Bohm, Birgit: ”Differentielle Rekrutierung der Isoformen des kleinen G-Proteins Rho bei der Invasion von Shigellen in Epithelzellen“

18

Kapitel 2. Material und Methoden

2.1. Zellinien und Bakterienstämme

2.1.1. Zellen

Die zellbiologischen Untersuchungen wurden an HeLa-Zellen, einer humanen Cervixkarzinomzellinie, durchgeführt. 13

2.1.2. Bakterienstämme

Eingesetzt wurden der Bakterienstamm TG 1, ein K12-Derivat von Escherichia coli 145 , und der adhäsive, invasive Stamm SC 301 von Shigella flexneri. 55 Es handelt sich hierbei um eine Mutante von S. flexneri Serotyp 5b mit dem Virulenzplasmid pWR110 20 und dem Plasmid pIL22, das für AFA-I ( ein afimbrielles Adhäsin von uropathogenen E. coli K552 ) codiert. 146

2.2. Geräte

Für die Bearbeitung der Aufgabenstellung wurden die nachfolgend aufgelisteten Geräte eingesetzt.

Abzug sowie Säuren- und Laugenschrank von Köttermann

Autoklaviergerät

Beckmann L-8-M Ultrazentrifuge von Beckmann

Begasungsbrutschrank BB 16 von Heraeus

IBM Computer Pentium I, Betriebssystem Windows 95

DNA Thermal Cycler 480 von Perkin Elmer

elektronische Waage im µg-Bereich A 120 S von Sartorius

elektronische Waage LC 6201 von Sartorius

Elektrophoresegerät: Mini-Gel Electrophoresis Unit Mupid®-2 von Eurogentec

Fireboy plus von Integra Biosciences

Inkubator 1000 und Unimax-Schüttler 1010 von Heidolph

Inverses Mikroskop Telaval 31 von Zeiss mit dem Objektiv Achromat LDN 20 x / 0,35

Kühlschrank 4°C von Liebherr


19

Kühlschrank -20°C von Liebherr

Kühlschrank -80°C von Heraeus

Kühlzentrifuge eppendorf centrifuge 5402 von Eppendorf

Labofuge 400 R von Heraeus

Laminar Flow Box antairBSK Klasse 2

LI-COR® DNA-Sequencer model 4000 von MWG Biotech

Magnetrühr- und Erwärmungsplatte MR 3001 von Heidolph

Metallblock Thermostat Techne-Dri-Block® BD 2A von thermo-Dux

Mikroskop Axiovert 135 von Zeiss mit den Objektiven:

Mikroskop-Kamera MC 80 von Zeiss

Modell 2000/200 von BioRad für die Elektrophorese

pH-Meter von Beckman: pHITM

Scanmaker Office plus von Mikrotek

Standardmikrowellengerät

Stratagene Eagle EyeTM II von Stratagene

Tischzentrifuge centrifuge 5415 C von Eppendorf

Trio-ThermoblockTM von Biometra

Ultraspec® III, Spektralphotometer von Pharmacia

UV-Kamera von Polaroid

UV-Transilluminator von Pharmacia

Vakuumwasserpumpe vac 30 von Heraeus

Vortexgerät REAX 2000 von Heidolph

Wasserbad von der Firma Dinkelberg

Zentrifuge K 26 D für große Volumina von MLW


20-21

2.3. Chemikalien

2.3.1. Bezugsliste der Chemikalien

Abkürzung/Formel

Name/Erläuterung

Bezug

1 kb DNA Ladder

DNA-Fragment-Längenmarker

MBI Fermentas

100 bp DNA Ladder

DNA-Fragment-Längenmarker

MBI Fermentas

6 X Loading Dye Solution

Farbmarker, 6fach konzentriert

MBI Fermentas

Aceton p. A.

Merck

Agarose

Sigma

Ampicillin

Antibiotikum

Sigma

AmpliTaq ( mit Puffer und MgCl2 )

DNA Polymerase

Perkin Elmer

Anti-mouse Texas Red ( TR )

Anti-VSV-Zweitantikörper

Jackson

APS

Ammoniumpersulfat

Fluka

BES

N, N-bis-2 aminoethane-sulfonic acid buffered saline, Zellreagenz

Merck

Bodipy-phallacidine

markiertes Peptid für die F-Aktinfärbung

Molecular probes

Borsäure p. A.

Merck

Bromphenolblau

Farbmarker

Sigma

BSA

Bovines Serum-Albumin

MBI Fermentas

CaCl2

Kalziumchlorid

Sigma

Calf intestine alkaline phosphatase

DNA-Phosphatase

MBI Fermentas

Cellfectin

Transfektionsreagenz

Gibco BRL Life TechnologiesTM

CH3COOH

Eisessig

Merck

Chloroform p. A.

Merck

DNTP

desoxy-Nukleosidtriphosphat

MBI Fermentas

DMRIE-C

Transfektionsreagenz

Gibco BRL Life TechnologiesTM

Dynabeads® M-280 Streptavidin

Magnetpartikel, s. Magnetische Separation mit Dynabeads® M-280 Streptavidin

Deutsche Dynal GmbH

Eco32I ( EcoRV )

Restriktionsendonuklease

MBI Fermentas

EcoRI

Restriktionsendonuklease

MBI Fermentas

EDTA

Ethylendiamintetraacetat

Merck

EndoFree Plasmid Maxi Kit

Kit für die endotoxinfreie Plasmidpräparation

Qiagen

Ethanol p. A.

Merck

Ethidiumbromid

Aldrich

FCS

Fötales Kälberserum

Gibco BRL Life TechnologiesTM

Fnu4HI

Restriktionsendonuklease

New England Biolabs

Formamid

Sigma

Glycerol, wasserfrei

Merck

Glycin p. A.

Roth

HCl 25 %

Salzsäure

Merck

Isopropanol p. A.

Merck

K2HPO4

Dikaliumhydrogenphosphat

Merck

Kanamycin

Antibiotikum

Sigma

KCl

Kaliumchlorid

Merck

KH2PO4

Kaliumdihydrogenphosphat

Merck

KpnI

Restriktionsendonuklease

MBI Fermentas

LB

Luria-Bertani Medium

Fluka

Lipofectamine

Transfektionsreagenz

Gibco BRL Life TechnologiesTM

Lipofectin

Transfektionsreagenz

Gibco BRL Life TechnologiesTM

Long RangerTM DNA Sequencing Gel Solution

Gel-Lösung für DNA Sequenziergele

FMC BioProducts

M 13 ( -20 ) F

forward-Primer für pUC19

MWG Biotech

M 13 ( -24 ) R

reverse-Primer für pUC19

MWG Biotech

M 13 ( -47 ) F

forward-Primer für pUC19

MWG Biotech

M 13 reverse CS ( -49 )

reverse-Primer für pUC19

MWG Biotech

M 13 universal CS ( -43 )

forward-Primer für pUC19

MWG Biotech

MEM

Minimal Essential Medium

Gibco BRL Life TechnologiesTM

MgCl2 x 6 H2O

Magnesiumchlorid

Merck

Moviol 4-88

Substanz zum Eindecken von Deckgläschen

Sigma

Na2HPO4, 12 H2O

Dinatriumhydrogenphosphat

Merck

NaCH3COO

Natriumacetat

Merck

NaCl p. A.

Natriumchlorid

Merck

NaH2PO4, H2O p. A.

Natriumdihydrogenphosphat

Merck

NaOH

Natriumhydroxid

Merck

NheI

Restriktionsendonuklease

MBI Fermentas

NotI

Restriktionsendonuklease

MBI Fermentas

P5D4

Anti-VSV-Erstantikörper

Kultur-Überstand, im Labor hergestellt

PauI

Restriktionsendonuklease

MBI Fermentas

PEG 50 % ( w/v )

Polyethylenglycol 4000

MBI Fermentas

PFA

Paraformaldehyd

Fluka

pH-Teststreifen

Merck

Phenol

Fluka

Phenol/Chloroform Gemisch

Fluka

Plasmid Maxi Kit

Kit für die Plasmidpräparation

Qiagen

Plasmid Midi Kit

Kit für die Plasmidpräparation

Qiagen

PstI

Restriktionsendonuklease

MBI Fermentas

pUC19

Plasmid/Vektor

New England Biolabs

Pwo ( mit Puffer und MgSO4 )

DNA Polymerase

Eurogentec

Qiaquick Gel Extraction Kit

Kit für die DNA-Extraktion aus Agarosegelen

Qiagen

SDS

Natriumdodecylsulfat, Detergens

Sigma

Silan

Sigma

SpinPlasmidPrep

Kit für die Plasmidpräparation

Qiagen

T4 DNA Ligase

DNA-Ligase

MBI Fermentas

TEMED

N, N, N’,N’-Tetramethylethylen-diamin

Fluka

TfxTM-50 Reagent

Transfektionsreagenz

Promega

Thermo Sequenase fluorescentlabelled primer cycle sequencing kit

Reagenzien für die DNA-Sequenzierung

Amersham LIFE SCIENCE

Tris base p. A.

Puffer

Roth

Triton-X-100

Detergens

Sigma

Trypsin

Proteinase

Gibco BRL Life TechnologiesTM

TSB

Tryptic soy broth

Fluka

Urea p. A.

Harnstoff

Roth

Xylencyanol

Farbmarker

Sigma


22

2.3.2. Zusammensetzung verwendeter Reagenzien

2.3.2.1. Medien

    Nachstehend wiedergegeben sind die Arbeitsanleitungen zur Herstellung der in den Experimenten eingesetzten Medien.

2.3.2.2. Puffer

    Zur Herstellung der in den Experimenten eingesetzten Puffer wurde auf die folgenden Arbeitsanleitungen zurückgegriffen.

BBS-Puffer
2 X BBS
Zubereitung von 40 ml 2 X BBS:

Substanz

Molekulargewicht

Menge für 40 ml

Konzentration in 2 X Lösung

BES

213,20 g/mol

0,43 g

50 mM

NaCl

58,44 g/mol

0,66 g

280 mM

Na2HPO4 ,12 H2O

358,14 g/mol

0,0214 g

1,5 mM


23

EDTA
0,5 M EDTA ( pH 8,0 )

10 X EDTA/Salzlösung für Trypsin
Zubereitung einer 100 ml Lösung aus:

PBS-Puffer
10 X nach Dulbecco pH 7,4 ( mit NaOH einstellen )
mit Ca2+ und Mg2+

Herstellung:

Substanz

Molekulargewicht

Ansatz pro Liter

Konzentration in 10 X Lösung

CaCl2

111,00 g/mol

1 g

9 mM

KCl

74,55 g/mol

2 g

26,8 mM

KH2PO4

136,10 g/mol

2 g

14,7 mM

MgCl2 x 6 H2O

203,30 g/mol

1 g

4,92 mM

NaCl

58,44 g/mol

80 g

1,37 mM

Na2HPO4 x 7 H2O

268,10 g/mol

21,6 g

80,57 mM

10 X nach Dulbecco pH 7,4 ( mit NaOH einstellen )
ohne Ca2+ und Mg2+


24

TAE-Puffer
konzentrierte Vorratslösung

50 X =

242 g Tris base

57,1 ml Eisessig

100 ml 0,5 M EDTA ( pH 8,0 )

A. bid. ad 1000 ml

Gebrauchslösung

1 X =

0,04 M Tris acetat

0,001 M EDTA

TBE-Puffer
konzentrierte Vorratslösung

10 X =

108 g Tris Base

55 g Borsäure

40 ml 0,5 M EDTA ( pH 8,0 )

A. bid. ad 1000 ml

Gebrauchslösung

1 X =

0,089 M Trisborat

0,002 M EDTA

TE-Puffer
10 X TE-Puffer pH 8,0 ( mit HCl einstellen )

Substanz

Ansatz pro Liter

Konzentration in 10 X Lösung

Tris ( MW 21,14 g/mol )

12,14 g

100 mM

EDTA ( 0,5 M )

20 ml

10 mM


25

2.3.2.3. Weitere Reagenzien

    Wiedergegeben sind die Arbeitsanleitungen für die Herstellung der in den Experimenten eingesetzten Reagenzien.

Moviol zum Eindecken der Deckgläschen

Natriumacetatlösung
Herstellung einer sterilen 3 M Natriumacetat-Lösung ( pH 5,2 ) mit einem Endvolumen von 50 ml:

Paraformaldehyd 3,7 % in 1 X PBS
Herstellung einer 100 ml Lösung:


26

Trypsin
Herstellung von 0,25 % Trypsin ( 1 X ) aus 10 X Trypsin ( 2,5 % ) ohne EDTA und 10 X EDTA/Salzlösung:

Stop-Reagenz für die DNA-Sequenzierreaktion
Herstellung einer 10 ml Lösung:

9,5 ml

Formamid

0,4 ml

EDTA ( 0,5 M )

0,1 ml

A. bid.

5 mg

Bromphenolblau

5 mg

Xylencyanol


27

2.4. Methoden

2.4.1. Zellbiologische Methoden

Nachstehend aufgeführt sind die Arbeitsanleitungen für den Einsatz von HeLa-Zellen in den durchgeführten Experimenten.

2.4.1.1. Kultivierung von HeLa-Zellen

verwendete Materialien

Arbeitsschritte

Trypsinieren von HeLa-Zellen in 15 ml Zellkulturschalen

2.4.1.2. Quantifikation von Zellen

Quantifikation:

Ansatz für eine neue Zell-Kultur:

2.4.1.3. Transfektion von HeLa-Zellen

Kalziumphosphat-Methode, modifiziert für die 6-Loch-Platte

verwendete Materialien

Arbeitsschritte

Tag 1

Tag 2

18-24 h später

Tag 3

18-24 h später

Tag 4

Infektion, s. 2.4.1.4

2.4.1.4. Infektion von HeLa-Zellen

modifiziert für die 6-Loch-Platte

verwendete Materialien

Arbeitsschritte

2.4.1.5. Zellfärbung mit Antikörpern

verwendete Materialien

Arbeitsschritte

2.4.1.6. Herstellung von Objektträgern

verwendete Materialien


31

Arbeitsschritte

2.4.2. Bakteriologische Methoden - Klonierung

Nachstehend wiedergegeben sind die Arbeitsanleitungen für die Klonierungsexperimente mit E.coli-Zellen.

2.4.2.1. Herstellung kompetenter E.coli-Zellen

verwendete Materialien

Arbeitsschritte


32

2.4.2.2. Transformation kompetenter E.coli-Zellen

verwendete Materialien

Arbeitsschritte

2.4.2.3. Isolierung von Klonen mit rekombinantem Plasmid

verwendete Materialien

Arbeitsschritte

2.4.3. Molekularbiologische Methoden

Aufgeführt sind die Arbeitsanleitungen für die Arbeiten mit DNA.

2.4.3.1. Allgemeine Techniken

2.4.3.1.1. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

am UV-Spektrometer 148 , Appendix C1

( Verdünnungsfaktor der DNA bei der Berechnung berücksichtigen )

2.4.3.1.2. Elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten

verwendete Materialien


34

Arbeitsschritte

Gießen eines 1,4 % Agarosegels in 1 X TAE

Elektrophorese

2.4.3.1.3. DNA-Extraktion aus Agarosegelen mittels Qiaquick Gel Extraction Kit, in Anlehnung an das Qiaquick Protokoll

verwendete Materialien

Arbeitsschritte

2.4.3.1.4. Aufreinigung von DNA über Phenol/Chloroform-Extraktion

verwendete Materialien

Arbeitsschritte


36

2.4.3.1.5. Ethanolpräzipitation von DNA

verwendete Materialien

Arbeitsschritte

2.4.3.1.6. Magnetische Separation mit Dynabeads® M-280 Streptavidin

Allgemeine Information

Es handelt sich um eine Suspension von 6,7 x 108 Dynabeads®/ml ( 10 mg/ml ) gelöst in PBS ( pH 7,4 ), 0,1 % BSA und 0,02 % NaN3. Dynabeads® M-280 Streptavidin sind paramagnetische Partikel von einheitlicher Größe, die von Streptavidin umhüllt sind. Sie können aufgrund ihrer paramagnetischen Eigenschaften beliebig oft selektiert und wieder resuspendiert werden. Durch die hohe Affinität des Streptavidins zu Biotin ist eine Bindung von biotinylierten Molekülen, wie beispielsweise Doppelstrang-DNA, Einzelstrang-DNA, RNA, Proteinen und


37

Lectinen möglich. Die Bindungskapazität für DNA beträgt 22 pmol eines 526 bp-Fragments/mg Dynabeads® bzw. 5 µg biotinylierte DNA/100 µl Beads ( = 1 mg Beads ).

Puffer für die Arbeit mit den Beads

Bindungspuffer:

10 mM Tris-HCl ( pH 7,5 )

100 mM NaCl

1 mM EDTA

0,15 % Triton-X-100

20 X SSPE:

3 M NaCl

0,2 M NaH2PO4, H2O

0,02 M EDTA

pH 7,4

Denaturierungslösung:

0,5 M NaOH

2 mM EDTA

´Annealing´-Puffer:

150 mM NaCl

10 mM Tris-HCl

1 mM EDTA

pH 8

Extensionspuffer:

Puffer der entsprechenden Polymerase

Protokoll für die Bindung von biotinylierter DNA an die Beads

Ergebnis: Einzelstrang-DNA, die über die Biotin-Streptavidin-Bindung an die Beads gebunden ist; jetzt sind ´Annealing´ und Extension möglich

Protokoll für ´Annealing´- und Extensionsreaktion mit an Dynabeads ® gebundener Einzelstrang-DNA als template DANN

Weiterarbeit nach obigem Protokoll

Ergebnis: Doppelstrang-DNA, die über Biotin-Streptavidin-Bindung an die Beads gebunden ist; durch Restriktionsbehandlung ist die DNA von den Beads lösbar

2.4.3.1.7. Präparation von Plasmid-DNA

mittels Qiagen Plasmid Kit, modifiziert nach dem Qiagen-Protokoll

verwendete Materialien

Arbeitsschritte

Anmerkung: Bei der endotoxinfreien Plasmidpräparation wird zusätzlich ein im Endofree-Kit mitgeliefertes Filtersystem verwendet und die Arbeit erfolgt mit endotoxinfreien Substanzen.

2.4.3.1.8. Hybridisierung von Oligonukleotiden

verwendete Materialien


40

Arbeitsschritte

Anmerkung: Die Tm ( Hybridisierungstemperatur ) der Oligonukleotide berechnet sich wie folgt:

Tm = 81,5 +0,41 (C+G) +16,6 log [ Na+ ] - 500/d

( G + C )

prozentualer Anteil der beiden Basen am gesamten Oligonukleotid

[ Na+ ]

Molarität

d

Länge der hybridisierten Doppelstrang-DNA

2.4.3.2. Enzymatische Methoden

2.4.3.2.1. Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

verwendete Materialien

Arbeitsschritte

Anmerkung: Es ist ebenfalls möglich, einen Restriktionsansatz o/n zu inkubieren. Dabei sollte jedoch maximal 1 U Enzym pro µg DNA für die Restriktion eingesetzt werden.

2.4.3.2.2. Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten

verwendete Materialien

Arbeitsschritte

2.4.3.2.3. Ligation von DNA-Fragmenten

verwendete Materialien

Arbeitsschritte

DNA-Fagment Ligation in einen Vektor, sticky end-Ligation

Verwendung der PEG 50 % -Lösung für die blunt end-Ligation sowie für die Ligation von zwei Inserts in einen geschnittenen Vektor bzw. die Ligation dreier Fragmente = Doppelligation

Kontrollmöglichkeiten der Ligation von Vektor und Fragment mit anschließender Transformation:


43

2.4.3.2.4. Durchführung einer PCR

verwendete Materialien

Arbeitsschritte

1. 94°C

3’

Denaturierung

2. 65°C

30’’

´Annealing´

3. 72°C

1’

Extension

4. 94°C

1’

Denaturierung

5. 65°C

30’’

´Annealing´

6. 72°C

1’

Extension

6. an 4.:

15 Zyklen

7. 94°C

1’

Denaturierung

8. 65°C

30’’

´Annealing´

9. 72°C

10’

Extension

10. 4°C

Reaktionsstop


44

2.4.3.2.5. DNA-Sequenzierung

Anwendung findet ein sogenanntes ”cycle sequencing“-Verfahren, bei dem die Sequenzierung auf der Synthese eines neuen DNA-Stranges beruht, der an der Bindungsstelle des Primers beginnt und durch den Einbau eines Dideoxynukleosidtriphosphats ( ddNTP ) terminiert wird. Die Konzentrationen von dNTP’s und ddNTP’s sind so gewählt, daß der Einbau eines ddNTP anstelle eines dNTP’s an jeder Position der zu sequenzierenden DNA möglich ist. Bei diesem Verfahren trägt der Primer eine 5’-Infrarot-Farbstoff-Markierung, die durch den Laser des LI-COR® DNA-Sequencer Model 4000 von MWG Biotech erkannt wird. Wie der Name ”cycle sequencing“ besagt, erfolgt die Synthese der DNA-Stränge durch wiederholte Zyklen von Denaturierung, ´Annealing´ und Exten-sion/Terminierung. Der markierte Primer kann so mehrfach an die template-DNA binden, wodurch einerseits nur eine sehr geringe Menge template-DNA benötigt wird und sich andererseits der Anteil an markierten Banden/DNA-Fragmenten erhöht. Die Qualität der Sequenzierreaktion hängt von der spezifischen Bindung des Primers an das Template ab. Deshalb sollte die ´Annealing´-Temperatur optimal auf den eingesetzten Primer abgestimmt sein. Die ´Annealing´-Temperatur läßt sich dabei wie folgt berechnen: T´Annealing´ = TmPrimer + 3°C.

SEQUENZIERREAKTION

verwendete Materialien

Arbeitsschritte

1. 5’

95°C

Denaturierung

2. 30’’

95°C

Denaturierung

3. 30’’

58°C ( abhängig vom Primer )

´Annealing´

4. 1’

70°C

Extension

4. an 2. :

30 Zyklen

5. 4°C


45

HERSTELLUNG EINES GELS FÜR DIE DNA-SEQUENZIERUNG

verwendete Materialien

Arbeitsschritte

Herstellung der Gel-Lösung für ein 8 %-Gel

Gießen des Gels


46

Elektrophorese mit dem LI-COR ® DNA-Sequencer Model 4000 von MWG Biotech

2.4.4. Computerprogramme

Bildbearbeitungsprogramme Adobe Photoshop und Corel Photo Paint

Gendatenbanken: EMBL, GenBank

HUSAR: Heidelberg Unix Sequence Analysis Resources

IBM OS/2 Base ImageIR Software mit den Programmteilen Data Collection und Image Analysis für die DNA-Sequenzierung

Microsoft Word 97 für Windows

Zeichenprogramm Autosketch


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