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Kapitel 3. ERGEBNISSE

3.1. Methoden zur konventionellen Identifizierung der Candida-Isolate

Für die Identifizierung der Candida-Isolate wurden folgende konventionelle Techniken getestet:

• Anzucht auf dem Differentialnährboden ALBICANS ID-Agar ®
• Bildung von Chlamydosporen, Pseudohyphen und echten Hyphen nach Anzucht auf Reisagar
• Prüfung der Stoffwechselleistungen mit den Systemen API 32C und API-zym

Der Differentialnährboden ALBICANS ID-Agar® enthält ein chromogenes Substrat, welches durch das für C. albicans und die eng verwandten Spezies C. stellatoidea und C. dubliniensis spezifische Enzym Hexosaminidase gespalten wird. Kolonien dieser Spezies erscheinen deshalb auf Differentialnährboden blau- bis hellgrün gefärbt, während alle anderen Kolonien weiß bzw. andersfarbig aussehen. Mit dieser Methode können daher C. albicans-Isolate einfach und sicher von anderen Candida-Arten, mit Ausnahme von C. dubliniensis, unterschieden werden ( Abbildung 2 ).

Abbildung 2: Candida albicans und non-albicans Arten auf dem Nährboden ALBICANS ID-Agar®

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Bei einem Wachstum von Candida auf Reisagar wird ein halbanaerobes Milieu erzeugt, wodurch es zur Bildung von Hyphen und Chlamydosporen kommt ( Abbildung 3 und Abbildung 4 ).

Abbildung 3: Mit Candida Arten beimpfte Reisagar-Platte

Alle auf dem Differentialnährboden ALBICANS ID-Agar® gewachsenen Kolonien wurden nach 2 bis maximal 10tägiger Bebrütung auf Reisextrakt-Agar mikroskopisch untersucht. Bei den meisten der blaugrün gefärbten C. albicans wurden die erwarteten Pseudohyphen gefunden. Bei einigen dieser blaugrünen Kolonien konnten jedoch auch nach 10-tägiger Bebrütung keine Chlamydosporen beobachtet werden.

Abbildung 4: Auf Reisagar angezüchtet C. albicans mit Hyphen (H) und Chlamydosporen (C).

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Mit dem Api-System ID-32 C konnten die meisten C. albicans als Biotyp 1 mit dem Profil 7340 3400 (ausgezeichnete Identifizierung) identifiziert werden. Biotyp 2 (C. stellatoidea) mit dem Profil 3142 3000 (ausgezeichnete Identifizierung) wurde für 9 C. albicans-Isolate erhalten. Bei der Identifizierung von 32 C. albicans-Stämmen (s. Tabellen 17 - 19 ab 53) und von den meisten der 37 non-C. albicans-Stämmen (s. Tabelle 16 , Seite 45) waren die Ergebnisse mit dem Api-System allerdings problematisch, da sie sich entweder keinem oder nicht ausreichend sicher einem bestimmtem Profil zuordnen ließen.

Alle Candida albicans-Stämme, die mit diesen drei Methoden (Differentialnährboden ALBICANS ID-Agar®, Mikromorphologie auf Reisagar und Api-System ID 32-C) abweichende morphologische und biochemische Eigenschaften aufwiesen und deshalb nicht klar identifizierbar waren, werden in der vorliegenden Arbeit als "atypische Stämme" bezeichnet.

Das Identifizierungssystem Api-Zym hat in unseren Studien wenig zufriedenstellende Ergebnisse gezeigt. Dieses System erlaubt den schnellen semiquantitativen Nachweis von 19 Enzymaktivitäten in sehr geringen Probenmengen. Die Technik eignet sich für alle Untersuchungsmaterialien wie z.B. Gewebe, Zellen, biologische Flüssigkeiten, Mikroorganismen, Spülfüssigkeiten, Bodenproben, Öl u.a. und ist mit einer Inkubationszeit von 4 Stunden schnell durchführbar. Dieses System erreicht nicht die Präzision spektrometrischer und elektrophoretischer Messmethoden, wird aber verwendet, um Untersuchungsmaterialien auf Enzymaktivitäten zu prüfen, die dann bei Bedarf mit genaueren Methoden exakt bestimmt werden können. Im Vergleich zum Api-zym-Test wurden mit dem Api ID 32 C deutlich mehr Stämme erfaßt. Außerdem ist das Api-Zym-System lediglich ein Enzymnachweis und nicht primär eine Methode zur Speziesidentifizierung. Es ist nicht auszuschließen, daß gleiche Enzymkonstellationen bei unterschiedlichen Organismen vorhanden sein können. Aus diesen Gründen und aus Kostengründen haben wir uns für das Api ID 32 C-System für die biochemische Charakterisierung der Candida-Isolate entschieden.

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3.2. Konventionelle und molekularbiologische Identifizierung schwer differenzierbarer Candida-Stämme

3.2.1. Differenzierung von C. guilliermondii und C. famata

3.2.1.1. Ergebnisse konventioneller Identifizierungsmethoden

In der vorliegenden Arbeit wurden konventionelle und molekularbiologische Verfahren für die Differenzierung von insgesamt 37 C guilliermondii/ C.famata-Isolaten, die von Patienten der Dermatologischen Klinik und Poliklinik der Charité stammten, eingesetzt. Andere Probenmaterialien außer Hautproben standen nicht zur Verfügung. Die konventionelle Diagnostik erfolgte mittels Biochemotypie mit dem Api-System ID-32 C und durch den Nachweis der Pseudomyzelbildung auf Reisagar. Nur für 2 Stämme konnte jedoch die Ausbildung von Pseudomyzelien eindeutig nachgewiesen werden.

Die API-Profile der in dieser Studie getesteten als C.guilliermondii/ C.famata-Isolate sind in Tabelle 16 dargestellt. Für die unter 1-4 erfaßten Isolate wurde aufgrund einer fraglichen Pseudomyzelbildung sowie aufgrund klinischer Angaben die Verdachtsdiagnose C. guilliermondii gestellt. Die beiden Stämme, die eindeutig Pseudomyzelien ausbildeten, sind unter Punkt 5 aufgelistet. Wegen fehlender klinischer Symptome und fehlender Pseudomyzelbildung wurde vermutet, daß es sich bei den übrigen Isolaten (6-13) um C. famata handelt.

Mit dem API-System konnten nur die 23, unter 4 und 5 aufgelisteten, Isolate mit der Profilnummer 5577 3521 als C. guilliermondii identifiziert werden. Für den unter (1) beschriebenen Stamm konnte keine Differenzierung zwischen C. guilliermondii und C. famata erreicht werden, während die Stämme unter den Punkten (3) sowie (6-8) aufgrund ihres API-Profils eher der Spezies C. famata zugeordnet werden müßten. Für die übrigen Stämme war eine Identifizierung mit dem API-System überhaupt nicht möglich.

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Tabelle 16: Zusammenfassung der Ergebnisse konventioneller und molekularbiologischer Methoden für die Identifizierung fraglicher C.guilliermondii/ C.famata- Isolate

Anzahl der	Pseu-dohy-	Identifizierung mit Api 32C (V. 1)		Molekulare Diagnostik	Reihe
Stämme	ph	Profil	Ergebnisse aus Datenbank
1	nein	5177 3521	C. famata %id= 58 C. guilliermondii %id= 40 Gute Identifizierung auf Genus Ebene	C. guilliermondii	1
1	nein	5577 1501	nicht vorhanden	C. guilliermondii	2
4	nein	5577 3501	C. famata %id= 81 C. guilliermondii %id= 19 Ausgezeichnete Identifizierung auf Genus Ebene	C. guilliermondii	3
21	nein	5577 3521	C. guilliermondii %id= 88 C. famata %id= 12 Ausgezeichnete Identifizierung auf Genus Ebene	C. guilliermondii	4
2	ja	5577 3521	C. guilliermondii %id= 88 C. famata %id= 12 Ausgezeichnete Identifizierung auf Genus Ebene	C. guilliermondii	5
1	nein	5577 3561	C. famata %id= 93,8 Gute Identifizierung	C. guilliermondii	6
1	nein	7577 3543	C. famata %id= 99,3 Sehr gute Identifizierung	C. guilliermondii	7
1	nein	5577 3553	C. famata %id= 97,4 Gute Identifizierung	C. famata	8
1	nein	5777 1503	nicht vorhanden	C. famata	9
1	nein	5777 3551	nicht vorhanden	C. famata	10
1	nein	5177 1743	nicht vorhanden	non-famata / non-guilliermondii	11
1	nein	5567 3501	nicht vorhanden	non-famata / non-guilliermondii	12
1	nein	5777 1703	nicht vorhanden	Non-famata / non-guilliermondii	13

Bei der Biochemotypie wurden somit sowohl Stämme, deren Profile nicht erfaßt sind, als auch Profile, die von einer schlechten bis zu einer sehr guten Identifizierung reichen, innerhalb dieser beiden Candida-Arten gefunden.

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3.2.1.2. Ergebnisse molekularbiologischer Identifizierungsmethoden

3.2.1.2.1. PCR-Fingerprinting

Unsere Arbeitsgruppe konnte in früheren Untersuchungen zeigen ( Thanos et al. 1996 ), daß bei Amplifizierung der genomischen DNA unterschiedlicher Candida-Arten mit einzelnen unspezifischen Primern speziesspezifische Amplifikationsprodukte erhalten werden. Durch den Vergleich der PCR-Fingerprints klinischer Isolate mit denen entsprechender Referenzstämme war es möglich, Candida-Spezies korrekt zu identifizieren. Da die C.guilliermondii- und C.famata-Referenzstämme mit dieser Fingerprint-Technik gut diskriminiert werden konnten, haben wir diese Methode in unserer Studie für die Differenzierung der C.guilliermondii/ C famata-Stämme eingesetzt. Wir haben dafür zunächst die Primer T3B und M13 Core-Sequenz verwendet, die beide stets übereinstimmende Ergebnisse lieferten. Bei späteren Versuchen wurde dann nur noch Primer T3B eingesetzt, da die mit ihm erhaltenen Profile eindeutiger und leichter auswertbar waren.

Wie in Abbildung 5 zu sehen ist, wurden für C. guilliermondii vs. C. famata deutlich unterschiedliche PCR-Fingerprints mit dem Primer T3B beobachtet, die eine klare Zuordnung der klinischen Isolate (Bahnen 8, 10, 14-16, 18-21: C. guilliermondii; Bahnen 5, 6, 9: C. famata) gestatteten. Einige PCR-Profile entsprachen jedoch weder denen von C. guilliermondii noch denen für C. famata. Derartige Isolate wurden als non-famata / non-guilliermondii Isolate bezeichnet (Bahnen 4, 7, 17). Eine Identifizierung war auch nach Vergleich mit den PCR-Profilen der 26 bisher untersuchten Candida-Spezies ( Thanos et al. 1996 ) nicht möglich.

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Abbildung 5: PCR-Fingerprint-Muster ausgewählter C.famata/ C.guilliermondii-Isolate erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B.

Bahnen 1, 11 und 22: 1 kb-Molekulargewichtsmarker

Bahnen 2-3: Referenzstämme von C. famata (CBS 1795)

Bahn 4: non-famata / non-guilliermondii

Bahn 5: C. famata

Bahn 6: C. famata

Bahn 7: non-famata / non-guilliermondii

Bahn 8: C. guilliermondii

Bahn 9: C. famata

Bahn 10: C. guilliermondii

Bahnen 12-13: Referenzstämme von C. guilliermondii ATCC 6260

Bahn 14: C. guilliermondii

Bahn 15: C. guilliermondii

Bahn 16: C. guilliermondii

Bahn 17: non-famata / non-guilliermondii

Bahn 18: C. guilliermondii

Bahn 19: C. guilliermondii

Bahn 20: C. guilliermondii

Bahn 21: C. guilliermondii

3.2.1.2.2. Restriktionsanalyse der amplifizierten ITS-Region

Die ”internal transcribed spacer“ im ribosomalen Operon sind hypervariable DNA-Regionen, die bei vielen Mikroorganismen für die Identifizierung auf Speziesebene genutzt werden. Diese nichtkodierenden Sequenzen ( Abbildung 6 ) liegen zwischen den Genen für die ”small subunit“ (ssu) rRNA und für die 5.8S rRNA einerseits (ITS1) und zwischen den Genen für die 5.8S rRNA und die ”large subunit“ (lsu)“ rRNA andererseits

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Abbildung 6: Schematische Darstellung der Gesamt-ITS-Region mit der Lokalisation der in der PCR verwendeten Primer.

Wir haben die ITS-Regionen der C. guilliermondii / C. famata-Isolate mit den von Vilgalys et al. und von White et al. (1990) entwickelten pilzspezifischen Primern LR1 und SR6R amplifiziert ( Abbildung 7 ). Die PCR-Produkte unterschieden sich mit 640 bp für C. guilliermondii und 670 bp für C. famata nur gering in ihrer Größe. Nach Spaltung der Amplifikate mit den Restriktionsenzymen Hae III und Dde I konnten jedoch die beiden Spezies gut unterschieden werden ( Abbildung 8 ). Dabei konnte der Stamm in Bahn 3a und 3b, der auf Grund fehlender Pseudohyphenbildung konventionell als C. famata bestimmt worden war, eindeutig als C. guilliermondii identifiziert werden.

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Abbildung 7: Amplifizierung der ITS-Regionen von C. guilliermondii /C. famata mit den Primern SR6R und LR1

Bahn 1: 123 bp DNA-Leiter (Molekulargewichtsmarker)

Bahn 2 und 3: Referenzstämme von C. famata CBS 1795

Bahn 4 und 5: Referenzstämme von C. guilliermondii ATCC 6260

Bahn 6 bis 22: klinische Isolate von C. guilliermondii /C. famata

Abbildung 8: Spaltung der amplifizierten ITS-Regionen von C. famata und C. guilliermondii mit den Restriktionsendonukleasen Hae III (a) und Dde I (b).

Bahn 1a, 2a und 1b, 2b: Referenzstämme von C. famata CBS 1795

Bahn 3a und 3b: C. famata (C. guilliermondii bestätigt)

Bahn 4a, 5a und 4b, 5b: Referenzstämme von C. guilliermondii (ATCC 6260)

Bahn 6a und b: C. guilliermondii (klinisches Isolat)

Bahn M: 123 bp DNA-Leiter (Molekulargewichtsmarker)

Bahn X: ungespaltener Spacer

3.2.1.2.3. Vergleich der Ergebnisse konventioneller phänotypischer und molekularbiologischer Methoden für die Identifizierung von C. guilliermondii und C. famata

Im folgenden soll anhand eines klinischen Beispiels die Differenzierung von C. guilliermondii und C. famata im Detail beschrieben werden:

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Bei der Patientin S.C., 45 Jahre, mit der klinischen Diagnose therapierefraktäre chronisch rezidivierende Onychomykose ( Abbildung 9 ), wurden von den Fingernägeln Hefen isoliert, die auf Reisagar keine Pseudomyzelien bildeten ( Abbildung 10 ). Mit dem API-System ID 32-C wurde das Profil 5577 1503 bestimmt, welches in der Datenbank eine gute Identifizierung (%id =98,5) als C. famata ergab.

Abbildung 9: Chronisch rezidivierende Onychomykose bei der Patientin S.C.

Abbildung 10: Stamm der Patientin S.C. ohne Pseudomyzelbildung auf Reisagar

Die molekularbiologische Diagnostik mit dem PCR-Fingerprinting ( Abbildung 11 ) sowie auch die Restriktionsanalyse der amplifizierten ITS-Regionen ( Abbildung 12 ) ergaben als Speziesdiagnose jedoch C. guilliermondii.

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Abbildung 11: PCR-Fingerprint-Muster ausgewählter C.famata/ C.guilliermondii-Isolate erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B.

G: C. guilliermondii-Referenzstämme ATCC 6260; g: klinische Isolate von C. guilliermondii; F: Referenzstämme von C. famata CBS 1795; f: klinisches Isolat von C. famata; n: non-guilliermondii / non-famata -Isolate; *: Isolat der Patientin S.C.

Abbildung 12: Spaltung der amplifizierten ITS-Regionen von C. famata und C. guilliermondii mit der Restriktionsendonuklease Hae III.

*: Patienten-Isolat

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C. famata sind nicht als Erreger von Dermatomykosen beschrieben, sondern werden lediglich als Kontaminanten angesehen. Somit führte die Identifizierung dieses Patientenisolats als C. guilliermondii zur Bestätigung der Erkrankung als therapiepflichtige Mykose. Für diesen C. guilliermondii-Stamm wurde von unserer Arbeitsgruppe (Tietz and Czaika 1999) eine Hoch-Resistenz gegenüber Fluconazol und Itraconazol festgestellt. Da für die systemische Therapie von Infektionen durch Hefepilze nur diese beiden Azole zur Verfügung stehen, Griseofulvin und Terbinafin sind unwirksam, war eine systemische Therapie unmöglich. In dem Fall unserer Patientin blieb so der Einsatz von Lokalantimykotika die einzige Möglichkeit.

Insgesamt haben wir die Ergebnisse der konventionellen und der molekularbiologischen Identifizierung für 37 fragliche C. guilliermondii /C. famata-Isolate verglichen ( Tabelle 16 ). Nur bei zwei dieser Isolate konnte die Diagnose C. guilliermondii aufgrund der eindeutigen Bildung von Pseudomyzelien auf Reisagar gestellt werden.

Mit dem PCR-Fingerprinting und der RFLP-Analyse der ITS-Region konnten 31 der getesteten Isolate als C. guilliermondii identifiziert werden ( Tabelle 16 : Reihe 1 bis 7). 23 dieser Stämme wurden auch mit dem API-System ID 32C sicher erkannt (Reihe 4-5), die alle das gleiche API-Profil 5577 3521 aufwiesen. Bei 5 Stämmen konnte in der Biochemotypie nicht zwischen C. guilliermondii und C. famata diskriminiert werden (Reihe 1 + 3). Weitere zwei Stämme wurden sogar mit sehr guter bzw. guter Identifizierung als C. famata diagnostiziert (Reihe 6-7), während das API-Profil eines C. guilliermondii-Stamms überhaupt keine Aussagen gestattete (Reihe 2).

Drei der 37 untersuchten Isolate erwiesen sich nach Durchführung des PCR-Fingerprinting und der RFLP-Analyse der ITS-Region als C. famata (Reihe 8-10), nur einer dieser Stämme wurde auch in der Biochemotypie erkannt (Reihe 8). Für zwei C. famata-Isolate konnte im API-System keine Spezieszugehörigkeit ermittelt werden (Reihe 9-10). Drei non-guilliermondii / non-famata-Isolate, deren API-Profile in der API-Datenbank nicht vorhanden waren und die auch mit den molekularen Techniken nicht identifiziert werden konnten, müssen noch zugeordnet werden (Reihe 11-13).

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3.2.2. Identifizierung von Candida albicans-Stämmen mit atypischen morphologischen und biochemischen Eigenschaften

3.2.2.1. Ergebnisse konventioneller Identifizierungsmethoden

In dieser Arbeit wurden die Ergebnisse konventioneller und molekularbiologischer Identifizierungsmethoden auch für Candida-Isolate mit atypischen morphologischen und biochemischen Eigenschaften verglichen. 9 klinische Candida-Stämme aus Deutschland wiesen untypische Profile im API-System ID 32 C auf, wie in Tabelle 17 angegeben. Die untypischen API-Profile waren durch die fehlende Assimilation von 2-Ketogluconat (2KG) und Xylose (XYL) bedingt. Laut Angaben des Herstellers sind 100%- bzw. 98% aller Candida albicans-Stämme in der Lage, diese beiden Substrate zu verwerten. Sowohl die Xylose-negativen als auch die 2KG-negativen Stämme waren in den übrigen phänotypische Merkmalen unauffällig im Vergleich zu ”normalen“ C. albicans-Populationen.

Tabelle 17: Atypische Candida-Isolate aus Deutschland

Erreger	ID-32 C	Anzahl	Profil (bioMerieux Datenbank V.1)
2KG negative-Stämme	7345 3400	4	nicht vorhanden
XYL negative-Stämme	7347 1400	5	C. albicans %id= 99,9 Sehr gute Identifizierung

Aus Afrika stammen die in der Tabelle 18 und Tabelle 19 aufgelisteten atypischen Candida-Isolate, bei denen folgende API-Profile gefunden wurden, wobei das Profil 7046 3400 dominierte.

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Tabelle 18: Atypische Candida-Isolate aus Angola

Stamm-Nr.	(bioMerieux Datenbank V.1)
	ID-32 C	Profil
AA 1634	7040 3400	nicht vorhanden
AA 1587	7042 3400	Candida sake %id= 99,2 Gute Identifizierung
AA 1605	7046 3400	nicht vorhanden
AA 1622g	7046 3400	nicht vorhanden
AA 1078	7046 3400	nicht vorhanden
AA 579	7046 3400	nicht vorhanden
AA 759	7046 3400	nicht vorhanden
AA 1598	7047 3400	nicht vorhanden
AA 1618	7047 3400	nicht vorhanden

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Tabelle 19: Atypische Candida-Isolate aus Madagaskar

Stamm-Nr.	(bioMerieux Datenbank V.1)
	ID-32 C	Profil
MA 1649	3142 3000	C. stellatoidea %id= 99,7 Ausgezeichnete Identifizierung
MA 2	7045 3400	nicht vorhanden
MA 11	7046 3400	nicht vorhanden
MA 82	7046 3400	nicht vorhanden
MA 268	7046 3400	nicht vorhanden
MA 335	7046 3400	nicht vorhanden
MA 1653	7046 3400	nicht vorhanden
MA 1654	7046 3400	nicht vorhanden
MA 1655	7046 3400	nicht vorhanden
MA 1660	7046 3400	nicht vorhanden
MA 1669	7046 3400	nicht vorhanden
MA 8621	7046 3400	nicht vorhanden
MA 8627	7046 3400	nicht vorhanden
MA 8640	7046 3400	nicht vorhanden

Alle afrikanischen Stämme waren ausnahmslos durch ein verlangsamtes Wachstum in Vergleich zu den anderen Stämmen gekennzeichnet, waren positiv im Keimschlauchtest in humanem Serum, wuchsen als blaugrüne Kolonien auf ALBICANS ID-Agar ( Abbildung 2, Seite 41 ) und bildeten Pseudohyphen ( Abbildung 13 B). Sie waren jedoch unfähig, die für C. albicans typischen Chlamydosporen ( Abbildung 13 A) auf Reisagar auszuprägen und die Aminozucker Glukosamin und N-Acetylglukosamin zu assimilieren ( Abbildung 14 ).

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Abbildung 13: C. albicans-Stämme auf Reisagar, (A) mit und (B) ohne Chlamydosporenbildung.

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Abbildung 14: ID-32C-Profil von typischen C. albicans des Biotyps 1 (A) und von atypischen NAG-negativ Stämmen (B).

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3.2.2.2. Ergebnisse des PCR-Fingerprintings

Die Spezieszugehörigkeit aller atypischen Candida-Isolate wurde mit dem PCR-Fingerprinting (Primer T3B) überprüft. In früheren Studien ( Thanos et al. 1996 , Schönian et al. 1993a -b ) konnte gezeigt werden, daß diese PCR-Fingerprints speziesspezifisch waren, wobei bei unterschiedlichen Candida-Arten nur 10-50% der amplifizierten Fragmente übereinstimmten. Stämme der gleichen Spezies wiesen jedoch im Rahmen des artspezifischen Musters auch stammspezifische Unterschiede auf. Die mit Primer T3B erhaltenen PCR-Fingerprints unterschiedlicher C. albicans-Stämme waren nur zu ca. 88-95% identisch. Die PCR-Profile von C. albicans waren stets sehr charakteristisch und wiesen immer eine prominente Bande bei ca. 1160 bp auf, die bei keiner anderen getesteten Candida-Spezies gefunden wurde. Die meisten Unterschiede bei den C. albicans-Stämmen wurden in den T3B-Profilen im Molekulargewichtsbereich zwischen 800 und 500 bp beobachtet. In diesem Bereich unterschieden sich z.B. auch die beiden C. albicans-Referenzstämme CBS 562 und CBS 5983 ( Abbildung 15 ).

Abbildung 15 PCR-Fingerprint-Muster 2KG- und XYL-negativer Candida-Isolate aus Deutschland erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B

Bahnen 1, und 13: 1 kB-Leiter; Bahn 2: klinisches C. dubliniensis-Isolat; Bahnen 3-5: 2KG-negative Candida-Stämme; Bahnen 6-10: XYL-negative Candida-Stämme; Bahnen 11-12: C. albicans-Referenzstämme CBS 562 und CBS 5983.

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Die afrikanischen atypischen Stämmen wurden in dem PCR-Fingerprinting ebenfalls als C. albicans identifiziert ( Abbildung 16 ) obwohl sie die für C. albicans charakteristischen Merkmale wie die Bildung von Chlamydosporen und die Verwertung der Aminozucker N-Acetylglukosamin und Glukosamin nicht ausprägten. Die Stämme hatten sehr ähnliche PCR-Muster, während bei den ”typischen“ Candida albicans-Stämmen eine größere Heterogenität in ihren PCR-Profilen beobachtet wurde ( Tietz et al. 1995 ).

Abbildung 16: PCR-Fingerprint-Muster atypischer Candida-Isolate aus Afrika erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B.

Bahnen 1, 11 und 22: 1 kb DNA-Leiter (Molekulargewichtsmarker); Bahn 2: C. sake-Referenzstamm CBS 159; Bahn 3-5, 7-10, 12-17: Candida atypisch aus Madagaskar; Bahn 18-20: Candida atypisch aus Angola; Bahn 21: C. albicans-Referenzstamm CBS 562.

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3.3. Charakterisierung von C. albicans-Vaginalisolaten aus Afrika und Europa

3.3.1. Phänotypische Charakterisierung mit den in der Routinediagnostik angewendeten konventionellen Methoden

Bei 6 verschiedenen Candida albicans-Populationen ( Tabelle 20 ) aus Angola (2 Populationen), Madagaskar, Deutschland (2 Populationen) und Portugal wurde die Variabilität phänotypischer und genotypischer Merkmale untersucht. In diese Analyse wurden neben C. albicans-Stämmen mit normalem Biotyp (Populationen aus Deutschland, Portugal und eine Population aus Angola) auch die bereits im vorangegangene Abschnitten beschriebenen atypischen afrikanischen Stämme mit einbezogen.

Sowohl die typischen wie auch die atypischen Stämme stammten aus Routineuntersuchungen und wurden mit den üblichen konventionellen Methoden charakterisiert. Die Candida albicans-Stämme des Biotyps 1 waren phänotypisch ähnlich. Sie wurden ausnahmslos alle mit einem typischen Api 32 C Profil (7347 3400) als Candida albicans identifiziert, wiesen die blaugrüne Färbung auf ALBICANS-ID-Agar auf und bildeten Pseudohyphen und Chlamydosporen auf Reisagar. Die phänotypischen Eigenschaften der atypischen Stämme wurden bereits früher ( Seite 55 ) beschrieben.

Tabelle 20: Candida albicans-Populationen aus Afrika und Europa

Population	Bezeichnung	Anzahl	ID-32 C-Profil (V.1)
C. albicans Biotyp 1 Angola	AT	49	7347 3400
C. albicans atypisch Angola	AA	8	verschiedene
C. albicans atypisch Madagaskar	MA	14	verschiedene
C. albicans Biotyp 1 Berlin	BE	47	7347 3400
C. albicans Biotyp 1 München	MÜ	45	7347 3400
C. albicans Biotyp 1 Lissabon	PO	49	7347 3400

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3.3.2. Genetische Charakterisierung mit dem PCR-Fingerprinting

Wie bereits früher ( Seite 25 ) ausgeführt, werden beim PCR-Fingerprinting neben speziesspezifischen auch eine Reihe von stammspezifischen PCR-Produkten erhalten, die für die Charakterisierung unterschiedlicher Stämme von C. albicans genutzt werden können. Wir haben deshalb diese Methode gewählt, um den Grad der genetischen Variabilität bei den in Tabelle 20 aufgeführten typischen und atypischen C. albicans-Populationen zu überprüfen. Die mit Primer T3B erhaltenen PCR-Profile ausgewählter Stämme aus allen 6 Populationen sind in Abbildung 17 dargestellt.

Abbildung 17 PCR-Fingerprint-Muster ausgewählter C. albicans-Isolate aus Afrika, Deutschland und Portugal erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B.

Bahnen / Isolat-Nr.
1, 21 und 27: 1 kb-Molekulargewichtsmarker
2-3: AT 66, AT 78	12-13: AT 93, AT 96
4: Be 157	14: Be 120
5: Mü 267	15: AT 94
6: Be 116	16-18: Be 112, Be 127, Be 145
7-8: Mü 288, Mü 287	19: AA 60
9-10: AT 62, AT 81	20: MA 49
11: Mü 278	22-26: PO 370-374

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Für jeden C. albicans-Stamm der 6 untersuchten Populationen wurde eine 38-stellige binäre Matrix (0 = Bande ist nicht vorhanden; 1 = Bande ist vorhanden) erstellt. Dafür wurden mittels scannergestützter Hard- und Software zunächst die Molekulargewichte für jede einzelne Bande bestimmt, wobei der Referenzstamm CBS 562 jeweils als Standard diente.

Für die insgesamt 212 C. albicans-Isolate aus Afrika, Deutschland und Portugal wurden 87 unterschiedliche PCR-Fingerprint-Genotypen nachgewiesen, von denen aber nur 18 bei drei bzw. mehr als drei verschiedenen C. albicans-Stämmen. 14 weitere PCR-Fingerprints waren für jeweils 2 Stämme identisch, alle übrigen Stämme hatten individuelle Genotypen.

Die typischen C. albicans-Populationen aus Europa und Afrika zeigten keine grundsätzlich verschiedenen Muster, unterschieden sich aber im Ausmaß der genetischen Variabilität innerhalb der verschiedenen Populationen.

Die 92 Isolate aus Berlin und München wiesen 40 unterschiedliche PCR-Fingerprint-Profile auf ( Tabelle 21 ), wobei in beiden Stammgruppen relativ oft übereinstimmende Genotypen (z.B. die Genotypen D, G, K, P) nachweisbar waren. Genotyp D wurde bei dieser Stammgruppe am häufigsten (13 Stämme) bestimmt. Nur 9 der 40 deutschen Fingerprint-Muster wurden bei drei und mehr Stämmen und weitere 8 Muster wurden bei jeweils zwei Stämmen gefunden. 23 C. albicans-Stämme aus diesen Populationen hatten demnach individuelle Genotypen.

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Die afrikanischen C. albicans-Stämme waren durch eine geringere genetische Heterogenität gekennzeichnet. Für die 49 typischen Isolate aus Angola wurden nur 9 verschiedene PCR-Fingerprint-Muster erhalten. Dabei wurde bei 23 Stämmen der identische Genotyp A, bei 13 Stämmen Genotyp C und bei jeweils 4 Stämmen die Genotypen M und N nachgewiesen. Die verbleibenden 5 Stämme wiesen distinkte Amplifikationsmuster auf. Keine Übereinstimmungen gab es in den Fingerprint-Mustern zwischen den typischen und atypischen Isolaten aus Angola, obwohl sie von Patientinnen der gleichen Klinik stammten. Demgegenüber waren jedoch die PCR-Profile von 6 der 8 atypischen angolanischen Stämme und von 9 der 14 Stämme aus Madagaskar identisch (Genotyp B).

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Tabelle 21: PCR-Fingerprint-Genotypen, die bei mehr als drei unterschiedlichen C. albicans-Stämmen nachgewiesen wurden (0 = Bande nicht vorhanden, 1 = Bande vorhanden).

Gruppen (Anzahl)	Genotypen	Stämme
A (= 24)	11000101001010000010100100110011000010	AT101
		AT102
		AT103
		AT104
		AT106
		AT107
		AT108
		AT109
		AT110
		AT78
		AT79
		AT80
		AT82
		AT83
		AT84
		AT85
		AT86
		AT87
		AT88
		AT89
		AT90
		AT92
		AT98
		PO357
B (= 15)	11000101001010101101010000010001010010	AA1587
		AA1598
		AA1605
		AA1618
		AA1626
		AA1634
		M11
		M1653
		M1654
		M1655
		M2
		M268
		M82
		M8627
		M8640

65

Gruppen (Anzahl)	Genotypen	Stämme
C (= 13)	11000101001010100010110100111001000010	AT64
		AT65
		AT66
		AT67
		AT68
		AT69
		AT70
		AT72
		AT73
		AT74
		AT75
		AT76
		AT77
D (= 13)	10000101001010000010100001000011000010	Be131
		Be137
		Be138
		Be139
		Be141
		Be151
		Be155
		Mü272
		Mü283
		Mü284
		Mü286
		Mü289
		Mü296
E (= 8)	10000101001010001010110100000011000010	Mü280
		Mü281
		Mü282
		Mü285
		Mü290
		Mü293
		Mü294
		Mü295
F (= 7)	10000101001010001010100001000011000010	Mü297
		Mü298
		Mü299
		Mü303
		Mü304
		Mü305
		Mü308

66

Gruppen (Anzahl)	Genotypen	Stämme
G (= 7)	11000101001010101010110100000011000010	Be119
		Be126
		Be133
		Be134
		Be140
		Be142
		Mü306
H (= 5)	10000101001010001010100001000001000010	Be116
		Be117
		Be118
		Be124
		Be136
I (= 5)	11000100101010000010100100100011000010	PO354
		PO362
		PO391
		PO394
		PO396
K (= 4)	10000011001010001010100100011011000010	Be156
		Be157
		Be158
		Mü265
L (= 4)	11000100101010000010100000100011000010	PO390
		PO392
		PO398
		PO404
M (= 4)	11000100101010100010101000100111000010	AT94
		AT95
		AT96
		AT97
N (= 4)	11000100101110000010110100110001000010	AT100
		AT91
		AT93
		AT99
O (= 3)	10000101001010000010100001000001000010	Mü263
		Mü268
		Mü270
P (= 3)	10000101001010000010100100000011000010	Be153
		Be154
		Mü266
Q (= 3)	10000101001010101010110100010011000010	Be143
		Be144
		Be150
R (= 3)	11000100001010000010100000100011000010	PO355
		PO358
		PO361

67

Gruppen (Anzahl)	Genotypen	Stämme
S (= 3)	11000101001010000010100000100011000010	PO352
		PO356
		PO366

Sieht man von den Übereinstimmungen zwischen den atypischen Isolaten aus Angola und Madagaskar und zwischen den Isolaten aus Berlin und München ab, wurden zwischen den unterschiedlichen Populationen zwar einige ähnliche jedoch keine völlig übereinstimmenden Genotypen beobachtet. Eine Ausnahme bildete lediglich der portugiesische Stamm PO 357, der den bei den typischen angolanischen Stämmen häufigen Genotyp A aufwies. Es ist jedoch nicht auszuschließen, daß dieses Isolat von einer in Portugal lebenden afrikanischen Frau stammt.

Die Beziehungen zwischen den Fingerprint-Genotypen, die bei den Stämmen der 6 Populationen gefunden wurden, wurden mittels UPGMA-Distanz-Methode untersucht. In dem resultierenden Dendrogramm ( Abbildung 18 ) sind die meisten Stämme der unterschiedlichen geographischen Populationen in einem großen Cluster zu finden, welches allerdings in die zwei Komplexe I und II unterteilt ist. Die meisten Stämme aus Berlin und München befinden sich im Komplex I, lediglich 7 Stämme aus Portugal und 16 Stämme aus Afrika ließen sich dieser Gruppierung zuordnen. Interessanterweise gehören zu Komplex II die übrigen afrikanischen Stämme mit normalem Biotyp (AT) und fast alle portugiesischen Stämme (PO). Alle atypischen Stämme aus Afrika bilden den gut separierten Komplex III. 5 Stämme aus Deutschland, deren Fingerprints deutlich von denen der meisten anderen Stämme abwichen, sind im Komplex IV zu finden. Generell sind die dargestellten Beziehungen zwischen den Isolaten mit Bootstrap-Werten meist unter 50%, statistisch allerdings nicht gut unterstützt.

68

Abbildung 18: Phylogenetische Beziehungen zwischen C. albicans-Stämmen unterschiedlicher geographischer Herkunft ermittelt mit der UPGMA-Distanz-Methode. Die statistische Relevanz der Gruppierungen wurde durch eine Bootstrap-Analyse geprüft. Nur Boostrap-Werte höher als 50% sind in dem Dendrogramm angezeigt.

69

3.4. Vergleichende Untersuchung von Candida-Stämmen isoliert von Patientinnen mit Vaginalcandidose und ihren Partnern

3.4.1. Phänotypische Charakterisierung mit den in der Routinediagnostik angewendeten konventionellen Methoden

In der vorliegenden Arbeit wurden Vaginal-, Mund- und Stuhlisolate von 21 Patientinnen gynäkologischer Sprechstunden in Frankfurt/Oder sowie Isolate ihrer Partner aus Sperma, Mundhöhle und Stuhl mit den üblichen konventionellen Methoden und mit dem PCR-Fingerprinting charakterisiert. Die Ergebnisse der phänotypischen Identifizierung sind in Tabelle 22 dargestellt.

Tabelle 22: Ergebnisse nach Biotypisierung mit konventionellen Methoden

Befund bei Patientinnen						Partner
Ref.	Vagina	Mund	Stuhl	Klinik	Vaginal-Hefen	Sperma	Mund	Stuhl
1/1	X	X	X	Vaginitis	C.alb	X		X
1/2	XX		XX	Vaginitis	C.alb	neg		X
1/3	X	X	X	Vaginitis	C.alb	neg		neg
1/4	X X			o. A.	C.alb	X		X
1/5	X X			Vaginitis	C.alb	X		X X
1/8	X		X	Vaginitis	C.alb	neg		X
7/1	X		X	Vaginitis	C.alb	neg		neg
8/1	neg		X	Vaginitis		X		neg
8/2	X			Vaginitis	C.glab	X		neg
9/1-4	X	X	X	asympt	C.alb	neg		X
9/5-8	XXX			Vaginitis	C.alb	neg	X	X
9/6	neg	X		asympt			X
9/7	XX			o. A.	C.alb		X	X
9/11	neg		X	o. A.		neg		X
9/13	X		X	Vaginitis	C.alb	X
9/15	X	XX		Vaginitis	C.alb	neg	neg	neg
9/17	X	X		Vaginitis	C.alb	neg	X
9/18	X			asympt	C.alb			X
9/20	X	X		o. A.	C.alb		X
9/21	X	X	X	asympt	C.alb	X		X
10/1	X		X	asympt	C.alb	neg	---	neg

Ref.: Patientinen-Bezeichnung; C.alb: Candida albicans; C.glab: C. glabrata; o.A.: ohne klinische Angaben; asympt: klinisch asymptomatisch; X, XX, XXX: 1 bzw. 2 bzw. 3 Isolate.

70

3.4.2. Genetische Charakterisierung mit dem PCR-Fingerprinting

Mit der phänotypischen Differenzierung konnte nur eine Identifizierung der Candida-Isolate auf Speziesebene erreicht werden. Für die Identifizierung identischer oder ähnlicher Isolate aus unterschiedlichen Körperregionen bzw. von den Frauen und ihren Partnern wurde wieder das PCR-Fingerprinting mit Primer T3B eingesetzt. Die erhaltenen PCR-Profile sind in den Abbildungen 19 bis 24 zu sehen.

Bei Patientin 1/1 stimmten die Vaginal- und Stuhlisolate mit denen aus Sperma und Stuhl ihres Partners ( Abbildung 19 , Bahnen 2 bis 6) überein. Die Vaginalisolate von Patientin 1/4 (Bahnen 9 und 10) und das Isolat aus dem Sperma ihres Partners (Bahn 7) waren identisch, während das Stuhlisolat des Partners unterschiedlich war (Bahn 8). Bei wiederholte Episoden wurden bei dieser Frau identische Vaginalisolate nachgewiesen (Bahnen 9 und 10). Bei der Patientin 1/5 (Bahnen 12 bis 16) wurden gleiche Fingerprint-Muster für die beiden Vaginalisolate und das Isolat aus Sperma gefunden. Die 2 Stuhlisolate des Partners waren untereinander unterschiedlich, eines davon war eine non-C. albicans-Spezies (Bahn 16). Bei der Patientin 8/1 (Bahnen 17 und 18) wurde trotz klinischer Vaginitis nur im Stuhl C. albicans nachgewiesen.

71

Abbildung 19: PCR-Fingerprint-Muster der Candida-Isolate von 4 gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B

Bahnen / Isolate Nr.
1, 11 und 22: 1 kb-Molekulargewichtsmarker
2: 1/1 V	13: 1/5 V2
3: 1/1 D	14: 1/5 Sp.3
4: 1/1 M	15: 1/5 St.P.4
5: 1/1 Sp.	16: 1/5 St.P.5
6: 1/1 St.P.	17: 8/1 D
7: 1/4 Sp	18: 8/1 Sp
8: 1/4 St.P.	19: C. albicans Referenzstamm CBS 562
9: 1/4 V1	20: C. albicans Referenzstamm CBS 5983
10: 1/4 V2	21: Wasserprobe
12: 1/5 V1

V: Vagina; D: Stuhl/Frau; M: Mund/Frau; Sp: Sperma; St.P: Stuhl/Partner.

72

Abbildung 20: PCR-Fingerprint-Muster der Candida-Isolate von 5 gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B

Bahnen / Isolate Nr.
1, 7 und 19: 1 kb-Molekulargewichtsmarker
2: C. glabrata Referenzstamm NCYC 350
3: 7/1 V	12: 9/11 D
4: 7/1 D	13: 9/13 V
5: 8/2 V	14: 9/13 D
6: 8/2 Sp	15: 9/13 Sp
8: 1/3 D	16: C. albicans Referenzstamm CBS 562
9: 1/3 M	17: C. albicans Referenzstamm CBS 5983
10: 1/3 V	18: Wasserprobe 9/13 Sp
11: 9/11 St.P

V: Vagina; D: Stuhl/Frau; M: Mund/Frau; Sp: Sperma; St.P: Stuhl/Partner.

Die Patientin 7/1 (Bahnen 3 und 4) hatte identische Vaginal- und Stuhlisolate, während beim Partner ein negativer Befund erhoben wurde. Bei der Patientin 8/2 wurden die Vaginal- und Spermaisolate als C. glabrata bestätigt, wobei beide ein sehr ähnliches Fingerprint-Muster aufwiesen (Bahnen 5 und 6). Bei der Patientin 1/3 zeigten die Vaginal- und Stuhlisolate identische Fingerprints, während das Isolat aus der Mundhöhle unterschiedlich war. Identische Stuhlisolate bei Frau und Partner wurden im Falle der Patientin 9/11 (Bahnen 14, 15) und gleiche Isolate aus der Vagina, dem Stuhl der Patientin 9/13 und aus dem Sperma des Partners (Bahnen 14 bis 18) nachgewiesen.

73

Abbildung 21: PCR-Fingerprint-Muster der Candida-Isolate von 4 gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B

Bahnen / Isolate Nr.
1, 11 und 22: 1 kb-Molekulargewichtsmarker
2: 9/1 M	13: 9/5 V1
3: 9/1 V	14: 9/5 St.P
4: 9/1 D	15: 9/6 V2 (=9/5)
5: 9/1 St.P	16: 9/8 V3 (=9/5)
6: 9/4 V (=9/1)	17: 9/6 M
7: 9/7 V1	18: 9/6 M.P
8: 9/7 St.P	19: C. albicans Referenzstamm CBS 562
9: 9/7 M.P	20: C. albicans Referenzstamm CBS 5983
10: 9/7 V2	21: Wasserprobe
12: 9/5 MP

V: Vagina; D: Stuhl/Frau; M: Mund/Frau; Sp: Sperma; St.P: Stuhl/Partner; M.P: Mund/Partner.

Bei Patientin 9/1 (Bahnen 2 bis 6) zeigten alle Isolate unterschiedliche Fingerprints. Bei einer späteren Probenentnahme aus der Vagina (Bahn 6) wurde eine non-C. albicans-Spezies nachgewiesen, obwohl dieses Isolat mit konventionellen Methoden als C. albicans identifiziert wurde. Bei Patientin 9/7 waren die Fingerprints der beiden Vaginalisolate (Bahnen 7 und 10) sehr ähnlich. Die Partnerisolate (Bahnen 8 und 9) unterschieden sich sowohl untereinander als auch von denen der Frau.

Zwei zu verschiedenen Zeitpunkten bei Patientin 9/5 isolierte Vaginalisolate (Bahnen 13 und 16) hatten identische PCR-Profile. Ein drittes Isolat (Bahn 15) hatte einen sehr ähnlichen Fingerprint. Die Partnerisolate differierten sowohl untereinander als auch im Ver-

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Abbildung 22: PCR-Fingerprint-Muster der Candida-Isolate von 7 gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B

Bahnen / Isolate Nr.
1, 11 und 22: 1 kb-Molekulargewichtsmarker
2: 9/15 V	13: 1/8 D
3: 9/15 M1	14: 1/8 St.P
4: 9/15 M2	15: 9/19 V
5: 9/16 V	16: 9/20 V
6: 9/17 V	17: 9/20 M
7: 9/17 M	18: 9/20 M.P
8: 9/17 M.P	19: C. albicans Referenzstamm CBS 562
9: 9/18 V	20: C. albicans Referenzstamm CBS 5983
10: 9/18 St.P	21: Wasserprobe
12: 1/8 V

V: Vagina; D: Stuhl/Frau; M: Mund/Frau; Sp: Sperma; St.P: Stuhl/Partner; M.P: Mund/Partner.

Bei Patientin 9/15 wurde in der Vagina C. albicans nachgewiesen (Bahn 2). Aus der Mundhöhle wurden 2 phänotypisch unterschiedliche, genotypisch aber identische C. famata-Isolate (Bahnen 3 bis 4) nachgewiesen. Aus den 3 Proben vom Partner wurden keine Hefen isoliert. Bei den Patientinnen 9/16 und 9/19 (Bahnen 5 und 15) waren bis auf das Vaginalisolat alle Proben negativ. Eine erneute Probenentnahme konnte bisher

75

Bei der Patientin 1/2 ( Abbildung 23 Bahnen 4 bis 8) stimmten die Vaginal- und Stuhlisolate mit dem Isolat aus dem Stuhl ihres Partners überein. Bei einer späteren Untersuchung wurden aus der Vagina und dem Stuhl der Patientin unterschiedliche Isolate nachgewiesen, ohne Beziehung zu den früher isolierten Stämmen. Bei Patientin 10/1 stimmten die Isolate aus der Vagina und dem Stuhl (Bahnen 9-10) überein. Die Isolate der Patientin 9/21 hatten identische Fingerprint-Muster (Bahnen 13 bis 15) während beim Partner (Bahnen 16-17) für das Stuhlisolat ein anderer C. albicans-Genotyp und im Sperma eine non-C. albicans-Spezies (C. lusitaniae) nachgewiesen wurde.

Die Ergebnisse der Stammvergleiche mit dem PCR-Fingerprinting für die einzelnen Patientinnen sind in Tabelle 23 dargestellt.

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Abbildung 23: PCR-Fingerprint-Muster der Candida-Isolate von 3 gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B

Bahnen / Isolate Nr.
1, 12 und 18: 1 kb-Molekulargewichtsmarker
2: C. albicans Referenzstamm CBS 562
3: C. albicans Referenzstamm CBS 5983
4: 1/2 D	11: Wasserprobe
5: 1/2 St.P	13: 9/21 V
6: 1/2 V	14: 9/21 D
7: 1/2 (5702 V)	15: 9/21 M
8: 1/2 (5702 D)	16: 9/21 St.P
9: 10/1 V	17: 9/21 Sp
10: 10/1 D

V: Vagina; D: Stuhl/Frau; M: Mund/Frau; Sp: Sperma; St.P: Stuhl/Partner.

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Tabelle 23: Ergebnisse des PCR-Fingerprinting für die von gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern isolierten Candida-Stämme

Gruppen / Eigenschaft	Patienten-Nr. / Merkmale
A Identische Isolate aus verschiedenen Körperregionen (8x)	1/1 Vagina = Stuhl 1/2 Vagina = Stuhl 1/8 Vagina = Stuhl 7/1 Vagina = Stuhl 9/13 Vagina = Stuhl 9/20 Vagina = Mund 9/21 Vagina = Stuhl = Mund 10/1 Vagina = Stuhl
B Keine Identische Isolate aus verschiedenen Körperregionen (4x)	1/3 Vagina = Stuhl Mund 9/1 Vagina1 2 Stuhl Mund 9/15 Vagina Mund 9/17 Vagina Mund
C Identische Fingerprint-Muster bei beiden Partnern (9x)	Frau = Partner 1/1 Vaginal = Sperma/Stuhl (1x) ¼ Vaginal = Sperma (3x) 1/5 ‘’ ‘’ 8/2 ‘’ ‘’ 1/2 Vaginal = Stuhl (3x) 9/13 ‘’ ‘’ 9/18 ‘’ ‘’ 9/17 Vaginal = Mund (1x) 9/11 Stuhl = Stuhl (1x)
D Keine identische Isolate bei beiden Partnern (7x)	1/8 8/1 9/1-9/4 9/5 9/6 9/7 9/21
E Wiederholte Proben bzw. mehrfache Isolate (5x)	½ Vaginal/Stuhl unterschiedlich 9/5 Vaginal 1 & 3 identisch

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Abbildung 24: Vergleich der von den Vaginalisolaten verschiedener Patientinnen erhaltenen PCR-Fingerprint-Muster (Primer T3B)

Bahnen / Isolate Nr.
1, 17 und 21: 1 kb-Molekulargewichtsmarker
2: 1/1 V	8: 9/6 V	14: 1/4 V1
3: 1/4 V2	9: 9/8 V	15: 9/17 V
4: 1/5 V2	10: 7/1 V	16: 1/8 V
5: 9/7 V1	11: 1/2 V1	18: 9/1 V
6: 9/7 V	12: 1/3 V1	19: 10/1 V
7: 9/5 V	13: 9/18 V	20: 9/21 V
+: klinische Vaginitis; -: asymptomatisch; 0: ohne klinische Daten

Durch einen Vergleich der 18 Vaginalisolate von 15 Frauen (von 3 Frauen wurden jeweils 2 Stämme in die Analyse einbezogen) wollten wir überprüfen, ob es einen Zusammenhang zwischen den Besiedlungsstämmen bei nicht klinisch erkrankten Frauen und den Infektionsstämmen von klinisch erkrankten Frauen gibt ( Abbildung 24 ). Von den 18 Isolaten stammten 9 von Frauen, die klinisch an einer Vaginitis erkrankt waren (+), und 4 von Frauen ohne Beschwerden (0). Zu den verbleibenden 5 Frauen
(-) konnten wir keine Angaben erhalten. Obwohl für 11 der Isolate sehr ähnliche bis identische Fingerprint-Muster nachgewiesen wurden (Bahnen 1-5 und 7-13), ließ sich keine Korrelation zwischen bestimmten Genotypen und der unterschiedlichen klinischen Symptomatik feststellen.

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