de Andrade, Manuel Vieira Dias Pinto: ”Identifizierung von Candida-Spezies und -Stämmen durch den Nachweis von polymorphen DNA-Regionen in der PCR”

Aus der Dermatologischen Universitätsklinik und Poliklinik
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin


DISSERTATION
”Identifizierung von Candida-Spezies und -Stämmen
durch den Nachweis von polymorphen DNA-Regionen in der PCR”

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)

Vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Manuel Vieira Dias Pinto de Andrade ,
aus: Luanda

Dekan: Prof. Dr. med. M. Dietel

Gutachter:
Prof. Dr. med. H.-J. Tietz
Prof. Dr. med. H. C. Korting
Frau Prof. Dr. med. H. Bernardt

Datum der Promotion: 12.07.1999

Abstract

A PCR fingerprinting approach and a RFLP analysis of the amplified ITS region were used to differentiate Candida species and strains as well as to assess genetic and epidemiological relationships of strains belonging to the same species. The PCR fingerprinting amplifies anonymous DNA sequences sampled throughout the whole genome. The ITS region is part of the ribosomal operon which occurs in tandem arrays of nearly 50-100 copies in one cell.

1.a. Both methods were used to identify clinical isolates of C. famata and C. guilliermondii which were difficult to differentiate with routine methods. Out of 37 ambiguous isolates 31 could be identified as C. guilliermondii, 3 as C. famata and the other 3 were not identifiable. Biochemical typing (Api 32 C V.1) identified only 23 out of 31 C. guilliermondii and 1 out of 3 C. famata whereas 14 isolates were misidentified or not identified at all.

1.b. By using the PCR fingerprinting technique strains of C. albicans with altered phenotypes could be identified at species level. Atypical isolates which did not express those characteristics which are thought to be typical for C.albicans like the formation of clamydospores, the ability to metabolise the amino sugars glucosamine and N-acetylglucosamine as the sole carbon source or to assimilate 2-ketogluconate and xylose showed the PCR patterns typical for C.albicans. Our study revealed that biochemical and morphological methods of species identification are limited if some of the key reactions fail.

2. We investigated the variability of phenotypic and genotypic properties of 6 different C. albicans populations from different countries (Angola, Madagascar, Portugal and Germany) including atypical strains. Except for the atypical strains only very little phenotypical variation was observed. However, 87 different genotypes were found among the 212 strains. The relatedness of the fingerprint-genotypes were analysed by measuring genetic distances with the UPGMA method.

3. Vaginal isolates of Candida spp. obtained from patients with recurrent episodes of vaginitis were compared with isolates from different body locations of the women and from their male partners. It has been shown that strain exchanges between the partners occur, that the original strain with or without minor genotypic changes can persist despite of the therapy, but also that reinfection by a new strain is possible.

The identification of an ethiological agent by the mycological diagnostic laboratory is of clinical and epidemiological importance. Molecular biological methods should not replace well established conventional methods but they can supplement the identification of fungal pathogens in specialised reference laboratories if diagnosis cannot be achieved easily by conventional diagnostic procedures.

Keywords:
Candida, polymorfism, PCR, identification, ITS-region

Zusammenfassung

Für die Identifizierung bzw. Differenzierung von Candida- Spezies und -Stämmen sowie für die Bestimmung der genetischen und epidemiologischen Verwandtschaft von Stämmen der gleichen Spezies wurde eine PCR-Fingerprint-Technik und eine RFLP-Analyse der amplifizierten ITS-Region angewandt. Das PCR-Fingerprinting amplifiziert anonyme Sequenzen in der chromosomalen DNA, die über das gesamte Genom verteilt sind. Die ITS-Region ist Bestandteil des ribosomalen Operons, welches in ca. 50-100 Kopien/Zelle vorhanden ist.

1.a. Beide molekularbiologischen Verfahren wurden zur Unterscheidung von routinemäßig schwer differenzierbaren klinischen Candida famata und Candida guilliermondii-Isolaten genutzt. Von insgesamt 37 fraglichen Stämmen konnten 31 als C. guilliermondii und 3 als C. famata identifiziert werden, die drei verbliebenen Stämme waren mit diesen Techniken nicht identifizierbar. Mit der Biochemotypie gelang nur die Zuordnung eines der 3 C. famata-Isolate sowie von 23 der 31 C. guilliermondii-Isolate. 14 Isolate wurden mit den konventionellen Methoden gar nicht oder falsch identifiziert.

1b. Mit dem PCR-Fingerprinting wurde auch die Spezieszugehörigkeit phänotypisch veränderter Candida albicans-Isolate überprüft. Alle atypischen Stämme, bei denen solche für C.albicans charakteristischen Merkmale wie die Bildung von Chlamydosporen, die Verwertung der Aminozucker Glukosamin und N-Acetylglukosamin sowie die Assimilation von 2-Ketogluconat und Xylose nicht ausgeprägt waren, wiesen die für C. albicans typischen Fingerprintmuster auf. Unsere Studie zeigte, daß die biochemische Typisierung an Grenzen stößt, wenn typische Stoffwechselreaktionen nicht nachgewiesen werden können.

2. Bei 6 verschiedenen C. albicans-Populationen aus Angola, Madagaskar, Deutschland und Portugal wurde die Variabilität phänotypischer und genotypischer Merkmale untersucht, wobei in diese Analyse auch atypische Stämme miteinbezogen wurden. Während die phänotypischen Eigenschaften, bis auf die der atypischen Stämme, kaum variierten, wurden für die insgesamt 212 C. albicans-Isolate 87 unterschiedliche PCR-Fingerprint-Genotypen nachgewiesen. Eine Analyse der Beziehungen zwischen den Fingerprint-Genotypen wurde mit der UPGMA-Distanz-Methode durchgeführt.

3. Weiterhin wurden Candida-Vaginalisolate von Patientinnen mit rezidivierenden Episoden von Candida-Vaginitis mit Stämmen verglichen, die aus anderen Körperregionen stammten bzw. bei ihren Partnern isoliert wurden. Es konnte gezeigt werden, daß Stammaustausche zwischen den Partnern vorkommen, ein Stamm ohne oder mit geringfügigen genotypischen Veränderungen trotz Therapie persistieren kann und daß eine Reinfektion auch durch einen neuen Stamm möglich ist.

Das Problem der Erregeridentifizierung in der mykologischen Labordiagnostik ist sowohl klinisch als auch epidemiologisch relevant. Molekularbiologische Methoden sollen gut funktionierende konventionelle Methoden zur Erregeridentifizierung nicht ersetzen, können aber bei Problemfällen eine wertvolle Ergänzung für die mykologische Diagnostik vorzugsweise in fachständigen Referenzlaboratorien darstellen.

Schlagwörter:
Candida, Polymorphismus, PCR, Identifizierung, ITS-Region


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Inhaltsverzeichnis

Titelseite”Identifizierung von Candida-Spezies und -Stämmen durch den Nachweis von polymorphen DNA-Regionen in der PCR”
Widmung
1 EINLEITUNG
1.1.Biologie der Candida-Spezies
1.2.Epidemiologie der Candida-Infektionen
1.3.Verfahren zur Identifizierung von Candida-Spezies in der Routinediagnostik
1.3.1.Mikroskopie
1.3.2.Kultur
1.3.3.Biochemische Diagnostik
1.3.4.Serologische Methoden
1.3.5.Molekularbiologische Methoden
1.4.Verfahren zur Stammtypisierung bei Candida
1.5.Aufgabenstellung
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1.Material
2.1.1.Stämme
2.1.2.Primer
2.2.Methoden
2.2.1.Probengewinnung
2.2.2.Identifizierung mit konventionellen Methoden
2.2.2.1.Kulturelle Verfahren
2.2.2.2.Mikroskopie
2.2.2.3.Biochemische Differenzierung
2.2.2.3.1.API-System
2.2.3.Identifizierung mit molekularbiologischen Methoden
2.2.3.1. DNA-Präparation
2.2.3.2.DNA-Konzentrationsbestimmung und Lagerung der DNA-Proben
2.2.3.3.PCR-Fingerprinting (Polymerasekettenreaktion)
2.2.3.4.Amplifizierung und Restriktionsanalyse der ITS-Region
2.2.3.4.1.PCR zur Amplifizierung der ITS-Region
2.2.3.4.2.Restriktionsanalyse der ITS-Region
2.2.3.5.Nachweis der PCR-Produkte
2.2.3.5.1.Elektrophorese für das Fingerprinting
2.2.3.5.2.Elektrophorese des ITS-PCR-Produkts und des Restriktionsfragments
2.2.3.5.3.Fotografie
2.2.3.6.Computergestützte Analyse der PCR-Fingerprints
2.2.3.7.Computergestützte Auswertung der ITS-RFLP-Analysen
2.2.4.Rezepte
3 ERGEBNISSE
3.1.Methoden zur konventionellen Identifizierung der Candida-Isolate
3.2.Konventionelle und molekularbiologische Identifizierung schwer differenzierbarer Candida-Stämme
3.2.1.Differenzierung von C. guilliermondii und C. famata
3.2.1.1.Ergebnisse konventioneller Identifizierungsmethoden
3.2.1.2.Ergebnisse molekularbiologischer Identifizierungsmethoden
3.2.1.2.1.PCR-Fingerprinting
3.2.1.2.2.Restriktionsanalyse der amplifizierten ITS-Region
3.2.1.2.3.Vergleich der Ergebnisse konventioneller phänotypischer und molekularbiologischer Methoden für die Identifizierung von C. guilliermondii und C. famata
3.2.2.Identifizierung von Candida albicans-Stämmen mit atypischen morphologischen und biochemischen Eigenschaften
3.2.2.1.Ergebnisse konventioneller Identifizierungsmethoden
3.2.2.2.Ergebnisse des PCR-Fingerprintings
3.3.Charakterisierung von C. albicans-Vaginalisolaten aus Afrika und Europa
3.3.1.Phänotypische Charakterisierung mit den in der Routinediagnostik angewendeten konventionellen Methoden
3.3.2.Genetische Charakterisierung mit dem PCR-Fingerprinting
3.4.Vergleichende Untersuchung von Candida-Stämmen isoliert von Patientinnen mit Vaginalcandidose und ihren Partnern
3.4.1.Phänotypische Charakterisierung mit den in der Routinediagnostik angewendeten konventionellen Methoden
3.4.2.Genetische Charakterisierung mit dem PCR-Fingerprinting
4 DISKUSSION
4.1.Identifizierung konventionell schwer differenzierbarer Candida-Stämme mit molekularbiologischen Methoden
4.1.1.Differenzierung von C. guilliermondii / C. famata-Isolaten von dermatologischen Patienten
4.1.2.Identifizierung von Candida albicans-Stämmen mit atypischen morphologischen und biochemischen Eigenschaften
4.2.Vergleichende genotypische Charakterisierung von C.albicans-Vaginalisolaten aus Afrika und Europa
4.3.Vergleichende Untersuchung von Candida-Stämmen isoliert von Patientinnen mit Vaginalcandidose und ihren Partnern
5 ZUSAMMENFASSUNG
Bibliographie LITERATUR
Selbständigkeitserklärung
Lebenslauf
Danksagung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Medizinisch relevanten Candida-Arten (nach M. G. Rinaldi, modifiziert)
Tabelle 2. Anamorph-teleomorphe Verwandtschaften für medizinisch relevante Candida-Spezies (nach M. G. Rinaldi)
Tabelle 3: Methoden für die Direktuntersuchung von Proben zum Nachweis von Candida spp. im mikrobiologischen Routinelabor
Tabelle 4: Molekularbiologische Methoden für die Identifizierung von Candida-Spezies.
Tabelle 5: PCR-Verfahren für den direkten Nachweis von Candida spp. aus Patientenmaterial.
Tabelle 6: Herkunft der klinischen Stämme
Tabelle 7: Referenzstämme
Tabelle 8: Verwendete Primer. Hersteller: TIB MOLBIOL, Berlin
Tabelle 9: PCR-Ansätze
Tabelle 10: PCR-Programme für das DNA-Fingerprint
Tabelle 11: PCR Ansatz zur Amplifizierung der gesamten ITS-Region
Tabelle 12: Zyklerprogramm der PCR zur Amplifizierung der gesamten ITS-Region
Tabelle 13: Ansatz zur enzymatischen Spaltung der amplifizierten ITS-Region mit den Restriktionsenzymen Hae III und Dde I
Tabelle 14: Verwendete Chemikalien:
Tabelle 15: Verwendete Geräte:
Tabelle 16: Zusammenfassung der Ergebnisse konventioneller und molekularbiologischer Methoden für die Identifizierung fraglicher C.guilliermondii/ C.famata- Isolate
Tabelle 17: Atypische Candida-Isolate aus Deutschland
Tabelle 18: Atypische Candida-Isolate aus Angola
Tabelle 19: Atypische Candida-Isolate aus Madagaskar
Tabelle 20: Candida albicans-Populationen aus Afrika und Europa
Tabelle 21: PCR-Fingerprint-Genotypen, die bei mehr als drei unterschiedlichen C. albicans-Stämmen nachgewiesen wurden (0 = Bande nicht vorhanden, 1 = Bande vorhanden).
Tabelle 22: Ergebnisse nach Biotypisierung mit konventionellen Methoden
Tabelle 23: Ergebnisse des PCR-Fingerprinting für die von gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern isolierten Candida-Stämme
Tabelle 24: Zusammenfassung der Daten der biochemischen Charakterisierung der Biotypen 1 und 2 von C. albicans sowie der atypischen Stämme aus der Mundhöhle HIV-Infizierter anhand der Prozentualtabelle der BioMerieux Datenbank (Salkin et al. 1998).

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Beispiele für Morphotypen von Candida albicans. Quelle: WWW-Server für C. albicans [ 160 ].
Abbildung 2: Candida albicans und non-albicans Arten auf dem Nährboden ALBICANS ID-Agar®
Abbildung 3: Mit Candida Arten beimpfte Reisagar-Platte
Abbildung 4: Auf Reisagar angezüchtet C. albicans mit Hyphen (H) und Chlamydosporen (C).
Abbildung 5: PCR-Fingerprint-Muster ausgewählter C.famata/ C.guilliermondii-Isolate erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B.
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Gesamt-ITS-Region mit der Lokalisation der in der PCR verwendeten Primer.
Abbildung 7: Amplifizierung der ITS-Regionen von C. guilliermondii /C. famata mit den Primern SR6R und LR1
Abbildung 8: Spaltung der amplifizierten ITS-Regionen von C. famata und C. guilliermondii mit den Restriktionsendonukleasen Hae III (a) und Dde I (b).
Abbildung 9: Chronisch rezidivierende Onychomykose bei der Patientin S.C.
Abbildung 10: Stamm der Patientin S.C. ohne Pseudomyzelbildung auf Reisagar
Abbildung 11: PCR-Fingerprint-Muster ausgewählter C.famata/ C.guilliermondii-Isolate erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B.
Abbildung 12: Spaltung der amplifizierten ITS-Regionen von C. famata und C. guilliermondii mit der Restriktionsendonuklease Hae III.
Abbildung 13: C. albicans-Stämme auf Reisagar, (A) mit und (B) ohne Chlamydosporenbildung.
Abbildung 14: ID-32C-Profil von typischen C. albicans des Biotyps 1 (A) und von atypischen NAG-negativ Stämmen (B).
Abbildung 15 PCR-Fingerprint-Muster 2KG- und XYL-negativer Candida-Isolate aus Deutschland erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B
Abbildung 16: PCR-Fingerprint-Muster atypischer Candida-Isolate aus Afrika erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B.
Abbildung 17 PCR-Fingerprint-Muster ausgewählter C. albicans-Isolate aus Afrika, Deutschland und Portugal erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B.
Abbildung 18: Phylogenetische Beziehungen zwischen C. albicans-Stämmen unterschiedlicher geographischer Herkunft ermittelt mit der UPGMA-Distanz-Methode. Die statistische Relevanz der Gruppierungen wurde durch eine Bootstrap-Analyse geprüft. Nur Boostrap-Werte höher als 50% sind in dem Dendrogramm angezeigt.
Abbildung 19: PCR-Fingerprint-Muster der Candida-Isolate von 4 gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B
Abbildung 20: PCR-Fingerprint-Muster der Candida-Isolate von 5 gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B
Abbildung 21: PCR-Fingerprint-Muster der Candida-Isolate von 4 gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B
Abbildung 22: PCR-Fingerprint-Muster der Candida-Isolate von 7 gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B
Abbildung 23: PCR-Fingerprint-Muster der Candida-Isolate von 3 gynäkologischen Patientinnen und ihren Partnern erhalten durch Amplifizierung mit Primer T3B
Abbildung 24: Vergleich der von den Vaginalisolaten verschiedener Patientinnen erhaltenen PCR-Fingerprint-Muster (Primer T3B)

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