18

Kapitel 2. Material und Methoden

2.1. Zellinien und Bakterienstämme

2.1.1. Zellen

Die zellbiologischen Untersuchungen wurden an HeLa-Zellen, einer humanen Cervixkarzinomzellinie, durchgeführt. 13

2.1.2. Bakterienstämme

Eingesetzt wurden der Bakterienstamm TG 1, ein K12-Derivat von Escherichia coli 145 , und der adhäsive, invasive Stamm SC 301 von Shigella flexneri. 55 Es handelt sich hierbei um eine Mutante von S. flexneri Serotyp 5b mit dem Virulenzplasmid pWR110 20 und dem Plasmid pIL22, das für AFA-I ( ein afimbrielles Adhäsin von uropathogenen E. coli K552 ) codiert. 146

2.2. Geräte

Für die Bearbeitung der Aufgabenstellung wurden die nachfolgend aufgelisteten Geräte eingesetzt.

Abzug sowie Säuren- und Laugenschrank von Köttermann

Autoklaviergerät

Beckmann L-8-M Ultrazentrifuge von Beckmann

Begasungsbrutschrank BB 16 von Heraeus

IBM Computer Pentium I, Betriebssystem Windows 95

DNA Thermal Cycler 480 von Perkin Elmer

elektronische Waage im µg-Bereich A 120 S von Sartorius

elektronische Waage LC 6201 von Sartorius

Elektrophoresegerät: Mini-Gel Electrophoresis Unit Mupid^®-2 von Eurogentec

Fireboy plus von Integra Biosciences

Inkubator 1000 und Unimax-Schüttler 1010 von Heidolph

Inverses Mikroskop Telaval 31 von Zeiss mit dem Objektiv Achromat LDN 20 x / 0,35

Kühlschrank 4°C von Liebherr

19

Kühlschrank -80°C von Heraeus

Kühlzentrifuge eppendorf centrifuge 5402 von Eppendorf

Labofuge 400 R von Heraeus

Laminar Flow Box antair_BSK Klasse 2

LI-COR^® DNA-Sequencer model 4000 von MWG Biotech

Magnetrühr- und Erwärmungsplatte MR 3001 von Heidolph

Metallblock Thermostat Techne-Dri-Block^® BD 2A von thermo-Dux

Mikroskop Axiovert 135 von Zeiss mit den Objektiven:

• Plan Neofluar 100 x / 1,30 Öl ( Nr. 440486 )
• Plan Neofluar 40 x / 1,30 Öl ( Nr. 440451 )

Mikroskop-Kamera MC 80 von Zeiss

Modell 2000/200 von BioRad für die Elektrophorese

pH-Meter von Beckman: pHI^TM

Scanmaker Office plus von Mikrotek

Standardmikrowellengerät

Stratagene Eagle Eye^TM II von Stratagene

Tischzentrifuge centrifuge 5415 C von Eppendorf

Trio-Thermoblock^TM von Biometra

Ultraspec^® III, Spektralphotometer von Pharmacia

UV-Kamera von Polaroid

UV-Transilluminator von Pharmacia

Vakuumwasserpumpe vac 30 von Heraeus

Vortexgerät REAX 2000 von Heidolph

Wasserbad von der Firma Dinkelberg

Zentrifuge K 26 D für große Volumina von MLW

20-21

2.3. Chemikalien

2.3.1. Bezugsliste der Chemikalien

Abkürzung/Formel	Name/Erläuterung	Bezug
1 kb DNA Ladder	DNA-Fragment-Längenmarker	MBI Fermentas
100 bp DNA Ladder	DNA-Fragment-Längenmarker	MBI Fermentas
6 X Loading Dye Solution	Farbmarker, 6fach konzentriert	MBI Fermentas
Aceton p. A.		Merck
Agarose		Sigma
Ampicillin	Antibiotikum	Sigma
AmpliTaq ( mit Puffer und MgCl2 )	DNA Polymerase	Perkin Elmer
Anti-mouse Texas Red ( TR )	Anti-VSV-Zweitantikörper	Jackson
APS	Ammoniumpersulfat	Fluka
BES	N, N-bis-2 aminoethane-sulfonic acid buffered saline, Zellreagenz	Merck
Bodipy-phallacidine	markiertes Peptid für die F-Aktinfärbung	Molecular probes
Borsäure p. A.		Merck
Bromphenolblau	Farbmarker	Sigma
BSA	Bovines Serum-Albumin	MBI Fermentas
CaCl2	Kalziumchlorid	Sigma
Calf intestine alkaline phosphatase	DNA-Phosphatase	MBI Fermentas
Cellfectin	Transfektionsreagenz	Gibco BRL Life TechnologiesTM
CH3COOH	Eisessig	Merck
Chloroform p. A.		Merck
DNTP	desoxy-Nukleosidtriphosphat	MBI Fermentas
DMRIE-C	Transfektionsreagenz	Gibco BRL Life TechnologiesTM
Dynabeads® M-280 Streptavidin	Magnetpartikel, s. Magnetische Separation mit Dynabeads® M-280 Streptavidin	Deutsche Dynal GmbH
Eco32I ( EcoRV )	Restriktionsendonuklease	MBI Fermentas
EcoRI	Restriktionsendonuklease	MBI Fermentas
EDTA	Ethylendiamintetraacetat	Merck
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Kit für die endotoxinfreie Plasmidpräparation	Qiagen
Ethanol p. A.		Merck
Ethidiumbromid		Aldrich
FCS	Fötales Kälberserum	Gibco BRL Life TechnologiesTM
Fnu4HI	Restriktionsendonuklease	New England Biolabs
Formamid		Sigma
Glycerol, wasserfrei		Merck
Glycin p. A.		Roth
HCl 25 %	Salzsäure	Merck
Isopropanol p. A.		Merck
K2HPO4	Dikaliumhydrogenphosphat	Merck
Kanamycin	Antibiotikum	Sigma
KCl	Kaliumchlorid	Merck
KH2PO4	Kaliumdihydrogenphosphat	Merck
KpnI	Restriktionsendonuklease	MBI Fermentas
LB	Luria-Bertani Medium	Fluka
Lipofectamine	Transfektionsreagenz	Gibco BRL Life TechnologiesTM
Lipofectin	Transfektionsreagenz	Gibco BRL Life TechnologiesTM
Long RangerTM DNA Sequencing Gel Solution	Gel-Lösung für DNA Sequenziergele	FMC BioProducts
M 13 ( -20 ) F	forward-Primer für pUC19	MWG Biotech
M 13 ( -24 ) R	reverse-Primer für pUC19	MWG Biotech
M 13 ( -47 ) F	forward-Primer für pUC19	MWG Biotech
M 13 reverse CS ( -49 )	reverse-Primer für pUC19	MWG Biotech
M 13 universal CS ( -43 )	forward-Primer für pUC19	MWG Biotech
MEM	Minimal Essential Medium	Gibco BRL Life TechnologiesTM
MgCl2 x 6 H2O	Magnesiumchlorid	Merck
Moviol 4-88	Substanz zum Eindecken von Deckgläschen	Sigma
Na2HPO4, 12 H2O	Dinatriumhydrogenphosphat	Merck
NaCH3COO	Natriumacetat	Merck
NaCl p. A.	Natriumchlorid	Merck
NaH2PO4, H2O p. A.	Natriumdihydrogenphosphat	Merck
NaOH	Natriumhydroxid	Merck
NheI	Restriktionsendonuklease	MBI Fermentas
NotI	Restriktionsendonuklease	MBI Fermentas
P5D4	Anti-VSV-Erstantikörper	Kultur-Überstand, im Labor hergestellt
PauI	Restriktionsendonuklease	MBI Fermentas
PEG 50 % ( w/v )	Polyethylenglycol 4000	MBI Fermentas
PFA	Paraformaldehyd	Fluka
pH-Teststreifen		Merck
Phenol		Fluka
Phenol/Chloroform Gemisch		Fluka
Plasmid Maxi Kit	Kit für die Plasmidpräparation	Qiagen
Plasmid Midi Kit	Kit für die Plasmidpräparation	Qiagen
PstI	Restriktionsendonuklease	MBI Fermentas
pUC19	Plasmid/Vektor	New England Biolabs
Pwo ( mit Puffer und MgSO4 )	DNA Polymerase	Eurogentec
Qiaquick Gel Extraction Kit	Kit für die DNA-Extraktion aus Agarosegelen	Qiagen
SDS	Natriumdodecylsulfat, Detergens	Sigma
Silan		Sigma
SpinPlasmidPrep	Kit für die Plasmidpräparation	Qiagen
T4 DNA Ligase	DNA-Ligase	MBI Fermentas
TEMED	N, N, N’,N’-Tetramethylethylen-diamin	Fluka
TfxTM-50 Reagent	Transfektionsreagenz	Promega
Thermo Sequenase fluorescentlabelled primer cycle sequencing kit	Reagenzien für die DNA-Sequenzierung	Amersham LIFE SCIENCE
Tris base p. A.	Puffer	Roth
Triton-X-100	Detergens	Sigma
Trypsin	Proteinase	Gibco BRL Life TechnologiesTM
TSB	Tryptic soy broth	Fluka
Urea p. A.	Harnstoff	Roth
Xylencyanol	Farbmarker	Sigma

22

2.3.2. Zusammensetzung verwendeter Reagenzien

2.3.2.1. Medien

Nachstehend wiedergegeben sind die Arbeitsanleitungen zur Herstellung der in den Experimenten eingesetzten Medien.

• TSB für Shigellen: 30 g/l
• im Autoklaven bei 121°C über 15’ sterilisieren, abkühlen lassen
• Zugabe der Antibiotika Ampicillin 100 µg/ml und Kanamycin 50 µg/ml für den Stamm SC 301
• LB für E. coli ( TG 1 ): 20 g/l
• im Autoklaven bei 121°C über 15’ sterilisieren, abkühlen lassen
• Zugabe des Antibiotikum Ampicillin 100 µg/ml
• - für Agar-Platten:
  Agarosegehalt 1,5 %, d. h. zu einem Liter Medium 15 g Agarose zugeben, autoklavieren,
  abkühlen lassen, Antibiotikum zugeben und anschließend Platten gießen

2.3.2.2. Puffer

Zur Herstellung der in den Experimenten eingesetzten Puffer wurde auf die folgenden Arbeitsanleitungen zurückgegriffen.

BBS-Puffer
2 X BBS
Zubereitung von 40 ml 2 X BBS:

Substanz	Molekulargewicht	Menge für 40 ml	Konzentration in 2 X Lösung
BES	213,20 g/mol	0,43 g	50 mM
NaCl	58,44 g/mol	0,66 g	280 mM
Na2HPO4 ,12 H2O	358,14 g/mol	0,0214 g	1,5 mM

• Mengen in 30 ml Aqua bid. lösen
• ca. 750 µl 1 M NaOH-Lösung zur Einstellung des pH-Wertes zugeben ( pH = 6,95 ), kontrollieren
• auffüllen auf 40 ml und steril filtrieren

23

EDTA
0,5 M EDTA ( pH 8,0 )

• 186,1 g Dinatriumethylendiamintetraacetat in 800 ml A. bidest mittels Magnetrührer auflösen
• pH-Wert auf 8,0 titrieren ( Zugabe von NaOH-Plätzchen, ca. 20 g )
• A. bid. ad 1000 ml
• steril filtrieren

10 X EDTA/Salzlösung für Trypsin
Zubereitung einer 100 ml Lösung aus:

• EDTA 0,2 g
• NaCl 8 g
• KCl 0,2 g
• Na₂HPO₄ 1,15 g
• KH₂PO₄ 0,2 g
• Aqua bidest ad 80 ml
• pH-Wert auf 7,5 einstellen
• A. bid. ad 100 ml
• steril filtrieren bzw. autoklavieren

PBS-Puffer
10 X nach Dulbecco pH 7,4 ( mit NaOH einstellen )
mit Ca²⁺ und Mg²⁺

Herstellung:

• 10 X Lösung ohne CaCl₂ ansetzen ( Ausfällung )
• CaCl2 zu 1 X Lösung ad 0,9 mM zugeben

Substanz	Molekulargewicht	Ansatz pro Liter	Konzentration in 10 X Lösung
CaCl2	111,00 g/mol	1 g	9 mM
KCl	74,55 g/mol	2 g	26,8 mM
KH2PO4	136,10 g/mol	2 g	14,7 mM
MgCl2 x 6 H2O	203,30 g/mol	1 g	4,92 mM
NaCl	58,44 g/mol	80 g	1,37 mM
Na2HPO4 x 7 H2O	268,10 g/mol	21,6 g	80,57 mM

10 X nach Dulbecco pH 7,4 ( mit NaOH einstellen )
ohne Ca²⁺ und Mg²⁺

• siehe oben, CaCl₂ und MgCl₂ weglassen

24

TAE-Puffer
konzentrierte Vorratslösung

50 X =	242 g Tris base
	57,1 ml Eisessig
	100 ml 0,5 M EDTA ( pH 8,0 )
	A. bid. ad 1000 ml

Gebrauchslösung

1 X =	0,04 M Tris acetat
	0,001 M EDTA

TBE-Puffer
konzentrierte Vorratslösung

10 X =	108 g Tris Base
	55 g Borsäure
	40 ml 0,5 M EDTA ( pH 8,0 )
	A. bid. ad 1000 ml

Gebrauchslösung

1 X =	0,089 M Trisborat
	0,002 M EDTA

TE-Puffer
10 X TE-Puffer pH 8,0 ( mit HCl einstellen )

Substanz	Ansatz pro Liter	Konzentration in 10 X Lösung
Tris ( MW 21,14 g/mol )	12,14 g	100 mM
EDTA ( 0,5 M )	20 ml	10 mM

• - A. bid. ad 1000 ml

25

2.3.2.3. Weitere Reagenzien

Wiedergegeben sind die Arbeitsanleitungen für die Herstellung der in den Experimenten eingesetzten Reagenzien.

Moviol zum Eindecken der Deckgläschen

• zusammengeben:
  6 g Glycerol
  2,4 g Moviol 4-88
  6 ml Aqua bidest
• h bei RT inkubieren
• 12 ml Tris-HCl 0,2 M ( pH 8,5 ) zugeben
• 10’ bei 50°C inkubieren
• 15’ bei 7.500 g zentrifugieren
• Aliquots bei 4°C aufbewahren

Natriumacetatlösung
Herstellung einer sterilen 3 M Natriumacetat-Lösung ( pH 5,2 ) mit einem Endvolumen von 50 ml:

• 12,3 g Natriumacetat abwägen ( Natriumacetat hat ein MW von 82,03 g/mol )
• Aqua bid. ad 30 ml
• CH₃COOH-Zugabe zur pH-Einstellung
• Aqua bid. ad 50 ml
• steril filtrieren

Paraformaldehyd 3,7 % in 1 X PBS
Herstellung einer 100 ml Lösung:

• 3,7 g PFA in 20 ml A. bid. lösen
• auf 50-60°C erhitzen
• einige Tropfen 10 M NaOH zugeben ( zur Lösung des PFA )
• abkühlen lassen auf RT
• 10 X PBS zugeben zu 1 X PBS ( 10 ml )
• pH-Wert mit HCl auf 7,6 einstellen
• A. bid. ad 100 ml
• aliquotieren und aufbewahren bei -20°C ( Ausdehnung beachten )

26

Trypsin
Herstellung von 0,25 % Trypsin ( 1 X ) aus 10 X Trypsin ( 2,5 % ) ohne EDTA und 10 X EDTA/Salzlösung:

• 1 : 10 Verdünnung des Trypsins 2,5 % und
• 1 : 10 Verdünnung der EDTA/Salzlösung, jeweils mit Aqua ad injectionem

Stop-Reagenz für die DNA-Sequenzierreaktion
Herstellung einer 10 ml Lösung:

9,5 ml	Formamid
0,4 ml	EDTA ( 0,5 M )
0,1 ml	A. bid.
5 mg	Bromphenolblau
5 mg	Xylencyanol

27

2.4. Methoden

2.4.1. Zellbiologische Methoden

Nachstehend aufgeführt sind die Arbeitsanleitungen für den Einsatz von HeLa-Zellen in den durchgeführten Experimenten.

2.4.1.1. Kultivierung von HeLa-Zellen

verwendete Materialien

• HeLa-Zellen
• MEM
• FCS
• 1 X Trypsin + 1 X EDTA/Salzlösung, hier bezeichnet als Trypsin

Arbeitsschritte

• Zellkultur unter dem Mikroskop betrachten:
  - Zellen konfluent, dann trypsinieren
  - Zellen nicht konfluent, dann Medium wechseln: altes Medium aspirieren, durch neues Medium mit 10 % FCS ersetzen

Trypsinieren von HeLa-Zellen in 15 ml Zellkulturschalen

• Medium aspirieren, Zellen mit 2 ml Trypsin waschen, Trypsin verwerfen
• - 3,5 ml Trypsin zugeben, Zellkulturschale 5’ bei 37°C im Brutschrank inkubieren
• - nach Lösung aller Zellen 9,5 ml MEM zugeben und in Zentrifugenröhrchen überführen
• - Zellen abzentrifugieren über 4’ bei 500 g und RT
• - Überstand verwerfen
• - Resuspension des Zellpellets in 2 ml MEM
• - Zellen zählen, s. Quantifikation von Zellen
• - Neuaussaat der Zellen in die gewünschte Zellkulturschale in entsprechender Konzentration und Zugabe von
• MEM mit 10 % FCS
• Aufbewahrung der Zellen im Brutschrank bei 37°C und 5 % CO₂

2.4.1.2. Quantifikation von Zellen

• verwendet wird die Neubauer Zählkammer mit 16er Feld ( 16 Quadrate: 4 x 4, die von einer Tripellinie umgeben sind )

  ---

  28

• 1 Quadrat hat die Abmessungen: 0,0025 mm² Grundfläche x 0,100 mm Tiefe; das entspricht einem Volumen = V = 0,00025 mm³ = 0,00025 µl

Quantifikation:

• fünf 16er-Kästchen auszählen, die Summe entspricht N
• N/5 = X
• X/16 x 4000 = Zellen/µl bzw. X x 250 = Zellen/µl
• Zellen/µl x 10³ = Zellen/ml = c₁

Ansatz für eine neue Zell-Kultur:

• c₁ ( s.o. ) x V₁ = c₂ ( gewünschte Zellzahl/ml ) x V₂ ( Volumen der neuen Zellkulturschale )
• V₁ = c₂ x V₂ / c₁

2.4.1.3. Transfektion von HeLa-Zellen

Kalziumphosphat-Methode, modifiziert für die 6-Loch-Platte

verwendete Materialien

• HeLa-Zellen, elektronenmikroskopisch getestet waren die Zellen Mykoplasmen-frei
• 2,5 M CaCl₂
• 2 X BBS
• DNA
• A. bid.
• MEM
• FCS
• Trypsin

Arbeitsschritte

Tag 1

• Arbeit unter der Laminar Flow Box
• HeLa-Zellen trypsinieren, s. Kultivierung von HeLa-Zellen
• in eine sterile 6-Loch-Platte pro Vertiefung ein steriles Deckgläschen 22 x 22 mm einlegen
• HeLa-Zellen einsäen: 2 ml MEM + 10 % FCS mit 7 x 10⁴ Zellen/ml, d. h. 1,4 x 10⁵ Zellen/Vertiefung

Tag 2

18-24 h später

• Mediumwechsel 2-4 h vor Zugabe der DNA/CaPO₄-Präzipitate
• lösen von 5-10 µg DNA/Vertiefung in Aqua bid. und CaCl₂ ( Endkonzentration 250 mM ) in einem Gesamtvolumen von 130 µl
• tropfenweise Zugabe von 130 µl 2 X BBS auf dem Vortexgerät zur Bildung kleinster Präzipitate
• 15-20’ bei Raumtemperatur inkubieren

  ---

  29

• tropfenweise Zugabe der Präzipitate ( 250 µl/Vertiefung ) zu den Zellen
• Inkubation bei 37°C und 5 % CO₂

Tag 3

18-24 h später

• Zellen mit MEM waschen
• 2 ml MEM mit 10 % FCS/Vertiefung zugeben

Tag 4

Infektion, s. 2.4.1.4

2.4.1.4. Infektion von HeLa-Zellen

modifiziert für die 6-Loch-Platte

verwendete Materialien

• TSB
• SC 301
• Kanamycin
• Ampicillin
• HeLa-Zellen
• MEM
• FCS
• Eis
• PBS
• PFA
• Glycin
• Triton-X-100

Arbeitsschritte

• o/n-Schüttelkultur von SC 301 in TSB mit Ampicillin 100 µg/ml und Kanamycin 50 µg/ml
• von der o/n Schüttelkultur des Stammes SC 301 am Morgen eine 1 : 100 Verdünnung in TSB ohne Antibiotikazusatz herstellen, diese bei 37°C wachsen lassen bis zu einer optischen Dichte ( OD ) von 0,7-0,8 bei 600 nm ( 1 OD bei 600 nm = 4 x 10⁸ Bakterien/ml )
• HeLa-Zellen waschen mit MEM und nur noch 2 ml MEM ohne FCS/Vertiefung zugeben
• die Konzentration der Bakterien im Experiment beträgt 6 x 10⁷ Bakterien/ml MEM, d. h. abzentrifugieren der Bakterien der angesetzten Verdünnungskultur bei 9.500 g in einer Tischzentrifuge über 10’ bei RT, Überstand verwerfen, Pellet auf Eis
• Aufnahme des Pellets in 15 ml MEM
• MEM von den HeLa-Zellen aspirieren

  ---

  30

• Zugabe von 2 ml SC 301 in MEM/Vertiefung, 20’ bei RT inkubieren zur Adhärenz der Bakterien an die Zellen
• anschließend erfolgt durch Inkubation im Wasserbad bei 37°C über 13’ die bakterielle Invasion
• nachfolgend den Überstand verwerfen
• mehrfaches Waschen der Zellen mit 1 X PBS ( 2 ml/Vertiefung )
• Fixation der Zellen: pro Vertiefung 2 ml PFA 3,7 % in 1 X PBS zugeben, 20’ bei RT inkubieren
• mehrfaches Waschen der Zellen mit 1 X PBS ( 2 ml/Vertiefung )
• pro Vertiefung 2 ml 0,1 M Glycin in 1 X PBS zugeben, mindestens 5’ bei RT inkubieren
• mehrfaches Waschen der Zellen mit 1 X PBS ( 2 ml/Vertiefung )
• Zugabe von 1,5 ml Triton-X-100 0,1 % in 1 X PBS/Vertiefung, waschen mit 1 X PBS, anschließend 2 ml Triton X-100 0,1 % in 1 X PBS/Vertiefung zugeben, 5’ bei RT inkubieren zur Permeabilisation der Zellmembran
• mehrfaches Waschen der Zellen mit 1 X PBS ( 2 ml/Vertiefung )
• Färbung, s. Zellfärbung mit Antikörpern

2.4.1.5. Zellfärbung mit Antikörpern

verwendete Materialien

• Primärantikörper: P5D4, Kulturüberstand von entsprechendem Hybridom ( Maus, IgG₁ ) 147
• fluoreszenzmarkierter Sekundär-Antikörper: Anti-mouse Texas Red ( Maus, IgG )
• Bodipy-phallacidine: Bodipy markiertes Phallacidin zur F-Aktin - Färbung
• 1 X PBS
• mit transfizierten und infizierten Zellen benetzte Deckgläschen
• Parafilm

Arbeitsschritte

• Antikörper in 1 X PBS steril verdünnen
• Parafilm ausbreiten
• pro 22 x 22 mm Deckgläschen 40 µl der Antikörper-Verdünnung auftragen, darauf die Deckgläschen mit der mit fixierten Zellen versehenen Seite nach unten auflegen
• 20’ in feuchter Kammer lichtgeschützt bei RT inkubieren
• anschließend Zellen mehrfach mit 1 X PBS waschen

2.4.1.6. Herstellung von Objektträgern

verwendete Materialien

• Deckgläschen mit fixierten Zellen
• Objektträger
• Moviol

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Arbeitsschritte

• Objektträger beschriften
• zum Eindecken der Deckgläschen auf den Objektträger Moviol auftragen ( ca.17 µl Moviol bei 22 x 22 mm großen Deckgläschen )
• Deckgläschen ausrichten
• 10’ bei 37°C im Brutschrank trocknen lassen

2.4.2. Bakteriologische Methoden - Klonierung

Nachstehend wiedergegeben sind die Arbeitsanleitungen für die Klonierungsexperimente mit E.coli-Zellen.

2.4.2.1. Herstellung kompetenter E.coli-Zellen

verwendete Materialien

• LB
• E.coli-Zellen
• Eis
• CaCl₂ ( 100 mM )
• Glycerol

Arbeitsschritte

• Übernachtschüttelkultur von E.coli-Zellen in LB bei 37°C
• Verdünnung der Übernachtschüttelkultur 1 : 100 in 50 ml LB
• Verdünnungskultur bei 37°C bis zu einer optischen Dichte von 0,3-0,4 bei 600 nm wachsen lassen
• ab jetzt auf Eis arbeiten ( 4°C )
• zentrifugieren 10’ bei 4°C und 5000 g
• Überstand verwerfen
• Resuspension des Pellets in 10 ml CaCl₂ ( 100 mM )
• 20’ auf Eis inkubieren
• erneut zentrifugieren über 10’ bei 4°C und 5000 g
• Überstand verwerfen
• Resuspension des Pellets in 2,5 ml CaCl₂ ( 100 mM )
• aliquotieren
• Glycerol ad 20 % zur Aufbewahrung bei -80°C
• oder 20’ auf Eis inkubieren und anschließend transformieren

32

2.4.2.2. Transformation kompetenter E.coli-Zellen

verwendete Materialien

• kompetente E.coli-Zellen
• Plasmid-DNA, die ein Resistenzgen für ein Antibiotikum enthält; verwendet wurden die Plasmide pUC19 und pKC3, s. Einsatz verschiedener Vektoren
• LB
• LB-Agarplatten mit Antibiotikum entsprechend der Plasmidresistenz
• Eis

Arbeitsschritte

• bei -80°C aufbewahrte kompetente E.coli-Zellen 20’ auf Eis inkubieren
• zu 200 µl E.coli-Zellen DNA zugeben
• weitere 20’ auf Eis inkubieren
• anschließend Hitzeschock über 2’ bei 42°C im Wasserbad
• sofort nach dem Hitzeschock 800 µl LB zugeben
• Inkubation bei 37°C > 1 h
• zentrifugieren über 2’ bei 12.000 g und RT in einer Tischzentrifuge
• Resuspension des Pellets in 100 µl LB
• ausstreichen der 100 µl auf einer LB-Agarplatte mit Antibiotikum
• Inkubation der Agarplatten über Nacht bei 37°C
• Kontrolle der Agarplatten durch kompetente E.coli-Zellen, die nicht mit Plasmid-DNA transformiert wurden; aufgrund der fehlenden Antibiotikaresistenz sollten keine Kolonien wachsen
• Effizienz: ca. 1.000.000 Kolonien/µg transformierte Plasmid-DNA

2.4.2.3. Isolierung von Klonen mit rekombinantem Plasmid

verwendete Materialien

• Plasmide, wie pUC19, die Fremd-DNA ( z.B. ein PCR-Produkt ) als Insert enthalten
• kompetente E.coli-Zellen
• LB
• Ampicillin
• LB-Agarplatten mit Ampicillin 100 µg/ml
• Glycerol

Arbeitsschritte

• Transformation der kompetenten E.coli-Zellen mit der gewünschten Plasmid-DNA, die zusätzlich ein Resistenzgen für Ampicillin als Selektionskriterium enthält, s. Transformation kompetenter E.coli-Zellen
• ausplattieren auf LB/Ampicillin Agarplatten

  ---

  33

• von mindestens zwei der gewachsenen Kolonien fraktionierte Ausstriche herstellen, um Einzelkolonien zu erhalten
• o/n-Schüttelkultur von zwei Einzelkolonien in LB mit Ampicillin 100 µg/ml
• von diesen Schüttelkulturen jeweils 300 µl abnehmen und 900 µl Glycerol zugeben ( ad 75 % ), anschließend bei -80°C als Stamm 1 / 2 aufbewahren
• restliche Schüttelkultur für die Plasmidpräparation verwenden, s. Präparation von Plasmid-DNA
• Kontrolle der Plasmide mittels Restriktionsanalyse und Sequenzierung, s. Enzymatische Methoden

2.4.3. Molekularbiologische Methoden

Aufgeführt sind die Arbeitsanleitungen für die Arbeiten mit DNA.

2.4.3.1. Allgemeine Techniken

2.4.3.1.1. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

am UV-Spektrometer 148 , ^{Appendix C1}

• eine OD von 1,000 in einer Quarzküvette mit 10 mm Durchmesser und einer Wellenlänge des verwendeten Lichts von 260 nm entspricht:
  50 µg Doppelstrang-DNA/ml
  40 µg Einzelstrang-DNA oder RNA/ml
  20 µg Oligonukleotide/ml

( Verdünnungsfaktor der DNA bei der Berechnung berücksichtigen )

2.4.3.1.2. Elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten

verwendete Materialien

• Agarose
• 50 X TAE
• A. bidest
• mehrfach konzentrierter Farbmarker
• Lösung mit DNA-Fragmenten verschiedener Länge
• Ethidiumbromid-Bad

34

Arbeitsschritte

Gießen eines 1,4 % Agarosegels in 1 X TAE

• für 100 ml Gel-Lösung werden pipettiert:
  1,4 g Agarose
  2 ml 50 X TAE
  auffüllen mit A. bid. ad 100 ml
• Gemisch 3-5’ in der Mikrowelle erwärmen bis sich die Agarose gelöst hat
• Lösung abkühlen lassen und das Gel gießen, Kamm einpassen
• Agarosegel erstarren lassen, ca. 30’

Elektrophorese

• Agarosegel in die Elektrophoresekammer legen und die Kammer mit 1 X TAE auffüllen
• zu der DNA-Lösung Farbmarker pipettieren, daß dieser im Endvolumen 1fach konzentriert vorliegt
• auftragen der DNA-Farblösung in die Taschen des Gels
• schließen der Elektrophoresekammer, elektrische Verbindung herstellen und starten der Elektrophorese mit 5- 10 V/cm
• nach Beendigung der E-Phorese das Agarosegel 15-30’ in ein Ethidiumbromid-Bad legen zur Färbung der DNA-Fragmente ( Konzentration des Ethidiumbromids in A. bidest: 0,5 µg/ml )
• Ergebnis mittels UV-Transilluminator oder Eagle Eye ansehen und dokumentieren

2.4.3.1.3. DNA-Extraktion aus Agarosegelen mittels Qiaquick Gel Extraction Kit, in Anlehnung an das Qiaquick Protokoll

verwendete Materialien

• Qiaquick Gel Extraction Kit
• Ethanol 70 %
• Isopropanol
• 3 M Natriumacetatlösung ( pH 5,2 )
• DNA im Agarosegel
• A. bid.

Arbeitsschritte

• DNA-Fragment mittels Skalpell aus dem Agarosegel ausschneiden
• wägen des erhaltenen Gelstücks
• zu je 100 mg Gel 300 ml Puffer QX1 des Kits geben
• Gemisch bei 50°C inkubieren bis sich das Gel verflüssigt, ca. 10-20’
• anschließend für je 100 mg Gel 100 µl Isopropanol hinzufügen, vortexen
• Überprüfung des pH-Wertes der Lösung, der < 7,5 sein soll; pH-Korrektur ist durch Zugabe von 10 µl einer 3 M Natriumacetatlösung ( pH 5,2 ) möglich

  ---

  35

• Qiaquick-Säulen vorbereiten ( eine Säule für 400 mg Agarose ), Reaktionsgemisch hineingeben
• zentrifugieren der beladenen Säulen bei 10.000 g für 1’ bei RT
• aufgefangene Flüssigkeit verwerfen
• waschen der Säule mit 0,5 ml Puffer QX1 des Kits, zentrifugieren s. o.
• waschen der Säule mit 0,75 ml Puffer PE des Kits, zentrifugieren s. o.
• nach dem Verwerfen der aufgefangenen Flüssigkeit wird erneut für 1’ bei 10.000 g und RT zentrifugiert
• zur Eluierung der DNA werden 30 µl A. bid. in die Säule pipettiert, nach 1’ wird die DNA-Lösung in ein neues Reaktionsgefäß bei maximaler g-Zahl abzentrifugiert
• messen der DNA-Konzentration am UV-Spektrometer, s. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

2.4.3.1.4. Aufreinigung von DNA über Phenol/Chloroform-Extraktion

verwendete Materialien

• DNA/Proteinlösung mit definiertem Ausgangsvolumen ( AV )
• TE
• Phenol
• Phenol/Chloroform-Gemisch
• Chloroform
• Eis

Arbeitsschritte

• alle Arbeiten finden unter dem Abzug statt
• da durch häufiges Pipettieren Verluste entstehen, ist ein Mindestvolumen von 300 µl zu empfehlen, d. h. DNA/Proteinlösung gegebenenfalls mit 1 X TE auffüllen
• 1 AV Phenol zugeben ( V_Ansatz : V_Phenol = 1 : 1 )
• 2’ vortexen
• zentrifugieren über 15’ bei maximaler g-Zahl und 4°C
• Überstand ( wäßrige Phase mit gelöster DNA ) in ein neues Reaktionsgefäß überpipettieren, hydrophobe Phase in einen Phenol-Abfallbehälter
• 1 Volumen des Phenol-Chloroform-Gemischs zugeben
• 2’ vortexen
• zentrifugieren über 15’ bei maximaler g-Zahl und 4°C
• Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überpipettieren, Rest in den Phenol-Abfallbehälter
• 1 Volumen Chloroform zugeben
• 2’ vortexen
• zentifugieren über 5’ bei maximaler g-Zahl und RT
• Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überpipettieren
• jetzt auf Eis stellen
• anschließend Ethanolpräzipitation der DNA, s. Ethanolpräzipitation von DNA

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2.4.3.1.5. Ethanolpräzipitation von DNA

verwendete Materialien

• gelöste DNA in entsprechendem Ausgangsvolumen ( AV )
• 3 M NaCH₃COO ( pH 5,2 )
• Ethanol 100 %
• Ethanol 70 %

Arbeitsschritte

• pipettieren:
  gelöste DNA in entsprechendem Ausgangsvolumen ( AV )
  + 1/10 AV 3 M NaCH₃COO ( pH 5,2 )
  + 2 x AV Ethanol 100%
• 2’ vortexen
• o/n-Präzipitation bei -20°C
  oder
• Präzipitation über 30’ bei -80°C
• waschen der DNA:
  1. zentrifugieren über 15’ bei maximaler g-Zahl und -2°C, damit sich die DNA nicht löst
  2. vorsichtig Ethanol-Überstand aspirieren
  3. 1 ml Ethanol 70 % ( -20°C ) zugeben, vortexen
  4. zentrifugieren über 10’ bei maximaler g-Zahl und -2°C
  5. Überstand aspirieren
  6. 3.-5. Wiederholen
  7. 200 µl Ethanol 100 % ( -20°C ) zugeben
  8. zentrifugieren über 10’ bei maximaler g-Zahl und -2°C
  9. Überstand aspirieren
  10. Pellet trocknen lassen
  11. Resuspension des Pellets in entsprechendem Volumen Aqua bid.
• anschließend DNA-Messung zur Konzentrationsbestimmung

2.4.3.1.6. Magnetische Separation mit Dynabeads^® M-280 Streptavidin

Allgemeine Information

Es handelt sich um eine Suspension von 6,7 x 10⁸ Dynabeads^®/ml ( 10 mg/ml ) gelöst in PBS ( pH 7,4 ), 0,1 % BSA und 0,02 % NaN₃. Dynabeads^® M-280 Streptavidin sind paramagnetische Partikel von einheitlicher Größe, die von Streptavidin umhüllt sind. Sie können aufgrund ihrer paramagnetischen Eigenschaften beliebig oft selektiert und wieder resuspendiert werden. Durch die hohe Affinität des Streptavidins zu Biotin ist eine Bindung von biotinylierten Molekülen, wie beispielsweise Doppelstrang-DNA, Einzelstrang-DNA, RNA, Proteinen und

37

Puffer für die Arbeit mit den Beads

Bindungspuffer:	10 mM Tris-HCl ( pH 7,5 )
	100 mM NaCl
	1 mM EDTA
	0,15 % Triton-X-100
20 X SSPE:	3 M NaCl
	0,2 M NaH2PO4, H2O
	0,02 M EDTA
	pH 7,4
Denaturierungslösung:	0,5 M NaOH
	2 mM EDTA
´Annealing´-Puffer:	150 mM NaCl
	10 mM Tris-HCl
	1 mM EDTA
	pH 8
Extensionspuffer:	Puffer der entsprechenden Polymerase

Protokoll für die Bindung von biotinylierter DNA an die Beads

• Arbeit mit gleichen Volumina Beads und DNA
• 30 µl Beads 2 x mit Bindungspuffer waschen
• resuspendieren der Beads in 30 µl Bindungspuffer
• 30 µl DNA ( biotinyliert ) 10’ auf 65°C erhitzen ( Linearisierung ), anschließend anzentrifugieren zur Rückgewinnung des Kondensats vom Reaktionsgefäßdeckel
• Beads zu der linearisierten DNA geben ( 30 µl + 30 µl = 60 µl )
• Zugabe von 1/3 des bisherigen Volumens ( 60 µl ) = 20 µl 20 X SSPE zu 5 X SSPE Endkonzentration
• vortexen
• Inkubation über 1 h bei 40°C und anschließend über 20’ bei RT, zwischendurch antippen, damit die Beads nicht sedimentieren
• 3 x mit vorgewärmtem Bindungspuffer waschen ( 37°C )
• Resuspension in 24 µl Aqua bidest
• Zugabe von 6 µl Denaturierungslösung zur Bildung von Einzelstrang-DNA, vortexen
• 5’ bei RT inkubieren
• Überstand verwerfen ( nicht biotinylierter Einzelstrang )

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  38

• Beads 2 x mit 150 µl Bindungspuffer waschen
• resuspendieren in 30 µl Bindungspuffer

Ergebnis: Einzelstrang-DNA, die über die Biotin-Streptavidin-Bindung an die Beads gebunden ist; jetzt sind ´Annealing´ und Extension möglich

Protokoll für ´Annealing´- und Extensionsreaktion mit an Dynabeads ^® gebundener Einzelstrang-DNA als template DANN

Weiterarbeit nach obigem Protokoll

• Einzelstrang-DNA-Beads 1 x in 150 µl ´Annealing´-Puffer waschen
• Überstand verwerfen
• Resuspension in
  7,7 µl Aqua bidest
  + 2 µl ´Annealing´-Puffer
  + 0,3 µl Oligonukleotid X ( Konzentration abhängig von der Konzentration der Ausgangs-DNA )
• ´Annealing´ über 30’, beginnend mit z. B. 72°C für 2’, anschließend langsamer Temperaturabfall auf 45°C, dann 4°C; die ´Annealing´-Temperatur richtet sich nach dem Tm-Wert des Oligonukleotids
• 3 x waschen in 1 X Extensionspuffer
• Zugabe der Beads zu entsprechendem ”PCR-Ansatz“ von 100 µl für die Extension, z. B. Beads
  + 10 X Puffer 10 µl
  + 5 mM MgSO₄ zu 1,5 mM 6 µl
  + 5 mM Nukleotide zu 400 µM 8 µl
  + Pwo 2,5 U/µl zu 0,5 U 0,2 µl
  + Aqua bid. 75,8 µl
• Extension auf vorgewärmtem Block bei 72°C für 10’
• anschließend 2 x waschen mit Bindungspuffer
• resuspendieren in 50 µl Bindungspuffer
• bei 4°C o/n aufbewahren

Ergebnis: Doppelstrang-DNA, die über Biotin-Streptavidin-Bindung an die Beads gebunden ist; durch Restriktionsbehandlung ist die DNA von den Beads lösbar

2.4.3.1.7. Präparation von Plasmid-DNA

mittels Qiagen Plasmid Kit, modifiziert nach dem Qiagen-Protokoll

verwendete Materialien

• LB
• TG 1 mit entsprechendem Plasmid
• Ethanol 70 %

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  39

• Isopropanol
• Qiagen Plasmid Kit ( SpinPlasmidPrep, Midi, Maxi, Endofree Maxi )
• Eis
• A. bid.
• 1 M NaOH
• 20 % SDS

Arbeitsschritte

• o/n-Kultur von TG 1 mit Plasmid in
  10 ml LB mit Ampicillin 100 µg/ml für das SpinPlasmidPrep
  50 ml LB mit Ampicillin 100 µg/ml für das Midi Kit200 ml LB mit Ampicillin 100 µg/ml für das Maxi Kit200 ml LB mit Ampicillin 100 µg/ml für das Endofree Maxi Kit
• Bakterienzellen abzentrifugieren bei 8.000 g und RT über 15’
• Resuspension des Bakterienzellenpellets in Puffer P1 des Kits
• Puffer P2 frisch zubereiten, P2 = 200 mM NaOH, 1 % SDS
• Zugabe von Puffer P2, vorsichtig mischen und anschließend bei RT 5’ inkubieren
• gekühlten Puffer P3 des Kits zugeben, vorsichtig mischen und danach 15’ auf Eis inkubieren
• Zentrifugation in der Ultrazentrifuge bei ca. 80.000 g und 4°C über 45’
• Überstand von der Zentrifugation auf die zuvor mit Puffer QBT äquilibrierte Säule geben
• zweimaliges Waschen der Säule mit Puffer QC des Kits
• Eluierung der Plasmid-DNA mit Puffer QF
• durch Zugabe von Isopropanol wird die DNA ausgefällt
• anschließend 45’ bei ca. 80.000 g und 4°C zentrifugieren
• Überstand vorsichtig abpipettieren und DNA mit ca. 2-3 ml Ethanol 70 % waschen, zentrifugieren und den Überstand vorsichtig aspirieren
• das DNA-Pellet trocknen lassen und im Anschluß daran in A. bid. aufnehmen
• DNA-Konzentration am UV-Spektrometer bestimmen und gleichzeitig den Reinheitsgrad der DNA ermitteln über das Verhältnis der Meßergebnisse bei 260 nm und 280 nm ( A_260nm/A_280nm soll > 1,5 sein )
• Kontrolle des Plasmids über Restriktionsanalyse oder Sequenzierung, s. Enzymatische Methoden

Anmerkung: Bei der endotoxinfreien Plasmidpräparation wird zusätzlich ein im Endofree-Kit mitgeliefertes Filtersystem verwendet und die Arbeit erfolgt mit endotoxinfreien Substanzen.

2.4.3.1.8. Hybridisierung von Oligonukleotiden

verwendete Materialien

• A. bid.
• Oligonukleotide 1 und 2
• 10 X TE
• 1 M NaCl

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Arbeitsschritte

• aufnehmen der Oligonukleotide in sterilem A. bid. und anschließend Konzentrationsbestimmung am UV-Spektrometer, s. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
• pipettieren des Reaktionsansatzes zu folgenden Bedingungen in einem Gesamtvolumen von 100 µl:
  - soll das Hybridisierungsprodukt in einer Konzentration von 10 µM vorliegen, so müssen beide Oligonukleotide im Reaktionsansatz in einer Konzentration von 10 µM vorliegen
  - die Hybridisierung erfolgt in 1 X TE und 100 mM NaCl
• erhitzen des Reaktionsgemisches auf 94°C für 3’
• anschließend Reaktionsgemisch auf die Tm der Oligonukleotide abkühlen lassen
• bei Erreichen der Tm Reaktionsgemisch auf Eis stellen
• das Hybridisierungsprodukt kann sofort verwendet werden, z. B. zur Restriktion, Ligation und Klonierung

Anmerkung: Die Tm ( Hybridisierungstemperatur ) der Oligonukleotide berechnet sich wie folgt:

Tm = 81,5 +0,41 (C+G) +16,6 log [ Na⁺ ] - 500/d

( G + C )	prozentualer Anteil der beiden Basen am gesamten Oligonukleotid
[ Na+ ]	Molarität
d	Länge der hybridisierten Doppelstrang-DNA

2.4.3.2. Enzymatische Methoden

2.4.3.2.1. Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

verwendete Materialien

• Doppelstrang-DNA, z. B. Plasmid-DNA
• Restriktionsendonuklease(n), z. B. PstI und EcoRI
• Enzym-spezifische(r), meist 10fach konzentrierte(r) Puffer
• A. bid.
• BSA, wird nur von einigen Restriktionsendonukleasen benötigt

Arbeitsschritte

• pipettieren von A. bid., zu schneidender DNA, Reaktionspuffer und Restriktionsenzym(en) zu folgenden Bedingungen:
  - der Puffer liegt im Gesamtvolumen 1fach konzentriert vor
  - das Restriktionsenzym liegt im Verhältnis zu der zu schneidenden DNA in mindestens 5fachem Überschuß vor, d. h. pro µg DNA werden mindestens 5 U Enzym benötigt
  

  ---

  41

  - die Menge an verwendetem Restriktionsenzym muß im Gesamtansatz 1 : 20 verdünnt vorliegen, d. h. wird 1 µl der Enzymlösung eingesetzt, dann muß der Gesamtansatz minimal 20 µl betragen
  - benötigt das Enzym BSA, so beträgt dessen Konzentration im Reaktionsansatz 100 µg/ml
• Inkubation des Restriktionsansatzes bei der für das Enzym typischen Restriktionstemperatur, z. B. 37°C für EcoRI über 60-90’
• stoppen der Reaktion durch kurzzeitiges Erwärmen des Reaktionsansatzes auf die für das Enzym spezifische Inaktivierungstemperatur, z. B. 65°C über 10’ für EcoRI oder Reinigung der DNA vom Enzym mittels Elektrophorese, DNA-Extraktion aus dem Gel und anschließender Phenol/Chloroform-Extraktion, s. Allgemeine Techniken
• Kontrolle der Restriktionsanalyse mittels Elektrophorese und mitlaufendem DNA-Fragment-Längenmarker

Anmerkung: Es ist ebenfalls möglich, einen Restriktionsansatz o/n zu inkubieren. Dabei sollte jedoch maximal 1 U Enzym pro µg DNA für die Restriktion eingesetzt werden.

2.4.3.2.2. Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten

verwendete Materialien

• CIAP ( calf intestine alkaline phosphatase ) von MBI Fermentas
• 10fach konzentrierter Reaktionspuffer für CIAP
• A. bid.
• phosphorylierte DNA

Arbeitsschritte

• pipettieren des Reaktionsansatzes mit einem Gesamtvolumen von 50 µl:
  10-40 µl DNA-Lösung, die 1-20 pmol an 3’- oder 5’-DNA-Enden enthält
  5 µl 10 X Reaktionspuffer
  0,05-1 U CIAP
  Aqua bidest ad 50 µl
• Reaktionsansatz für 30’ bei 37°C inkubieren
• stoppen der Reaktion durch Erwärmung auf 75°C über 10’ oder mittels Phenol/Chloroform-Extraktion und anschließender DNA-Präzipitation mit Ethanol, s. Allgemeine Techniken

2.4.3.2.3. Ligation von DNA-Fragmenten

verwendete Materialien

• T4 DNA Ligase ( mit PEG ) von MBI Fermentas
• 10fach konzentrierter Reaktionspuffer für die Ligase
• PEG 50 % -Lösung
• BSA

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• A. bid.
• zu ligierende DNA-Fragmente
• Eis

Arbeitsschritte

DNA-Fagment Ligation in einen Vektor, sticky end-Ligation

• pipettieren des Reaktionsansatzes mit einem Gesamtvolumen von maximal 20 µl zu folgenden Bedingungen:
  - der Reaktionsansatz enthält 1-3 U an T4 DNA Ligase
  - der Reaktiospuffer ist 1fach konzentriert
  - das Verhältnis der Molaritäten von Vektor zu Fragment ist 1 : 2, d. h. verwendet man 50 fmol anVektor-DNA werden 100 fmol Fragment-DNA eingesetzt
• Reaktionsansatz gut mischen
• Inkubation des Ligationsansatzes für mindestens 60’ bei 16°C ( o/n-Ligation ist auch möglich )
• durch Erhitzen auf 65°C für 10’ wird die T4 DNA Ligase inaktiviert
• der Reaktionsansatz kann im Anschluß an die Ligation für die Transformation kompetenter E. coli-Zellen genutzt werden

Verwendung der PEG 50 % -Lösung für die blunt end-Ligation sowie für die Ligation von zwei Inserts in einen geschnittenen Vektor bzw. die Ligation dreier Fragmente = Doppelligation

• pipettieren des Reaktionsansatzes mit einem Gesamtvolumen von 20 µl zu folgenden Bedingungen:
  - der Reaktionsansatz enthält 3-4 U T4 DNA Ligase
  - der Reaktionspuffer ist 1fach konzentriert
  - die PEG 50 % -Lösung hat eine Endkonzentration von 10 %
  - das Verhältnis der Molaritäten von Vektor zu jedem Fragment ist 1 : 2, d. h. verwendet man 50 fmol an Vektor-DNA werden 100 fmol von jeder Fragment-DNA eingesetzt werden
• den Reaktionsansatz bei 16°C o/n inkubieren
• durch Erhitzen auf 65°C für 10’ wird die T4 DNA Ligase inaktiviert, anschließend auf Eis stellen
• der Reaktionsansatz kann im Anschluß an die Ligation für die Transformation kompetenter E. coli-Zellen genutzt werden

Kontrollmöglichkeiten der Ligation von Vektor und Fragment mit anschließender Transformation:

• Positivkontrolle für die Ligation: Wiederholung einer bereits erfolgreichen Ligationsreaktion
• Negativkontrolle für die Ligation:
  a) Ansatz nur mit dem linearisierten Vektor, dessen Enden nicht ligierbar sind
  b) Ansatz nur mit dem Fragment
• Positivkontrolle für die Transformation: Verwendung eines Plasmids mit Resistenzgen

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2.4.3.2.4. Durchführung einer PCR

verwendete Materialien

• A. bid.
• template-DNA ( Matrize )
• DNA Polymerase, z. B. Pwo
• 10 X Reaktionspuffer für die Polymerase
• 25 mM MgSO₄
• 5 mM dNTP’s
• Oligonukleotide als Primer
• Mineralöl

Arbeitsschritte

• pipettieren des Reaktionsansatzes von 100 µl zu folgenden Bedingungen pro Ansatz:
  1,5 fmol template-DNA
  20 pmol von jedem Primer ( forward- und reverse-Primer )
  0,5 U Pwo
  1,5 mM MgSO₄
  100 µM jedes dNTP, d. h. 400 µM zusammen
  1 X Reaktionspuffer
  A. bid. ad 100 µl
• stets eine Leerprobe mitführen, d. h. alle Reagenzien ohne template-DNA, um eine Hybridisierung der Oligonukleotide aneinander auszuschließen bzw. andersartige Verunreinigungen, die als Template dienen
• Zugabe von 70 µl Mineralöl pro Ansatz
• Programmierung des Thermocyclers wie folgt:

	1. 94°C	3’	Denaturierung
	2. 65°C	30’’	´Annealing´
	3. 72°C	1’	Extension
	4. 94°C	1’	Denaturierung
	5. 65°C	30’’	´Annealing´
	6. 72°C	1’	Extension
		6. an 4.:	15 Zyklen
	7. 94°C	1’	Denaturierung
	8. 65°C	30’’	´Annealing´
	9. 72°C	10’	Extension
	10. 4°C	Reaktionsstop

• Kontrolle der PCR mittels Elektrophorese, Größenbestimmung des PCR-Produkts anhand des mitlaufenden DNA-Fragment-Längenmarkers
• anschließend Reinigung des PCR-Produkts über Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation
• Sequenzierung des PCR-Produkts, s. DNA-Sequenzierung

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2.4.3.2.5. DNA-Sequenzierung

Anwendung findet ein sogenanntes ”cycle sequencing“-Verfahren, bei dem die Sequenzierung auf der Synthese eines neuen DNA-Stranges beruht, der an der Bindungsstelle des Primers beginnt und durch den Einbau eines Dideoxynukleosidtriphosphats ( ddNTP ) terminiert wird. Die Konzentrationen von dNTP’s und ddNTP’s sind so gewählt, daß der Einbau eines ddNTP anstelle eines dNTP’s an jeder Position der zu sequenzierenden DNA möglich ist. Bei diesem Verfahren trägt der Primer eine 5’-Infrarot-Farbstoff-Markierung, die durch den Laser des LI-COR_® DNA-Sequencer Model 4000 von MWG Biotech erkannt wird. Wie der Name ”cycle sequencing“ besagt, erfolgt die Synthese der DNA-Stränge durch wiederholte Zyklen von Denaturierung, ´Annealing´ und Exten-sion/Terminierung. Der markierte Primer kann so mehrfach an die template-DNA binden, wodurch einerseits nur eine sehr geringe Menge template-DNA benötigt wird und sich andererseits der Anteil an markierten Banden/DNA-Fragmenten erhöht. Die Qualität der Sequenzierreaktion hängt von der spezifischen Bindung des Primers an das Template ab. Deshalb sollte die ´Annealing´-Temperatur optimal auf den eingesetzten Primer abgestimmt sein. Die ´Annealing´-Temperatur läßt sich dabei wie folgt berechnen: T_{´Annealing´} = Tm_Primer + 3°C.

SEQUENZIERREAKTION

verwendete Materialien

• Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit von Amersham LIFE SCIENCE
• zu sequenzierende DNA
• Primer
• Mineralöl
• Stop-Reagenz

Arbeitsschritte

• Herstellung einer DNA/Primer-Lösung pro DNA-Probe mit einem Gesamtvolumen von 24 µl, dabei sollen die 24 µl ca. 0,15-0,25 pmol an DNA und 2 pmol an Primer enthalten
• Aufteilen der 24 µl auf 4 Reaktionsgefäße: A, C, G, T
• Zugabe von 2 µl A-, C-, G- oder T-Lösung des Sequenzierkits zu dem entsprechenden Reaktionsgefäß, jedes Reaktionsgefäß enthält ein Volumen von 8 µl
• pro Reaktionsgefäß 30 µl Mineralöl zugeben
• Sequenzierreaktion starten:

	1. 5’	95°C	Denaturierung
	2. 30’’	95°C	Denaturierung
	3. 30’’	58°C ( abhängig vom Primer )	´Annealing´
	4. 1’	70°C	Extension
	4. an 2. :	30 Zyklen
	5. 4°C

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• nach Beendigung des Thermocycling-Programms Zugabe von 6 µl Stop-Reagenz unter das Öl
• erneute Denaturierung bei 95°C für 3’
• anschließend 1-2 µl pro Tasche auf das Sequenzier-Gel auftragen; d. h. mehrmaliges Auftragen ist möglich

HERSTELLUNG EINES GELS FÜR DIE DNA-SEQUENZIERUNG

verwendete Materialien

• A. bidest
• Ethanol
• Silan/Ethanollösung ( 50 µl Silan in 10 ml Ethanol )
• Eisessig
• APS 10 %
• TEMED
• 10 X TBE
• Urea
• Long Ranger Gel Solution ( 50 % )
• Nalgene cellulose acetate filter ( > 0,45 + M )

Arbeitsschritte

Herstellung der Gel-Lösung für ein 8 %-Gel

• das Gesamtvolumen der fertigen Lösung beträgt 50 ml
• 21 g Urea, 5 ml von 10 X TBE und 8 ml Long Ranger Gel Solution ( 50 % ) zusammen in ein Gefäß geben, unter Erwärmung vorsichtig mischen bis sich der Harnstoff gelöst hat, anschließend auf Raumtemperatur abkühlen lassen
• Zugabe von A. bid. zu einem Gesamtvolumen von 50 ml
• Filtern der Gel-Lösung durch einen Nalgene cellulose acetate filter ( > 0,45 + M )

Gießen des Gels

• Glasplatten säubern mit A. bid. und Ethanol
• zu 165 µl der Silan/Ethanollösung 5 µl 10 %igen Eisessig geben, mit diesem Gemisch die Stelle der späteren Kammlage benetzen und 3’ trocknen lassen
• Glasplatten mit plazierten Spacern ausrichten, in die Vorrichtung stellen und fixieren
• 1,5 ml der gefertigten Gel-Lösung entnehmen, 25 µl APS 10 % und 5 µl TEMED zugeben, vortexen und unverzüglich in die vorgestanzten Mulden des Fußes der Vorrichtung geben für die untere Abdichtung des Gels, 10’ polymerisieren lassen
• Glasplatten jetzt schräg lagern
• zu der restlichen Gel-Lösung 225 µl APS 10 % und 22,5 µl TEMED hinzufügen, vortexen und mittels Pipette das Gel luftblasenfrei gießen
• anschließend Kamm einlegen und diesen mittels Klammern fest einspannen
• das Gel benötigt 60’-90’ für die Polymerisation

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Elektrophorese mit dem LI-COR _® DNA-Sequencer Model 4000 von MWG Biotech

• auspolymerisiertes Gel in die LI-COR Kammer einspannen
• Tankbehälter für Pufferlösung aufsetzen und mit 1 X TBE füllen
• Verbindungen herstellen, Elektrophorese-Kammer schließen
• Vorlauf starten bei einer Spannung von 1000 Volt bis das Gel eine Temperatur von 50°C erreicht
• Laser-Scanner fokussieren
• ist die gewünschte Temperatur erreicht, wird der Vorlauf gestoppt
• öffnen der E-Phorese-Kammer, richtiges Positionieren des Kammes und sorgfältiges Ausspülen der Probentaschen
• auftragen von 1-2 µl der Sequenzierreaktion pro Tasche
• elektrische Verbindungen herstellen, Elektrophorese-Kammer schließen
• Elektrophorese starten mit einer Spannung von 1500 Volt, d.h. 36 V/cm
• eine Auswertung mit der entsprechenden Software ( s. Computerprogramme ) ist nach ungefähr 6-8 Stunden möglich

2.4.4. Computerprogramme

Bildbearbeitungsprogramme Adobe Photoshop und Corel Photo Paint

Gendatenbanken: EMBL, GenBank

HUSAR: Heidelberg Unix Sequence Analysis Resources

IBM OS/2 Base ImageIR Software mit den Programmteilen Data Collection und Image Analysis für die DNA-Sequenzierung

Microsoft Word 97 für Windows

Zeichenprogramm Autosketch

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