de Andrade , Manuel Vieira Dias Pinto : ”Identifizierung von Candida-Spezies und -Stämmen durch den Nachweis von polymorphen DNA-Regionen in der PCR”

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Kapitel 4. DISKUSSION

Mit steigender Häufigkeit werden Vertreter der Gattung Candida als Ursache nosokomialer Infektionen, besonders bei Patienten mit defizitärer Infektabwehr, nachgewiesen. Dabei reicht das Spektrum der Erkrankungen von Infektionen der Haut und der Schleimhäute bis hin zu schweren systemischen Mykosen bei immunsupprimierten Patienten. Candida albicans ist der am meisten isolierte Erreger derartiger Pilzinfektionen. Außerdem spielen Candida-Arten als Infektionserreger eine herausragende Rolle in der Dermatologie (Dermatomykosen aller Art), in der Gynäkologie (Problem der chronisch rezidivierenden Vaginalcandidose) und in der Pädiatrie. Die verschiedenen medizinisch relevanten Candida-Arten unterscheiden sich in ihrer Pathogenität und auch in ihrem Resistenzverhalten gegenüber gebräuchlichen Antimykotika ( Nguyen et al. 1996 ). Das Problem der Speziesidentifizierung in der mykologischen Labordiagnostik ist deshalb sowohl klinisch als auch epidemiologisch (Erregerwandel) und wirtschaftlich (Einsatz von Breitbandantimykotika bei unsicherer Identifizierung) relevant.

4.1. Identifizierung konventionell schwer differenzierbarer Candida-Stämme mit molekularbiologischen Methoden

4.1.1. Differenzierung von C. guilliermondii / C. famata-Isolaten von dermatologischen Patienten

Candida guilliermondii ist seit langem als seltener Erreger von septischen Arthritiden oder Endokarditiden vor allem bei IV-Drogenabhängigen, aber auch bei immunsupprimierten und chirurgischen Patienten, bekannt. Dieser Erreger kann jedoch auch als Kommensale auf der Haut gesunder Menschen und in Tierprodukten, wie z.B. in Kuhmilch, vorkommen ( Lagneau et al., 1996 , Rinaldi, 1993 , Rippon, 1982 ). Als Standortflora in der Vagina spielt C. guilliermondii allerdings keine Rolle. In Sri Lanka wurde C. guilliermondii nur bei 1/140 Fällen in Vaginalabstrichen von symptomatischen Frauen mit Vulvovaginitis und in keinem Fall bei asympromatischen Frauen nachgewiesen ( Perera & Clayton 1994 ). In der Schweiz fand Bregenzer (1996) C. guilliermondii bei 2% der Candidasepsis-Fälle in einer 6-jährigen retrospektiven Studie.

In der Dermatologischen Klinik der Universitätsklinik Charité Berlin, wurden von 1992 bis 1995 131 Candida guilliermondii-Stämme erfaßt. Die Speziesidentifizierung basierte


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auf den Ergebnissen der routinemäßig angewendeten konventionellen Methoden und der klinischen Manifestation der Erkrankung. Damit nahmen C. guilliermondii die dritte Stelle bei den candidabedingten Dermatomykosen nach C. parapsilosis und C. albicans ein. Von den insgesamt 5,9% der durch Hefen verursachten Hautmykosen wurden 1,8% durch diesen Erreger hervorgerufen.

Candida famata wurde ursprünglich in Japan aus der Luft ( Saito, 1922 ) isoliert und als ”Torula candida“ beschrieben. Seitdem wurden diese Hefen auch aus Lebensmitteln, einschließlich Obst und vergorenen Produkten, aus verschiedenen tierischen Quellen und gelegentlich aus klinischen Proben wie Haut und Schleimhaut isoliert. Bisher wurden Stämme von C. famata meist nur als Kontaminanten angesehen, obwohl es inzwischen Berichte über ihre potentielle Pathogenität bei immunsupprimierten Patienten gibt ( Quindos 1994 ) und die Pathogenität auch im Tiermodell nachgewiesen werden konnte ( Nishikawa et al. 1996 ). Der erste Fall einer intravenösen katheterassoziierten Fungämie durch C. famata wurde bei einem knochenmarkstransplantierten Patienten ( St-Germain & Laverdière 1986 ) beobachtet.

Schwierigkeiten treten bei der Differenzierung zwischen C. guilliermondii und C. famata-Isolaten häufig auf ( Odds et al. 1997 , Kitch et al. 1996 , Quindos 1994 , Mendling 1993 ). Odds et al. berichteten 1997, daß die Identifizierung von Hefen vorwiegend mit kommerziell erhältlichen Kits Probleme bereiten kann, und daß beispielsweise bei der Differenzierung der Spezies C. guilliermondii und der Spezies C. famata Irrtümer oft schwer zu vermeiden sind. Diese beiden Spezies ähneln sich in vielen morphologischen und physiologischen Eigenschaften. Eine erfolgreiche phänotypische Diskriminierung zwischen diesen beide Spezies ist durch den Nachweis der Pseudohyphenbildung bei C. guilliermondii möglich. Dieses für C. guilliermondii normalerweise typische Merkmal wird aber manchmal nicht ausgeprägt ( Odds et al. 1997 , McGinnis et al. 1984 ), so daß die Differenzierung zwischen den beiden Spezies nicht immer gelingt. In einer Studie zur Klärung der taxonomischen Stellung klinischer Isolate von C. famata, bei der einerseits phänotypische Merkmale aber auch die DNA/DNA-Reassoziation untersucht wurden, konnten nur 3 von 5 klinischen C. famata-Stämmen aus der Sammlung der Fa. bioMerieux als C. famata bestätigt werden ( Nishikawa et al. 1996 ). Die übrigen 2 Isolate wurden als C. guilliermondii / C. famata bezeichnet, obwohl keiner der 5 Stämme Pseudomyzelien gebildet hatte. Eine häufige Verwechslung der phänotypisch ähnlichen Arten C. famata und C. guilliermondii bei einer Identifizierung mit dem System Api 20 Au-


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xonogramm sowie durch Anzucht auf Reisagar wurde auch von Mendling (1993) beschrieben.

Differentialnährmedien wie der ALBICANS ID-Agar oder die CHROM-Agar-Platten sind nicht in der Lage zwischen C. guilliermondii und C. famata zu diskriminieren, weil deren Kolonien die gleiche Färbung aufweisen ( San-Milán et al. 1996 ).

Früher wurden die Candida-Hefen zwei unterschiedlichen Gattungen, Candida und Torulopsis, zugeordnet, die durch die Fähigkeit (Candida) bzw. die Unfähigkeit (Torulopsis) unter den entsprechenden Bedingungen Pseudohyphen zu bilden gekennzeichnet waren. Diese Trennung konnte sich jedoch nicht durchsetzen, weil sie nicht durch molekulare Untersuchungen gestützt werden konnte, so daß alle Candida und Torulopsis-Arten wieder in der Gattung Candida vereint wurden ( Yarrow & Meyer 1978 ), obwohl diese Fusion immer starke Gegner hatte ( McGinnis et al. 1984 ). Odds (1997) unterstützte die Zusammenfassung von Candida und Torulopsis, da er zeigen konnte, daß unabhängige Beobachter diese Eigenschaft bei den gleichen Isolaten unterschiedlich bewerteten. Die Pseudohyphenbildung stellt somit ein zu unzuverlässiges Kriterium für die Zuordnung der Hefen zu zwei unterschiedlichen Gattungen dar. Für die Differenzierung einiger Spezies jedoch, wie z.B. von C. guilliermondii und C. famata ist die Pseudohyphenbildung die einzige akzeptable unterschiedliche phänotypische Eigenschaft.

Die Identifizierung von C. guilliermondii stellt gegenwärtig ein wichtiges Problem bei der Diagnostik von Dermatomykosen dar. Mit beiden molekularbiologischen Methoden konnten von den 37 fraglichen Stämmen 31 als C. guilliermondii und 3 als C. famata identifiziert werden. Mit der Biochemotypie gelang nur der Nachweis eines der drei C. famata-Isolate und von 23 der 31 C. guilliermondii - Isolate (74%). 24 Isolate wurden mit den konventionellen Methoden gar nicht oder falsch identifiziert. Als besonderes Problem muß dabei die fehlende bzw. fragliche Pseudomyzelbildung bei fast allen untersuchten Stämmen genannt werden. Diese Eigenschaft hat sich in unserem Stammgut als unzureichendes Kriterium für die Diskriminierung von C.guilliermondii und C. famata erwiesen. Drei Stämme konnten auch mit molekularbiologischen Methoden wegen fehlender Referenzstämme nicht identifiziert werden, es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, daß es bei diesen Isolaten um Stammkontaminationen handelt. Kitch et al. (1996) konnten bei der Evaluierung einer qualitativen Mikromethode (RapID Yeast Plus system), welche konventionelle und chromogene Substrate für eine schnelle Identifizierung medizinisch relevanter Hefen verwendet, zum Beispiel auch zeigen, daß ein Can-


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dida utilis-Stamm als C.famata/ C.guilliermondii falsch identifiziert wurde.

Die beiden in dieser Arbeit angewendeten molekularbiologischen Identifizierungsverfahren weisen unterschiedliche Abschnitte in der genomischen DNA von Candida nach. Beim PCR-Fingerprinting werden über das gesamte Genom verteilte DNA-Abschnitte mit unspezifischen Primern amplifiziert (Welsh et al. 1992 ), die Restriktionsanalyse der ITS-Region weist dagegen Polymorphismen in den hochvariablen intergenischen Spacern der ribosomalen Operone nach.

Sowohl das PCR-Fingerprinting als auch die RFLP-Analyse der ITS-Regionen haben stets zu eindeutigen und übereinstimmenden Ergebnissen bei der Diskriminierung der Spezies C. guilliermondii und C. famata geführt. Der Nachteil des PCR-Fingerprinting ist, daß diese Technik nur mit Reinkulturen durchgeführt werden kann, weil die verwendeten unspezifischen Primer auch humane oder tierische DNA sowie die DNA kontaminierender Mikroorganismen amplifizieren würden. Die ITS-PCR konnte bereits direkt aus Einzelkolonien durchgeführt werden ( Nho et al., 1997 ), die Amplizierung direkt aus klinischen Materialien ohne vorherige Anzucht erscheint prinzipiell möglich.

Bei der Sequenzierung eines Teils des ”Internal Transcribed Spacers“ (ITS2) im ribosomalen Operon von 7 C. famata- bzw. Debaryomyces hansenii-Stämmen (Teleomorph von C. famata) aus der Stammsammlung des ATCC zeigten alle Stämme Sequenzenunterschiede in dieser Region, was darauf hinweist, daß es sich bei C. famata möglicherweise eher um einen taxonomischen Komplex von mehr als einer Spezies handelt ( Elie et al. 1998 ). Mit der in unserem Labor angewandten RFLP-Analyse der ITS-Region konnten wir keine Stammunterschiede feststellen, was darauf zurückzuführen sein könnte, daß die Sequenzunterschiede nicht die Schnittstellen der Restriktionsenzyme betrafen und auch nicht zu nachweisbaren Unterschieden in der Größe der erhaltenen Fragmente führten.

Es gibt eine große und weiter zunehmende Anzahl an Präparaten für die Therapie von Dermatomykosen in den verschiedensten Darreichungsformen. Für die lokale Anwendung haben sich zahlreiche Antimykotika unterschiedlicher chemischer Klassen (Azole, Allylamine, Tolnaftate, Tolziclate, Amorolfine, Ciclopirox, etc.) durchgesetzt. Alle diese Präparate zeigen bei einer hohen Wirksamkeit nur selten unerwünschte Nebenwirkungen. Bei einer systemischen Therapie der Dermatomykose ist die Auswahl der Mittel kleiner. Drei Wirkstoffe genießen hier eine große Wertschätzung: Fluconazol, Itracona-


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zol (Triazol) und Terbinafin (Allylamin). Letzteres gilt als das wirksamste Mittel zur Therapie von Infektionen, die durch Dermatophyten hervorgerufen werden. Dermatophytenspezifisch wirkt auch Griseofulvin, das erste systemische Antimykotikum überhaupt. Fluconazol ist ein Präparat, das hochwirksam gegen Hefen ist, sich aber in der Therapie von Dermatomykosen noch nicht durchgesetzt hat.

In den diagnostischen Laboratorien werden Resistenztestungen bei Hefen noch nicht routinemäßig eingesetzt. Verschiedene Autoren haben jedoch eine erhöhte Resistenz von C. guilliermondii gegenüber Antimykotika beschrieben ( Tietz and Czaika 1999 , Dick 1985 ). Deshalb wäre nach einer korrekten Identifizierung von therapierefraktären C. guilliermondii eine systemische Therapie sinnlos und es müßte in diesen Fällen eine Lokaltherapie empfohlen werden. Da bisher keine resistente C. famata-Isolate beschrieben wurden, könnte bei der Diagnose von C. famata ohne Resistenztestung eine systemische Therapie eingesetzt werden.

4.1.2. Identifizierung von Candida albicans-Stämmen mit atypischen morphologischen und biochemischen Eigenschaften

Ein großer Vorteil molekularbiologischer Techniken ist, daß sie eine Speziesidentifizierung auch bei Isolaten mit atypischer Morphologie, mit veränderten Wachstumseigenschaften und abweichender Biochemotypie gestatten. Andererseits können auch phänotypisch identische Stämme mit diesen Methoden unterschieden werden. Schon 1993 wurde von Jitsurong et al. im Zusammenhang mit der Evaluierung eines neuen milchhaltigen Mediums für die Keimschlauch- und Chlamydosporenbildung bei C. albicans über Chlamydosporen-negative Candida albicans-Stämme berichtet. Eine weitere Charakterisierung dieser Stämme wurde jedoch nicht durchgeführt.

Von unserer Gruppe konnten vaginale Candida-Isolate aus Südost- und Südwestafrika, die nicht in der Lage waren, Glukosamin und N-Acetylglukosamin zu verwerten und auf Reisagar Chlamydosporen zu bilden und deshalb in der Biochemotypie (ID 32C, bioMerieux V. 1) als C. sake fehlinterpretiert worden waren (Identifizierungscode 7042 3400), mit dem PCR-Fingerprinting eindeutig als C. albicans-Stämme identifiziert werden ( Tietz et al. 1995 ). Ähnliche Stämme wurden auch in Deutschland aus der Mundhöhle HIV-Infizierter isoliert. Auch hier wurden 5 biochemisch als C. sake identifizierte Stämme im PCR Fingerprinting als C. albicans bestimmt ( Hoegl et al. 1998 ). Die von unserer Ar-


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beitsgruppe und von anderen Autoren beschriebenen Probleme bei der biochemischen Identifizierung atypischer Candida-Isolate wurden in der kürzlich vom Hersteller herausgegeben Version 2 des API-Systems ID 32C berücksichtigt.

Eine inzwischen in unserer Arbeitsgruppe durchgeführte populationsgenetische Untersuchung der atypischen C. albicans-Stämme mit gleichen biochemischen Eigenschaften hat ergeben, daß diese einen besonderen Klon darstellen und sich deutlich von Populationen mit normalem Biotyp aus Afrika unterscheiden ( Forche 1999 ).

Seit Beginn dieses Jahrzehnts mehren sich Berichte über atypische Candida-Stämme, die von immunsupprimierten Patienten, vor allem aus der Mundhöhle von HIV-Infizierten bzw. AIDS-Patienten, isoliert wurden ( Pujol et al. 1997 , McCullough et al. 1995 , Sullivan et al. 1993 ). Einige dieser Isolate zeichneten sich durch eine phänotypische Ähnlichkeit mit C. albicans aus, wiesen aber auch eine Reihe von Unterschieden auf ( Tabelle 24 ), die ihre Identifizierung in dem API-System erschwerten ( Sullivan and Coleman 1998 , Salkin et al. 1998 ). Diese Isolate wuchsen auf CHROMagar als dunkelgrüne Kolonien (C. albicans: blaugrün), zeigten aber im Gegenteil zu C. albicans kein Wachstum bei 45º C ( Pinjon et al. 1998 ).

Tabelle 24: Zusammenfassung der Daten der biochemischen Charakterisierung der Biotypen 1 und 2 von C. albicans sowie der atypischen Stämme aus der Mundhöhle HIV-Infizierter anhand der Prozentualtabelle der BioMerieux Datenbank (Salkin et al. 1998).

Stämme

Substrat

MDG*

XYL**

Biotyp 1

98%

98%

Biotyp 2

0%

67%

atypische

0%

0%

* alpha-Methyl-D-Glucoside; **D-XYLose

Die genetische Analyse dieser atypischen Candida-Isolate mittels MLEE, mittels DNA-Fingerprinting mit der für C. albicans-spezifischen 27A-Sonde sowie mit verschiedenen ”simple repeat“-Sonden, mittels PCR-Fingerprinting mit kurzen Zufallsprimern (RAPD-Technik), mittels Karyotyp-Analyse und rDNA-Sequenzierung zeigte deutliche Unterschiede in der Organisation ihres Genoms im Vergleich zu C. albicans und C. stellatoi-


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dea. Sequenzvergleiche einer variablen Region (V3) im lsu rRNA-Gen ergab, daß sich die atypischen Isolate von allen anderen getesteten Candida-Spezies unterschieden, wobei sie allerdings am stärksten zu C. albicans verwandt waren. Die genetischen wie auch die phänotypischen Charakteristika der atypischen Isolate unterstützten somit ihre Zuordnung zu einer neuen Spezies C. dubliniensis ( Sullivan et al. 1995 ). Inzwischen wird weltweit über das Vorkommen dieser atypischen Isolate berichtet ( Sullivan et al. 1997 , Boerlin et al. 1995b , McCullough et al. 1995 ). Auch der ehemalige C. stellatoidea-Referenzstamm ”NCPF 3108“ der ”British National Collection of Pathogenic Fungi“ wurde als C. dubliniensis identifiziert ( Sullivan and Coleman 1998 ).

In Zusammenarbeit mit unserer Gruppe wurde eine biochemisch nicht typisierbare rotpigmentierte Variante von C. albicans ( Kerkmann et al. 1999 ) beschrieben, die durch verschiedene molekularbiologische Methoden wie das PCR-Fingerprinting mit dem Primer T3B und die Analyse der 18S rRNA-Gen-Sequenz identifiziert wurde. Dieses Isolat, welches wegen seiner ungewöhnlichen bräunlichen Färbung auffiel, stammte von einem an zystischer Fibrose erkrankten Patienten, von dem bereits eine chronische Besiedlung mit Pseudomonas spp. bekannt war. Weitere Untersuchungen haben für diesen Stamm eine Primärresistenz gegenüber Flucytosin (MHK > 32 µg/ml) ergeben. Es besteht die Gefahr, daß eine derartige ”rotpigmentierte Hefe“, möglicherweise als ”Rhodotorula spp.“ bezeichnet wird und somit als nicht therapiebedürftiges Isolat gilt. Ähnliche Probleme können auch mit anderen als ”unidentifizierbar“ bezeichneten Isolaten auftreten.

Die in dieser Arbeit analysierten atypischen Stämme, mit Ausnahme eines 2KG-negativen Isolats ( Abbildung 15 , Bahn 2), konnten nicht als neue Candida-Spezies identifiziert werden. Mit dem PCR-Fingerprinting konnten keine wesentlichen Unterschiede zu C. albicans festgestellt werden, während C. dubliniensis-Isolate unter den gleichen Bedingungen distinkte PCR-Profile aufwiesen. Forche (1998) konnte durch die Sequenzierung einer variablen Region des lsu rRNA-Gens (D1/D2) eindeutig nachweisen, daß sich sowohl die von uns getesteten typischen als auch die atypischen C. albicans-Stämme innerhalb der C. albicans-Gruppe einordnen. Kurtzman & Robnett (1997) konnten mit dem gleichen Verfahren nachweisen, daß die phänotypische Variabilität bei Isolaten derselben Spezies sehr ausgeprägt sein kann. Unsere atypischen Isolate ließen sich klar von der am engsten verwandten Spezies, C. dubliniensis, abgrenzen und stellen vermutlich eher eine Mutante oder eine spezielle Untergruppe von Candida albicans


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dar.

Als Beispiele für C. albicans-Mutanten bzw. -Varianten können C. stellatoidea Typ I und II aufgeführt werden, die zunächst als separate Candida-Spezies klassifiziert wurden. Untersuchungen zu ihrer Genetik und ihrer Virulenz ( Kwon-Chung et al. 1990 , Kwon-Chung et al. 1989 ) haben gezeigt, daß C. stellatoidea Typ II eine stabile Saccharose-negative Mutante von C. albicans ist, während C. stellatoidea Typ I aufgrund gravierender Abweichungen z.B. im Karyotyp, in der mitochondrialen DNA und in der RFLP-Analyse als Variante von C. albicans charakterisiert wurde ( Kwon-Chung & Bennett 1992 ).

4.2. Vergleichende genotypische Charakterisierung von C.albicans-Vaginalisolaten aus Afrika und Europa

Mit verschiedenen molekularen Typisierungsmethoden wurden in der Vergangenheit unterschiedliche Genotypen bei verschiedenen C. albicans-Stämmen nachgewiesen. Clemons et al. 1991 , Schmid et al. 1990 , Magee et al. 1987 und Scherer & Stevens 1987 setzten für diesen Zweck eine RFLP- Analyse ein. Hoegl et al. 1998 , Niesters et al. 1993 , Schönian et al. 1993a-b und Lehmann et al. 1992 nutzten die RAPD-Technik bzw. eine ähnliche PCR-Fingerprint-Technik, während Bostock et al. 1993 und Magee et al. 1992 RAPD, PFGE und RFLP verglichen. Die relativ kostengünstige RFLP-Analyse ist erst nach Hybridisierung mit spezifischen und repetitiven DNA-Sonden aussagekräftig und hat den Nachteil, daß sie große Mengen DNA benötigt. Die Karyotypie mit der PFGE und die RAPD haben eine bessere Diskriminierungsstärke, sind aber kosten- und zumindest die PFGE, auch zeitaufwendiger. Bei einem Vergleich der unterschiedlichen Methoden kam Bostock (1993) zu dem Schluß, daß zukünftig die RAPD wahrscheinlich für große epidemiologische Studien bei C. albicans die Methode der Wahl sein wird. Lehmann et al. (1992) haben die RAPD-Methode (PCR-Fingerprinting) verwendet, um die genetische Verwandtschaft zwischen medizinisch relevanten Stämmen der Gattung Candida zu ermitteln. Sie erhielten ”distinktive“ und reproduzierbare Sets von PCR-Produkten für verschiedene Candida-Spezies und konnten mit ihrer RAPD-Technik Intraspezies-DNA-Polymorphismen bei Isolaten verschiedener Candida-Spezies nachweisen. Sie waren z.B. in der Lage, 3 unterschiedliche Gruppen von C. parapsilosis zu differenzieren.

Schmid et al. 1990 entwickelten eine computergestützte Methode (Dendron) zur Spei-


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cherung von DNA-Fingerprint-Mustern in ”data files“. Die Berechnung der Similaritätskoeffizienten zwischen Isolaten erfolgt je nach Stärke und Verteilung der Banden und gestattet die Darstellung der Beziehungen zwischen den Stämmen bzw. von Untergruppen von Stämmen bei großen epidemiologischen Studien.

Kurtzman (1997) konnte bei der Sequenzanalyse der variablen (D1/D2)-Region am 5’ Ende des lsu (26S) rRNA-Gens zeigen, daß Mitglieder einer Spezies nicht mehr als 0 bis 2 Nukleotidaustausche in dieser Region aufweisen, so daß diese Methode nicht in der Lage war, Stammvariationen innerhalb einer Spezies nachzuweisen. Unterschiedliche, auch selten gefundene Candida-Spezies wiesen in dieser Region 6 bis 49 Sequenzunterschiede auf.

Die meisten dieser Untersuchungen führten zu der Schlußfolgerung daß die zur normalen Besiedlungsflora gehörenden Candida albicans-Stämme die Quelle nachfolgender Infektionen sind und daß alle oder die meisten der kommensalen Stämme in der Lage sind, klinische Symptome hervorzurufen. Es gibt jedoch auch Hinweise auf einen möglichen Stammaustausch beim Übergang zur Infektion ( Schmid et al. 1993 ).

Pfaller et al. (1998) haben mittels DNA-Fingerprinting unter Verwendung der speziesspezifischen Ca3-Sonde und eines computergestützten Auswertungssystems die Verwandtschaft von 162 Candida albicans-Stämmen analysiert, die in den USA bei hämatogenen Infektionen isoliert wurden. Sie fanden, daß besondere Stämme in bestimmten geographischen Regionen konzentriert sind. Derartige ”etablierte Stämme“ kommen in einigen aber nicht in allen Krankenhäusern endemisch vor und werden vorwiegend bei den dort hospitalisierten Patienten gefunden. In diese Studie wurden auch Fluconazol-resistente Stämme einbezogen; es konnte jedoch keine enge Verwandtschaft zwischen den Fluconazol-resistenten Stämmen und aus dem Blut isolierten Stämmen, weder vom gleichen geographischen Ort noch vom selben Krankenhaus, gefunden werden.

In dieser Arbeit wurden für die insgesamt 212 untersuchten C.albicans-Stämme 87 unterschiedliche PCR-Fingerprint-Genotypen nachgewiesen. Die ”typischen“ C. albicans-Isolate aus Deutschland, Portugal und Angola hatten nahezu identische phänotypische Eigenschaften, konnten aber 81 verschiedenen Genotypen zugeordnet werden. Die typischen C. albicans-Populationen aus Europa und Afrika zeigten zwar keine grundsätzlich verschiedenen PCR-Muster, zwischen den unterschiedlichen Populationen wurden aber bis auf eine Ausnahme keine völlig übereinstimmenden Genotypen beob-


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achtet. Bei den 22 atypischen Stämmen aus Angola und Madagaskar wurden 6 Genotypen bestimmt, wobei aber die meisten Stämme (15) einen einheitlichen Genotyp hatten. Die europäischen Populationen erwiesen sich als weitaus variabler als die typischen und atypischen Populationen aus Afrika.

Die geringere genetische Variabilität der typischen afrikanischen und, in noch stärkerem Maße, der atypischen C. albicans-Populationen aus verschiedenen Regionen Afrikas wurde durch populationsgenetische Analysen mittels unabhängiger molekularer Marker bestätigt ( Forche 1998 ). Die Ursache dafür ist noch unklar. Da Schmierinfektionen und sexuelle Übertragungen in diesen Gebieten eine große Rolle spielen, könnten dadurch bestimmte Stämme bzw. Klone verbreitet werden und zirkulieren, was die geringere Heterogenität innerhalb der ”normalen“ angolanischen C.albicans-Population erklären könnte. Andererseits werden für C. albicans überwiegend klonale Populationsstrukturen beschrieben ( Boerlin et al. 1996 , Gräser et al. 1996 , Pujol et al. 1993 ), da für diese diploide Hefen bisher keine sexuellen Vermehrungsformen gefunden wurden. Für Klonalität sprechen auch die in dieser Studie in allen Populationen gefundenen überrepräsentierten Genotypen. Möglicherweise handelt es sich bei den afrikanischen C. albicans um wenige, aber relativ stabile Klone.

Unsere Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß eine gewisse, allerdings statistisch nicht abgesicherte Korrelation zwischen dem Genotyp und der geographischen Herkunft der Stämme besteht. Möglicherweise sind die engeren Beziehungen zwischen den afrikanischen und portugiesischen Stämmen, wie sie im Komplex II zu sehen sind, dadurch bedingt, daß viele der portugiesischen Patientinnen afrikanischen Ursprungs sind bzw. daß durch Einwanderer ”afrikanische“ Stämme in größerer Anzahl nach Portugal gelangt sind.

4.3. Vergleichende Untersuchung von Candida-Stämmen isoliert von Patientinnen mit Vaginalcandidose und ihren Partnern

Klinische Vaginitis wird häufig durch C. albicans verursacht, wobei die betroffenen Patientinnen oft rezidivierende Episoden dieser Erkrankung durchmachen. Die Ursachen für diese Rezidive sind noch nicht völlig geklärt. Es wird angenommen, daß gesunde Frauen mit C. albicans kolonisiert sind und daß Stämme in ihrer anorektalen Region, oder kommensale Stämme des Partners oder ein persistierender Stamm in der Vagina die


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Ursache für die nach Therapie wieder aufflammenden klinischen Symptome sind.

Einige Autoren nehmen an, daß gesunde Frauen Trägerinnen von kommensalen Candida-Stämmen sind und daß diese Stämme das äthiologische Agens bei späteren Episoden von Vulvovaginalinfektionen als Folge physiologischer Veränderungen bzw. von einer Abschwächung der Immunabwehr beim Wirt sind. Bei diesen Patientinnen wird der ursprüngliche Stamm ohne genetische Veränderungen erhalten ( Maffei et al. 1997 , Lockhart et al. 1996 ). In einer Langzeitbeobachtung wurden insgesamt 10 Frauen mit rezidivierender Vulvovaginalcandidose in einem Zeitraum von 24 bis 47 Monaten untersucht ( Vazquez et al. 1994 ). Durch Karyotypie konnten für die Candida albicans-Vaginalisolate, trotz des langen Beobachtungszeitraums und zahlreicher antimykotischer Therapieversuche, fast immer die gleichen Genotypen nachgewiesen werden. In den zwei Fällen, bei denen ein Stammaustausch stattfand, wurden die neuen Stämme dann wieder über einen längeren Zeitraum nachgewiesen. Zu ähnlichen Ergebnissen führte auch die Untersuchung von 2 Frauen und ihren Partnern ( Schröppel et al. 1994 ), bei der in einem Fall der gleiche Stamm, mit geringeren Veränderungen, in jeder weiteren Vaginitis-Episode wieder gefunden wurde, während in dem anderen Falle ein Stammaustausch stattfand. Die Tatsache, daß in verschiedenen Studien, im Laufe nachfolgender Vaginitis-Episoden, immer geringfügige Veränderungen bei den ”Infektionsstämmen“ festgestellt wurden ( Schröppel et al. 1994 , Vazquez et al. 1994 , Mercure et al. 1993 , Schmid et al. 1993 , Soll et al. 1991 , Soll et al. 1988 ), spricht dafür, daß die ”Infektionsstämme“ von rezidivierenden Candida-Vaginosen genetisch nicht stabil sind. Die Antimykotikabehandlung kann sowohl zur Selektion von Varianten des früheren Infektionsstammes als auch zum Austausch gegen einen genetisch unterschiedlichen Stamm führen, dessen Quelle der männliche Partner sein kann.

Von den 12 Frauen in unserer Studie, bei denen Candida-Stämmen aus der Vagina und anderen Körperregionen, wie Stuhl und Mundhöhle, gleichzeitig isoliert wurden, wiesen 8 Patientinnen identische Stämme auf. Bei den übrigen 4 Patientinnen wurden unterschiedliche Stämme isoliert. Dieses Ergebnis stimmt gut mit früheren Befunden unserer Arbeitsgruppe überein. Im Rahmen einer epidemiologischen Studie von C. albicans-Isolaten von immunsupprimierten Patienten wurde gezeigt, daß zwei Drittel dieser Patienten mit identischen C. albicans-Stämmen besiedelt bzw. infiziert waren, während von einem Drittel der Patienten unterschiedliche Isolate nachgewiesen wurden ( Schönian et al. 1996 ).


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Bei drei Patientinnen (1/4, 1/5, 9/7) wurden morphologisch unterschiedliche Vaginalisolate untersucht, die sich im PCR-Fingerprinting als genetisch identisch erwiesen. Andere Autoren haben ähnliche Befunde erhoben. Soll (1988) beschrieb unterschiedliche Candida-Stämme der gleichen Spezies bei einem knochenmarktransplantierten Patienten im Verlauf einer systemischen Infektion. Bei der Überprüfung der genetischen Verwandtschaft von Stämmen, die aus 17 verschiedenen Körperregionen gesunder Frauen (insbesondere aus der Mundhöhle, aus der vulvovaginalen und anorektalen Region) isoliert worden waren, wurden nur bei etwa 52% der Frauen identische Isolate an verschiedenen Standorten gefunden ( Soll et al. 1991 ). Die übrigen Frauen waren durch unterschiedliche oder ähnliche, aber nicht identische Stämme besiedelt. Es wird vermutet, daß ähnliche Isolate durch genetische Divergenz von einem gleichen Ausgangsstamm entstanden sind. In unserer Studie wurden bei 3 der 5 asymptomatischen Frauen neben dem Vaginalisolat auch Isolate aus anderen Körperregionen nachgewiesen, die bei 2 von ihnen identisch und bei einer unterschiedlich waren. Bei den beiden anderen Frauen (9/6 und 9/18) wurde Candida-Stämme nur aus der Vagina isoliert, die somit nur mit den Partnerisolaten verglichen werden konnten. Andererseits fanden Soll und Mitarbeiter eine verminderte genetische Variabilität bei den in ihrer Studie analysierten Vaginalisolaten, was auf eine mögliche Adaptation dieser Stämme an ihren Standort hinweisen könnte. Ähnliche Schlußfolgerungen können aus unseren Ergebnissen nicht gezogen werden, da nur bei 4 unserer 12 Patientinnen unterschiedliche Isolate in den verschiedenen Körperregionen nachgewiesen wurden.

Bei 9 der 17 Patientinnen, bei deren Partnern Candida aus dem Sperma, dem Stuhl und/oder der Mundhöhle isoliert wurden, stimmten die PCR-Fingerprints der Isolate von beiden Partnern überein (bei einer Patientin war das Vaginalisolat mit dem Isolat aus Sperma und Stuhl des Partners identisch, bei 3 Patientinnen wurden gleiche PCR-Profile für die Isolate aus Vagina und Sperma nachgewiesen, bei weiteren 3 Patientinnen stimmte das Vaginalisolat mit dem Isolat aus dem Stuhl des Partners überein, bei einer Patientin zeigten das Vaginalisolat und das Isolat aus dem Mund ihres Partners gleiche PCR-Muster und in einem Falle waren die Stuhlisolate beide Partner übereinstimmend im PCR-Profil).

Schmid et al. haben 1993 eine höhere Quote von identischen Stämmen (8 von 10) bei Partneruntersuchungen nachgewiesen. In seiner Studie zeigten alle 10 Frauen klinische Symptome einer Vaginitis. Im Gegensatz dazu, haben wir in unserer Studie eine ge-


91

mischte Population analysiert. Von den 12 Frauen mit Vaginitissymptomatik hatten 6 identische Stämme wie ihre Partner, während bei den 5 asymptomatischen Frauen keine identischen Stämme bei ihren Partnern nachgewiesen werden konnten. Bei den 4 Frauen ohne klinische Angaben stimmten bei 2 Patientinnen die Vaginalisolate und bei einer Patientin das Stuhlisolat mit den entsprechenden Partnerisolaten überein.

Der Befund, daß es keine besonderen Genotypen gibt, die in direktem Zusammenhang mit der Pathogenität bei C. albicans stehen, stimmt mit früheren Beobachtungen überein ( Lunel et al. 1998 , McCullough et al. 1996 , Meusel 1996 , Schönian et al. 1993a-b ). Das bedeutet, daß gleiche oder sehr ähnliche Stämme sowohl für die Besiedlung als auch für die Infektion des Vaginaltrakts verantwortlich sein können.

Bei 2 Patientinnen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten Candida-Spezies in der Vagina nachgewiesen. Bei Patientin 1/2 wurden verschiedene Isolate während zweier Vaginitis-Episoden beobachtet. Während jeder Episode stimmten die Isolate allerdings mit denen ihres Partners überein. Bei Patientin 9/5 wurden identische oder zumindest sehr ähnliche PCR-Fingerprints für die C. albicans-Stämme nachgewiesen, die während drei Episoden einer rezidivierenden Vaginitis isoliert wurden. Diese C. albicans-Stämme unterschieden sich jedoch von allen Isolaten, die vom Partner stammten.

In einer vergleichbaren Studie zur rezidivierenden Vulvovaginalcandidose haben Mercure et al. 1993 unter Verwendung von Bio- und DNA-Typisierungsmethoden keine Bio- oder Genotypen gefunden, die mit den rezidivierenden Prozessen oder die mit bestimmten Körperregionen assoziiert waren. Bei den Patientinnen persistierten in der Regel ähnliche Stämme in verschiedenen Körperregionen. Außerdem sprach die Rückfallrate von 86% dafür, daß meisten dieser Vaginalinfektionen eine endogene Quelle haben müssen.

Die zwei in unserer Studie untersuchten Fälle von rezidivierenden Candida-Vaginosen lassen keinen Schluß auf die möglichen Ursachen dieser Rezidive zu. Identische oder zumindest sehr ähnliche Stämme in den unterschiedlichen Episoden würden für eine endogene Ursache, unterschiedliche Stämme für eine exogene Übertragung sprechen.


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