Bohm, Birgit: ”Differentielle Rekrutierung der Isoformen des kleinen G-Proteins Rho bei der Invasion von Shigellen in Epithelzellen“

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Kapitel 4. Diskussion

4.1. Diskussion der Methoden

4.1.1. Molekularbiologische Methoden

    Die Herstellung der Konstrukte erfolgte durch Mutagenese bereits vorhandener Plasmid-DNA für die Rho-Isoformen RhoA, RhoB und RhoC. Dabei kamen verschiedene molekularbiologische Techniken zum Einsatz.

4.1.1.1. In-vitro Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion - PCR

Die PCR ist ein molekularbiologisches Verfahren zur in-vitro Replikation von DNA. 150 Da wir die zu amplifizierende DNA in ihrer Sequenz verändern wollten, interessierte uns vorrangig die Fehlerquote der Kettenverlängerung während des Reaktionsablaufs. Deshalb enthielten unsere PCR-Ansätze nur die notwendigen Reagenzien, wie DNA-Polymerase, Puffer für die Polymerase, Mg2+, Oligonukleotide als Primer, dNTP’s und Aqua bidest. BSA und Detergenzien, die über eine Enzymstabilisierung die Effizienz der Reaktion erhöhen, wurden nicht eingesetzt. Anwendung fanden zwei verschiedene DNA Polymerasen, Taq und Pwo. Pwo ist eine thermostabile ” high fidelity “ DNA Polymerase, die gegenüber der Taq Polymerase eine etwa 10fach höhere Genauigkeit, aber eine geringere Prozessivität aufweist. Die hohe Genauigkeit resultiert aus der 3’-5’ Exonukleaseaktivität des Enzyms, die den Einbau falscher Nukleotide während der Extension verringert. Aufgrund der von uns gewünschten geringen Fehlerquote arbeiteten wir experimentell vorwiegend mit Pwo. Bei den eingesetzten Oligonukleotiden wurde neben der Kontrolle auf weitere Bindungsmöglichkeiten an die template-DNA eine routinemäßige Prüfung auf das Vorhandensein von Palindromen und komplementären Strukturen vorgenommen. Weiterhin achteten wir darauf, daß das 3’-Ende der Oligonukleotide von der Base Adenin gebildet wurde. Primer, an deren 3’-Terminus Adenin steht, weisen experimentell die geringste Effi zienz für die Extensionsreaktion bei falscher Basenpaarung auf und erhöhen damit die Wahrscheinlichkeit für die korrekte Sequenz des PCR-Produkts. 150 Um eine hohe Genauigkeit der PCR zu erzielen, ermittelten wir die Reaktionsbedingungen für Taq und Pwo, die bei Minimierung der Fehlerrate zu einer ausreichenden Menge an PCR-Produkt führten. Dazu gingen wir für den Einsatz der Taq Polymerase von einem festen zeitlichen Profil für die einzelnen PCR-Teilreaktionen aus und veränderten die ´Annealing´-Temperatur, die Zykluszahl und die Menge der eingesetzten template-DNA. Für den Einsatz von Pwo wurden zusätzlich die Konzentration von Mg2+, die Konzentration der dNTP’s und die eingesetzte Menge an Enzym ermittelt. Es ergab sich der folgende PCR-Standard für die beiden Polymerasen, der in den Experimenten Anwendung fand.


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PCR-Ansatz von 100 µl mit

Taq

Pwo

Menge an eingesetztem Enzym

1,5 U

0,5 U

Reaktionspuffer

1 X

1 X

MgCl2/MgSO4

1,5 mM

1,5 mM

template-DNA

1,5 fmol

1,5 fmol

Oligonukleotide 1 und 2

je 20 pmol

je 20 pmol

Nukleotide im Vierermix

200 µM

400 µM

Das genaue Zeitprofil der PCR ist aus den Methoden ( s. Durchführung einer PCR ) zu entnehmen. Um eine hohe Spezifität der Bindung der Primer an die template-DNA zu gewährleisten, erfolgte das ´Annealing´ in Abhängigkeit von der Primerlänge bei 65°C bzw. bei 72°C. Die Zykluszahl wurde zur Reduzierung der Fehlerquote auf 15 festgelegt. Die geringe Fehlerquote der so durchgeführten PCR’s wurde anhand der Sequenzierergebnisse bestätigt.

4.1.1.2. Einsatz von Dynabeads® M-280 Streptavidin

Dynabeads® M-280 Streptavidin sind suspendierte paramagnetische Partikel von einheitlicher Größe, die mit Streptavidin beladen sind. Sie können durch Anlegen eines magnetischen Feldes beliebig oft gesammelt und wieder resuspendiert werden. Durch die hohe Affinität des Streptavidins zu Biotin ist eine Bindung von biotinylierten Molekülen, wie beispielsweise Doppelstrang-DNA, Einzelstrang-DNA, RNA, Proteinen und Lectinen möglich. Die biotinylierten Moleküle können im Anschluß an die Bindung an Dynabeads über magnetische Separation aus Lösungen isoliert und nach Resuspension in enzymatischen Reaktionen eingesetzt werden.
Ein Anwendungsbeispiel für den Einsatz sogenannter Dynabeads® ist die von uns ausgeführte in-vitro Mutagenese von DNA. ( s. Konstrukt RhoABA ) Wir gingen dabei so vor, daß wir durch den Einsatz eines 5’-biotinylierten Oligonukleotids in der PCR-Reaktion als PCR-Produkt biotinylierte Doppelstrang-DNA erhielten. Nach Bindung dieses PCR-Produktes an die Dynabeads® isolierten wir im Anschluß an eine Denaturierung der DNA den kodierenden Einzelstrang. An diesem Einzelstrang, der gebunden an die Dynabeads® vorlag, sollte die Mutagenese der DNA über die Bindung eines entsprechend veränderten Oligonukleotids und eine einfache Extension mit Pwo erfolgen. Diese Reaktion führte jedoch nicht zum erwarteten Ergebnis. Nach experimenteller Überprüfung der Dynabeads®, der Biotin-Streptavidin-Bindung und der Denaturierung war offensichtlich, daß die Ursache des Mißerfolgs in der Extensionsreaktion lag. Das für die Extension eingesetzte Oligonukleotid wurde anhand einer erfolgreichen PCR überprüft. Deshalb untersuchten wir, ob anstelle der Extensionsreaktion auch eine PCR durchgeführt werden könnte. Eine PCR in Anlehnung an den ermittelten Standard für Pwo blieb im Gegensatz zu einer mit Taq Polymerase ausgeführten PCR erfolglos. Intensive Kontrollen ergaben, daß eine PCR mit dem Enzym Pwo und an Dynabeads® gebundener Einzelstrang-DNA als Template erst nach 35 Zyklen und Einsatz von 7 fmol template-DNA zu einem elektrophoretisch nachweisbaren Ergebnis führte. Demnach stellt die Bindung der DNA an die Dynabeads® eine entscheidende Behinderung für das Enzym Pwo dar. Diese Funktionsbehinderung ergibt sich möglicherweise aus einer unspezifischen Bindung von Pwo an die Beads oder einer sterischen Behinderung. Im technischen Handbuch der Firma Dynal ist für die Durchführung einer PCR nur der Einsatz der Taq Polymerase beschrieben. Erfahrungen über den Einsatz von Pwo bei der Arbeit mit Dynabeads® liegen nicht vor.


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4.1.1.3. Hybridisierung von Oligonukleotiden

Der Einsatz hybridisierter Oligonukleotide zur DNA-Mutagenese ( s. Konstrukt RhoACC und Konstrukt RhoBd ) bot sich dort an, wo in unmittelbarer Nähe zu der zu verändernden DNA nur einmal vorkommende Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen im Gen von RhoA und RhoB vorliegen. Die beidseitige Begrenzung der Oligonukleotide durch offene Restriktionsschnittstellen ermöglichte im Anschluß an die Hybridisierung eine sofortige Ligation mit anderen DNA-Fragmenten. Der Gebrauch hybridisierter Oligonukleotide hat gegenüber der PCR den Vorteil, daß eine Veränderung in der übrigen DNA-Sequenz sehr unwahrscheinlich ist.

4.1.1.4. Einsatz verschiedener Vektoren

In den Experimenten wurden die hergestellten Konstrukte in den Plasmiden pUC19 und pKC3
kloniert. Die Klonierung der Mutanten in pUC19 erfolgte, um die vorgenommenen DNA-Veränderungen über eine Sequenzierreaktion mit Standardprimern zu verifizieren.

Für die Untersuchung der funktionellen Aktivität der Mutanten und ihres Rekrutierungsverhaltens während der Invasion von Shigella flexneri in HeLa-Zellen erfolgte die Umklonierung der in ihrer Sequenz verifizierten Konstrukte in pKC3. pKC3 ist ein Expressionsvektor für eukaryote Zellen. Es handelt sich um ein Derivat von pBR322 mit einem SV40 early promotor. Dieser Promotor verhindert eine zu starke Expression der transfizierten DNA. Die Rekrutierung der Rho-Mutanten läßt sich am besten in schwach transfizierten Zellen mit einer relativ geringen Expression der transfizierten DNA beurteilen. Stark transfizierte Zellen zeigen verstärkte Rho-Aktivität. Eine aufgrund zu hoher Rho-Aktivität vermehrt einsetzende Bildung von ”stress fibers“ verringert den zellulären Bestand an G-Aktin. Dies führt zu einer Verringerung der bakteriellen Infektionsrate, da nicht mehr ausreichend G-Aktin für die mit dem Invasionsvorgang verbundene charakteristische Reorganisation des zellulären Zytoskeletts zur Verfügung steht. 93

4.1.2. Zellbiologische Methoden

4.1.2.1. Transfektion

Die Transfektion der HeLa-Zellen mit der entsprechenden Plasmid-DNA erfolgte anhand der in den Methoden beschriebenen Kalziumphosphat-Methode ( s. Transfektion von HeLa-Zellen ). Andere gängige Transfektionsmethoden, die gegenüber der Kalziumphosphat-Methode eine in Abhängigkeit von der Zellart höhere Effizienz aufweisen, erfordern den Einsatz kationischer Lipidreagenzien. Die Lipidreagenzien Lipofectin, Lipofectamine, Cellfectin, DMRIE-C und


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TfxTM50 wurden von uns für die Transfektion eingesetzt. Allerdings waren die Ergebnisse bezüglich der Transfektionseffizienz mit denen der Kalziumphosphat-Methode vergleichbar. Da nicht auszuschließen ist, daß die Lipidreagenzien die Zellmembran und damit die Invasion von Shigella flexneri in HeLa-Zellen verändern, haben wir uns für die Kalziumphosphat-Methode entschieden.

4.2. Diskussion der Ergebnisse

Während der Invasion von Shigella flexneri in HeLa-Zellen kommt es zu einer isoformspezifischen, differentiellen Rekrutierung von RhoA, RhoB und RhoC an den bakteriellen Invasionslocus. RhoA zeigt eine Akkumulation um die eindringenden Bakterien herum. RhoB und RhoC hingegen werden in die, die Bakterien umgebenden zellulären Protrusionen rekrutiert. 93 Dies ist insofern erstaunlich, als RhoA und RhoC auf Primärstrukturebene eine größere Homologie ( 93 % ) besitzen als RhoB und RhoC ( 85 % ), bzw. RhoA und RhoB ( 85 % ). Auffällig ist, daß es C-terminal zwischen allen drei Isoformen die größten Differenzen in der Aminosäuresequenz gibt. Vergleicht man die Aminosäuren 181-189 von RhoA, die der CAAX-Box des Proteins vorangehen, mit den entsprechenden Aminosäuren von RhoC, zeigt sich, daß sich beide Isoformen in diesem, neun Aminosäuren umfassenden Abschnitt an sechs Positionen unterscheiden. Dies entspricht einer Differenz von 67 %. Zwischen RhoA und RhoB beträgt die Differenz 78 % an der vergleichbaren Stelle und zwischen RhoB und RhoC sogar 89 %.

Aufgrund des Sequenzvergleichs der Isoproteine betrafen die von uns vorgenommenen Mutationen im Rho-Protein einerseits C-terminale Aminosäuren von RhoA und andererseits die CAAX-Box der Isoformen. Nur für RhoA wurde gezeigt, daß es posttranslational zu drei spezifischen C-terminalen Veränderungen an der CAAX-Box kommt. Zuerst erfolgt eine Geranylgeranylierung am Cystein. Dem schließt sich die Abspaltung der drei C-terminalen Aminosäuren ( AAX ) an. Danach folgt als letzte Modifikation die Carboxylmethylierung am Cystein. 141 Da RhoB und RhoC ebenfalls das CAAX-Motiv aufweisen und X bei allen drei Rho-Isoformen der Aminosäure Leucin entspricht, ist die Geranylgeranylierung am Cystein auch für RhoB und RhoC anzunehmen. Für RhoA wurde nachgewiesen, daß die C-terminalen Modifikationen sowohl für die Interaktion von RhoA mit den Regulationsproteinen RhoGDI und GEF als auch für die Membranbindung des Proteins bedeutsam sind. 142 , 143 Die Isoprenylierung ermöglicht die Membranbindung über die erhöhte Lipophilie von Rho. 151 Der Carboxylmethylierung wird aufgrund der Neutralisierung der negativen Ladung des COOH-Terminus ebenfalls eine Verstärkung der Membranbindungsaffinität zugeschrieben. 152

Die intrazelluläre Lokalisation der Rho-Isoformen in Fibroblasten zeigt, daß eine kleine Fraktion von allen drei Proteinen in der Plasmamembran zu finden ist. Vorwiegend sind RhoA und RhoC jedoch im Zytosol lokalisiert und RhoB in den Endosomen und dem prälysosomalen Kompartiment. 153 Auch in rat kidney cortex cells, d. h. in polarisierten Epithelzellen ist die Lokalisation von RhoA mehr zytosolisch als membranös. 154 Als bedeutsam für die intrazelluläre Lokalisation erwies sich der C-Terminus der Proteine. RhoA/RhoB-Chimäre, bei denen die 14 bzw. 17 C-terminalen Aminosäuren gegenseitig ausgetauscht wurden, zeigten eine Lokalisation entsprechend dem vorhandenen C-Terminus, d. h. RhoA mit den C-terminalen Aminosäuren von RhoB zeigte dieselbe


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Lokalisation wie das vollständige RhoB-Protein und umgekehrt. 153 Überdies ließ sich die Lokalisation der Isoproteine innerhalb der Zelle durch eine Mutation des CAAX-Peptid-Motivs beeinflussen. Der Ersatz des Cysteins der CAAX-Box beider Isoformen durch Serin führte dazu, daß RhoA vorwiegend nukleär zu finden war und RhoB zytosolisch und nukleär. 153

Die von uns vorgenommenen Mutationen im Rho-Protein sollten nicht zu einer Beeinträchtigung der enzymatischen Aktivität und damit der biologischen Funktionen des Enzyms führen. Eine wesentliche Bedeutung besitzen in diesem Zusammenhang die Aminosäuren 32-42 des Rho-Moleküls. Da die Mikroinjektion des kleinen G-Proteins Ras, substituiert mit den Aminosäuren 25-48 von RhoA, in Fibroblasten nicht zu einer Induktion von ”stress fibers“ führte, wird eine zweite C-terminal lokalisierte Effektordomäne von Rho vermutet. 155 Ras und Rho besitzen auf Primärstrukturebene nur eine Homologie von 30%, die sich auf den N-terminalen Abschnitt beider Proteine bezieht. 139 , 140 Wir sind davon ausgegangen, daß die von uns erfolgten C-terminalen Veränderungen im Protein nicht zu einer Beeinflussung der GTPase-Tätigkeit führten, weil die Mutanten weiterhin vollständige Rho-Moleküle darstellten. Es sollten vom Ansatz her also C-terminal modifizierte Rho-Proteine hergestellt werden, die für die Enzymaktivität positiv sind und deren Rekrutierungsverhalten nicht dem für die Invasion von Shigella flexneri beschriebenen Muster entspricht bzw. negativ ist.

Experimentell nachgewiesen wurde, daß N-terminal hinzugefügte Aminosäuren die biologische Aktivität der Rho-Proteine nicht beeinflussen. 153 Deshalb wurde den Rho-Mutanten zu ihrer späteren Visualisierung in den Experimenten N-terminal die VSV-tag Sequenz vorangestellt. Die VSV-Sequenz kodiert für 11 Aminosäuren ( Y-T-D-I-E-M-N-R-L-G-K ) des Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein G, die von dem monoklonalen Antikörper P5D4 erkannt werden. 147

Da der Vergleich der Aminosäuresequenz der Rho-Isoformen eine größere Homologie zwischen RhoA und RhoC zeigt, wurden zur Untersuchung der Shigella-spezifischen Rekrutierung HeLa-Zellen mit den folgenden Rho-Mutanten transfiziert:

Alle transfizierten Konstrukte wurden exprimiert und waren funktionell aktiv, d.h. sie führten zu Aktinpolymerisation, erkennbar an der Bildung von ”stress fibers“. Unterschiede zwischen den einzelnen Konstrukten zeigten sich im Rekrutierungsverhalten.

Die untersuchten Konstrukte RhoAd, RhoCd und RhoABd, die CAAX-Deletionsmutanten darstellen, wurden nicht an die bakterielle Eintrittsstelle von Shigella flexneri rekrutiert. Die funktionelle Aktivität der CAAX-Deletionsmutanten war hingegen in unseren Experimenten nicht beeinträchtigt. Letzteres steht in Übereinstimmung mit anderen veröffentlichten Untersuchungen. Eine Mutation im RhoA-Molekül an Position 190, bei der das Cystein der CAAX-Box durch Serin ersetzt wurde und damit die posttranslationalen Modifikationen von RhoA verhindert wurden, führte nicht zu einem Funktionsverlust des Proteins. 155


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Die Bedeutung des CAAX-Motivs für die Rekrutierung von Rho könnte wie folgt erklärt werden. Im Zytoplasma liegt Rho im wesentlichen gebunden an RhoGDI vor. 69 , 70 Im Rahmen der Aktivierung von Rho ist ein Kompartimentwechsel mit vorübergehender Membranbindung beschrieben. 112 , 153 Dieser Kompartimentwechsel kann als Ausdruck des veränderten Gleichgewichts zwischen den Bindungskräften von RhoGDI zur GTPase und der Bindungsaffinität des isoprenylierten und carboxylmethylierten Rho-Proteins zur Membran gedeutet werden. 74 , 151 , 152 Isoprenylierung und Carboxylmethylierung erfolgen an der CAAX-Box des Proteins. Fehlt das CAAX-Motiv, erfolgt weder die Geranylgeranylierung noch die Carboxylmethylierung von Rho. Die Bindung von Rho an die Membran könnte gestört sein, da das posttranslational unveränderte Protein nicht die erforderliche Lipophilie aufweist.

Weiterhin ist während der vorübergehenden Membranbindung eine Kolokalisation von RhoA mit den Proteinen der ERM-Familie beschrieben. 112 Diese Proteine verankern das Zytoskelett der Zelle in der Plasmamembran über die gleichzeitige Bindung von F-Aktin und CD44, einem zellulären Oberflächenprotein. Die Bindung der ERM-Proteine zu CD44 schließt drei weitere Proteine ein. Interessanterweise wurde RhoGDI als ein Bestandteil des Moesin/CD44-Komplexes identifiziert. 111 Die Rekrutierung von Rho zur Plasmamembran könnte demzufolge in gebundener Form an RhoGDI erfolgen. Eine sich anschließende Aktivierung von Rho bewirkt die Lösung der GTPase von RhoGDI, das seinerseits Bestandteil des Proteinkomplexes aus ERM-Proteinen mit zellulären Oberflächenrezeptoren wird. Für die Interaktion von Rho mit RhoGDI sind die posttranslationalen Modifikationen am CAAX-Motiv von wesentlicher Bedeutung. 142 , 143 Die infolge der Deletion der CAAX-Box verhinderte Interaktion von Rho mit RhoGDI könnte sich demnach negativ auf die Rekrutierung auswirken und somit eine Erklärung für die nicht erfolgte Rekrutierung der CAAX-Deletionsmutanten während der bakteriellen Invasion bieten.

Das CAAX-Motiv ist anhand unserer experimentellen Ergebnisse als Voraussetzung für die Rekrutierung der Rho-Isoformen RhoA und RhoC anzusehen. Daß die CAAX-Box von genereller Bedeutung für die Rekrutierung der Rho-Isoformen während des bakteriellen Invasionsvorganges ist, muß durch die Transfektion von RhoBd, der CAAX-Deletionsmutante von RhoB, nachgewiesen werden. Aufgrund der gezeigten, nicht erfolgten Rekrutierung von RhoABd ist unseres Erachtens nach davon auszugehen.

Die Konstrukte RhoACA und RhoACC zeigten während der Invasion von Shigella flexneri in HeLa-Zellen das Rekrutierungsmuster von RhoC. Da RhoACA die CAAX-Box von RhoA und RhoACC die CAAX-Box von RhoC besitzt, bestätigte sich unsere Vermutung, daß sich die isoformspezifische Rekrutierung nicht durch die Konfiguration des CAAX-Motivs und die damit verbundenen posttranslationalen Modifikationen, die bisher nur für RhoA beschrieben sind, erklären läßt. Aufgrund unserer Resultate ist vielmehr davon auszugehen, daß die C-terminalen Aminosäuren ab Position 181 für das Rekrutierungsverhalten bedeutsam sind. In welcher Weise die Aminosäuren 181-189 von RhoA und RhoC bzw. die Aminosäuren 181-192 von RhoB die isoformspezifische Rekrutierung beeinflussen, muß durch den Einsatz weiterer Mutanten im HeLa-Zell-Modell ermittelt werden. Dies erfordert neben der Untersuchung der Rho-Konstrukte RhoABB und RhoABA, die in Anlehnung an die bisherigen Ergebnisse das Rekrutierungsverhalten von RhoB aufweisen müßten, die Herstellung weiterer Konstrukte. Eines dieser Konstrukte wäre beispielsweise RhoCAC, RhoC substituiert mit den Aminosäuren 181-189 von RhoA. RhoCAC müßte für die Bestätigung unserer These nach Expression in HeLa-Zellen und Infektion mit S. flexneri das Rekrutierungsverhalten von RhoA zeigen.


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Möglicherweise bewirken diese 9 bzw. 12 Aminosäuren über die Veränderung der Sekundär- und Tertiärstruktur der Proteine eine unterschiedliche Konformation der Isoformen, die letztendlich entscheidend für das Rekrutierungsmuster ist. Dies kann lediglich vermutet werden, da bisher nur die dreidimensionale Struktur der katalytischen Domäne von RhoA im Zusammenspiel mit einem RhoGAP veröffentlicht ist. 78 Die Röntgenstrukturanalyse von Ras wiederum berücksichtigt lediglich die Aminosäuren 1-171 des Proteins. Die C-terminalen 18 Aminosäuren konnten nicht mitkristallisiert werden, sodaß aus dieser Struktur ebenfalls keine Analogieschlüsse hinsichtlich der C-terminalen Struktur von Rho gezogen werden können. 140

Eine andere Möglichkeit ist, daß nur einzelne Aminosäuren im C-terminalen Molekülabschnitt für die isoformspezifische Rekrutierung verantwortlich sind. Um dieser Variante nachzugehen, erfolgte die Herstellung der Konstrukte RhoA 183, RhoA 186, und RhoA 188.

Nicht auszuschließen ist außerdem, daß die Rekrutierung auch durch weiter N-terminal gelegene Aminosäuren beeinflußt wird. Ein Vergleich der Primärstruktur der Aminosäuren 1-180 von RhoA und RhoC zeigt jedoch insgesamt nur acht Veränderungen in diesem Molekülabschnitt ( 4,5 %ige Differenz ) gegenüber dem C-Terminus beider Isoproteine ( Aminosäuren 181-189 ) mit einer 67 %igen Differenz. An nur drei dieser acht Aminosäurepositionen, an Position 140, 141 und 157, unterscheiden sich RhoA und RhoC dabei durch einen nicht-konservativen Austausch von Aminosäuren. Um einen möglichen Einfluß dieser Aminosäuren auf das Rekrutierungsverhalten zu untersuchen, wurde RhoA 140, d.h. RhoA substituiert mit den Aminosäuren 140 und 141 von RhoC, hergestellt.

Das Rekrutierungsverhalten dieser Rho-Mutanten wird derzeit im Labor von Herrn Dr. Adam untersucht. Abschließende Ergebnisse zum Rekrutierungsmuster liegen gegenwärtig noch nicht vor.


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