Bohm, Birgit: ”Differentielle Rekrutierung der Isoformen des kleinen G-Proteins Rho bei der Invasion von Shigellen in Epithelzellen“

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Kapitel 1. Einleitung

Die Bakterien der Gattung Shigella sind die Erreger der Bakterienruhr beim Menschen. Shigellen sind unbegeißelte und damit unbewegliche, gramnegative, fakultativ anaerobe Stäbchenbakterien. Phylogenetisch der Gattung Escherichia eng verwandt gehören sie zur Familie der Enterobacteriaceae. 1 , 2

Biochemisch werden vier Shigella Spezies voneinander abgegrenzt: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii und S. sonnei. Eine weitere Unterteilung der Spezies in Serovare beruht auf dem Vorhandensein spezifischer O-Antigene. Bei S. dysenteriae werden 10 Serovare, bei S. flexneri 11 Sero- und Subserovare und bei S. boydii 15 Serovare unterschieden. S. sonnei ist serologisch einheitlich.

Die bakterielle Ruhr, vorwiegend verursacht durch S. sonnei und S. flexneri, ist weltweit endemisch verbreitet. Hervorgerufen durch S. dysenteriae kann sie aber auch in epidemischer Form auftreten.

In den Industriestaaten Mitteleuropas gehören die Shigellen mit einer Inzidenz von etwa 10 Fällen/ 100 000 Einwohner/Jahr zu den eher seltenen Erregern bakterieller Durchfallerkrankungen. In Deutschland wurden 1997 insgesamt 1926 Fälle gemeldet, wobei Verdacht, Erkrankung und Tod meldepflichtig sind. 3

Der natürliche Lebensraum der Shigellen ist der Darm des Menschen. An Shigellose Erkrankte sind daher die Infektionsquelle. Ansteckungsgefahr besteht hauptsächlich während der ersten 2-3 Tage post manifestationem bis zu maximal sechs Wochen nach klinischer Genesung. Die Übertragung der Shigellen erfolgt direkt fäkal-oral über Schmierinfektion oder über kontaminierte Nahrungsmittel bzw. mit Fäkalien verunreinigtes Wasser. Kennzeichnend ist eine sehr geringe minimale Infektionsdosis von 10-100 virulenten Bakterien. 4 Im Gegensatz zu anderen Enterobakterien besitzen Shigellen eine relative Säureresistenz, so daß ihre Keimzahl während der Magenpassage nicht wesentlich reduziert wird. 5 Die Inkubationszeit beträgt 1-3 Tage.

Pathologisch-anatomisch handelt es sich bei der Shigellose um eine Kolitis. Die Eintrittspforte der Bakterien sind M-Zellen, spezialisierte Epithelzellen über den Lymphfollikeln, den Peyerschen Plaques. 6 , 7 Verbunden mit der Invasion der Shigellen in die Zellen der Darmschleimhaut kommt es zur Auslösung inflammatorischer Reaktionen. Gefäßläsionen, Mikroabszesse und membranartig belegte Ulzera der Kolonschleimhaut sowie herdförmige Blutungen ausgedehnter Geschwüre charakterisieren patho-histologisch das Vollbild der Infektion. 8 , 9 , 10

Klinisch zeigt die Shigellose eine vielfältige Symptomatik. 11 Die Verläufe variieren von oligosymptomatisch schleichend bis zu foudroyant toxischen Formen. Uncharakteristische Prodomi, wie Kopf- und Gliederschmerzen, Müdigkeit, Inappetenz und erhöhte Temperatur kennzeichnen den Beginn der Erkrankung, deren klassisches Bild durch die drei Symptome akutes Fieber bis 40°C, Tenesmen mit Stuhldrang und initial profuse, später blutige Durchfälle geprägt wird. Gewöhnlich heilt die Shigellose unbehandelt nach einer Dauer von 1-2 Wochen aus. Seltene lokale Komplikationen der akuten Phase der Erkrankung sind das toxische Megakolon und die Darmperforation mit der Gefahr einer kotigen Peritonitis. Systemische Manifestationen in Form von Exsikkose, Sepsis, hämolytisch-urämischem Syndrom, Enzephalopathie und Krampfanfällen sind ebenfalls selten und werden vorwiegend bei Kindern beobachtet. 12 Als postinfektiöse Spätkomplikationen, die innerhalb einer Woche bis zu mehreren Monaten nach Beginn der intestinalen Symptomatik auftreten, werden die Reaktive Arthritis und das Reiter-Syndrom beschrieben.


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Die Mechanismen, mit deren Hilfe Shigella flexneri die Darmschleimhaut infiziert, sind seit längerer Zeit Gegenstand bakteriologischer Pathogenitätsforschung. Ein wesentlicher Virulenzfaktor von Shigella flexneri ist die Fähigkeit zur Invasion von Darmepithelzellen. 13 Das Studium der molekularen und zellulären Grundlagen der Zellinvasion erfolgt vorwiegend am Zellkulturmodell etablierter Epithelzellinien, wie Henle 407, HeLa, T84 oder Caco2. Die Ergebnisse dieser in-vitro an epithelialen Zellmonolayern durchgeführten experimentellen Arbeiten, können anschließend in-vivo durch den Einsatz der Mutanten im Sereny-Test und dem Makaken-Modell, dem besten Tiermodell für die humane Shigellose, verifiziert werden. Während der Sereny-Test durch Inokkulation der virulenten Shigellen in den Konjunktivalsack von Meerschweinchen eine ulzeröse Keratokonjunktivitis hervorruft, führt die intragastrische Inokkulation der Shigellen bei Makaken zum klinischen Bild der Shigellose. 14 , 15 ,- 16

Auf bakterieller Seite ist die Epithelzellinvasion durch Shigella flexneri bereits sehr gut erforscht. 17 , 18 , 19 Genetische Grundlage des virulenten Phänotyps der Shigellen ist ein 220 kb Virulenzplasmid. 20 Untersuchungen haben gezeigt, daß die gesamte genetische Information für die Expression des invasiven Phänotyps auf einem 31 kb-Fragment des Virulenzplasmids lokalisiert ist. 21 Dieses Fragment enthält 32 Gene, u. a. ipgC, ipaA, ipaB, ipaC und ipaD sowie die Mehrheit der mxi-spa Gene. Die ipa-Gene kodieren für die Ipa-Proteine IpaA, IpaB, IpaC und IpaD, die als erstes im Zusammenhang mit der durch sie hervorgerufenen Immunantwort der Infizierten beschrieben wurden. 22 Sie sind die bedeutendsten bakteriellen Proteine für den Invasionsvorgang. 23 , 24 , 25 , 26 Die Ipa-Proteine befinden sich überwiegend im Zytosol der Bakterienzelle. IpaB und IpaC liegen dabei an das Chaperon IpgC gebunden vor. Nach Wahrnehmung der Epithelzellen seitens der Shigellen sezernieren diese einen Proteinkomplex, der die Invasionsproteine IpaB, IpaC und weitere, noch nicht identifizierte Proteine enthält, zu denen auch IpaA gehören könnte. 27 , 28 Dieser Sekretionsvorgang ist Wachstumsphasen-abhängig. 29 Die Sekretion des Proteinkomplexes erfolgt über einen von den Mxi- und Spa-Proteinen gebildeten Sekretionsapparat. 30 , 31 , 32 Es wurde gezeigt, daß die sezernierten Ipa-Proteine an der Regulation ihrer eigenen Sekretion beteiligt sind, da IpaB und IpaD den Sekretionsvorgang in Abwesenheit stimulierender Signale verhinderten. 33 Stimuliert wird die Sekretion durch Glykoproteine der den Epithelzellen aufliegenden extrazellulären Matrix, wie Fibronectin, Laminin und Kollagen Typ IV. 28 Weiterhin wurde gezeigt, daß die Bindung des sezernierten IpaB/IpaC-Komplexes an Latex-Partikel von Bakteriengröße in-vitro zu deren zellulärer Aufnahme führte. 34 Die Aufnahme der Latex-Partikel ging mit einer Reorganisation des zellulären Zytoskeletts einher und glich somit dem für Shigellen beschriebenen erregerspezifischen Infektionsprozeß, der gekennzeichnet ist durch eine vom Bakterium induzierte Aufnahme über einen Phagozytose-ähnlichen Mechanismus. 35

Shigella flexneri kann offenbar verschiedene Zellen im Colon infizieren. Die ersten Zielzellen sind M-Zellen, spezialisierte Darmepithelzellen der Peyerschen Plaques. 36 Nachdem Shigellen die M-Zellen durchwandert haben, werden sie von den die M-Zellen umgebenden Makrophagen phagozytiert. Nach Auflösung der Phagosomenmembran induzieren sie über Aktivierung des Interleukin-1beta converting enzyme die Apoptose der Makrophagen. 37 , 38 Beide Vorgänge sind IpaB-abhängig und führen zu einer massiven IL-1beta - Freisetzung durch die Makrophagen und letztlich durch deren Untergang ebenfalls zur Freisetzung der Shigellen. 39 , 40 , 41 Welche Bedeutung nicht-programmierten Formen des Zelltodes in diesem Prozeß zukommt ist derzeit ungewiß. 42 Die Infektion der M-Zellen ist notwendig, da Shigellen Enterozyten nicht über deren apikalen Pol infizieren können. Nur am basolateralen Pol können sie in Epithelzellen eindringen. 43 Die Infektion der Enterozyten über den


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basolateralen Pol kann einerseits von benachbarten M-Zellen aus erfolgen und andererseits nach Freisetzung aus den Makrophagen. Eine dritte Möglichkeit des bakteriellen Zugangs zum basolateralen Pol der Enterozyten bietet die durch Interleukin-1beta ausgelöste Einwanderung von Granulozyten in das Infektionsgebiet. Die Migration der Granulozyten in Richtung des Darmlumens bewirkt eine Öffnung epithelialer Zell-Zell-Verbindungen, die es luminalen Shigellen ermöglicht, den basolateralen Pol der Enterozyten auf direktem Weg zu erreichen. 44

Durch den Einsatz spezifischer Antikörper, die zu einer Inhibition der Interleukin-1 vermittelten Signaltransduktion führten oder die Transmigration der Granulozyten blockierten, konnte die bakterielle Invasion erheblich reduziert werden. Dies beweist, daß die durch Infektion der Makrophagen ausgelöste inflammatorische Reaktion in der Pathogenese der Shigellose einen hohen Stellenwert einnimmt. 6 , 45

Kürzlich wurde veröffentlicht, daß Shigella-LPS, das polarisierten Epithelien an ihrer apikalen Membran präsentiert wurde, via Transzytose durch die Epithelzelle zu einer Attraktion von Granulozyten führe und somit der Infektion der M-Zellen vorangehe. 46

Die in die Enterozyten eingedrungenen Bakterien lysieren die Vakuolenmembran und gelangen so in das Zytoplasma der Zelle. Dort vermehren sie sich mit einer Generationszeit von 40 Minuten. 47 Die unbegeißelten Shigellen werden intrazellulär unter Ausnutzung physiologischer Funktionen der Epithelzelle bewegt. Dabei unterscheidet man den ”organelle-like-movement“-Bewegungstyp ( OLM ), bei dem die Bakterien entlang von zellulären Mikrofilamenten bewegt werden, vom icsA- ( intra- and intercellular spread ) abhängigen Bewegungstyp. 48 , 49 , 50 IcsA ist ein bakterielles Protein, das über eine Induktion von Aktinpolymerisation zur Ausbildung eines Aktinschweifs an einem Pol des Bakteriums führt, der das Bakterium vor sich herschiebt. IcsA ist bedeutsam für die Infektion von Nachbarzellen und somit für die interzelluläre Ausbreitung der Shigellen. Die Infektion der Nachbarzellen erfolgt über die Ausbildung hochorganisierter Zell-Zell-Kontakte mit bakteriellen Protrusionen von der infizierten in die zu infizierende Zelle. 51 Die bakteriellen Protrusionen sind von einer Doppelmembran umgeben, die von der Zellmembran der infizierten Zelle und der Membran der Nachbarzelle gebildet wird. Durch Lyse dieser Doppelmembran erhalten die Shigellen Zugang zum Zytoplasma der Nachbarzelle. IcsA-negative Mutanten infizierten in-vitro zwar Epithelzellen über deren basolateralen Pol, sie waren jedoch nicht mehr infektiös für die umgebenden Nachbarzellen. Ebenso führte der Einsatz der icsA-Mutanten im Makakenmodell histopathologisch und klinisch nicht zum Bild der Shigellose bei den Affen, sondern nur zu einer lokalisierten perifollikulären Entzündung, die mit einer milden dysenterischen Symptomatik einherging. 16 Da icsA-Mutanten M-Zellen infizieren können und durch die Infektion von Makrophagen inflammatorische Reaktionen hervorrufen können wird offensichtlich, daß nicht nur die bakteriell ausgelöste Entzündungsreaktion ein entscheidender Pathogenitätsfaktor für die Entstehung der Shigellose ist, sondern auch die intraepitheliale Ausbreitung der Bakterien. Es ergibt sich die Schlußfolgerung, daß die Enterozyten der Kolonschleimhaut die eigentlichen Wirtszellen der Shigellen sind. Diese These wird unterstützt durch den Nachweis, daß die infizierten Epithelzellen im Gegensatz zu den infizierten Makrophagen nicht geschädigt werden. Die Replikation der Shigellen in HeLa-Zellen führte weder zu einer Aktivierung stressinduzierter Stoffwechselvorgänge noch zu sichtbaren Zeichen von Apoptose. 52

Die über intra- und interzelluläre Ausbreitung der Shigellen erfolgte massive bakterielle Infektion der Epithelzellen führt letztendlich zu einer schweren Kolitis mit Dysenterie. Eine systemische Ausbreitung der Shigellen im menschlichen Organismus wird nur selten beobachtet. Die durch Apoptose der Makrophagen


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ausgelöste inflammatorische Reaktion, die initial die Invasion von Shigella begünstigt, führt zu einer schnellen Demarkierung des Infektionsgebietes und einer beschleunigten Ablösung der infizierten Epithelzellschicht und damit zur Exkretion des Erregers aus dem Intestinaltrakt. 6 , 45

Die Infektion der Epithelzellen durch Shigella flexneri beginnt mit einer bislang nicht definierten Zell-Zell-Interaktion. Eine Adhärenz der Bakterien an die Zellen ist in-vitro kaum nachweisbar. 35 Die sich anschließende Invasion ist Ausdruck des erregerspezifischen Infektionsprozesses, der gekennzeichnet ist durch eine vom Bakterium induzierte zelluläre Aufnahme über einen Phagozytose-ähnlichen Mechanismus. 35 Charakteristisch für diesen Invasionsprozeß ist einerseits, daß die Internalisation von Shigella nicht mit einer Erhöhung der zytosolischen Ca2+-Konzentration einhergeht. 53 Andererseits ist die bakterielle Invasion abhängig von einer grundlegenden Funktion des Zytoskeletts der Epithelzelle, der Aktinpolymerisation. Durch Vorbehandlung der Zellen mit Cytochalasin B, einem Inhibitor der Aktinpolymerisation, konnte die Aufnahme des Erregers in-vitro verhindert werden. 54 Außerdem wurde die Induktion der zellulären Aktinpolymerisation durch Shigella flexneri direkt gezeigt. 35

Die Bedeutung des zellulären Zytoskeletts im Infektionsprozeß wird unterstrichen durch die mit Hilfe der Elektronenmikroskopie sichtbaren morphologischen Strukturen während der Invasion, die die bakterieninduzierten Veränderungen des Zytoskeletts eindrucksvoll widerspiegeln. Die Shigella-induzierten Verwerfungen der Zytoplasmamembran der Epithelzellen beim Eindringen des Bakteriums wurden mit der Ausbildung von ”membrane ruffles“ in Verbindung gebracht. 55 ”Membrane ruffles“ entstehen in klassischer Weise infolge zellulärer Rezeptorstimulation durch Wachstumsfaktoren wie EGF und PDGF. 56 Für Shigella ist eine direkte Interaktion der Bakterien mit zellulären Rezeptoren bisher nicht nachgewiesen. Möglicherweise findet eine Rezeptorstimulation durch sezernierte bakterielle Produkte statt, denn es wurde gezeigt, daß in CHO Zellkulturen die sezernierten Ipa-Proteine von Shigella flexneri an alpha5beta1 Integrinrezeptoren der Zellen binden. 57 Integrine sind Membranproteine, die extrazelluläre Signale ins Zellinnere weiterleiten und in enger Verbindung zu Zelladhäsionsplaques, einem wesentlichen Bestandteil des Zytoskeletts, stehen. 58 Die durch S. flexneri bewirkte Ausbildung von ”membrane ruffles“ weist im Gegensatz zu der klassischen, EGF-induzierten Form einige Besonderheiten auf. 56 Es handelt sich hierbei um eine das Bakterium umgebende blütenartige Membranstruktur mit Pfeilerarchitektur. 59 Die Pfeiler werden von Protrusionen der Epithelzelle gebildet. Sie entstehen um das Bakterium herum, folgen jedoch nicht exakt dessen Form. Die Zytoplasmamembran verbindet die Pfeiler untereinander, erreicht dabei aber nicht immer die Höhe der Pfeilerspitzen, die somit sichtbar bleiben. Die zellulären Protrusionen konfluieren über dem Bakterium und internalisieren es. Mit der Bildung des Phagosoms ist die Invasion beendet. Mittels S1-Myosin-Markierung von F-Aktin wurde gezeigt, daß die seitlich des Bakteriums entstehenden Protrusionen angefüllt sind mit langen, parallel angeordneten Aktinfilamenten. Die positiven Enden der Aktinfilamente sind zur Plasmamembran hin orientiert, während die negativen Enden zum Zellinneren zeigen. Die Aktinfilamente entstehen infolge der nach initialem Kontakt zwischen Bakterium und Wirtszelle einsetzenden Ausbildung von Aktinnukleationszonen und einer de-novo Aktinpolymerisation unterhalb des Bakteriums und neben dem Bakterium. Die Bündelung der Aktinfilamente in den Protrusionen erfolgt durch die T-Isoform von Plastin, die an die bakterielle Eintrittsstelle rekrutiert wird. 59


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Die beschriebene Invasions-assoziierte Zytoskelettreorganisation durch Shigella und die anhand von Plastin nachgewiesene Rekrutierung eines orientierungssensitiven Aktin-bündelnden Proteins an den bakteriellen Invasionslocus führte zur Suche nach Bindegliedern zwischen bakteriellen Signalen und den Veränderungen des zellulären Zytoskeletts. Von besonderem Interesse waren in diesem Zusammenhang die kleinen G-Proteine der Rho-Familie. 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 Zu dieser Proteinfamilie gehören Rho, Rac, CDC42 und TC10. Diese Proteine sind GTPasen mit einem Molekulargewicht von 20-24 kDa. Sie besitzen die Fähigkeit, Guaninnukleotide zu binden und zu hydrolysieren. Im GTP-gebundenem Zustand sind sie biologisch aktiv und im GDP-gebundenem Zustand inaktiv. Der Übergang von der einen in die andere Form wird durch verschiedene Regulationsproteine bewirkt. Zu diesen Regulatoren gehören GTPase aktivierende Proteine ( GAP’s ) und Guanin-Nukleotid Austausch Faktoren ( GEF’s ). Während GEF’s den Austausch von GDP gegen GTP fördern und somit die biologische Aktivität der GTPasen, stimulieren GAP’s die GTPase-Aktivität der Rho-Proteine und damit den Übergang in die inaktive Form. 67 , 68 Weitere negative Regulatoren der Rho-Aktivität sind GDP-Dissoziations-Inhibitoren ( GDI’s ). Diese Proteine verhindern den GDP/GTP-Austausch. Zusätzlich beeinflussen die GDI’s die Lokalisation der Rho-Proteine innerhalb der Zelle, indem sie sie im GDP-gebundenem Zustand zytosolisch stabilisieren. 69 , 70 , 71 , 72 , 73 , 74

Neben diesen physiologischen Regulatoren kann die Aktivität kleiner G-Proteine der Rho-Familie durch eine Vielzahl bakterieller Toxine beeinflußt werden. 75 Einige Toxine führen zu einer Stabilisierung der GTPasen im aktiven, GTP-gebundenen Zustand, wie beispielsweise CNF1 ( Cytotoxic necrotizing factor 1 ) von E. coli. Die Wirkung von CNF1 beruht dabei auf der Desaminierung von Glutamin an Position 63 von Rho bzw. Glutamin 61 von CDC42. Diese Desaminierung führt zu einer funktionellen Aktivierung, da die intrinsische wie die GAP stimulierte GTPase-Aktivität inhibiert werden. 76 , 77 , 78 Eine monospezifische Aktivierung von Rho ist für das Toxin CNF2 von E. coli nachgewiesen worden. 79 Die bakteriellen Toxine, die eine Inhibition kleiner Rho-Proteine verursachen, werden in die beiden Gruppen der großen Clostridien-Toxine ( Molekulargewicht um 270 kDa ) und der C3-artigen Exoenzyme ( Molekulargewicht um 25 kDa ) eingeteilt. Zu der ersten Gruppe gehören Toxin A und B von Clostridium difficile, die eine Glukosylierung der Aminosäure Threonin an Position 37 bzw. 35 hervorrufen. Sie wirken an Rho, Rac und CDC42. 80 , 81 , 82 , 83 Die Toxine der zweiten Gruppe sind monospezifische Inhibitoren für Rho. Sie erzielen ihre Wirkung über die ADP-Ribosylierung von Asparagin an Position 41 im Rho-Molekül. 84 Vertreter dieser Gruppe sind Clostridium limosum Transferase, Staphylococcus aureus Transferase ( EDIN ), Bacillus cereus Transferase und der Namensgeber dieser Gruppe, das Exoenzym C3 von Clostridium botulinum. 75 , 85 , 86 , 87 , 88 , 89

Der Effekt von Rho-GTPasen auf das Zytoskelett ist am besten in Fibroblasten untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß die EGF vermittelte Entstehung von ”membrane ruffles“ Rac-abhängig ist. 56 CDC42 ist an der Ausbildung von Filopodien beteiligt. 90 Zu den biologischen Funktionen von Rho gehört die Ausbildung von Zelladhäsionsplaques sowie von ”stress fibers“. 91 Aber auch für Rho konnte die Induktion von ”membrane ruffling“ durch Stimulation von KB Zellen mit HGF oder TPA gezeigt werden. 92

Die komplexe Zytoskelettstruktur an der bakteriellen Eintrittsstelle mit ihren eng gebündelten Aktinfilamenten ließ an eine Verwandtschaft mit Rho-abhängigen Zytoskelettstrukturen ( ”stress fibers“, Zelladhäsionsplaques ) denken. Deshalb wurde Rho auf eine mögliche Rolle bei der Shigellen-Invasion untersucht. Durch den Einsatz des Rho-spezifischen Inhibitors C3 konnte zunächst in quantitativen Studien der Nachweis erbracht werden, daß die Funktion dieser kleinen GTPase für die Epithelzellinvasion der Shigellen essentiell ist. 93 , 94


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Erkenntnisse über die biologischen Funktionen von Rho wurden überwiegend durch Mikroinjektion von C3, Rho-GDI, GTPgammaS-Rho, RhoVal 14 oder RhoGAP p190 gewonnen. 95 , 96 , 97 , 98 GTPgammaS-Rho und RhoVal 14 stellen dabei aktive Rho-Formen dar. Bislang wurden die Untersuchungen fast ausschließlich mit RhoA durchgeführt, obwohl mehrere Isoformen von Rho beschrieben sind. Drei dieser Isoformen, RhoA, RhoB und RhoC, werden in allen bisher untersuchten Geweben exprimiert. 99

RhoA-Aktivität steht sowohl im Zusammenhang mit der Bildung von Protein-Proteinkomplexen, wie Zelladhäsionsplaques und Cadherin vermittelten Zell-Zell-Verbindungen als auch mit der Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts, sichtbar an Aktinpolymerisation und der Ausbildung von ”stress fibers“. 91 , 100 , 101 Weitere Funktionen von Rho betreffen den Phospholipidstoffwechsel und die Phosphorylierung von Proteinen. Phospholipide und Proteinphosphorylierung gehören neben Kalzium und Calmodulin zu den Regulatoren der Interaktion vieler Aktin-bindender Proteine mit G- oder F-Aktin. Aktiviertes RhoA bewirkt eine Aktivierung von Phospholipase D, Phosphatidylinositol 3-Kinase und Phosphatidylinositol 4-Phosphat 5-Kinase. 102 , 103 , 104 , 105 Die Aktivierung der Phosphatidylinositol 4-Phosphat 5-Kinase führt zur Synthese von Phosphatidylinositoldiphosphat ( PIP2 ). PIP2 bindet u. a. Profilin, Vinculin und alpha-Actinin. Die Bindung von PIP2 an Profilin, ein G-Aktin bindendes Protein, bewirkt die Dissoziation von Profilin und G-Aktin. G-Aktin steht damit für die Polymerisation zur Verfügung. Vinculin verankert das Zytoskelett in der Zellmembran durch gleichzeitige Bindung von Talin oder alpha-Actinin und F-Aktin. Eine Bindung von PIP2 mit Vinculin führt zu einer Konformationsänderung von Vinculin, die die Bindungsaffinität für F-Aktin und Talin erhöht. 106 Auch die Funktion der ERM-Proteine ( Ezrin, Radixin, Moesin ) wird von PIP2 beeinflußt. Die Proteine der ERM-Familie stellen wie Vinculin Verbindungselemente zwischen Aktinfilamenten und der Plasmamembran dar. 107 , 108 Der N-Terminus dieser Proteine stellt die Verbindung zu zellulären Oberflächenproteinen her, wie CD44, CD43 oder der H+/K+ ATPase. 109 , 110 , 111 Der C-Terminus ist für die Interaktion mit den Aktinfilamenten verantwortlich. C- und N-Terminus inhibieren gegenseitig ihre Funktion. Diese gegenseitige Funktionsbehinderung wird durch PIP2-Bindung aufgehoben. 111 In MDCK Zellen, die RhoA exprimierten, zeigte RhoA eine Kolokalisation mit ERM-Proteinen in ”membrane ruffling areas“ und Zelladhäsionsplaques. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß die Assoziation von ERM und Vinculin mit der Plasmamembran RhoA-Aktivität voraussetzt. 112 , 113

Die Etablierung fokaler Adhäsionskomplexe und die Induktion von ”stress fibers“, die beide Rho-abhängig sind, werden über verschiedene Signaltransduktionsketten realisiert. Ersteres kann durch den Einsatz des Kinase-Inhibitors Staurosporin blockiert werden. Die Aktinpolymerisation wird davon nicht beeinflußt. Demgegenüber können sowohl die Ausbildung von ”stress fibers“ als auch die Bildung von Zelladhäsionskomplexen durch den Einsatz von Genistein, einem Tyrosinkinase-Inhibitor, verhindert werden. 114 Die Induktion der ”stress fiber“-Bildung geht einher mit einer Aktivierung der Isoform NHE1 des Na+/H+-Austauschers, die für die Aufrechterhaltung des intrazellulären pH-Wertes bedeutsam ist. 115 Die Assoziation zum Zytoskelett ergibt sich möglicherweise durch die Wirkung des pH-Wertes auf die Funktion von Cortactin. Cortactin ist ein F-Aktin bindendes und F-Aktin bündelndes Protein. Cortactin ist submembranös in ”membrane ruffles“ lokalisiert und wird durch die Tyrosinkinase Src phosphoryliert. 116 , 117 Die Tyrosin-Phosphorylierung reduziert die F-Aktin-bündelnde Aktivität von Cortactin. Diese Aktivität ist an das Vorhandensein eines physiologischen pH-Wertes geknüpft. 118 Auch für Src wurde ein Zusammenhang mit der Aktivität von Rho nachgewiesen. Die Translokation von Src zur Zellperipherie, dem biologischen Wirkort dieser Tyrosinkinase, ist Rho-abhängig. 119 Neben dem bereits erwähnten Cortactin sind FAK, Paxillin und RhoGAP p190 weitere Substrate von Src. 117 Die Expression


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von Src in Fibroblasten führt zu einer drastischen Aktindepolymerisation. In diesen Vorgang scheint die Phosphorylierung von RhoGAP p190 involviert zu sein, da sie zeitgleich erfolgt. 120

Die Aufklärung der Signaltransduktion via Rho erfordert neben der Beschreibung der gefundenen Zuammenhänge auch Informationen über die Aktivierung von Rho, direkte Substrate von Rho und das Abschalten der Rho-Aktivität. Bekannt ist, daß die extrazelluläre Zugabe von Lysophosphatidsäure, Bombesin oder Sphingosin 1-Phosphat die Rho-Aktivität stimuliert. 91 , 121 Ob diese Stimulation wie bei Ras über GEF’s vermittelt wird, ist nicht bekannt. Ras ist über das Adaptorprotein Grb2 sowohl mit Wachstumshormonrezeptoren verbunden als auch mit Sos, einem GEF für Ras. 122 , 123 , 124

Einige direkte Substrate von Rho sind identifiziert worden. Dazu zählen als Substrate mit bekannter Funktion die Serin/Threonin Kinase PKN, die eine Bindungsstelle für alpha-Actinin besitzt; p140mDia, das Profilin binden kann und p160RhoKinase, eine Serin/Threonin Kinase, deren Aktivität zu einer Phosphorylierung der Myosin light chain-Phosphatase führt. 125 , 126 , 127 , 128 , 129 Als Rho-Substrate mit bisher undefinierter Funktion sind Rhophilin und Citron bekannt. 65 Die Rho-Aktivität wird beendet durch die Funktion der GAP’s. Zu dieser Gruppe von Regulationsproteinen gehören p122 ( ein RhoA-GAP ), das Phospholipase C-delta1 bindet, p190RhoGAP und myr5. 130 Myr5 ist ein unkonventionelles Myosin, das über die gleichzeitige Bindung von Rho und Aktin-Filamenten eine direkte Assoziation von Rho mit dem Zytoskelett ermöglicht. 131 , 132 Weiterhin wurde berichtet, daß die Stimulierung von Proteinkinase A ( PKA ) zur Aktindepolymerisation existierender Filamente führt, aber deren Neubildung nicht verhindert. 114 Grundlage dieses Phänomens ist die Phosphorylierung von membrangebundenem RhoA/GTP an Serin 188 durch PKA. 133 Phosphoryliertes RhoA/GTP zeigt keine Veränderung der Bindungsaffinitäten für die Guaninnukleotide und auch keine Änderung der intrinsischen GTPase-Aktivität, jedoch bindet es RhoGDI mit hoher Affinität. Es kommt dadurch zum Verlust der Membranbindung von RhoA im GTP-gebundenem Zustand. Der Wechsel des Zellkompartiments ( Membran-Zytosol ) stellt hier einen alternativen Weg für die Beendigung der RhoA-Aktivität dar.

Eine Möglichkeit der Steuerung der biologischen Aktivität von Enzymen ist ihre Rekrutierung. Sie beschränkt die enzymatische Aktivität auf eine bestimmte intrazelluläre Lokalisation. Während biochemische Untersuchungen meist das Ziel verfolgen, potentielle Interaktionen zwischen verschiedenen Molekülen in-vitro zu zeigen, ist für eine tatsächliche Interaktion in-vivo Voraussetzung, daß sich die Reaktionspartner zu einem bestimmten Zeitpunkt in unmittelbarer räumlicher Nähe zueinander befinden. Rekrutierung bezeichnet insofern den Vorgang einer gesteuerten intrazellulären Translokation eines Moleküls zur Ermöglichung einer biochemischen Interaktion mit einem potentiellen Reaktionspartner. Da für kleine GTPasen vom Rho-Typ eine Vielzahl potentieller Reaktionspartner beschrieben wurde 125 , 126 , 127 , 128 , 129 , ist die genaue Beschreibung der Rekrutierungsmuster eine wichtige Voraussetzung zur Erforschung der in-vivo ablaufenden Signaltransduktionskaskaden.

Derweil die Literatur über die biologischen Funktionen von Rho ständig an Umfang gewinnt, ist kaum etwas über die Rekrutierung von Rho veröffentlicht. Beschrieben ist, daß in MDCK Zellen die Stimulation der RhoA-Aktivität mit der dynamischen Translokation von RhoA vom Zytosol zur ”membrane ruffling area“ einhergeht. Dieser Vorgang kann durch RhoGDI und C3 verhindert werden, d.h. daß sowohl die Aktivierung von Rho als auch die Substratbindung für eine Rekrutierung notwendig sind. 112 , 113


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Für die Regulation der Shigella-induzierten Zytoskelettveränderungen während der Epithelzellinvasion ist die Aktivität des kleinen G-Proteins Rho essentiell. 93 , 94 Die Inaktivierung von Rho führt zu Aktindepolymerisation und damit zu morphologischen Veränderungen der Zelle. 134 , 135 In C3 vorbehandelten Zellen unterblieb das bakterieninduzierte Rearrangement des Zytoskeletts und damit die den Invasionsvorgang begleitende Ausbildung der blütenartigen Membranstruktur. 93 Zellen mit blockierter Rho-Aktivität zeigten noch Aktinnukleation unterhalb von Shigella jedoch keine Aktinpolymerisation mehr. Eine funktionelle Bedeutung von Rho für den Invasionsvorgang liegt demnach in der Induktion der Aktinpolymerisation in den Shigella-induzierten zellulären Protrusionen.

Die von Shigella flexneri induzierte Zytoskelettstruktur am bakteriellen Eintrittsort enthält eine Reihe von Proteinen, die Bestandteile von Zelladhäsionskomplexen sind, wie Vinculin, Paxillin, Talin, alpha-Actinin und die Tyrosinkinase pp125FAK. In Anlehnung an die Bedeutung der Rho-Aktivität für die Bildung von Zelladhäsionsplaques konnten in-vitro Interaktionen von Rho mit einigen dieser Proteine während des Invasionsprozesses von Shigella aufgedeckt werden. Die mit der Invasion von S. flexneri in CHO-Zellen einhergehende lokalisierte Akkumulation von F-Aktin und Vinculin ist Rho-abhängig. 94 alpha-Actinin wird IpaA- abhängig an den Invasionslocus rekrutiert. 26 Dieses Protein bindet Proteinkinase N ( PKN ), eines der Substrate von Rho. Paxillin ist ein Substrat von FAK. 136 Sowohl FAK als auch Paxillin werden im Zusammenhang mit der bakteriellen Invasion Rho-abhängig phosphoryliert. 94

Weitere Proteine, die an die Eintrittsstelle von Shigella rekrutiert werden, sind Cortactin und Src. In HeLa-Zellen konnte während des bakteriellen Invasionsvorganges eine lokale Kinaseaktivierung von Src mit der daraus resultierenden Tyrosinphosphorylierung von Cortactin nachgewiesen werden. 137 Möglicherweise ist dies ein Schritt in Richtung einer Antagonisierung der Rho induzierten Zytoskelettreorganisation nach erfolgreicher Aufnahme der Shigellen, da die Tyrosinphosphorylierung durch Src die F-Aktin-bündelnde Aktivität von Cortactin reduziert. 118 Eine lokale Aktindepolymerisation könnte die Folge sein. Die Rekrutierung von myr5, dem atypischen Myosin mit RhoGAP-Funktion, an die bakterielle Eintrittsstelle von S. flexneri im HeLa-Zell-Modell unterstreicht hierbei den Prozeß der Gegenregulation der Rho-Aktivität. 138

Ein direktes Substrat für Rho während der Invasion von Shigella flexneri in Epithelzellen ist bisher nicht beschrieben. Jedoch wurde gezeigt, daß Rho als essentielles Glied der Signaltransduktionskette selbst an den Invasionslocus, den Ort der Zytoskelettreorganisation, rekrutiert wird. Diese Rekrutierung umfaßt die Isoformen RhoA, RhoB und RhoC. Obwohl die Sequenzhomologie zwischen diesen drei Isoformen groß ist, zeigen sie ein unterschiedliches Rekrutierungsmuster an der bakteriellen Eintrittsstelle. RhoA akkumuliert vorwiegend um die eindringenden Shigellen herum. Dagegen werden RhoB und RhoC in die zellulären Protrusionen rekrutiert, die die Bakterien umgeben. 93


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1.1. Fragestellung

Die Aufgabenstellung dieser Promotionsarbeit war die Untersuchung der differentiellen, isoformspezifischen Rekrutierung des kleinen G-Proteins Rho bei der Invasion von Shigellen in Epithelzellen auf submolekularer Ebene.

Die Rho-Proteine gehören zur Familie der kleinen G-Proteine. 139 Auf der Ebene der Primärstruktur besitzen sie eine 30 %ige Homologie zu den Ras-Proteinen. Diese Sequenzhomologie betrifft fünf bei allen kleinen G-Proteinen konservierte Regionen für die Bindung der Guaninnukleotide und das am C-terminalen Ende zu findende Peptid-Motiv CAAX. 140 C steht dabei für die Aminosäure Cystein, A für eine beliebige aliphatische Aminosäure und X für Leucin. Das charakteristische CAAX-Motiv ist von wesentlicher Bedeutung für die posttranslationale Modifikation der kleinen GTPasen.

Für RhoA wurde nachgewiesen, daß es posttranslational zu drei spezifischen C-terminalen Veränderungen an der CAAX-Box kommt. 141 Zuerst erfolgt eine Geranylgeranylierung am Cystein. Dem schließt sich die Abspaltung der drei C-terminalen Aminosäuren ( AAX ) an. Danach folgt als letzte Modifikation die Carboxylmethylierung am Cystein. Die beschriebenen Veränderungen sind sowohl für die Membranbindung des Proteins als auch für die Interaktion von Rho mit den Regulationsproteinen RhoGDI und RhoGEF bedeutsam. 142 , 143 , 144

Ein Vergleich der drei Rho-Isoformen auf Primärstrukturebene läßt eine hohe Sequenzhomologie der Isoproteine untereinander erkennen. ( HUSAR, s. Computerprogramme ) RhoA und RhoC werden von je 193 Aminosäuren gebildet. Das RhoB-Molekül besteht aufgrund dreier zusätzlicher Aminosäuren aus insgesamt 196 Aminosäuren. Alle drei Isoformen enthalten C-terminal die CAAX-Box. Der Unterschied in der Aminosäuresequenz von RhoA zu RhoB beläuft sich abgesehen von den drei zusätzlichen Aminosäuren im RhoB-Molekül auf 28 Aminosäuren ( 15 % ), zwischen RhoA und RhoC auf nur 14 Aminosäuren ( 7 % ). RhoB und RhoC unterscheiden sich ebenfalls in 28 Aminosäuren ( 15 % ). Wird demgegenüber die C-terminale Aminosäuresequenz der Isoformen ab Position 181 verglichen, zeigt sich zwischen RhoA und RhoB ebenso wie zwischen RhoB und RhoC eine Differenz von 89 % in diesem Abschnitt der Primärstruktur. Zwischen RhoA und RhoC besteht C-terminal ab Position 181 eine 67 %ige Differenz.

Obwohl auf Primärstrukturebene RhoA und RhoC homologer sind als RhoB und RhoC, werden RhoB und RhoC während der Invasion von Shigella in die zellulären Protrusionen der entstehenden Eintrittsstruktur rekrutiert. RhoA akkumuliert vorwiegend um die eindringenden Bakterien herum. Deshalb war das Ziel dieser Promotionsarbeit, der isoformspezifischen Rekrutierung von Rho während der Invasion von Shigella flexneri in HeLa-Zellen auf molekularer Ebene näherzukommen.


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Mon Jan 17 14:01:56 2000