de Andrade , Manuel Vieira Dias Pinto : ”Identifizierung von Candida-Spezies und -Stämmen durch den Nachweis von polymorphen DNA-Regionen in der PCR”

41

Kapitel 3. ERGEBNISSE

3.1. Methoden zur konventionellen Identifizierung der Candida-Isolate

Für die Identifizierung der Candida-Isolate wurden folgende konventionelle Techniken getestet:

Der Differentialnährboden ALBICANS ID-Agar® enthält ein chromogenes Substrat, welches durch das für C. albicans und die eng verwandten Spezies C. stellatoidea und C. dubliniensis spezifische Enzym Hexosaminidase gespalten wird. Kolonien dieser Spezies erscheinen deshalb auf Differentialnährboden blau- bis hellgrün gefärbt, während alle anderen Kolonien weiß bzw. andersfarbig aussehen. Mit dieser Methode können daher C. albicans-Isolate einfach und sicher von anderen Candida-Arten, mit Ausnahme von C. dubliniensis, unterschieden werden ( Abbildung 2 ).

Abbildung 2: Candida albicans und non-albicans Arten auf dem Nährboden ALBICANS ID-Agar®


42

Bei einem Wachstum von Candida auf Reisagar wird ein halbanaerobes Milieu erzeugt, wodurch es zur Bildung von Hyphen und Chlamydosporen kommt ( Abbildung 3 und Abbildung 4 ).

Abbildung 3: Mit Candida Arten beimpfte Reisagar-Platte

Alle auf dem Differentialnährboden ALBICANS ID-Agar® gewachsenen Kolonien wurden nach 2 bis maximal 10tägiger Bebrütung auf Reisextrakt-Agar mikroskopisch untersucht. Bei den meisten der blaugrün gefärbten C. albicans wurden die erwarteten Pseudohyphen gefunden. Bei einigen dieser blaugrünen Kolonien konnten jedoch auch nach 10-tägiger Bebrütung keine Chlamydosporen beobachtet werden.

Abbildung 4: Auf Reisagar angezüchtet C. albicans mit Hyphen (H) und Chlamydosporen (C).


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Mit dem Api-System ID-32 C konnten die meisten C. albicans als Biotyp 1 mit dem Profil 7340 3400 (ausgezeichnete Identifizierung) identifiziert werden. Biotyp 2 (C. stellatoidea) mit dem Profil 3142 3000 (ausgezeichnete Identifizierung) wurde für 9 C. albicans-Isolate erhalten. Bei der Identifizierung von 32 C. albicans-Stämmen (s. Tabellen 17 - 19 ab 53) und von den meisten der 37 non-C. albicans-Stämmen (s. Tabelle 16 , Seite 45) waren die Ergebnisse mit dem Api-System allerdings problematisch, da sie sich entweder keinem oder nicht ausreichend sicher einem bestimmtem Profil zuordnen ließen.

Alle Candida albicans-Stämme, die mit diesen drei Methoden (Differentialnährboden ALBICANS ID-Agar®, Mikromorphologie auf Reisagar und Api-System ID 32-C) abweichende morphologische und biochemische Eigenschaften aufwiesen und deshalb nicht klar identifizierbar waren, werden in der vorliegenden Arbeit als "atypische Stämme" bezeichnet.

Das Identifizierungssystem Api-Zym hat in unseren Studien wenig zufriedenstellende Ergebnisse gezeigt. Dieses System erlaubt den schnellen semiquantitativen Nachweis von 19 Enzymaktivitäten in sehr geringen Probenmengen. Die Technik eignet sich für alle Untersuchungsmaterialien wie z.B. Gewebe, Zellen, biologische Flüssigkeiten, Mikroorganismen, Spülfüssigkeiten, Bodenproben, Öl u.a. und ist mit einer Inkubationszeit von 4 Stunden schnell durchführbar. Dieses System erreicht nicht die Präzision spektrometrischer und elektrophoretischer Messmethoden, wird aber verwendet, um Untersuchungsmaterialien auf Enzymaktivitäten zu prüfen, die dann bei Bedarf mit genaueren Methoden exakt bestimmt werden können. Im Vergleich zum Api-zym-Test wurden mit dem Api ID 32 C deutlich mehr Stämme erfaßt. Außerdem ist das Api-Zym-System lediglich ein Enzymnachweis und nicht primär eine Methode zur Speziesidentifizierung. Es ist nicht auszuschließen, daß gleiche Enzymkonstellationen bei unterschiedlichen Organismen vorhanden sein können. Aus diesen Gründen und aus Kostengründen haben wir uns für das Api ID 32 C-System für die biochemische Charakterisierung der Candida-Isolate entschieden.


44

3.2. Konventionelle und molekularbiologische Identifizierung schwer differenzierbarer Candida-Stämme

3.2.1. Differenzierung von C. guilliermondii und C. famata

3.2.1.1. Ergebnisse konventioneller Identifizierungsmethoden

In der vorliegenden Arbeit wurden konventionelle und molekularbiologische Verfahren für die Differenzierung von insgesamt 37 C guilliermondii/ C.famata-Isolaten, die von Patienten der Dermatologischen Klinik und Poliklinik der Charité stammten, eingesetzt. Andere Probenmaterialien außer Hautproben standen nicht zur Verfügung. Die konventionelle Diagnostik erfolgte mittels Biochemotypie mit dem Api-System ID-32 C und durch den Nachweis der Pseudomyzelbildung auf Reisagar. Nur für 2 Stämme konnte jedoch die Ausbildung von Pseudomyzelien eindeutig nachgewiesen werden.

Die API-Profile der in dieser Studie getesteten als C.guilliermondii/ C.famata-Isolate sind in Tabelle 16 dargestellt. Für die unter 1-4 erfaßten Isolate wurde aufgrund einer fraglichen Pseudomyzelbildung sowie aufgrund klinischer Angaben die Verdachtsdiagnose C. guilliermondii gestellt. Die beiden Stämme, die eindeutig Pseudomyzelien ausbildeten, sind unter Punkt 5 aufgelistet. Wegen fehlender klinischer Symptome und fehlender Pseudomyzelbildung wurde vermutet, daß es sich bei den übrigen Isolaten (6-13) um C. famata handelt.

Mit dem API-System konnten nur die 23, unter 4 und 5 aufgelisteten, Isolate mit der Profilnummer 5577 3521 als C. guilliermondii identifiziert werden. Für den unter (1) beschriebenen Stamm konnte keine Differenzierung zwischen C. guilliermondii und C. famata erreicht werden, während die Stämme unter den Punkten (3) sowie (6-8) aufgrund ihres API-Profils eher der Spezies C. famata zugeordnet werden müßten. Für die übrigen Stämme war eine Identifizierung mit dem API-System überhaupt nicht möglich.


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Tabelle 16: Zusammenfassung der Ergebnisse konventioneller und molekularbiologischer Methoden für die Identifizierung fraglicher C.guilliermondii/ C.famata- Isolate

Anzahl der

Pseu-dohy-

Identifizierung mit Api 32C (V. 1)

Molekulare

Diagnostik

Reihe

Stämme

ph

Profil

Ergebnisse aus Datenbank

 

 

1

nein

5177 3521

C. famata %id= 58

C. guilliermondii %id= 40

Gute Identifizierung auf Genus Ebene

C. guilliermondii

1

1

nein

5577 1501

nicht vorhanden

C. guilliermondii

2

4

nein

5577 3501

C. famata %id= 81

C. guilliermondii %id= 19

Ausgezeichnete Identifizierung auf Genus Ebene

C. guilliermondii

3

21

nein

5577 3521

C. guilliermondii %id= 88

C. famata %id= 12

Ausgezeichnete Identifizierung auf Genus Ebene

C. guilliermondii

4

2

ja

5577 3521

C. guilliermondii %id= 88

C. famata %id= 12

Ausgezeichnete Identifizierung auf Genus Ebene

C. guilliermondii

5

1

nein

5577 3561

C. famata %id= 93,8

Gute Identifizierung

C. guilliermondii

6

1

nein

7577 3543

C. famata %id= 99,3

Sehr gute Identifizierung

C. guilliermondii

7

1

nein

5577 3553

C. famata %id= 97,4

Gute Identifizierung

C. famata

8

1

nein

5777 1503

nicht vorhanden

C. famata

9

1

nein

5777 3551

nicht vorhanden

C. famata

10

1

nein

5177 1743

nicht vorhanden

non-famata / non-guilliermondii

11

1

nein

5567 3501

nicht vorhanden

non-famata / non-guilliermondii

12

1

nein

5777 1703

nicht vorhanden

Non-famata / non-guilliermondii

13

Bei der Biochemotypie wurden somit sowohl Stämme, deren Profile nicht erfaßt sind, als auch Profile, die von einer schlechten bis zu einer sehr guten Identifizierung reichen, innerhalb dieser beiden Candida-Arten gefunden.


46

3.2.1.2. Ergebnisse molekularbiologischer Identifizierungsmethoden

3.2.1.2.1. PCR-Fingerprinting

Unsere Arbeitsgruppe konnte in früheren Untersuchungen zeigen ( Thanos et al. 1996 ), daß bei Amplifizierung der genomischen DNA unterschiedlicher Candida-Arten mit einzelnen unspezifischen Primern speziesspezifische Amplifikationsprodukte erhalten werden. Durch den Vergleich der PCR-Fingerprints klinischer Isolate mit denen entsprechender Referenzstämme war es möglich, Candida-Spezies korrekt zu identifizieren. Da die C.guilliermondii- und C.famata-Referenzstämme mit dieser Fingerprint-Technik gut diskriminiert werden konnten, haben wir diese Methode in unserer Studie für die Differenzierung der C.guilliermondii/ C famata-Stämme eingesetzt. Wir haben dafür zunächst die Primer T3B und M13 Core-Sequenz verwendet, die beide stets übereinstimmende Ergebnisse lieferten. Bei späteren Versuchen wurde dann nur noch Primer T3B eingesetzt, da die mit ihm erhaltenen Profile eindeutiger und leichter auswertbar waren.

Wie in Abbildung 5 zu sehen ist, wurden für C. guilliermondii vs. C. famata deutlich unterschiedliche PCR-Fingerprints mit dem Primer T3B beobachtet, die eine klare Zuordnung der klinischen Isolate (Bahnen 8, 10, 14-16, 18-21: C. guilliermondii; Bahnen 5, 6, 9: C. famata) gestatteten. Einige PCR-Profile entsprachen jedoch weder denen von C. guilliermondii noch denen für C. famata. Derartige Isolate wurden als non-famata / non-guilliermondii Isolate bezeichnet (Bahnen 4, 7, 17). Eine Identifizierung war auch nach Vergleich mit den PCR-Profilen der 26 bisher untersuchten Candida-Spezies ( Thanos et al. 1996 ) nicht möglich.


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Abbildung 5: PCR-Fingerprint-Muster ausgewählter C.famata/ C.guilliermondii-Isolate erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B.

Bahnen 1, 11 und 22: 1 kb-Molekulargewichtsmarker

Bahnen 2-3: Referenzstämme von C. famata (CBS 1795)

Bahn 4: non-famata / non-guilliermondii

Bahn 5: C. famata

Bahn 6: C. famata

Bahn 7: non-famata / non-guilliermondii

Bahn 8: C. guilliermondii

Bahn 9: C. famata

Bahn 10: C. guilliermondii

Bahnen 12-13: Referenzstämme von C. guilliermondii ATCC 6260

Bahn 14: C. guilliermondii

Bahn 15: C. guilliermondii

Bahn 16: C. guilliermondii

Bahn 17: non-famata / non-guilliermondii

Bahn 18: C. guilliermondii

Bahn 19: C. guilliermondii

Bahn 20: C. guilliermondii

Bahn 21: C. guilliermondii

3.2.1.2.2. Restriktionsanalyse der amplifizierten ITS-Region

Die ”internal transcribed spacer“ im ribosomalen Operon sind hypervariable DNA-Regionen, die bei vielen Mikroorganismen für die Identifizierung auf Speziesebene genutzt werden. Diese nichtkodierenden Sequenzen ( Abbildung 6 ) liegen zwischen den Genen für die ”small subunit“ (ssu) rRNA und für die 5.8S rRNA einerseits (ITS1) und zwischen den Genen für die 5.8S rRNA und die ”large subunit“ (lsu)“ rRNA andererseits


48

(ITS 2). Bei Candida albicans sind die ribosomalen Gene, einschließlich der ITS-Regionen, in 50-100 Kopien, tandemförmig wiederholt, auf dem R-Chromosom lokalisiert. Die ITS-Regionen unterschiedlicher Candida-Spezies unterscheiden sich sowohl in ihrer Länge als auch in ihrer Nukleotidzusammensetzung ( Nho et al. 1997 , Willliams et al. 1995 , Lott et al. 1993 ). Nach Amplifizierung der beiden Spacer einschließlich des 5.8S rRNA-Gens und nach Verdauung des PCR-Produkts mit verschiedenen Restriktionsenzymen konnten Williams und Mitarbeiter (1995) 8 Candida-Spezies, darunter C. albicans und C. guilliermondii, klar differenzieren. Nho et al. (1997) verwendeten das gleiche Verfahren für die Diskriminierung von C. krusei, C. inconspicua und C. norvegensis.

Abbildung 6: Schematische Darstellung der Gesamt-ITS-Region mit der Lokalisation der in der PCR verwendeten Primer.

Wir haben die ITS-Regionen der C. guilliermondii / C. famata-Isolate mit den von Vilgalys et al. und von White et al. (1990) entwickelten pilzspezifischen Primern LR1 und SR6R amplifiziert ( Abbildung 7 ). Die PCR-Produkte unterschieden sich mit 640 bp für C. guilliermondii und 670 bp für C. famata nur gering in ihrer Größe. Nach Spaltung der Amplifikate mit den Restriktionsenzymen Hae III und Dde I konnten jedoch die beiden Spezies gut unterschieden werden ( Abbildung 8 ). Dabei konnte der Stamm in Bahn 3a und 3b, der auf Grund fehlender Pseudohyphenbildung konventionell als C. famata bestimmt worden war, eindeutig als C. guilliermondii identifiziert werden.


49

Abbildung 7: Amplifizierung der ITS-Regionen von C. guilliermondii /C. famata mit den Primern SR6R und LR1

Bahn 1: 123 bp DNA-Leiter (Molekulargewichtsmarker)

Bahn 2 und 3: Referenzstämme von C. famata CBS 1795

Bahn 4 und 5: Referenzstämme von C. guilliermondii ATCC 6260

Bahn 6 bis 22: klinische Isolate von C. guilliermondii /C. famata

Abbildung 8: Spaltung der amplifizierten ITS-Regionen von C. famata und C. guilliermondii mit den Restriktionsendonukleasen Hae III (a) und Dde I (b).

Bahn 1a, 2a und 1b, 2b: Referenzstämme von C. famata CBS 1795

Bahn 3a und 3b: C. famata (C. guilliermondii bestätigt)

Bahn 4a, 5a und 4b, 5b: Referenzstämme von C. guilliermondii (ATCC 6260)

Bahn 6a und b: C. guilliermondii (klinisches Isolat)

Bahn M: 123 bp DNA-Leiter (Molekulargewichtsmarker)

Bahn X: ungespaltener Spacer

3.2.1.2.3. Vergleich der Ergebnisse konventioneller phänotypischer und molekularbiologischer Methoden für die Identifizierung von C. guilliermondii und C. famata

Im folgenden soll anhand eines klinischen Beispiels die Differenzierung von C. guilliermondii und C. famata im Detail beschrieben werden:


50

Bei der Patientin S.C., 45 Jahre, mit der klinischen Diagnose therapierefraktäre chronisch rezidivierende Onychomykose ( Abbildung 9 ), wurden von den Fingernägeln Hefen isoliert, die auf Reisagar keine Pseudomyzelien bildeten ( Abbildung 10 ). Mit dem API-System ID 32-C wurde das Profil 5577 1503 bestimmt, welches in der Datenbank eine gute Identifizierung (%id =98,5) als C. famata ergab.

Abbildung 9: Chronisch rezidivierende Onychomykose bei der Patientin S.C.

Abbildung 10: Stamm der Patientin S.C. ohne Pseudomyzelbildung auf Reisagar

Die molekularbiologische Diagnostik mit dem PCR-Fingerprinting ( Abbildung 11 ) sowie auch die Restriktionsanalyse der amplifizierten ITS-Regionen ( Abbildung 12 ) ergaben als Speziesdiagnose jedoch C. guilliermondii.


51

Abbildung 11: PCR-Fingerprint-Muster ausgewählter C.famata/ C.guilliermondii-Isolate erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B.

G: C. guilliermondii-Referenzstämme ATCC 6260; g: klinische Isolate von C. guilliermondii; F: Referenzstämme von C. famata CBS 1795; f: klinisches Isolat von C. famata; n: non-guilliermondii / non-famata -Isolate; *: Isolat der Patientin S.C.

Abbildung 12: Spaltung der amplifizierten ITS-Regionen von C. famata und C. guilliermondii mit der Restriktionsendonuklease Hae III.

*: Patienten-Isolat


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C. famata sind nicht als Erreger von Dermatomykosen beschrieben, sondern werden lediglich als Kontaminanten angesehen. Somit führte die Identifizierung dieses Patientenisolats als C. guilliermondii zur Bestätigung der Erkrankung als therapiepflichtige Mykose. Für diesen C. guilliermondii-Stamm wurde von unserer Arbeitsgruppe (Tietz and Czaika 1999) eine Hoch-Resistenz gegenüber Fluconazol und Itraconazol festgestellt. Da für die systemische Therapie von Infektionen durch Hefepilze nur diese beiden Azole zur Verfügung stehen, Griseofulvin und Terbinafin sind unwirksam, war eine systemische Therapie unmöglich. In dem Fall unserer Patientin blieb so der Einsatz von Lokalantimykotika die einzige Möglichkeit.

Insgesamt haben wir die Ergebnisse der konventionellen und der molekularbiologischen Identifizierung für 37 fragliche C. guilliermondii /C. famata-Isolate verglichen ( Tabelle 16 ). Nur bei zwei dieser Isolate konnte die Diagnose C. guilliermondii aufgrund der eindeutigen Bildung von Pseudomyzelien auf Reisagar gestellt werden.

Mit dem PCR-Fingerprinting und der RFLP-Analyse der ITS-Region konnten 31 der getesteten Isolate als C. guilliermondii identifiziert werden ( Tabelle 16 : Reihe 1 bis 7). 23 dieser Stämme wurden auch mit dem API-System ID 32C sicher erkannt (Reihe 4-5), die alle das gleiche API-Profil 5577 3521 aufwiesen. Bei 5 Stämmen konnte in der Biochemotypie nicht zwischen C. guilliermondii und C. famata diskriminiert werden (Reihe 1 + 3). Weitere zwei Stämme wurden sogar mit sehr guter bzw. guter Identifizierung als C. famata diagnostiziert (Reihe 6-7), während das API-Profil eines C. guilliermondii-Stamms überhaupt keine Aussagen gestattete (Reihe 2).

Drei der 37 untersuchten Isolate erwiesen sich nach Durchführung des PCR-Fingerprinting und der RFLP-Analyse der ITS-Region als C. famata (Reihe 8-10), nur einer dieser Stämme wurde auch in der Biochemotypie erkannt (Reihe 8). Für zwei C. famata-Isolate konnte im API-System keine Spezieszugehörigkeit ermittelt werden (Reihe 9-10). Drei non-guilliermondii / non-famata-Isolate, deren API-Profile in der API-Datenbank nicht vorhanden waren und die auch mit den molekularen Techniken nicht identifiziert werden konnten, müssen noch zugeordnet werden (Reihe 11-13).


53

3.2.2. Identifizierung von Candida albicans-Stämmen mit atypischen morphologischen und biochemischen Eigenschaften

3.2.2.1. Ergebnisse konventioneller Identifizierungsmethoden

In dieser Arbeit wurden die Ergebnisse konventioneller und molekularbiologischer Identifizierungsmethoden auch für Candida-Isolate mit atypischen morphologischen und biochemischen Eigenschaften verglichen. 9 klinische Candida-Stämme aus Deutschland wiesen untypische Profile im API-System ID 32 C auf, wie in Tabelle 17 angegeben. Die untypischen API-Profile waren durch die fehlende Assimilation von 2-Ketogluconat (2KG) und Xylose (XYL) bedingt. Laut Angaben des Herstellers sind 100%- bzw. 98% aller Candida albicans-Stämme in der Lage, diese beiden Substrate zu verwerten. Sowohl die Xylose-negativen als auch die 2KG-negativen Stämme waren in den übrigen phänotypische Merkmalen unauffällig im Vergleich zu ”normalen“ C. albicans-Populationen.

Tabelle 17: Atypische Candida-Isolate aus Deutschland

Erreger

ID-32 C

Anzahl

Profil

(bioMerieux Datenbank V.1)

2KG negative-Stämme

7345 3400

4

nicht vorhanden

XYL negative-Stämme

7347 1400

5

C. albicans %id= 99,9

Sehr gute Identifizierung

Aus Afrika stammen die in der Tabelle 18 und Tabelle 19 aufgelisteten atypischen Candida-Isolate, bei denen folgende API-Profile gefunden wurden, wobei das Profil 7046 3400 dominierte.


54

Tabelle 18: Atypische Candida-Isolate aus Angola

Stamm-Nr.

(bioMerieux Datenbank V.1)

 

ID-32 C

Profil

AA 1634

7040 3400

nicht vorhanden

AA 1587

7042 3400

Candida sake %id= 99,2

Gute Identifizierung

AA 1605

7046 3400

nicht vorhanden

AA 1622g

7046 3400

nicht vorhanden

AA 1078

7046 3400

nicht vorhanden

AA 579

7046 3400

nicht vorhanden

AA 759

7046 3400

nicht vorhanden

AA 1598

7047 3400

nicht vorhanden

AA 1618

7047 3400

nicht vorhanden


55

Tabelle 19: Atypische Candida-Isolate aus Madagaskar

Stamm-Nr.

(bioMerieux Datenbank V.1)

 

ID-32 C

Profil

MA 1649

3142 3000

C. stellatoidea %id= 99,7

Ausgezeichnete Identifizierung

MA 2

7045 3400

nicht vorhanden

MA 11

7046 3400

nicht vorhanden

MA 82

7046 3400

nicht vorhanden

MA 268

7046 3400

nicht vorhanden

MA 335

7046 3400

nicht vorhanden

MA 1653

7046 3400

nicht vorhanden

MA 1654

7046 3400

nicht vorhanden

MA 1655

7046 3400

nicht vorhanden

MA 1660

7046 3400

nicht vorhanden

MA 1669

7046 3400

nicht vorhanden

MA 8621

7046 3400

nicht vorhanden

MA 8627

7046 3400

nicht vorhanden

MA 8640

7046 3400

nicht vorhanden

Alle afrikanischen Stämme waren ausnahmslos durch ein verlangsamtes Wachstum in Vergleich zu den anderen Stämmen gekennzeichnet, waren positiv im Keimschlauchtest in humanem Serum, wuchsen als blaugrüne Kolonien auf ALBICANS ID-Agar ( Abbildung 2, Seite 41 ) und bildeten Pseudohyphen ( Abbildung 13 B). Sie waren jedoch unfähig, die für C. albicans typischen Chlamydosporen ( Abbildung 13 A) auf Reisagar auszuprägen und die Aminozucker Glukosamin und N-Acetylglukosamin zu assimilieren ( Abbildung 14 ).


56

Abbildung 13: C. albicans-Stämme auf Reisagar, (A) mit und (B) ohne Chlamydosporenbildung.


57

Abbildung 14: ID-32C-Profil von typischen C. albicans des Biotyps 1 (A) und von atypischen NAG-negativ Stämmen (B).


58

3.2.2.2. Ergebnisse des PCR-Fingerprintings

Die Spezieszugehörigkeit aller atypischen Candida-Isolate wurde mit dem PCR-Fingerprinting (Primer T3B) überprüft. In früheren Studien ( Thanos et al. 1996 , Schönian et al. 1993a -b ) konnte gezeigt werden, daß diese PCR-Fingerprints speziesspezifisch waren, wobei bei unterschiedlichen Candida-Arten nur 10-50% der amplifizierten Fragmente übereinstimmten. Stämme der gleichen Spezies wiesen jedoch im Rahmen des artspezifischen Musters auch stammspezifische Unterschiede auf. Die mit Primer T3B erhaltenen PCR-Fingerprints unterschiedlicher C. albicans-Stämme waren nur zu ca. 88-95% identisch. Die PCR-Profile von C. albicans waren stets sehr charakteristisch und wiesen immer eine prominente Bande bei ca. 1160 bp auf, die bei keiner anderen getesteten Candida-Spezies gefunden wurde. Die meisten Unterschiede bei den C. albicans-Stämmen wurden in den T3B-Profilen im Molekulargewichtsbereich zwischen 800 und 500 bp beobachtet. In diesem Bereich unterschieden sich z.B. auch die beiden C. albicans-Referenzstämme CBS 562 und CBS 5983 ( Abbildung 15 ).

Abbildung 15 PCR-Fingerprint-Muster 2KG- und XYL-negativer Candida-Isolate aus Deutschland erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B

Bahnen 1, und 13: 1 kB-Leiter; Bahn 2: klinisches C. dubliniensis-Isolat; Bahnen 3-5: 2KG-negative Candida-Stämme; Bahnen 6-10: XYL-negative Candida-Stämme; Bahnen 11-12: C. albicans-Referenzstämme CBS 562 und CBS 5983.


59

Die atypischen Stämme aus Deutschland erwiesen sich eindeutig als C. albicans-Stämme ohne klare Unterschiede zu den als "normal" bezeichneten Isolaten ( Abbildung 15 ). Zwei der XYL-negativen Stämme zeigten Unterschiede zu den anderen C.albicans-Isolaten im variablen Bereich des PCR-Profils. Lediglich das PCR-Profil des Isolats in Bahn 2 wich von dem für C. albicans typischen Amplifikationsmuster ab. Dieser PCR-Fingerprint entsprach dem von C. dubliniensis , einer kürzlich beschriebenen neuen Candida-Art (Schönian, pers. Mitteilung).

Die afrikanischen atypischen Stämmen wurden in dem PCR-Fingerprinting ebenfalls als C. albicans identifiziert ( Abbildung 16 ) obwohl sie die für C. albicans charakteristischen Merkmale wie die Bildung von Chlamydosporen und die Verwertung der Aminozucker N-Acetylglukosamin und Glukosamin nicht ausprägten. Die Stämme hatten sehr ähnliche PCR-Muster, während bei den ”typischen“ Candida albicans-Stämmen eine größere Heterogenität in ihren PCR-Profilen beobachtet wurde ( Tietz et al. 1995 ).

Abbildung 16: PCR-Fingerprint-Muster atypischer Candida-Isolate aus Afrika erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B.

Bahnen 1, 11 und 22: 1 kb DNA-Leiter (Molekulargewichtsmarker); Bahn 2: C. sake-Referenzstamm CBS 159; Bahn 3-5, 7-10, 12-17: Candida atypisch aus Madagaskar; Bahn 18-20: Candida atypisch aus Angola; Bahn 21: C. albicans-Referenzstamm CBS 562.


60

3.3. Charakterisierung von C. albicans-Vaginalisolaten aus Afrika und Europa

3.3.1. Phänotypische Charakterisierung mit den in der Routinediagnostik angewendeten konventionellen Methoden

Bei 6 verschiedenen Candida albicans-Populationen ( Tabelle 20 ) aus Angola (2 Populationen), Madagaskar, Deutschland (2 Populationen) und Portugal wurde die Variabilität phänotypischer und genotypischer Merkmale untersucht. In diese Analyse wurden neben C. albicans-Stämmen mit normalem Biotyp (Populationen aus Deutschland, Portugal und eine Population aus Angola) auch die bereits im vorangegangene Abschnitten beschriebenen atypischen afrikanischen Stämme mit einbezogen.

Sowohl die typischen wie auch die atypischen Stämme stammten aus Routineuntersuchungen und wurden mit den üblichen konventionellen Methoden charakterisiert. Die Candida albicans-Stämme des Biotyps 1 waren phänotypisch ähnlich. Sie wurden ausnahmslos alle mit einem typischen Api 32 C Profil (7347 3400) als Candida albicans identifiziert, wiesen die blaugrüne Färbung auf ALBICANS-ID-Agar auf und bildeten Pseudohyphen und Chlamydosporen auf Reisagar. Die phänotypischen Eigenschaften der atypischen Stämme wurden bereits früher ( Seite 55 ) beschrieben.

Tabelle 20: Candida albicans-Populationen aus Afrika und Europa

Population

Bezeichnung

Anzahl

ID-32 C-Profil (V.1)

C. albicans Biotyp 1 Angola

AT

49

7347 3400

C. albicans atypisch Angola

AA

8

verschiedene

C. albicans atypisch Madagaskar

MA

14

verschiedene

C. albicans Biotyp 1 Berlin

BE

47

7347 3400

C. albicans Biotyp 1 München

45

7347 3400

C. albicans Biotyp 1 Lissabon

PO

49

7347 3400


61

3.3.2. Genetische Charakterisierung mit dem PCR-Fingerprinting

Wie bereits früher ( Seite 25 ) ausgeführt, werden beim PCR-Fingerprinting neben speziesspezifischen auch eine Reihe von stammspezifischen PCR-Produkten erhalten, die für die Charakterisierung unterschiedlicher Stämme von C. albicans genutzt werden können. Wir haben deshalb diese Methode gewählt, um den Grad der genetischen Variabilität bei den in Tabelle 20 aufgeführten typischen und atypischen C. albicans-Populationen zu überprüfen. Die mit Primer T3B erhaltenen PCR-Profile ausgewählter Stämme aus allen 6 Populationen sind in Abbildung 17 dargestellt.

Abbildung 17 PCR-Fingerprint-Muster ausgewählter C. albicans-Isolate aus Afrika, Deutschland und Portugal erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B.

Bahnen / Isolat-Nr.

1, 21 und 27: 1 kb-Molekulargewichtsmarker

2-3: AT 66, AT 78

12-13: AT 93, AT 96

4: Be 157

14: Be 120

5: Mü 267

15: AT 94

6: Be 116

16-18: Be 112, Be 127, Be 145

7-8: Mü 288, Mü 287

19: AA 60

9-10: AT 62, AT 81

20: MA 49

11: Mü 278

22-26: PO 370-374


62

Bei wiederholter Durchführung des PCR-Fingerprinting für den gleichen C. albicans-Stamm wurden stets nahezu identische Amplifikationsmuster erhalten, gelegentlich waren Unterschiede in 1-2 schwachen Banden zu beobachten. Sehr große (> 3 kb) und sehr kleine (< 250 bp) Amplifikationsprodukte variierten häufiger und wurden deshalb aus der Analyse ausgeschlossen. Leichte Schwankungen in der Intensität der amplifizierten Banden, die bei der Auswertung vernachlässigt wurden, traten gelegentlich auf. Schwache Banden wurden nur berücksichtigt, wenn sie in wiederholten Experimenten konstant gefunden wurden. Um unterschiedliche Gele vergleichen zu können, wurde auf jedes Gel ein Fingerprint des C.albicans-Referenzstamms CBS 562 mit aufgetragen.

Für jeden C. albicans-Stamm der 6 untersuchten Populationen wurde eine 38-stellige binäre Matrix (0 = Bande ist nicht vorhanden; 1 = Bande ist vorhanden) erstellt. Dafür wurden mittels scannergestützter Hard- und Software zunächst die Molekulargewichte für jede einzelne Bande bestimmt, wobei der Referenzstamm CBS 562 jeweils als Standard diente.

Für die insgesamt 212 C. albicans-Isolate aus Afrika, Deutschland und Portugal wurden 87 unterschiedliche PCR-Fingerprint-Genotypen nachgewiesen, von denen aber nur 18 bei drei bzw. mehr als drei verschiedenen C. albicans-Stämmen. 14 weitere PCR-Fingerprints waren für jeweils 2 Stämme identisch, alle übrigen Stämme hatten individuelle Genotypen.

Die typischen C. albicans-Populationen aus Europa und Afrika zeigten keine grundsätzlich verschiedenen Muster, unterschieden sich aber im Ausmaß der genetischen Variabilität innerhalb der verschiedenen Populationen.

Die 92 Isolate aus Berlin und München wiesen 40 unterschiedliche PCR-Fingerprint-Profile auf ( Tabelle 21 ), wobei in beiden Stammgruppen relativ oft übereinstimmende Genotypen (z.B. die Genotypen D, G, K, P) nachweisbar waren. Genotyp D wurde bei dieser Stammgruppe am häufigsten (13 Stämme) bestimmt. Nur 9 der 40 deutschen Fingerprint-Muster wurden bei drei und mehr Stämmen und weitere 8 Muster wurden bei jeweils zwei Stämmen gefunden. 23 C. albicans-Stämme aus diesen Populationen hatten demnach individuelle Genotypen.


63

Für die insgesamt 49 Isolate aus Portugal wurden 32 unterschiedliche PCR-Fingerprint-Muster ermittelt. 4 Genotypen waren bei mehr als zwei Stämmen identisch, wobei der häufigste Genotyp I bei 5 Stämmen auftrat, und weitere 6 Fingerprints stimmten bei jeweils 2 Stämmen überein.

Die afrikanischen C. albicans-Stämme waren durch eine geringere genetische Heterogenität gekennzeichnet. Für die 49 typischen Isolate aus Angola wurden nur 9 verschiedene PCR-Fingerprint-Muster erhalten. Dabei wurde bei 23 Stämmen der identische Genotyp A, bei 13 Stämmen Genotyp C und bei jeweils 4 Stämmen die Genotypen M und N nachgewiesen. Die verbleibenden 5 Stämme wiesen distinkte Amplifikationsmuster auf. Keine Übereinstimmungen gab es in den Fingerprint-Mustern zwischen den typischen und atypischen Isolaten aus Angola, obwohl sie von Patientinnen der gleichen Klinik stammten. Demgegenüber waren jedoch die PCR-Profile von 6 der 8 atypischen angolanischen Stämme und von 9 der 14 Stämme aus Madagaskar identisch (Genotyp B).


64

Tabelle 21: PCR-Fingerprint-Genotypen, die bei mehr als drei unterschiedlichen C. albicans-Stämmen nachgewiesen wurden (0 = Bande nicht vorhanden, 1 = Bande vorhanden).

Gruppen

(Anzahl)

Genotypen

Stämme

A (= 24)

11000101001010000010100100110011000010

AT101

 

 

AT102

 

 

AT103

 

 

AT104

 

 

AT106

 

 

AT107

 

 

AT108

 

 

AT109

 

 

AT110

 

 

AT78

 

 

AT79

 

 

AT80

 

 

AT82

 

 

AT83

 

 

AT84

 

 

AT85

 

 

AT86

 

 

AT87

 

 

AT88

 

 

AT89

 

 

AT90

 

 

AT92

 

 

AT98

 

 

PO357

B (= 15)

11000101001010101101010000010001010010

AA1587

 

 

AA1598

 

 

AA1605

 

 

AA1618

 

 

AA1626

 

 

AA1634

 

 

M11

 

 

M1653

 

 

M1654

 

 

M1655

 

 

M2

 

 

M268

 

 

M82

 

 

M8627

 

 

M8640


65

Gruppen

(Anzahl)

Genotypen

Stämme

C (= 13)

11000101001010100010110100111001000010

AT64

 

 

AT65

 

 

AT66

 

 

AT67

 

 

AT68

 

 

AT69

 

 

AT70

 

 

AT72

 

 

AT73

 

 

AT74

 

 

AT75

 

 

AT76

 

 

AT77

D (= 13)

10000101001010000010100001000011000010

Be131

 

 

Be137

 

 

Be138

 

 

Be139

 

 

Be141

 

 

Be151

 

 

Be155

 

 

Mü272

 

 

Mü283

 

 

Mü284

 

 

Mü286

 

 

Mü289

 

 

Mü296

E (= 8)

10000101001010001010110100000011000010

Mü280

 

 

Mü281

 

 

Mü282

 

 

Mü285

 

 

Mü290

 

 

Mü293

 

 

Mü294

 

 

Mü295

F (= 7)

10000101001010001010100001000011000010

Mü297

 

 

Mü298

 

 

Mü299

 

 

Mü303

 

 

Mü304

 

 

Mü305

 

 

Mü308


66

Gruppen

(Anzahl)

Genotypen

Stämme

G (= 7)

11000101001010101010110100000011000010

Be119

 

 

Be126

 

 

Be133

 

 

Be134

 

 

Be140

 

 

Be142

 

 

Mü306

H (= 5)

10000101001010001010100001000001000010

Be116

 

 

Be117

 

 

Be118

 

 

Be124

 

 

Be136

I (= 5)

11000100101010000010100100100011000010

PO354

 

 

PO362

 

 

PO391

 

 

PO394

 

 

PO396

K (= 4)

10000011001010001010100100011011000010

Be156

 

 

Be157

 

 

Be158

 

 

Mü265

L (= 4)

11000100101010000010100000100011000010

PO390

 

 

PO392

 

 

PO398

 

 

PO404

M (= 4)

11000100101010100010101000100111000010

AT94

 

 

AT95

 

 

AT96

 

 

AT97

N (= 4)

11000100101110000010110100110001000010

AT100

 

 

AT91

 

 

AT93

 

 

AT99

O (= 3)

10000101001010000010100001000001000010

Mü263

 

 

Mü268

 

 

Mü270

P (= 3)

10000101001010000010100100000011000010

Be153

 

 

Be154

 

 

Mü266

Q (= 3)

10000101001010101010110100010011000010

Be143

 

 

Be144

 

 

Be150

R (= 3)

11000100001010000010100000100011000010

PO355

 

 

PO358

 

 

PO361


67

Gruppen

(Anzahl)

Genotypen

Stämme

S (= 3)

11000101001010000010100000100011000010

PO352

 

 

PO356

 

 

PO366

Sieht man von den Übereinstimmungen zwischen den atypischen Isolaten aus Angola und Madagaskar und zwischen den Isolaten aus Berlin und München ab, wurden zwischen den unterschiedlichen Populationen zwar einige ähnliche jedoch keine völlig übereinstimmenden Genotypen beobachtet. Eine Ausnahme bildete lediglich der portugiesische Stamm PO 357, der den bei den typischen angolanischen Stämmen häufigen Genotyp A aufwies. Es ist jedoch nicht auszuschließen, daß dieses Isolat von einer in Portugal lebenden afrikanischen Frau stammt.

Die Beziehungen zwischen den Fingerprint-Genotypen, die bei den Stämmen der 6 Populationen gefunden wurden, wurden mittels UPGMA-Distanz-Methode untersucht. In dem resultierenden Dendrogramm ( Abbildung 18 ) sind die meisten Stämme der unterschiedlichen geographischen Populationen in einem großen Cluster zu finden, welches allerdings in die zwei Komplexe I und II unterteilt ist. Die meisten Stämme aus Berlin und München befinden sich im Komplex I, lediglich 7 Stämme aus Portugal und 16 Stämme aus Afrika ließen sich dieser Gruppierung zuordnen. Interessanterweise gehören zu Komplex II die übrigen afrikanischen Stämme mit normalem Biotyp (AT) und fast alle portugiesischen Stämme (PO). Alle atypischen Stämme aus Afrika bilden den gut separierten Komplex III. 5 Stämme aus Deutschland, deren Fingerprints deutlich von denen der meisten anderen Stämme abwichen, sind im Komplex IV zu finden. Generell sind die dargestellten Beziehungen zwischen den Isolaten mit Bootstrap-Werten meist unter 50%, statistisch allerdings nicht gut unterstützt.


68

Abbildung 18: Phylogenetische Beziehungen zwischen C. albicans-Stämmen unterschiedlicher geographischer Herkunft ermittelt mit der UPGMA-Distanz-Methode. Die statistische Relevanz der Gruppierungen wurde durch eine Bootstrap-Analyse geprüft. Nur Boostrap-Werte höher als 50% sind in dem Dendrogramm angezeigt.


69

3.4. Vergleichende Untersuchung von Candida-Stämmen isoliert von Patientinnen mit Vaginalcandidose und ihren Partnern

3.4.1. Phänotypische Charakterisierung mit den in der Routinediagnostik angewendeten konventionellen Methoden

In der vorliegenden Arbeit wurden Vaginal-, Mund- und Stuhlisolate von 21 Patientinnen gynäkologischer Sprechstunden in Frankfurt/Oder sowie Isolate ihrer Partner aus Sperma, Mundhöhle und Stuhl mit den üblichen konventionellen Methoden und mit dem PCR-Fingerprinting charakterisiert. Die Ergebnisse der phänotypischen Identifizierung sind in Tabelle 22 dargestellt.

Tabelle 22: Ergebnisse nach Biotypisierung mit konventionellen Methoden

Befund bei Patientinnen

Partner

Ref.

Vagina

Mund

Stuhl

Klinik

Vaginal-Hefen

Sperma

Mund

Stuhl

1/1

X

X

X

Vaginitis

C.alb

X

 

X

1/2

XX

 

XX

Vaginitis

C.alb

neg

 

X

1/3

X

X

X

Vaginitis

C.alb

neg

 

neg

1/4

X X

 

 

o. A.

C.alb

X

 

X

1/5

X X

 

 

Vaginitis

C.alb

X

 

X X

1/8

X

 

X

Vaginitis

C.alb

neg

 

X

7/1

X

 

X

Vaginitis

C.alb

neg

 

neg

8/1

neg

 

X

Vaginitis

 

X

 

neg

8/2

X

 

 

Vaginitis

C.glab

X

 

neg

9/1-4

X

X

X

asympt

C.alb

neg

 

X

9/5-8

XXX

 

 

Vaginitis

C.alb

neg

X

X

9/6

neg

X

 

asympt

 

 

X

 

9/7

XX

 

 

o. A.

C.alb

 

X

X

9/11

neg

 

X

o. A.

 

neg

 

X

9/13

X

 

X

Vaginitis

C.alb

X

 

 

9/15

X

XX

 

Vaginitis

C.alb

neg

neg

neg

9/17

X

X

 

Vaginitis

C.alb

neg

X

 

9/18

X

 

 

asympt

C.alb

 

 

X

9/20

X

X

 

o. A.

C.alb

 

X

 

9/21

X

X

X

asympt

C.alb

X

 

X

10/1

X

 

X

asympt

C.alb

neg

---

neg

Ref.: Patientinen-Bezeichnung; C.alb: Candida albicans; C.glab: C. glabrata; o.A.: ohne klinische Angaben; asympt: klinisch asymptomatisch; X, XX, XXX: 1 bzw. 2 bzw. 3 Isolate.


70

Bei 18 der 21 Patientinnen wurden Hefen aus der Vagina isoliert, 17 dieser Isolate wurden als C. albicans und 1 Isolat als C. glabrata identifiziert. Bei 12 dieser 18 Frauen wurden Hefen auch aus anderen Körperregionen isoliert. Bei 11 Frauen wurden zusätzlich Isolate aus dem Stuhl und bei 8 Frauen aus der Mundhöhle erhalten. In vier Fällen wurden sowohl aus Vagina, Stuhl und Mundhöhle Hefen isoliert, bei 5 bzw. 3 Patientinnen war die Anzucht aus Vagina und Stuhl bzw. aus Vagina und Mund positiv. Bei 2 Frauen wurden Candida nur im Stuhl und bei einer nur in der Mundhöhle nachgewiesen. Bei 2 Patientinnen wurde die Probenentnahme zu einem späteren Zeitpunkt wiederholt. Von den 21 Frauen wurden die Partner mit untersucht. Bei 17 von ihnen wurden aus mindestens einer der klinischen Proben Hefen angezüchtet, wobei bei 4 Männern aus Sperma und Stuhl und bei 3 nur aus Sperma Candida isoliert wurden. Bei 2 Partnern wurden Hefen im Stuhl und im Mund, bei 5 bzw. 3 Partnern wurden Hefen nur im Stuhl bzw. nur im Mund nachgewiesen.

3.4.2. Genetische Charakterisierung mit dem PCR-Fingerprinting

Mit der phänotypischen Differenzierung konnte nur eine Identifizierung der Candida-Isolate auf Speziesebene erreicht werden. Für die Identifizierung identischer oder ähnlicher Isolate aus unterschiedlichen Körperregionen bzw. von den Frauen und ihren Partnern wurde wieder das PCR-Fingerprinting mit Primer T3B eingesetzt. Die erhaltenen PCR-Profile sind in den Abbildungen 19 bis 24 zu sehen.

Bei Patientin 1/1 stimmten die Vaginal- und Stuhlisolate mit denen aus Sperma und Stuhl ihres Partners ( Abbildung 19 , Bahnen 2 bis 6) überein. Die Vaginalisolate von Patientin 1/4 (Bahnen 9 und 10) und das Isolat aus dem Sperma ihres Partners (Bahn 7) waren identisch, während das Stuhlisolat des Partners unterschiedlich war (Bahn 8). Bei wiederholte Episoden wurden bei dieser Frau identische Vaginalisolate nachgewiesen (Bahnen 9 und 10). Bei der Patientin 1/5 (Bahnen 12 bis 16) wurden gleiche Fingerprint-Muster für die beiden Vaginalisolate und das Isolat aus Sperma gefunden. Die 2 Stuhlisolate des Partners waren untereinander unterschiedlich, eines davon war eine non-C. albicans-Spezies (Bahn 16). Bei der Patientin 8/1 (Bahnen 17 und 18) wurde trotz klinischer Vaginitis nur im Stuhl C. albicans nachgewiesen.


71

Abbildung 19: PCR-Fingerprint-Muster der Candida-Isolate von 4 gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B

Bahnen / Isolate Nr.

1, 11 und 22: 1 kb-Molekulargewichtsmarker

2: 1/1 V

13: 1/5 V2

3: 1/1 D

14: 1/5 Sp.3

4: 1/1 M

15: 1/5 St.P.4

5: 1/1 Sp.

16: 1/5 St.P.5

6: 1/1 St.P.

17: 8/1 D

7: 1/4 Sp

18: 8/1 Sp

8: 1/4 St.P.

19: C. albicans Referenzstamm CBS 562

9: 1/4 V1

20: C. albicans Referenzstamm CBS 5983

10: 1/4 V2

21: Wasserprobe

12: 1/5 V1

 

V: Vagina; D: Stuhl/Frau; M: Mund/Frau; Sp: Sperma; St.P: Stuhl/Partner.


72

Abbildung 20: PCR-Fingerprint-Muster der Candida-Isolate von 5 gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B

Bahnen / Isolate Nr.

1, 7 und 19: 1 kb-Molekulargewichtsmarker

2: C. glabrata Referenzstamm NCYC 350

3: 7/1 V

12: 9/11 D

4: 7/1 D

13: 9/13 V

5: 8/2 V

14: 9/13 D

6: 8/2 Sp

15: 9/13 Sp

8: 1/3 D

16: C. albicans Referenzstamm CBS 562

9: 1/3 M

17: C. albicans Referenzstamm CBS 5983

10: 1/3 V

18: Wasserprobe 9/13 Sp

11: 9/11 St.P

 

V: Vagina; D: Stuhl/Frau; M: Mund/Frau; Sp: Sperma; St.P: Stuhl/Partner.

Die Patientin 7/1 (Bahnen 3 und 4) hatte identische Vaginal- und Stuhlisolate, während beim Partner ein negativer Befund erhoben wurde. Bei der Patientin 8/2 wurden die Vaginal- und Spermaisolate als C. glabrata bestätigt, wobei beide ein sehr ähnliches Fingerprint-Muster aufwiesen (Bahnen 5 und 6). Bei der Patientin 1/3 zeigten die Vaginal- und Stuhlisolate identische Fingerprints, während das Isolat aus der Mundhöhle unterschiedlich war. Identische Stuhlisolate bei Frau und Partner wurden im Falle der Patientin 9/11 (Bahnen 14, 15) und gleiche Isolate aus der Vagina, dem Stuhl der Patientin 9/13 und aus dem Sperma des Partners (Bahnen 14 bis 18) nachgewiesen.


73

Abbildung 21: PCR-Fingerprint-Muster der Candida-Isolate von 4 gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B

Bahnen / Isolate Nr.

1, 11 und 22: 1 kb-Molekulargewichtsmarker

2: 9/1 M

13: 9/5 V1

3: 9/1 V

14: 9/5 St.P

4: 9/1 D

15: 9/6 V2 (=9/5)

5: 9/1 St.P

16: 9/8 V3 (=9/5)

6: 9/4 V (=9/1)

17: 9/6 M

7: 9/7 V1

18: 9/6 M.P

8: 9/7 St.P

19: C. albicans Referenzstamm CBS 562

9: 9/7 M.P

20: C. albicans Referenzstamm CBS 5983

10: 9/7 V2

21: Wasserprobe

12: 9/5 MP

 

V: Vagina; D: Stuhl/Frau; M: Mund/Frau; Sp: Sperma; St.P: Stuhl/Partner; M.P: Mund/Partner.

Bei Patientin 9/1 (Bahnen 2 bis 6) zeigten alle Isolate unterschiedliche Fingerprints. Bei einer späteren Probenentnahme aus der Vagina (Bahn 6) wurde eine non-C. albicans-Spezies nachgewiesen, obwohl dieses Isolat mit konventionellen Methoden als C. albicans identifiziert wurde. Bei Patientin 9/7 waren die Fingerprints der beiden Vaginalisolate (Bahnen 7 und 10) sehr ähnlich. Die Partnerisolate (Bahnen 8 und 9) unterschieden sich sowohl untereinander als auch von denen der Frau.

Zwei zu verschiedenen Zeitpunkten bei Patientin 9/5 isolierte Vaginalisolate (Bahnen 13 und 16) hatten identische PCR-Profile. Ein drittes Isolat (Bahn 15) hatte einen sehr ähnlichen Fingerprint. Die Partnerisolate differierten sowohl untereinander als auch im Ver-


74

gleich zu denen der Frau. Patientin 9/6 (Bahnen 17-18) war ohne klinische Symptome. Es konnte nur aus der Mundhöhle, aber nicht aus der Vagina, ein Candida-Isolat angezüchtet werden. Dieses unterschied sich vom Mundhöhlenisolat ihres Partners.

Abbildung 22: PCR-Fingerprint-Muster der Candida-Isolate von 7 gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B

Bahnen / Isolate Nr.

1, 11 und 22: 1 kb-Molekulargewichtsmarker

2: 9/15 V

13: 1/8 D

3: 9/15 M1

14: 1/8 St.P

4: 9/15 M2

15: 9/19 V

5: 9/16 V

16: 9/20 V

6: 9/17 V

17: 9/20 M

7: 9/17 M

18: 9/20 M.P

8: 9/17 M.P

19: C. albicans Referenzstamm CBS 562

9: 9/18 V

20: C. albicans Referenzstamm CBS 5983

10: 9/18 St.P

21: Wasserprobe

12: 1/8 V

 

V: Vagina; D: Stuhl/Frau; M: Mund/Frau; Sp: Sperma; St.P: Stuhl/Partner; M.P: Mund/Partner.

Bei Patientin 9/15 wurde in der Vagina C. albicans nachgewiesen (Bahn 2). Aus der Mundhöhle wurden 2 phänotypisch unterschiedliche, genotypisch aber identische C. famata-Isolate (Bahnen 3 bis 4) nachgewiesen. Aus den 3 Proben vom Partner wurden keine Hefen isoliert. Bei den Patientinnen 9/16 und 9/19 (Bahnen 5 und 15) waren bis auf das Vaginalisolat alle Proben negativ. Eine erneute Probenentnahme konnte bisher


75

noch nicht erfolgen. Bei Patientin 9/17 wurden identische Isolate in der Vagina und der Mundhöhle des Partners nachgewiesen (Bahnen 6 und 8), die sich jedoch von dem Mundhöhlenisolat der Frau unterschieden. Bei Patientin 9/18 stimmten die PCR-Fingerprints ihres Vaginalisolats und des Stuhlisolats ihres Partners überein (Bahnen 9-10). Bei Patientin 1/8 waren die Isolate der Frau (Vagina und Stuhl, Bahnen 12-13) identisch, differierten jedoch vom Stuhlisolats ihres Partners in Bahn 14. Patientin 9/20 hatten die Isolate der Frau (Vagina und Mund, Bahnen 16-17) gleiche das Isolat aus der Mundhöhle ihres Partners (Bahn 18) aber unterschiedliche Fingerprint-Muster.

Bei der Patientin 1/2 ( Abbildung 23 Bahnen 4 bis 8) stimmten die Vaginal- und Stuhlisolate mit dem Isolat aus dem Stuhl ihres Partners überein. Bei einer späteren Untersuchung wurden aus der Vagina und dem Stuhl der Patientin unterschiedliche Isolate nachgewiesen, ohne Beziehung zu den früher isolierten Stämmen. Bei Patientin 10/1 stimmten die Isolate aus der Vagina und dem Stuhl (Bahnen 9-10) überein. Die Isolate der Patientin 9/21 hatten identische Fingerprint-Muster (Bahnen 13 bis 15) während beim Partner (Bahnen 16-17) für das Stuhlisolat ein anderer C. albicans-Genotyp und im Sperma eine non-C. albicans-Spezies (C. lusitaniae) nachgewiesen wurde.

Die Ergebnisse der Stammvergleiche mit dem PCR-Fingerprinting für die einzelnen Patientinnen sind in Tabelle 23 dargestellt.


76

Abbildung 23: PCR-Fingerprint-Muster der Candida-Isolate von 3 gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B

Bahnen / Isolate Nr.

1, 12 und 18: 1 kb-Molekulargewichtsmarker

2: C. albicans Referenzstamm CBS 562

3: C. albicans Referenzstamm CBS 5983

4: 1/2 D

11: Wasserprobe

5: 1/2 St.P

13: 9/21 V

6: 1/2 V

14: 9/21 D

7: 1/2 (5702 V)

15: 9/21 M

8: 1/2 (5702 D)

16: 9/21 St.P

9: 10/1 V

17: 9/21 Sp

10: 10/1 D

 

V: Vagina; D: Stuhl/Frau; M: Mund/Frau; Sp: Sperma; St.P: Stuhl/Partner.


77

Tabelle 23: Ergebnisse des PCR-Fingerprinting für die von gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern isolierten Candida-Stämme

Gruppen / Eigenschaft

Patienten-Nr. / Merkmale

A

Identische Isolate aus verschiedenen Körperregionen (8x)

1/1 Vagina = Stuhl

1/2 Vagina = Stuhl

1/8 Vagina = Stuhl

7/1 Vagina = Stuhl

9/13 Vagina = Stuhl

9/20 Vagina = Mund

9/21 Vagina = Stuhl = Mund

10/1 Vagina = Stuhl

B

Keine Identische Isolate aus verschiedenen Körperregionen (4x)

1/3 Vagina = Stuhl ne Mund

9/1 Vagina1 ne 2 ne Stuhl ne Mund

9/15 Vagina ne Mund

9/17 Vagina ne Mund

C

Identische Fingerprint-Muster bei beiden Partnern (9x)

Frau = Partner

1/1 Vaginal = Sperma/Stuhl (1x)

¼ Vaginal = Sperma (3x)

1/5 ‘’ ‘’

8/2 ‘’ ‘’

1/2 Vaginal = Stuhl (3x)

9/13 ‘’ ‘’

9/18 ‘’ ‘’

9/17 Vaginal = Mund (1x)

9/11 Stuhl = Stuhl (1x)

D

Keine identische Isolate bei beiden Partnern (7x)

1/8

8/1

9/1-9/4

9/5

9/6

9/7

9/21

E

Wiederholte Proben bzw. mehrfache Isolate (5x)

½ Vaginal/Stuhl unterschiedlich

9/5 Vaginal 1 & 3 identisch


78

Abbildung 24: Vergleich der von den Vaginalisolaten verschiedener Patientinnen erhaltenen PCR-Fingerprint-Muster (Primer T3B)

Bahnen / Isolate Nr.

1, 17 und 21: 1 kb-Molekulargewichtsmarker

2: 1/1 V

8: 9/6 V

14: 1/4 V1

3: 1/4 V2

9: 9/8 V

15: 9/17 V

4: 1/5 V2

10: 7/1 V

16: 1/8 V

5: 9/7 V1

11: 1/2 V1

18: 9/1 V

6: 9/7 V

12: 1/3 V1

19: 10/1 V

7: 9/5 V

13: 9/18 V

20: 9/21 V

+: klinische Vaginitis; -: asymptomatisch; 0: ohne klinische Daten

Durch einen Vergleich der 18 Vaginalisolate von 15 Frauen (von 3 Frauen wurden jeweils 2 Stämme in die Analyse einbezogen) wollten wir überprüfen, ob es einen Zusammenhang zwischen den Besiedlungsstämmen bei nicht klinisch erkrankten Frauen und den Infektionsstämmen von klinisch erkrankten Frauen gibt ( Abbildung 24 ). Von den 18 Isolaten stammten 9 von Frauen, die klinisch an einer Vaginitis erkrankt waren (+), und 4 von Frauen ohne Beschwerden (0). Zu den verbleibenden 5 Frauen
(-) konnten wir keine Angaben erhalten. Obwohl für 11 der Isolate sehr ähnliche bis identische Fingerprint-Muster nachgewiesen wurden (Bahnen 1-5 und 7-13), ließ sich keine Korrelation zwischen bestimmten Genotypen und der unterschiedlichen klinischen Symptomatik feststellen.


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Tue Apr 11 20:36:34 2000