Bohm, Birgit: ”Differentielle Rekrutierung der Isoformen des kleinen G-Proteins Rho bei der Invasion von Shigellen in Epithelzellen“

47

Kapitel 3. Ergebnisse

Zur Untersuchung des molekularen Mechanismus der differentiellen Rekrutierung von RhoA, RhoB und RhoC während der Invasion von Shigella flexneri in HeLa-Zellen wurden definierte DNA-Mutanten der Isoformen erzeugt. Aufgrund der funktionellen Bedeutung des CAAX-Motivs kleiner G-Proteine und der beschriebenen Differenzen in der Primärstrukturebene der Rho-Isoformen ( s. Fragestellung ) wurden die folgenden Mutationen im Rho-Molekül vorgenommen. Eine Übersicht dazu bietet Tabelle 1 .

Es wurden CAAX-Deletionsmutanten für alle drei Isoformen hergestellt:

Weiterhin wurde RhoA wie folgt mutiert:

Des weiteren wurden Punktmutationen für RhoA an den Aminosäurepositionen vorgenommen, an denen nicht konservative Aminosäuredifferenzen sowohl zwischen RhoA und RhoB als auch zwischen RhoA und RhoC vorliegen. Infolge der größeren Sequenzhomologie zwischen RhoA und RhoC wurden die folgenden Mutanten hergestellt:


48

Für die Herstellung der Rho-Mutanten konnte von bereits vorhandener DNA, die für RhoA, RhoB oder RhoC mit dem N-terminal eingefügten Peptid-tag VSV kodiert, ausgegangen werden. Die VSV-tag Sequenz kodiert für 11 Aminosäuren ( Y-T-D-I-E-M-N-R-L-G-K ) des Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein G, die von dem spezifischen monoklonalen Antikörper P5D4 erkannt werden. 147 Die für RhoA vorliegende DNA kodierte jedoch nur für die Aminosäuren 5-193 des Proteins. Um vollständige Konstrukte zu erhalten, wurden die ersten vier Aminosäuren von RhoA in die Mutanten integriert, obwohl experimentell nachgewiesen wurde, daß das Fehlen dieser vier Aminosäuren die Funktion von RhoA nicht beeinträchtigt. Die Klonierung der hergestellten Mutanten in pUC19 ermöglichte die Sequenzierung der Konstrukte. Einige der sequenzierten Rho-Mutanten wurden nach Klonierung in pKC3, einem Expressionsvektor für eukaryote Zellen ( s. Einsatz verschiedener Vektoren ), im HeLa-Zell-Modell getestet. Durch die Transfektion von HeLa-Zellen mit der Konstrukt-DNA konnte der Einfluß der Mutanten auf das zelluläre Zytoskelett untersucht werden und nach zusätzlicher Infektion der transfizierten Zellen mit Shigella flexneri auch ihr Rekrutierungsverhalten. 60 , 61 , 62 , 93 , 149

Es wurden die in dem Methodenteil dargelegten experimentellen Techniken verwendet, die nun im einzelnen für die Herstellung der jeweiligen Konstrukte beschrieben sind. Experimentell eingesetz-te Oligonukleotide sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.


49-50

Tabelle 1 Übersicht über die Rho-Konstrukte

Konstrukt

Länge

RhoA

RhoB

RhoC

CAAX - Box

grafische Darstellung des Konstrukts

RhoAd

624 bp

1 - 189

-

-

fehlt

RhoBd

633 bp

-

1 - 192

-

fehlt

RhoC

639 bp

-

-

1 - 193

von RhoC

RhoCd

627 bp

-

-

1 - 189

fehlt

RhoABA

645 bp

190 - 193

181 - 192

-

von RhoA

RhoABB

645 bp

1 - 180

181 - 196

-

von RhoB

RhoABd

633 bp

1 - 180

181 - 192

-

fehlt

RhoACA

636 bp

190 - 193

-

181 - 189

von RhoA

RhoACC

636 bp

1 - 180

-

181 - 193

von RhoC

RhoACd

624 bp

1 - 180

-

181 - 189

fehlt

RhoA 140

636 bp

1 - 139

142 - 193

-

140 - 141

von RhoA

RhoA 183

636 bp

1 - 182

184 - 193

-

183

von RhoA

RhoA 186

636 bp

1 - 185

188 - 193

-

186 - 187

von RhoA

RhoA 188

636 bp

1 - 187

189 - 193

-

188

von RhoA


51-52

Tabelle 2 Verwendete Oligonukleotide

Name

laufende Nr. im Labor von Dr. Adam

Länge

5’-3’ Sequenz ( einschließlich
Restriktionsschnittstellen )

verwendet für
Konstrukt(e)

c

22

57 b

Nukleotidsequenz von Fnu4HI/den aa177-180 von RhoA/den aa181-193 von RhoC/stop/von PstI;beidseitig offen

RhoACC

c-rev

23

52 b

Gegenstrang zu c; beidseitig offen

RhoACC

rho a 1

9

84 b

Gegenstrang zur Nukleotidsequenz der aa173-180 von RhoA/der aa181-192 von RhoB/der aa190-193 von RhoA/stop/von PstI/ATCG

RhoABA

rho a 3

8

19 b

Gegenstrang zur Nukleotidsequenz der aa175-180 von RhoA

RhoABA

rho a 5

6

30 b

Gegenstrang zur Nukleotidsequenz der aa188-193 von RhoA/stop/von PstI/ATCG

RhoA 140

rhoa 140

31

50 b

Nukleotidsequenz der aa127-139 von RhoA/der aa140-141 von RhoC/der aa142-144 von RhoA

RhoA 140

rhoa 183

32

57 b

Gegenstrang zur Nukleotidsequenz der aa179-182 von RhoA/der aa183 von RhoC/der aa184-193 von RhoA/stop/von PstI/ATCG

RhoA 183

rhoa 186

29

44 b

Gegenstrang zur Nukleotidsequenz der aa183-185 von RhoA/der aa186-187 von RhoC/der aa188-193 von RhoA/stop/von PstI/ATCG

RhoA 186

rhoa 188

30

44 b

Gegenstrang zur Nukleotidsequenz der aa183-187 von RhoA/der aa188 von RhoC/der aa189-193 von RhoA/stop/von PstI/ATCG

RhoA 188

rhoabrev

24

49 b

Gegenstrang zur Nukleotidsequenz der aa185-196 von RhoB/stop/von PstI/ATCG

RhoABB

rhoacarev

43

45 b

Gegenstrang zur Nukleotidsequenz der aa184-189 von RhoC/der aa190-193 von RhoA/stop/von PstI/ATCG

RhoACA

rhoacdrev

44

39 b

Gegenstrang zur Nukleotidsequenz der aa181-189 von RhoC/stop/von PstI/ATCG

RhoCd, RhoACd

rhoadrev

45

38 b

Gegenstrang zur Nukleotidsequenz der aa181-189 von RhoA/stop/von PstI/ATCG

RhoAd

rhobd

41

45 b

Nukleotidsequenz von PstI/den aa180-192 von RhoB/stop/von PstI; beidseitig offen

RhoBd

rhobd.rev

42

45 b

Gegenstrang zu rhobd; beidseitig offen

RhoBd

rhobdrev

46

37 b

Gegenstrang zur Nukleotidsequenz der aa185-192 von RhoB/stop/von PstI/ATCG

RhoABd

rhocrev

26

35 b

Gegenstrang zur Nukleotidsequenz der aa186-193 von RhoC/stop/von PstI/ATCG

RhoC

vsv-cs-bio

1

26 b

TAC/Nukleotidsequenz von EcoRI/den aa1-6 vom VSV-tag; biotinyliert am 5’-Ende

RhoAd, RhoBd, RhoABA, RhoABB, RhoABd, RhoACA, RhoACd

vsvrhoc

25

63 b

TAC/Nukleotidsequenz von EcoRI/den aa1-12 vom VSV-tag/von KpnI/CAT/den aa1-3 von RhoC

RhoC, RhoCd


53

3.1. Herstell,ung der Rho-Konstrukte

3.1.1. Konstrukt RhoABA

Bei der ersten Mutante RhoABA wurden die Aminosäuren 181-189 von RhoA durch die Aminosäuren 181-192 von RhoB ersetzt, die CAAX-Box von RhoA blieb bestehen. Der Sequenz von RhoABA wurde am N-terminalen Ende eine Sequenz für das VSV-tag vorangestellt. Die VSV-tag-Sequenz kodiert für 11 Aminosäuren ( Y-T-D-I-E-M-N-R-L-G-K ) des Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein G, die von dem spezifischen monoklonalen Antikörper P5D4 erkannt werden. 147

Das Konstrukt RhoABA setzt sich zusammen aus:

  1. einer Schnittstelle für EcoRI
  2. der Sequenz für VSV ( VSV-tag )
  3. einer Schnittstelle für KpnI
  4. den aa 1-180 von RhoA ( magenta )
  5. den aa 181-192 von RhoB ( grün )
  6. den aa 190-193 von RhoA = CAAX-Box von RhoA ( magenta )
  7. dem Stop-Codon TGA
  8. einer Schnittstelle für PstI

Die folgenden Arbeitsschritte führten zum gewünschten Konstrukt, s. begleitend zum Text die Übersicht am Ende des Kapitels. Der erste Schritt beinhaltete eine PCR für das PCR-Produkt RhoA5-180 ( EcoRI/VSV-tag/KpnI/RhoA5-180 ) mit den Aminosäuren der gewünschten Mutante bis zur aa 180 von RhoA. Als template-DNA diente EcoRI/VSV/KpnI/RhoA5-193/stop/PstI in pKC3. Als Primer wurden eingesetzt:

Die PCR wurde mit dem Enzym Pwo durchgeführt. Pwo ist eine thermostabile ”high fidelity“ DNA Polymerase. Die hohe Genauigkeit ( etwa 10fach höher als die der Taq Polymerase ) resultiert aus der 3’-5’ Exonukleaseaktivität, die den Einbau falscher Nukleotide während der Extension verhindert. Das ´Annealing´ erfolgte bei 65°C, um eine hohe Spezifität der Primer-Bindung an die template-DNA zu gewährleisten. Insgesamt wurden nur 15 Zyklen gefahren, um die Fehlerrate der PCR gering zu halten. Die PCR wurde anhand einer Elektrophorese überprüft, s. Abbildung 1.


54

Abbildung 1 Elektrophoretische Kontrolle des PCR-Produkts RhoA5-180
Spur 1 : Leerprobe ( ohne template-DNA )
Spur 2 : pcr-Produkt von 576 bp bei Ansatz1
Spur 3 : pcr-Produkt von 576 bp bei Ansatz2

Es folgte die Reinigung von RhoA5-180 über eine Phenol-Chloroform-Extraktion mit anschließender Ethanolpräzipitation.

Der zweite Schritt zur Herstellung von RhoABA bestand in der Bindung von RhoA5-180 an Dynabeads®. ( s. Magnetische Separation mit Dynabeads® M-280 Streptavidin ) Anschließend erfolgte eine Denaturierung, um Einzelstrang-RhoA5-180 ( gebunden an die Beads ) zu erhalten. Der Ersatz der aa 181-189 von RhoA durch die aa 181-192 von RhoB sollte durch die Bindung des aus 84 Nukleotiden bestehenden Oligonukleotids rho a 1 an Einzelstrang-RhoA5-180 und eine einmalige Extensionsreaktion erfolgen. Mit Pwo waren die einfache Extension an der Beads-DNA und eine PCR nicht erfolgreich. ( s. Einsatz von Dynabeads( M-280 Streptavidin ) Deshalb erfolgte diese PCR, deren Template Einzelstrang-RhoA5-180 ( gebunden an die Beads ) war, mit Taq Polymerase und den Primern:

Da beim ersten ´Annealing´ nur 23 der 84 Basen des Oligonukleotids rho a 1 binden konnten, denn nur für diese Basen ( Nukleotidsequenz der aa173-180 von RhoA ) war ein Template vorhanden, erfolgte das erste ´Annealing´ bei 65°C. Beim zweiten ´Annealing´ konnten nach erfolgter Extension alle 84 Basen des Oligonukleotids rho a 1 binden, deshalb wurden ab dem 2. Zyklus ´Annealing´ und Extension bei einer Temperatur von 72°C ausgeführt. Das erhaltene PCR-Produkt war RhoABA5. Nach der elektrophoretischen Kontrolle der PCR ( Abbildung 2 ) schloß sich die Aufreinigung von RhoABA5 an.

Abbildung 2 Elektrophoretische Kontrolle des PCR-Produkts RhoABA5-193
Spur 1 : pcr-Produkt von 633 bp bei Ansatz1
Spur 2 : pcr-Produkt von 633 bp bei Ansatz2
Spur 3 : Leerprobe


55

Im folgenden Schritt wurde die gereinigte RhoABA5-DNA mit EcoRI und PstI über 1,5 h bei 37°C verdaut. Nach Hitzeinaktivierung der Enzyme über 10’ bei 70°C wurde die geschnittene DNA über ein 1,1 %iges Agarosegel in 1 X TAE elektrophoretisch aufgereinigt und die DNA aus dem Agarosegel mittels Qiaquick Gel Extraction Kit extrahiert. Im Anschluß daran erfolgte die Ligation von RhoABA5 ( EcoRI/PstI geschnitten ) und pUC19 ( EcoRI/PstI geschnitten ) mit T4 DNA Ligase über 1 h bei 16°C. Mit dem erhaltenen Ligationsprodukt wurden kompetente E. coli-Zellen ( TG 1 ) transformiert und ausplattiert. Die Transformation von RhoABA5 in pUC19 war erfolgreich. Von vier Klonen wurde ein fraktionierter Ausstrich gefertigt und nachfolgend das enthaltene Plasmid RhoABA5 in pUC19 von Klon 1-4 mit dem Midi-Kit von Qiagen präpariert. Die DNA-Messung ergab:

Plasmid-DNA von

mDNA

Konzentration

Klon 1

1,05 µg/µl

467 nM = 0,46 µM

Klon 2

1,50 µg/µl

668 nM = 0,67 µM

Klon 3

1,80 µg/µl

802 nM = 0,80 µM

Klon 4

2,10 µg/µl

935 nM = 0,93 µM

( pUC19/RhoABA5 hat eine Größe von ca. 3400 bp, d. h. ein MW von 2,244 x 106 g/l )

    Die Plasmide wurden durch eine EcoRI/PstI-Restriktionsanalyse kontrolliert ( Abbildung 3 ). Die Plasmide von Klon 2, 3 und 4 enthielten ein Fragment der entsprechenden Länge von 633 bp. Das Plasmid von Klon 1 enthielt kein Insert.

Abbildung 3 Elektrophoretische Kontrolle der EcoRI/PstI-Restriktionsanalyse der Plasmide pUC19/RhoABA5-193 von Klon 1-4
Spur 1 : Plasmid von Klon 1, kein Fragment enthalten
Spur 2 : Plasmid von Klon 2, Vektor ( 2800 bp ) und Fragment ( 633 bp ) der erwarteten Länge
Spur 3 : Plasmid von Klon 3, Vektor ( 2800 bp ) und Fragment ( 633 bp ) der erwarteten Länge
Spur 4 : Plasmid von Klon 4, Vektor ( 2800 bp ) und Fragment ( 633 bp ) der erwarteten Länge

Dementsprechend erfolgte die Sequenzierung der Inserts der Plasmide von Klon 2, 3 und 4 mit dem ”Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit“ von Amersham, dem forward-Primer M 13( -20 ) F und dem reverse-Primer M 13( -24 ) R. Das ´Annealing´ für die forward-Sequenzierung wurde bei 58°C ausgeführt und für die reverse-Sequenzierung bei 56°C. Die Sequenzierreaktion lief erfolgreich. Die folgenden Sequenzen waren lesbar.


56

Insert von Klon 3

Insert von Klon 4

Bei Klon 3 entsprach die Sequenz der erwarteten Sequenz für das Konstrukt RhoABA5. Die Sequenz des Inserts von Klon 4 enthielt an Position 18 im Gen von RhoA eine veränderte Aminosäure. Die Sequenz von Klon 2 war kaum lesbar. Mit dem Plasmid von Klon 3 \|--\| RhoABA5 in pUC19 \|--\| wurde weitergearbeitet.
Die letzte Veränderung, der Einbau der fehlenden ersten vier Aminosäuren von RhoA in das Konstrukt, war erst nach der Herstellung von VSV/RhoA1-193 in pKC3 möglich ( s. Konstrukt RhoACC ). Es erfolgte eine Restriktion von RhoABA5/pUC19 mit Eco32I und PstI, wobei das erhaltene Fragment ( RhoABA45-196, Eco32I/PstI geschnitten ) eluiert wurde. Des weiteren wurde ein Eco32I/PstI-Restriktionsverdau von VSV/RhoA1-193 in pKC3 durchgeführt und der Vektor ( pKC3/EcoRI/VSV/KpnI/RhoA1-45, Eco32I/PstI geschnitten ) dephosphoryliert und eluiert. Die sich anschließende Ligation von Fragment und Vektor ergab RhoABA in pKC3. Kompetente E. coli-Zellen wurden transformiert, vier Klone pKC3/RhoABA subkloniert und die Plasmide präpariert. Eine erste Kontrolle der Plasmide durch Restriktion mit EcoRI und PstI ( Abbildung 4 ) ergab, daß nur das Plasmid von Klon 1 das Fragment RhoABA mit einer Länge von 645 bp enthielt. Die Plasmide von Klon 2-4 enthielten ein etwa 1000 bp-Fragment unklarer Herkunft.

Abbildung 4 Elektrophoretische Kontrolle der EcoRI/PstI-Restriktionsanalyse der Plasmide pKC3/RhoABA1-193
Spur 1 : Plasmid von Klon 1, Vektor ( 3500 bp ) und Fragment ( 645 bp ) der erwarteten Länge
Spur 2 : Plasmid von Klon 2, Vektorgröße ist korrekt, 1000 bp-Fragment unklarer Herkunft
Spur 3 : Plasmid von Klon 3, Vektorgröße ist korrekt, 1000 bp-Fragment unklarer Herkunft
Spur 4 : Plasmid von Klon 4, Vektorgröße ist korrekt, 1000 bp-Fragment unklarer Herkunft

Eine zweite Kontrolle der Plasmid-DNA von Klon 1 war ebenfalls positiv. Eine PCR mit den Oligonukleotiden 1 ( vsv-cs-bio ) und 2 ( rho a 1 ) und der Plasmid-DNA von Klon 1 als Template führte zu einem PCR-Produkt der erwarteten Länge von 645 bp. Nach erfolgter Umklonierung des Fragments von Klon 1 in pUC19 wurde eine Sequenzierung durchgeführt. Die Auswertung dieses Sequenziergels bestätigte die Sequenz des hergestellten Konstrukts. Das Konstrukt RhoABA begann mit der ersten Aminosäure von RhoA. ( Sequenz s. unter Sequenzüberprüfung von RhoABA )


57

<A NAME=@Seite58@></A><HR><P CLASS=@PAGENUMBER@ ALIGN=RIGHT>58</P>

3.1.2. Konstrukt RhoACC

    Die zweite hergestellte Mutante, RhoACC, enthält anstelle der Aminosäuren 181-189 und der CAAX-Box ( aa 190-193 ) von RhoA die entsprechenden Aminosäuren ( aa 181-193 ) von RhoC.

Das Konstrukt RhoACC setzt sich zusammen aus:

  1. einer Schnittstelle für EcoRI
  2. der Sequenz für VSV ( VSV-tag genannt )
  3. einer Schnittstelle für KpnI
  4. den aa 1-180 von RhoA ( magenta )
  5. den aa 181-193 von RhoC ( blau )
  6. dem Stop-Codon TGA
  7. einer Schnittstelle für PstI

Zur Herstellung von RhoACC ( s. begleitend zum Text die Übersicht am Ende des Kapitels ) wurde von der Plasmid-DNA pUC19 mit dem Insert EcoRI/NotI/VSV/KpnI/RhoA5/PstI ausgegangen. Weiterhin wurden die im Gen von RhoA5-193 nur einfach vorhandenen Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Fnu4HI und Eco32I genutzt.

Als erster Schritt erfolgte ein Restriktionsverdau der Plasmid-DNA mit den beiden Endonukleasen NotI und PstI. Die beiden erhaltenen DNA-Fragmente, das Insert NotI/VSV/KpnI/RhoA5/PstI und der NotI/PstI geschnittene Vektor pUC19, wurden eluiert. Der Vektor wurde zusätzlich dephosphoryliert.
Es wurden insgesamt 5 µg von NotI/VSV/KpnI/RhoA5/PstI eluiert, da eine weitere Restriktion im Gen von RhoA mit dem Enzym Fnu4HI folgte ( Abbildung 5 ). Das entstandene Fragment NotI/VSV/KpnI/
RhoA5-177/Fnu4HI wurde nach Aufreinigung in einer Gesamtmenge von 1,3 µg eluiert.

Abbildung 5 Elektrophoretische Kontrolle der Restriktionsbehandlung von NotI/VSV/KpnI/RhoA5-193/PstI mit Fnu4HI
Spur 1 : Fragment NotI/VSV/KpnI/RhoA5-193/PstI ungeschnitten ( 624 bp )
Spur 2 : Restriktion des Fragments NotI/VSV/KpnI/RhoA5-193/PstI mit Fnu4HI führt zu zwei Fragmenten mit einer Größe von 567 bp und 57 bp


59

Der nächste Schritt bestand in der Hybridisierung der beiden Oligonukleotide c und c-rev ( s. Tabelle 2 ). Das entstandene Hybridisierungsprodukt war von den offenen Schnittstellen für Fnu4HI und PstI begrenzt, da die Oligonukleotidsequenzen von c und c-rev der Fnu4HI/PstI offenen Sequenz entsprachen. Es bildete den C-terminalen DNA-Abschnitt des Konstrukts RhoACC mit der Nukleotidsequenz von Fnu4HI/den aa177-180 von RhoA/den aa181-193 von RhoC/stop/von PstI.
Anschließend erfolgte die Ligation dreier DNA-Fragmente, s. auch Übersicht am Ende des Kapitels:

  1. 1. des dephosphorylierten, NotI/PstI geschnittenen Vektors pUC19
  2. 2. des Fragments NotI/VSV/KpnI/RhoA5-177/Fnu4HI und
  3. 3. des Hybridisierungsproduktes Fnu4HI/RhoA177-180/RhoC181-193 /stop/PstI.

Aus diesen drei Fragmenten entstand das Ligationsprodukt RhoACC5 in pUC19. Die Ligation wurde mit T4 DNA Ligase von Fermentas unter Zusatz von PEG bei 16°C o/n durchgeführt ( s. Ligation von DNA-Fragmenten ). Für die Ligation wurden der Vektor und die beiden Fragmente in verschiedenen Molaritätsverhältnissen zueinander eingesetzt, von 10 : 1 bis 1 : 10. Die Transformation kompetenter E. coli-Zellen mit den verschiedenen Ligationsansätzen ergab, daß bei korrekten Positiv- und Negativkontrollen für die Ligationsreaktion und die LB/Ampicillin-Agarplatten nur auf Platte A ( Molaritätsverhältnis Vektor zu Fragment 10 : 1 ) zwei Klone und auf Platte D ( Molaritätsverhältnis Vektor zu Fragment 1 : 2 ) vier Klone gewachsen waren. Diese sechs Klone A 1-2 und D 1 - 4 wurden fraktioniert ausgestrichen.
Nach erfolgter Plasmidpräparation wurde durch eine NotI/PstI-Restriktionsanalyse der Plasmide festgestellt ( Abbildung 6 ), daß bei Klon A 1 genomische DNA von TG 1 präpariert wurde, die Plasmid-DNA bei A 2 die Vektorlänge von pUC19 hatte, jedoch das NotI/PstI-Insert länger als erwartet war. Bei den Plasmiden von D 1 - 4 führte die Restriktion zu Vektor und Fragment der erwarteten Länge.

Abbildung 6 Elektrophoretische Kontrolle der NotI/PstI-Restriktionsanalyse der Plasmide pUC19/RhoACC5-193 von Klon A 1 - 2 und Klon D 1 4
Spur 1 : genomische DNA von Klon A 1
Spur 2 : Plasmid von A 2, Vektorlänge ist korrekt ( 2800 bp ), aber Fragment ( ca. 700 bp ) ist größer als erwartet
Spur 3 : Plasmid von D 1, Vektor ( 2800 bp ) und Fragment ( 624 bp ) der erwarteten Länge
Spur 4 : 100 bp-DNA-Längenmarker
Spur 5 : Plasmid von D 2, Vektor und Fragment korrekter Länge
Spur 6 : Plasmid von D 3, Vektor und Fragment korrekter Länge
Spur 7 : Plasmid von D 4, Vektor und Fragment korrekter Länge
Spur 8 : 1 kb-DNA-Längenmarker


60

Zur weiteren Kontrolle der NotI/PstI-Fragmente von A 2 und D 1 - 4, insbesondere zur Überprüfung der Übergänge an der Fnu4HI-Schnittstelle, wurde eine Sequenzierung durchgeführt. Bei der Auswertung stellte sich heraus, daß das Fragment von A 2 ein zusätzliches, beidseitig Fnu4HI geschnittenes Insert enthielt zwischen dem RhoA-Fragment und dem Hybridisierungsprodukt. Dies erklärte die größere Länge des
NotI/PstI-Inserts von A 2. Die Inserts von D 1 - 4 entsprachen der erwarteten Sequenz des Konstrukts RhoACC. Das Plasmid D 2 wurde für die Weiterarbeit ausgewählt.

Um das vollständige Konstrukt RhoACC ( beginnend mit der ersten Aminosäure von RhoA ) zu erhalten, wurde wie folgt vorgegangen. Im Labor war in der Zwischenzeit KpnI/RhoA1-193/PstI in pKC3 hergestellt worden. Somit lag die komplette RhoA-Sequenz in pKC3 vor. Allerdings war der Sequenz nicht das VSV-tag vorangestellt. Über einen KpnI/PstI-Restriktionsverdau der Plasmide RhoA in pKC3 und VSV/RhoA5 in pKC3 und eine anschließende Ligation von pKC3/VSV und RhoA1-193 entstand VSV/RhoA1-193 in pKC3.
Über einen erneuten Restriktionsverdau von RhoACC5 in pUC19 mit EcoRI und Eco32I entstand Eco32I/RhoACC45-193/pUC19/EcoRI. Ebenso wurde VSV/RhoA in pKC3 geschnitten und das Fragment EcoRI/VSV/KpnI/RhoA1-45/Eco32I eluiert ( Abbildung 7 ).

Abbildung 7 Elektrophoretische Kontrolle der EcoRI/Eco32I-Restriktionsanalyse der Plasmide pUC19/RhoACC5-193 und pKC3/RhoA1-193
Spur 1 : Restriktion des Plasmids pUC19/RhoACC5-193 führt zu einem Fragment von 171 bp und einem Vektor von ca. 3300 bp
Spur 2 : Restriktion des Plasmids pKC3/RhoA1-193 führt zu einem Fragment von 183 bp und einem Vektor von ca. 4000 bp

Die beiden DNA-Fragmente Eco32I/RhoACC45-193/pUC19/EcoRI ( 3300 bp ) und EcoRI/VSV/KpnI/
RhoA1-45/Eco32I ( 183 bp ) wurden zu EcoRI/VSV/KpnI/RhoACC/PstI in pUC19 ligiert und in E. coli-Zellen kloniert. Das Plasmid pUC19/RhoACC wurde mittels Restriktion kontrolliert und das Insert RhoACC über eine PCR sowie eine anschließende Sequenzierung bestätigt. ( Sequenz s. unter Sequenzüberprüfung von RhoACC ). In einem letzten Schritt wurde die Mutante VSV/RhoACC unter Verwendung der Restriktionsschnittstellen EcoRI und PstI in den Vektor pKC3 umkloniert.


61


62

3.1.3. Konstrukte RhoAd, RhoC, RhoCd, RhoABB, RhoABd, RhoACA, RhoACd

Ausgehend von der im Labor vorhandenen Plasmid-DNA und der hergestellten DNA für die Konstrukte
RhoABA und RhoACC konnten die CAAX-Deletionsmutanten RhoAd und RhoCd sowie die Konstrukte RhoC, RhoABB, RhoABd, RhoACA und RhoACd hergestellt werden.

    Die bereits für RhoC vorliegende DNA ( KpnI/NotI/VSV/EcoRI/RhoC/BamHI/XbaI/SalI/PstI in pUC19 ) wurde nur entsprechend der Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen verändert, damit die Konstrukte einen einheitlichen Aufbau erhielten.

Die Konstrukte setzen sich zusammen aus:

  1. einer Schnittstelle für EcoRI
  2. der Sequenz für VSV ( VSV-tag genannt )
  3. einer Schnittstelle für KpnI
  4. den entsprechenden aa, s. u.
  5. dem Stop-Codon TGA
  6. einer Schnittstelle für PstI

RhoAd = RhoA1-189 ( magenta )

RhoC = RhoC1-193 ( blau )

RhoCd = RhoC1-189 ( blau )

RhoABB = RhoA1-180 ( magenta ) /RhoB181-196 ( grün )

RhoABd = RhoA1-180 ( magenta ) /RhoB181-192 ( grün )


63

RhoACA = RhoA1-180 ( magenta ) /RhoC181-189 ( blau ) /RhoA190-193 ( magenta )

RhoACd = RhoA1-180 ( magenta ) /RhoC181-189 ( blau )

Für die Herstellung der neuen Konstrukte ( s. auch Übersicht am Ende des Kapitels ) wurde jeweils eine PCR über 15 Zyklen mit Pwo als DNA Polymerase bei einer ´Annealing´-Temperatur von 65°C durchgeführt.
Folgende Oligonukleotide ( s. Tabelle 2 Verwendete Oligonukleotide ) und Templates kamen dabei zum Einsatz:

Konstrukt

Größe

template-DNA

Oligonukleotid 1
5’-3’

Oligonukleotid 2
3’-5’

RhoAd

624 bp

VSV/RhoA

vsv-cs-bio

rhoadrev

RhoC

639 bp

VSV/RhoCalt

vsvrhoc

rhocrev

RhoCd

627 bp

VSV/RhoCalt

vsvrhoc

rhoacdrev

RhoABB

645 bp

VSV/RhoABA

vsv-cs-bio

rhoabrev

RhoABd

633 bp

VSV/RhoABA

vsv-cs-bio

rhobdrev

RhoACA

636 bp

VSV/RhoACC

vsv-cs-bio

rhoacarev

RhoACd

624 bp

VSV/RhoACC

vsv-cs-bio

rhoacdrev

Die PCR‘s wurden anhand einer Elektrophorese überprüft. Die entstandenen PCR-Produkte wurden nach Aufreinigung mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und PstI geschnitten und anschließend in den Vektor pUC19 ligiert. Nach erfolgter Klonierung wurden die Plasmide präpariert und mittels Restriktionsanalyse und PCR kontrolliert. Die im Anschluß durchgeführte Sequenzierung bestätigte die erwartete Sequenz für die Mutanten RhoAd, RhoC, RhoCd, RhoABB, RhoABd, RhoACA und RhoACd. ( Sequenzen s. unter Sequenzüberprüfung der hergestellten Rho-Konstrukte ) Als letzter Schritt erfolgte die Klonierung der Konstrukte RhoAd, RhoC, RhoCd, RhoABB, RhoABd, RhoACA und RhoACd in pKC3 unter Verwendung der EcoRI/PstI-Restriktionsschnittstellen.


64


65

3.1.4. 3.1.4 Konstrukt RhoBd

    Für RhoB wurde ebenfalls eine CAAX-Deletionsmutante hergestellt, allerdings mit der Besonderheit, daß der Triplett-Code der Aminosäure 180 von RhoB verändert wurde, ohne die Aminosäure 180 zu ändern. Die Veränderung wurde vorgenommen, um die an dieser Stelle im Gen von RhoB befindliche PstI-Schnittstelle zu eliminieren.

Das Konstrukt RhoBd setzt sich zusammen aus:

  1. einer Schnittstelle für EcoRI
  2. der Sequenz für VSV ( VSV-tag genannt )
  3. einer Schnittstelle für KpnI
  4. den aa 1-192 von RhoB ( grün ), dabei Veränderung der Nukleotidsequenz für die aa 180 von CAG zu CAA ohne Änderung der Aminosäure Glutamin an Position 180
  5. dem Stop-Codon TGA
  6. einer Schnittstelle für PstI

Zur Herstellung von RhoBd ( s. begleitend zum Text auch die Übersicht am Ende des Kapitels ) wurde von VSV/RhoB in pUC19 ausgegangen. Es wurde eine Einfachrestriktion mit PstI durchgeführt, die zu den beiden DNA-Fragmenten PstI/pUC19/EcoRI/VSV/KpnI/RhoB1-180/PstI und PstI/RhoB180-196/PstI führte. Im Anschluß an eine Dephosphorylierung wurde PstI/pUC19/EcoRI/VSV/KpnI/RhoB1-180/PstI eluiert.

Zur Vervollständigung des Konstrukts mußten die restlichen Nukleotide, die für die Aminosäuren 180-192 kodieren, wieder hinzugefügt werden und dabei die intragenische PstI-Schnittstelle entfernt werden. Dies erfolgte durch die Hybridisierung der beiden Oligonukleotide rhobd und rhobd.rev ( s. Tabelle 2 ). Das entstandene Hybridisierungsprodukt war beidseitig durch offene PstI-Schnittstellen begrenzt und veränderte die Nukleotidsequenz der aa180 von RhoB von CAG ( Glutamin ) zu CAA ( Glutamin ). Die intragenische Nukleotidfolge CTGCAG ( PstI-Restriktionsschnittstelle ) wurde dadurch zu CTGCAA umgewandelt, einer Sequenz, an der das Enzym PstI nicht mehr schneidet.

Die Ligation von PstI/pUC19/VSV/RhoB1-180/PstI mit dem Hybridisierungsprodukt PstI/RhoB180-192/PstI führte zu VSV/RhoBd. Im Anschluß an die Ligation erfolgte die Transformation von kompetenten E. coli-Zellen. Es wurden acht Klone subkloniert und die enthaltenen Plasmide präpariert. Nach Aufreinigung der Plasmid-DNA’s mittels Phenol/Chloroform-Extraktion erfolgte eine reverse-Sequenzierung der Inserts, um die Veränderung am C-terminalen Ende von RhoBd zu verifizieren. Die Sequenzierung führte zu dem Ergebnis, daß vier der acht Plasmide nicht das Hybridisierungsprodukt enthielten, dementsprechend einfach geschnittene, nicht dephosphorylierte Religationsplasmide von


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VSV/RhoBd1-180 in pUC19 waren. Bei einem Plasmid war das Hybridisierungsprodukt PstI/RhoB180-192/PstI mehrfach hintereinander in PstI/pUC19/VSV/RhoB1-180/PstI hineinligiert worden. Ein Plasmid enthielt das Hybridisierungsprodukt in falscher Orientierung. Zwei Plasmide enthielten das Hybridisierungsprodukt richtig orientiert, allerdings fehlten bei einem dieser beiden Plasmide vier Nukleotide in dem Molekülabschnitt, der aus den hybridisierten Oligonukleotiden entstanden ist. Das andere Plasmid enthielt die erwartete Sequenz. ( Sequenz s. unter Sequenzüberprüfung von RhoBd )

Zur Bestätigung der in Sequenzierreaktionen allgemein schwierig zu lesenden Sequenz GCGCGC ( Bandenkompression ) wurde eine zusätzliche Restriktionsanalyse mit dem für diese Nukleotidfolge spezifischen Enzym PauI durchgeführt. Dies war möglich, da die PauI-Schnittstelle in pUC19 nicht vorhanden ist und in RhoB nur einmal vorkommt.

Abschließend erfolgte die Klonierung der CAAX-Deletionsmutante RhoBd in pKC3 unter Verwendung der EcoRI/PstI-Restriktionsschnittstellen.


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68

3.1.5. 3.1.5 Konstrukt RhoA 140

    Bei diesem Konstrukt wurden einzelne Aminosäuren von RhoA verändert. Die Aminosäuren 140 ( Lysin ) und 141 ( Prolin ) von RhoA wurden durch die Aminosäuren 140 ( Arginin ) und 141 ( Serin ) von RhoC ersetzt. Der Austausch dieser Aminosäuren erfolgte, da sich RhoA und RhoC an beiden Positionen durch nicht konservative Aminosäuren unterscheiden.

Das Konstrukt RhoA 140 setzt sich zusammen aus:

  1. einer Schnittstelle für EcoRI
  2. der Sequenz für VSV ( VSV-tag genannt )
  3. einer Schnittstelle für KpnI
  4. den aa 1-139 von RhoA ( magenta )
  5. den aa 140-141 von RhoC ( blau )
  6. den aa 142-193 von RhoA ( magenta )
  7. dem Stop-Codon TGA
  8. einer Schnittstelle für PstI

Der erste Schritt für die Herstellung von RhoA 140 ( s. begleitend zum Text auch die Übersicht am Ende des Kapitels ) bestand in einer PCR, wiederum über 15 Zyklen, Pwo als DNA Polymerase und einer ´Annealing´-Temperatur von 65°C. Als Oligonukleotide dienten rhoa 140 und rho a 5 ( s. Tabelle 2 ) und als template-DNA wurde VSV/RhoA in pKC3 eingesetzt. Das PCR-Produkt A 140 ( Nukleotidsequenz der aa127-139 von RhoA/der aa140-141 von RhoC/der aa142-193 von RhoA/stop/von PstI ) wurde mit den Restriktionsendonukleasen NheI und PstI geschnitten. Ebenfalls erfolgte eine Restriktionsbehandlung von VSV/RhoAd in pUC19 mit NheI ( im Gen von RhoA kommt diese Schnittstelle nur einmal an der Aminosäureposition 128 vor ) und PstI, um den Vektor pUC19/VSV/RhoA1-128 ( NheI/PstI geschnitten ) zu erhalten. Es schloß sich die Ligation des Vektors mit A 140 zum Ligationsprodukt RhoA 140 in pUC19 an. Nach Klonierung und Plasmidpräparation wurden die Plasmide pUC19/RhoA 140 mittels EcoRI/PstI-Restriktion kontrolliert und anschließend das Insert VSV/RhoA 140 über eine Sequenzierung bestätigt. ( Sequenz s. unter Sequenzüberprüfung von RhoA 140 )

Das sequenzierte Konstrukt VSV/RhoA 140 wurde abschließend in den Vektor pKC3 unter Verwendung der EcoRI/PstI-Restriktionsschnittstellen umkloniert.


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70

3.1.6. 3.1.6 Konstrukte RhoA 183, RhoA 186, RhoA 188

RhoA und RhoC zeigen auf Primärstrukturebene eine 93 %ige Homologie in ihrem Aufbau. Im Gegensatz dazu beträgt die Übereinstimmung bezogen auf den Bereich der Aminosäuren 181-189 beider Isoformen nur 33 %. Bei dem Konstrukt RhoACA sind die Aminosäuren 181-189 von RhoA durch die Aminosäurem 181-189 von RhoC ersetzt worden. Bei den nachfolgend beschriebenen Konstrukten wurden nun einzelne Aminosäuren dieses Molekülabschnitts von RhoA gegen die entsprechenden Aminosäuren von RhoC ausgetauscht. Der Austausch erfolgte an den Positionen, an denen sich RhoA und RhoC durch nicht konservative Aminosäuren unterscheiden. Die Konstrukte setzen sich zusammen aus:

  1. einer Schnittstelle für EcoRI
  2. der Sequenz für VSV ( VSV-tag genannt )
  3. einer Schnittstelle für KpnI
  4. den aa 1-193 von RhoA mit Austausch einzelner aa von RhoA gegen die von RhoC, s. u.
  5. dem Stop-Codon TGA
  6. einer Schnittstelle für PstI

Konstrukt RhoA 183 = RhoA1-182 ( magenta ) /RhoC183 ( blau ) /RhoA184-193 ( magenta );
aa183 von RhoA ( Arginin ) durch Lysin ersetzt

Konstrukt RhoA 186 = RhoA1-185 ( magenta ) /RhoC186-187 ( blau ) /RhoA188-193 ( magenta );
aa186-187 von RhoA ( Lysin - Lysin ) durch Arginin - Arginin ersetzt

Konstrukt RhoA 188 = RhoA1-187 ( magenta ) /RhoC188 ( blau ) /RhoA189-193 ( magenta );
aa188 von RhoA ( Serin ) durch Arginin ersetzt

Diese drei Konstrukte wurden jeweils über eine PCR, deren Template VSV/RhoA in pKC3 war, hergestellt. ( s. begleitend zum Text auch die Übersicht am Ende des Kapitels ) Als Oligonukleotid 1 wurde vsv-cs-bio eingesetzt und als Oligonukleotid 2 entweder rhoa 183 oder rhoa 186 oder rhoa 188, s. Tabelle 2 Verwendete Oligonukleotide . Die PCR-Produkte wurden gereinigt, mit den Restriktionsenzymen EcoRI und PstI geschnitten und in pUC19 kloniert. Anschließend wurden die Inserts RhoA 183, RhoA 186 und RhoA 188 durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung bestätigt. ( Sequenzen s. unter Sequenzüberprüfung der hergestellten Rho-Konstrukte ) Die Klonierung der Rho-Mutanten RhoA 183, RhoA 186 und RhoA 188 in den Vektor pKC3 unter Verwendung der EcoRI/PstI-Restriktionsschnittstellen stellte den letzten Schritt dar.


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3.2. Sequenzüberprüfung der hergestellten Rho-Konstrukte

3.2.1. Sequenzüberprüfung von RhoAd

- vsvrhoad = vollständige DNA-Sequenz des Konstrukts RhoAd, Basen der Nukleotide 1 bis 624

- ad3f = forward-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts, 390 Basen gelesen

- ad3r = komplementärer Gegenstrang der 429 gelesenen Basen der reverse-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts

420


73


74

3.2.2. Sequenzüberprüfung von RhoBd

- vsvrhobd = vollständige DNA-Sequenz des Konstrukts RhoBd, Basen der Nukleotide 1 bis 633

- bd1f = forward-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts, 344 Basen gelesen

- bd1r = komplementärer Gegenstrang der 352 gelesenen Basen der reverse-Sequenzierung
des hergestellten Konstrukts


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3.2.3. Sequenzüberprüfung von RhoC

- vsvrhoc = vollständige DNA-Sequenz des Konstrukts RhoC, Basen der Nukleotide 1 bis 639

- c3f = forward-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts, 462 Basen gelesen

- c3r= komplementärer Gegenstrang der 466 gelesenen Basen der reverse-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts


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3.2.4. Sequenzüberprüfung von RhoCd

- vsvrhocd = vollständige DNA-Sequenz des Konstrukts RhoCd, Basen der Nukleotide 1 bis 627

- cd3f = forward-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts, 465 Basen gelesen

- cd3r = komplementärer Gegenstrang der 467 gelesenen Basen der reverse-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts


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80

3.2.5. Sequenzüberprüfung von RhoABA

- vsvrhoaba = vollständige DNA-Sequenz des Konstrukts RhoABA, Basen der Nukleotide 1 bis 645

- p26f = forward-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts, 236 Basen gelesen

- p26r = komplementärer Gegenstrang der 390 gelesenen Basen der reverse-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts


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3.2.6. Sequenzüberprüfung von RhoABB

- vsvrhoabb = vollständige DNA-Sequenz des Konstrukts RhoABB, Basen der Nukleotide 1 bis 645

- abb2f = forward-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts, 377 Basen gelesen

- abb2r = komplementärer Gegenstrang der 384 gelesenen Basen der reverse-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts


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84

3.2.7. Sequenzüberprüfung von RhoABd

- vsvrhoabd = vollständige DNA-Sequenz des Konstrukts RhoABd, Basen der Nukleotide 1 bis 633

- abd1f = forward-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts, 272 Basen gelesen

- abd1r = komplementärer Gegenstrang der 489 gelesenen Basen der reverse-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts


85


86

3.2.8. Sequenzüberprüfung von RhoACA

- vsvrhoaca = vollständige DNA-Sequenz des Konstrukts RhoACA, Basen der Nukleotide 1 bis 636

- aca1f = forward-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts, 493 Basen gelesen

- aca1r = komplementärer Gegenstrang der 280 gelesenen Basen der reverse-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts


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88

3.2.9. Sequenzüberprüfung von RhoACC

- vsvrhoacc = vollständige DNA-Sequenz des Konstrukts RhoACC, Basen der Nukleotide 1 bis 636

- p25f = forward-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts, 515 Basen gelesen

- p25r = komplementärer Gegenstrang der 643 gelesenen Basen der reverse-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts


89


90

3.2.10. Sequenzüberprüfung von RhoACd

- vsvrhoacd = vollständige DNA-Sequenz des Konstrukts RhoACd, Basen der Nukleotide 1 bis 624

- acd1f = forward-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts, 498 Basen gelesen

- acd1r = komplementärer Gegenstrang der 264 gelesenen Basen der reverse-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts


91


92

3.2.11. Sequenzüberprüfung von RhoA 140

- vsvrhoa140 = vollständige DNA-Sequenz des Konstrukts RhoA 140, Basen der Nukleotide 1 bis 636

- a140-1f = forward-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts, 433 Basen gelesen

- a140-1r = komplementärer Gegenstrang der 424 gelesenen Basen der reverse-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts


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94

3.2.12. Sequenzüberprüfung von RhoA 183

- vsvrhoa183 = vollständige DNA-Sequenz des Konstrukts RhoA 183, Basen der Nukleotide 1 bis 636

- a183-2f = forward-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts, 434 Basen gelesen

- a183-2r = komplementärer Gegenstrang der 542 gelesenen Basen der reverse-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts


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3.2.13. Sequenzüberprüfung von RhoA 186

- vsvrhoa186 = vollständige DNA-Sequenz des Konstrukts RhoA 186, Basen der Nukleotide 1 bis 636

- a186-1f = forward-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts, 436 Basen gelesen

- a186-1r = komplementärer Gegenstrang der 424 gelesenen Basen der reverse-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts


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3.2.14. Sequenzüberprüfung von RhoA 188

- vsvrhoa188 = vollständige DNA-Sequenz des Konstrukts RhoA 188, Basen der Nukleotide 1 bis 636

- a188-1f = forward-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts, 436 Basen gelesen

- a188-1r = komplementärer Gegenstrang der 543 gelesenen Basen der reverse-Sequenzierung des hergestellten Konstrukts


99

<A NAME=@Seite100@></A><HR><P CLASS=@PAGENUMBER@ ALIGN=RIGHT>100</P>

3.3. Transfektion mit ausgewählten Rho-Konstrukten

Nach erfolgter Sequenzierung der Rho-Konstrukte und ihrer Klonierung in pKC3 wurde ein Teil der hergestellten Mutanten in Transfektionsexperimenten auf Expression und funktionelle Aktivität hinsichtlich der Induktion von ”stress fibers“ untersucht. 91 Für diese Untersuchungen wurden HeLa-Zellen mit der entsprechenden DNA nach der Kalziumphosphat-Methode transfiziert ( s. Transfektion von HeLa-Zellen ). Eine sich an die Transfektion anschließende Infektion der Zellen mit dem Stamm SC 301 ( s. Infektion von HeLa-Zellen ) wurde durchgeführt, um neben der Expression der Rho-Mutanten auch ihr Rekrutierungsverhalten während der Invasion von Shigella flexneri zu beurteilen. Es stand die Frage, ob die hergestellten Rho-Konstrukte an die bakterielle Eintrittsstelle rekrutiert werden und wenn ja, ob ihre Rekrutierungsmuster dem von RhoA, RhoB oder RhoC entsprachen.

Die transfizierten HeLa-Zellen wurden 18-24 Stunden in MEM unter Zusatz von 10 % Fötalem Kälberserum bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. Vor der Infektion wurden die Zellen mit MEM gewaschen. Die Shigellen wurden in MEM aufgenommen und zu den Zellen gegeben. Nach Adhäsion der Bakterien an die HeLa-Zellen über 20’ bei Raumtemperatur erfolgte eine Inkubation im Wasserbad über 13’ bei 37°C für die zellu-läre Infektion. Im Anschluß daran wurden die Zellen mehrmals mit PBS-Puffer gewaschen. Die HeLa-Zellen wurden durch Zugabe von Paraformaldehyd ( 3,7 % in 1 X PBS, pH 7,4 ) über 20’ bei Raumtemperatur fixiert. Die Permeabilisation ihrer Zellmembran erfolgte mit Triton-X-100 ( 0,1 % in 1 X PBS ) über 5’ bei Raumtemperatur. Nach mehrfachem Waschen der Zellen mit PBS wurde die Färbung mit spezifischen Antikörpern vorgenommen ( s. Zellfärbung mit Antikörpern ).

Eine Überprüfung der Funktionalität der Mutanten erfolgte über Aktinfärbung. Als fluoreszenzmarkiertes Peptid für die Darstellung von F-Aktin wurde Bodipy-Phallacidine eingesetzt. Die Rho-Konstrukte, denen N-terminal die VSV-Sequenz vorangestellt war, konnten über eine Zweifachfärbung identifiziert werden. Zuerst erfolgte eine Färbung mit dem monoklonalen Anti-VSV Erstantikörper P5D4 147 , anschließend wurde mit dem ebenfalls fluoreszenzmarkierten Zweitantikörper Anti-mouse Texas-Red gegengefärbt.

Da die Invasion der Shigellen in Epithelzellen mit einer vorübergehenden Akkumulation von F-Aktin an der bakteriellen Eintrittsstelle einhergeht und diese lokale Anreicherung von F-Aktin in Infektionsexperimenten mit nicht-invasiven Shigellen nicht auftritt, läßt sich das Invasionsereignis ebenfalls anhand der F-Aktin-Färbung darstellen. 35

Die Ergebnisse der mikroskopischen Auswertung der Experimente wurden fotografisch dokumentiert.

Aufgrund der größeren Homologie zwischen RhoA und RhoC auf Primärstrukturebene ( nur 14 unterschiedliche Aminosäuren im Vergleich zu 28 differierenden Aminosäuren zwischen RhoA und RhoB ), wurden zur Untersuchung der Shigella-spezifischen Rekrutierung von Rho HeLa-Zellen mit den folgenden Rho-Mutanten transfiziert:


101

Die Transfektionsexperimente führten zu den folgenden Ergebnissen, s. auch Tabelle 3 .

    RhoAd und RhoCd, die CAAX-Deletionsmutanten von RhoA und RhoC, wurden exprimiert. Beide Konstrukte zeigten funktionelle Aktivität hinsichtlich der für Rho beschriebenen Induktion von Aktinpolymerisation ( Abbildungen 8 und 9 ).

Abbildung 8 Nachweis der funktionellen Aktivität des Konstrukts RhoAd
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; verstärkte Ausbildung von ”stress fibers“ in der transfizierten Zelle

Abbildung 9 Nachweis der funktionellen Aktivität des Konstrukts RhoCd
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; verstärkte Ausbildung von ”stresss fibers“ in der transfizierten Zelle


102

Demgegenüber erfolgte weder für RhoAd noch für RhoCd eine Shigella-induzierte Rekrutierung an die bakterielle Eintrittsstelle ( Abbildungen 10 und 11 ).

Abbildung 10 Rekrutierungsverhalten des Konstrukts RhoAd während der Invasion von Shigella flexneri in HeLa-Zellen
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt; keine Rekrutierung von RhoAd an die bakterielle Eintrittsstelle
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; lokale Anreicherung von F-Aktin am Invasionslocus von S. flexneri ( Bildmitte )

Abbildung 11 Rekrutierungsverhalten des Konstrukts RhoCd während der Invasion von Shigella flexneri in HeLa-Zellen
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt; keine Rekrutierung von RhoCd an die bakterielle Eintrittsstelle
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; Invasionslocus von S. flexneri ( Bildmitte )


103

    Die Resultate der Transfektionsexperimente des Konstrukts RhoABd entsprachen denen von RhoAd und RhoCd. RhoABd war funktionell aktiv, ersichtlich an der Induktion von ”stress fibers“. Eine Kolokalisation mit dem bakteriellen Invasionslocus konnte nicht nachgewiesen werden ( Abbildungen 12 und 13 ).

Abbildung 12 Nachweis der funktionellen Aktivität des Konstrukts RhoABd
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; verstärkte Ausbildung von ”stress fibers“ in der transfizierten Zelle

Abbildung 13 Rekrutierungsverhalten des Konstrukts RhoABd während der Invasion von Shigella flexneri in HeLa-Zellen
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt; keine Rekrutierung von RhoABd an die bakterielle Eintrittsstelle
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; lokale Anreicherung von F-Aktin am Invasionslocus von S. flexneri ( Bildmitte )


104

Auch die Transfektion der HeLa-Zellen mit den Rho-Mutanten RhoACA und RhoACC hatte eine Induktion von Aktinpolymerisation zur Folge ( Abbildungen 14 und 15 ).

Abbildung 14 Nachweis der funktionellen Aktivität des Konstrukts RhoACA
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; verstärkte Ausbildung von ”stress fibers“ in der transfizierten Zelle

Abbildung 15 Nachweis der funktionellen Aktivität des Konstrukts RhoACC
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt; wie bei Kalziumphosphat-Transfektion häufig auftretend, sind zwei benachbarte Zellen transfiziert
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; verstärkte Ausbildung von ”stress fibers“ in den transfizierten Zelle


105

Sowohl RhoACA als auch RhoACC wurden an die bakterielle Eintrittsstelle von Shigella flexneri rekrutiert. Beide Konstrukte wiesen das Rekrutierungsmuster von RhoC auf ( Abbildungen 16 und 17 ).

Abbildung 16 Rekrutierungsverhalten des Konstrukts RhoACA während der Invasion von Shigella flexneri in HeLa-Zellen
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt; Rekrutierung von RhoACA an die bakterielle Eintrittsstelle mit deutlicher Anreicherung in den zellulären Protrusionen ( Bildmitte )
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; lokale Anreicherung von Rekrutierung von RhoACA an die F-Aktin am Invasionslocus von S. flexneri ( Bildmitte )

Abbildung 17 Rekrutierungsverhalten des Konstrukts RhoACC während der Invasion von Shigella flexneri in HeLa-Zellen
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt; RhoACC weist das Rekrutierungsmuster von RhoC auf mit Anreicherung in den zellulären Protrusionen am Invasionslocus von S. flexneri
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; lokale Anreicherung von F-Aktin am bakteriellen Eintrittsort ( Bildmitte )


106

Die Resultate der durchgeführten Experimente sind in der folgenden Tabelle noch einmal zusammengefaßt.

Tabelle 3 Transfektionsergebnisse ausgewählter Rho-Konstrukte in HeLa-Zellen

Konstrukt

Expression

funktionell aktiv,

”stress fiber“-Bildung

Rekrutierung

Rekrutierungs-muster

RhoAd

+

+

-

entfällt

RhoCd

+

+

-

entfällt

RhoABd

+

+

-

entfällt

RhoACA

+

+

+

wie RhoC

RhoACC

+

+

+

wie RhoC


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