de Andrade , Manuel Vieira Dias Pinto : ”Identifizierung von Candida-Spezies und -Stämmen durch den Nachweis von polymorphen DNA-Regionen in der PCR”

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Kapitel 5. ZUSAMMENFASSUNG

Ziel dieser Arbeit war es zu prüfen, ob und wenn ja in welcher Form molekularbiologische Methoden eine sinnvolle Ergänzung der konventionellen mykologischen Diagnostik bei Problemfällen und bei epidemiologischen Studien, insbesondere für Candida spp., darstellen können.

Aufgrund ihrer Bedeutung als allgemeiner, humanpathopotenter Erreger hat C. albicans größere Aufmerksamkeit auf sich gezogen als andere Candida-Spezies. Studien zur Epidemiologie von Candida-Infektionen waren bisher durch das Fehlen zuverlässiger und einfach durchführbarer Typisierungssysteme beschwert. Bis vor kurzem war z.B. nur wenig über die Ätiologie und die Epidemiologie der durch Candida verursachten Vaginitis bekannt, da die Möglichkeiten für einen Vergleich unabhängiger Isolate auf genetischer Ebene fehlten. In der Vergangenheit erfolgte die Stammdifferenzierung meist mittels Biotypisierung, aber diese Methode vergleicht Phänotypen und läuft deswegen in Gefahr, genetisch ähnliche aber phänotypisch unterschiedliche Stämme zu trennen und andererseits genetisch unterschiedliche aber phänotypisch identische Stämme zusammenzufassen. Dieses Problem wurde mit der Entdeckung des reversiblen ”switching“ Systems, welches den Phänotyp von C. albicans bei nahezu unverändertem Genotyp dramatisch verändern kann, besonders deutlich.

Molekulargenetische Methoden zur Charakterisierung von Candida-Spezies haben in den letzen Jahren einen großen Aufschwung genommen. Große Fortschritte wurden mit Hilfe dieser Techniken bei der Klärung von Taxonomie und Epidemiologie unterschiedlicher Candida-Spezies erreicht.

In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche molekularbiologische Methoden für die Identifizierung konventionell schwer differenzierbarer Candida-Arten und für den Vergleich von C. albicans-Stämmen eingesetzt. Bei der PCR-Fingerprint-Technik werden durch den Einsatz einzelner unspezifischer Primer Muster von Amplifikationsprodukten unterschiedlicher Größe erzeugt. Diese PCR-Muster sind generell speziesspezifisch, weisen aber auch stammspezifische Unterschiede auf. Durch Vergleich mit den Amplifikationsprofilen entsprechender Referenzstämme gestattet das PCR-Fingerprinting eine Speziesidentifizierung bei humanpathogenen Pilzen auch dann, wenn konventionelle Methoden versagen. Für die Charakterisierung von Candida-Isolaten haben sich die Primer T3B, dessen Sequenz aus dem intergenischen Spacer


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der tDNA stammt, und M13 Core-Sequenz, der sich an Minisatelliten-DNA anlagert, besonders bewährt. Mit beiden Primern können sowohl Spezies- als auch Stammunterschiede nachgewiesen werden. Für eine Identifizierung von Candida-Isolaten auf Speziesebene ist die Analyse der ”Internal Transcribed Spacer“-Region (ITS), die im ribosomalen Operon zwischen den Genen für die 18S rRNA und die 26S rRNA liegen und die das 5.8S rRNA-Gen einschließen, gut geeignet. Durch Amplifikation mit pilzspezifischen Primern und anschließendem Verdau des PCR-Produkts mit häufigschneidenden Restriktionsenzymen können die verschiedenen Candida-Spezies voneinander unterschieden werden. Diese Technik weist zwar keine Stammunterschiede nach, kann aber für den Nachweis und die Speziesidentifizierung direkt im klinischen Material, ohne vorherige Anzucht der Hefen, eingesetzt werden.

Beide molekularbiologischen Verfahren wurden in der vorliegenden Arbeit für Unterscheidung von routinemäßig schwer differenzierbaren klinischen Candida famata und Candida guilliermondii-Isolaten genutzt. Parallel wurden bei allen Isolaten die Pseudomyzelbildung auf Reisagar sowie die biochemischen Eigenschaften mit dem API ID 32C-System überprüft. Molekularbiologisch konnten von insgesamt 37 fraglichen Stämmen 31 als C. guilliermondii und 3 als C. famata identifiziert werden, die drei verbliebenen Stämme waren mit diesen Techniken wegen fehlender Referenzstämme nicht identifizierbar. Mit der Biochemotypie gelang nur die Zuordnung eines der drei C. famata-Isolate sowie von 23 der 31 C. guilliermondii-Isolate. 14 Isolate wurden mit den konventionellen Methoden gar nicht oder falsch identifiziert. Zu diesem Ergebnis trug besonders die fehlende bzw. fragliche Pseudomyzelbildung bei fast allen untersuchten Stämmen bei, die somit in unserem Stammgut ein völlig unzureichendes Kriterium für die Diskriminierung von C. guilliermondii und C. famata darstellte.

Mit dem PCR-Fingerprinting wurde auch die Spezieszugehörigkeit phänotypisch veränderter Candida albicans-Isolate überprüft. Alle atypischen Stämmen wurden trotz des Fehlens solcher für C. albicans charakteristischer Merkmale wie der Bildung von Chlamydosporen, der Verwertung der Aminozucker N-Acetylglukosamin und Glukosamin sowie der Assimilation von 2-Ketogluconat und Xylose als C. albicans identifiziert. Eine exakte Spezies-Differenzierung mittels phänotypischer oder genotypischer Merkmale ist notwendig, da es z. B. in Deutschland noch keine Standardisierung von Resistenztestungen für Sproßpilze gibt und die Wahl des Antimykotikums unter anderem von der isolierten Candida-Spezies abhängt.


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Unsere Studie hat gezeigt, daß die Methode der biochemischen Typisierung dann Grenzen hat, wenn typische Stoffwechselreaktionen nicht nachgewiesen werden können. Zum Ausfall derartiger Stoffwechselleistungen kann es sowohl durch Einzelmutationen in den Genen als auch durch die Hemmung der Expression der beteiligten Enzyme durch verschiedene Umweltfaktoren kommen. Genetische Methoden, insbesondere die Fingerprint-Techniken, die auf der Analyse mehrerer Genomabschnitte beruhen, sind dagegen in der Lage, auch Isolate mit veränderten morphologischen und physiologischen Eigenschaften sicher nachzuweisen.

Bei 6 verschiedenen Candida albicans-Populationen aus Angola (2 Populationen), Madagaskar, Deutschland (2 Populationen) und Portugal wurde die Variabilität phänotypischer und genotypischer Merkmale untersucht, wobei in diese Analyse neben C. albicans-Stämmen mit normalem Biotyp auch atypische Stämme miteinbezogen wurden. Während die phänotypischen Eigenschaften, bis auf die der atypischen Stämme, kaum variierten, wurden für die insgesamt 212 C. albicans-Isolate 87 unterschiedliche PCR-Fingerprint-Genotypen nachgewiesen. Dabei erwiesen sich die europäischen Populationen als weitaus variabler als die typischen und atypischen Populationen aus Afrika. Die typischen C. albicans-Populationen aus Europa und Afrika zeigten zwar keine grundsätzlich verschiedenen PCR-Muster, zwischen den unterschiedlichen Populationen wurden aber bis auf eine Ausnahme keine völlig übereinstimmenden Genotypen beobachtet. Die Analyse der Beziehungen zwischen den Fingerprint-Genotypen mit der UPGMA-Distanz-Methode ergab, daß die meisten Stämme zwei großen Gruppen, wenn auch statistisch nicht gesichert, zugeordnet werden können. Im Komplex I waren die meisten Stämme aus Berlin und München und im Komplex II viele afrikanische Stämme mit normalem Biotyp (AT) sowie fast alle portugiesischen Stämme (PO) zu finden. Alle atypischen Stämme aus Afrika bildeten einen gut separierten dritten Komplex. Die Ergebnisse des PCR-Fingerprintings unterstützen die Hypothese einer primär klonalen Populationsstruktur bei C. albicans, die basierend auf den Ergebnissen der Isoenzymanalysen und der Analyse anonymer PCR-Marker aufgestellt wurde.

Rezidivierende Episoden bei Candida-Vaginitis können sowohl durch Persistenz der Erreger nach Therapie als auch durch Reinfektion mit neuen Stämmen entstehen. In der vorliegenden Arbeit wurden C. albicans-Vaginalisolate mit Stämmen, die aus verschiedenen Körperregionen der Patientinnen und ihrer Partner stammten, miteinander verglichen. Dabei waren zwei Drittel der Frauen mit identischen C. albicans-Stämmen


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besiedelt bzw. infiziert, während von einem Drittel der Patientinnen unterschiedliche Stämme Isoliert wurden. Bei etwa der Hälfte Patientinnen wurden identische Isolate bei ihren Partnern nachgewiesen. Bei einer Patientin wurden verschiedene Isolate während zweier Vaginitis-Episoden beobachtet, die jedoch jeweils mit denen ihres Partners übereinstimmten. Bei einer anderen Patientin wurden während drei Episoden einer rezidivierenden Vaginitis identische oder zumindest sehr ähnliche C. albicans-Stämme isoliert, die sich aber von allen Isolaten ihres Partners unterschieden. Wir können also anhand unserer Ergebnisse zeigen, daß ein Stammaustausch zwischen den Partnern möglich ist, eine Reinfektion durch einen neuen Stamm stattfinden kann oder, daß ein Stamm ohne oder mit geringfügigen genotypischen Veränderungen trotz Therapie persistieren kann.

Das Problem der Erregeridentifizierung in der mykologischen Labordiagnostik ist sowohl klinisch als auch epidemiologisch (Erregerwandel) relevant. Molekularbiologische Methoden sollen gut funktionierende konventionelle Methoden zur Erregeridentifizierung nicht ersetzen, können aber bei Problemfällen eine wertvolle Ergänzung für die dermatomykologische Diagnostik vorzugsweise in fachständigen Referenzlaboratorien darstellen.


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Tue Apr 11 20:36:34 2000