde die gleiche scannergestützte Hard- und Software für den Computer wie für das PCR-Fingerprinting verwendet.

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Tabelle 14: Verwendete Chemikalien:

Produkte	Hersteller
Agarose MetaPhor	Biozym, Oldenburg
Agarose NA	Pharmacia Biotech, Freiburg
Ampli Taq® DNA Polymerase	Perkin Elmer, Überlingen
Desoxynukleosidtriphosphate-set (dNTPs)	Pharmacia / LKB, Freiburg
DNA-Leiter 1 Kb	GibcoBRL, Eggenstein:
DNA-Leiter 123 bp	GibcoBRL, Eggenstein:
Hexadecetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)	Ferak, Berlin:
Mercaptoethanol	Ferak, Berlin:
Mineral Öl	Sigma, St. Louis, Mo. USA
Sabouraud-Dextrose-Agar	Difco Laboratories
Kimmig-Agar	Merck KGaA, Darmstadt
Reisextrakt-Agar	Merck KGaA, Darmstadt
ALBICANS ID-Agar	bioMérieux sa
Api ID 32 C	bioMérieux sa
Api Zym	bioMérieux sa
Hae III-Restriktionsendonuklease	Boehringer, Mannheim
Dde I-Restriktionsendonuklease	Boehringer, Mannheim

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Tabelle 15: Verwendete Geräte:

Produkte	Hersteller
Eagle Eye II	Startagene, Heidelberg
Kamera MP-4 Land Camera	Polaroid, USA
Polaroid Films Prolapan P100, P667	Kodak, Stuttgart
667 und 100-Positivfilm	Kodak, Stuttgart
Spektrophotometer Ultrospec III	Pharmacia / LKB, Freiburg
Speed Vac SVC100E	Savant Instruments, Farmingdale, NY
Thermozykler Trioblock	Biometra-Hybaid, Göttingen
Thermozykler Perkin-Elmer 9600	Perkin-Elmer Corp. Emeryville, California
UV-Transilluminator	UVP, San Gabriel, USA
Zentrifuge 5415 C	Eppendorf, Hamburg
ATB-Lesegerät	bioMérieux sa, Marcy-l'Etoile, Frankreich

2.2.4. Rezepte

CTAB-Puffer:

100 mM	Tris-Hcl pH 8,0
20 mM	EDTA
1,4 M	NaCl
2%	CTAB
0,2%	Mercaptoethanol
auf 100 ml mit bidest. auffüllen

TE-Puffer

10 mM Tris.Cl (pH 8,0)

1 mM EDTA (pH 8,0)

40

10 x TBE-Puffer:

107,8 g Tris-Base

55,0 g Borsäure

20 mM EDTA

auf 1000 ml mit Aqua bidest auffüllen

pH 7,5 mit Phosphorsäure einstellen

Stoplösung

0,5 ml Formamid

0,4 ml 0,5M EDTA (pH 8,0)

5 mg Bromphenolblau

5 mg Xylencyanol FF

0,1 ml Aqua bidest.

Komponenten für die PCR-Ansätze:

DNA	25 ng
Reaktionspuffer	(10 mM Tris-HCl [pH 8.0]; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl2: 3 mM MgAc)
dNTP’s	dATP, dCTP, dGTP und dTTP

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