Bohm, Birgit: ”Differentielle Rekrutierung der Isoformen des kleinen G-Proteins Rho bei der Invasion von Shigellen in Epithelzellen“

Aus dem Institut für Mikrobiologie und Hygiene
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin


DISSERTATION
”Differentielle Rekrutierung der Isoformen des kleinen G-Proteins Rho bei der Invasion von Shigellen in Epithelzellen“

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae ( Dr. med. )

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Birgit Bohm ,
aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. M. Dietel

Gutachter:
Prof. Dr. Dr. Ulf B. Göbel, Berlin
Prof. Dr. Dr. Klaus Aktories, Freiburg
Prf. Dr. Günter Schulz, Berlin

Datum der Promotion: 13. 12. 1999

Abstract

Shigella is the etiologic agent of human bacillary, an infectious large bowel disease. A major feature of Shigella’s pathogenic potential is the capacity to invade epithelial cells. Shigella entry into epithelial cells is considered a parasite-induced internalization requiring cytosceletal rearrangements; Shigella entry induces a blossom-like membrane structure at the bacterial entry site. This membrane folding process is dependent on the small GTPase rho. It has been shown that three rho isoforms rhoA, rhoB and rhoC are recruited into bacterial entry sites with different localization relative to the membrane structures. While rhoA preferentially accumulates in close vicinity to entering bacteria, rhoB and rhoC are recruited into the tips of Shigella-induced cellular protrusions. We could show that the C-terminal CAAX-region of rho is a prerequisite for recruitment, but not sufficient for different recruitment of rho isoforms. Additional information for differential recruitment patterns seems to come from the preterminal region of rho proteins. This result is of great importance for the functional role of rho during Shigella-invasion into epithelial cells.

Zusammenfassung

Bakterien der Gattung Shigella sind die Erreger der bakteriellen Ruhr beim Menschen. Der wesentliche Virulenzfaktor der Shigellen ist ihre Fähigkeit zur Invasion. Die Invasion in Epithelzellen ist Ausdruck des erregerspezifischen Infektionsprozesses, der gekennzeichnet ist durch eine vom Bakterium induzierte zelluläre Aufnahme über einen Phagozytose-ähnlichen Mechanismus. In dessen Verlauf führt die charakteristische Reorganisation des Zytoskeletts der Zelle zur Ausbildung einer blütenartigen Membranstruktur an der bakteriellen Eintrittsstelle. Als essentielles Glied der Signalisationskaskade vom Bakterium zum zellulären Zytoskelett erwies sich das kleine G-Protein Rho. Es wurde gezeigt, daß Rho als Regulator der Veränderungen des Zytoskeletts selbst an den bakteriellen Invasionslocus rekrutiert wird. Diese Rekrutierung umfaßt drei Isoformen von Rho: RhoA, RhoB und RhoC. Trotz hoher Sequenzhomologie der Isoformen untereinander ( 85% ) existiert ein unterschiedliches Rekrutierungsmuster dieser Isoproteine an der Eintrittsstelle von Shigella flexneri. RhoA akkumuliert vorwiegend um die eindringenden Bakterien herum. Demgegenüber werden RhoB und RhoC in die bakterieninduzierten zellulären Protrusionen rekrutiert. Der Mechanismus dieser isoformspezifischen Rekrutierung ist nicht bekannt. Anhand unserer Experimente konnten wir zeigen, daß das allen kleinen G-Proteinen gemeinsame C-terminale Peptid-Motiv CAAX ( C = Cystein, A = aliphatische Aminosäure, X = Leucin ) eine wesentliche Voraussetzung für die Rekrutierung von Rho darstellt, sich die isoformspezifische Rekrutierung jedoch nicht anhand des CAAX-Motivs erklären läßt. Bedeutsam für die differentielle Rekrutierung der Isoproteine ist vielmehr die präterminale Region des Moleküls. Diese Beobachtung hat weitreichende Konsequenzen für die funktionelle Rolle von Rho bei der Epithelzellinvasion durch Shigella.

Schlagwörter:
Shigella, GTPase, Rho, Zytoskelett

Keywords:
Shigella, GTPase, rho, cytosceleton


Seiten: [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20-21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49-50] [51-52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [106] [107] [108] [109] [110] [111] [112] [113] [114]

Inhaltsverzeichnis

Titelseite”Differentielle Rekrutierung der Isoformen des kleinen G-Proteins Rho bei der Invasion von Shigellen in Epithelzellen“
Danksagung
1 Einleitung
1.1.Fragestellung
2 Material und Methoden
2.1.Zellinien und Bakterienstämme
2.1.1.Zellen
2.1.2.Bakterienstämme
2.2.Geräte
2.3.Chemikalien
2.3.1.Bezugsliste der Chemikalien
2.3.2.Zusammensetzung verwendeter Reagenzien
2.3.2.1.Medien
2.3.2.2.Puffer
2.3.2.3.Weitere Reagenzien
2.4.Methoden
2.4.1.Zellbiologische Methoden
2.4.1.1.Kultivierung von HeLa-Zellen
2.4.1.2.Quantifikation von Zellen
2.4.1.3.Transfektion von HeLa-Zellen
2.4.1.4.Infektion von HeLa-Zellen
2.4.1.5.Zellfärbung mit Antikörpern
2.4.1.6.Herstellung von Objektträgern
2.4.2.Bakteriologische Methoden - Klonierung
2.4.2.1.Herstellung kompetenter E.coli-Zellen
2.4.2.2.Transformation kompetenter E.coli-Zellen
2.4.2.3.Isolierung von Klonen mit rekombinantem Plasmid
2.4.3.Molekularbiologische Methoden
2.4.3.1.Allgemeine Techniken
2.4.3.1.1.Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
2.4.3.1.2.Elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten
2.4.3.1.3.DNA-Extraktion aus Agarosegelen mittels Qiaquick Gel Extraction Kit, in Anlehnung an das Qiaquick Protokoll
2.4.3.1.4.Aufreinigung von DNA über Phenol/Chloroform-Extraktion
2.4.3.1.5.Ethanolpräzipitation von DNA
2.4.3.1.6.Magnetische Separation mit Dynabeads® M-280 Streptavidin
2.4.3.1.7.Präparation von Plasmid-DNA
2.4.3.1.8.Hybridisierung von Oligonukleotiden
2.4.3.2.Enzymatische Methoden
2.4.3.2.1.Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
2.4.3.2.2.Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten
2.4.3.2.3.Ligation von DNA-Fragmenten
2.4.3.2.4.Durchführung einer PCR
2.4.3.2.5.DNA-Sequenzierung
2.4.4.Computerprogramme
3 Ergebnisse
3.1.Herstell,ung der Rho-Konstrukte
3.1.1.Konstrukt RhoABA
3.1.2.Konstrukt RhoACC
3.1.3.Konstrukte RhoAd, RhoC, RhoCd, RhoABB, RhoABd, RhoACA, RhoACd
3.1.4.3.1.4 Konstrukt RhoBd
3.1.5.3.1.5 Konstrukt RhoA 140
3.1.6.3.1.6 Konstrukte RhoA 183, RhoA 186, RhoA 188
3.2.Sequenzüberprüfung der hergestellten Rho-Konstrukte
3.2.1.Sequenzüberprüfung von RhoAd
3.2.2.Sequenzüberprüfung von RhoBd
3.2.3.Sequenzüberprüfung von RhoC
3.2.4.Sequenzüberprüfung von RhoCd
3.2.5.Sequenzüberprüfung von RhoABA
3.2.6.Sequenzüberprüfung von RhoABB
3.2.7.Sequenzüberprüfung von RhoABd
3.2.8.Sequenzüberprüfung von RhoACA
3.2.9.Sequenzüberprüfung von RhoACC
3.2.10.Sequenzüberprüfung von RhoACd
3.2.11.Sequenzüberprüfung von RhoA 140
3.2.12.Sequenzüberprüfung von RhoA 183
3.2.13.Sequenzüberprüfung von RhoA 186
3.2.14.Sequenzüberprüfung von RhoA 188
3.3.Transfektion mit ausgewählten Rho-Konstrukten
4 Diskussion
4.1.Diskussion der Methoden
4.1.1.Molekularbiologische Methoden
4.1.1.1.In-vitro Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion - PCR
4.1.1.2.Einsatz von Dynabeads® M-280 Streptavidin
4.1.1.3.Hybridisierung von Oligonukleotiden
4.1.1.4.Einsatz verschiedener Vektoren
4.1.2.Zellbiologische Methoden
4.1.2.1.Transfektion
4.2.Diskussion der Ergebnisse
5 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 Übersicht über die Rho-Konstrukte
Tabelle 2 Verwendete Oligonukleotide
Tabelle 3 Transfektionsergebnisse ausgewählter Rho-Konstrukte in HeLa-Zellen

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 Elektrophoretische Kontrolle des PCR-Produkts RhoA5-180
Spur 1 : Leerprobe ( ohne template-DNA )
Spur 2 : pcr-Produkt von 576 bp bei Ansatz1
Spur 3 : pcr-Produkt von 576 bp bei Ansatz2
Abbildung 2 Elektrophoretische Kontrolle des PCR-Produkts RhoABA5-193
Spur 1 : pcr-Produkt von 633 bp bei Ansatz1
Spur 2 : pcr-Produkt von 633 bp bei Ansatz2
Spur 3 : Leerprobe
Abbildung 3 Elektrophoretische Kontrolle der EcoRI/PstI-Restriktionsanalyse der Plasmide pUC19/RhoABA5-193 von Klon 1-4
Spur 1 : Plasmid von Klon 1, kein Fragment enthalten
Spur 2 : Plasmid von Klon 2, Vektor ( 2800 bp ) und Fragment ( 633 bp ) der erwarteten Länge
Spur 3 : Plasmid von Klon 3, Vektor ( 2800 bp ) und Fragment ( 633 bp ) der erwarteten Länge
Spur 4 : Plasmid von Klon 4, Vektor ( 2800 bp ) und Fragment ( 633 bp ) der erwarteten Länge
Abbildung 4 Elektrophoretische Kontrolle der EcoRI/PstI-Restriktionsanalyse der Plasmide pKC3/RhoABA1-193
Spur 1 : Plasmid von Klon 1, Vektor ( 3500 bp ) und Fragment ( 645 bp ) der erwarteten Länge
Spur 2 : Plasmid von Klon 2, Vektorgröße ist korrekt, 1000 bp-Fragment unklarer Herkunft
Spur 3 : Plasmid von Klon 3, Vektorgröße ist korrekt, 1000 bp-Fragment unklarer Herkunft
Spur 4 : Plasmid von Klon 4, Vektorgröße ist korrekt, 1000 bp-Fragment unklarer Herkunft
Abbildung 5 Elektrophoretische Kontrolle der Restriktionsbehandlung von NotI/VSV/KpnI/RhoA5-193/PstI mit Fnu4HI
Spur 1 : Fragment NotI/VSV/KpnI/RhoA5-193/PstI ungeschnitten ( 624 bp )
Spur 2 : Restriktion des Fragments NotI/VSV/KpnI/RhoA5-193/PstI mit Fnu4HI führt zu zwei Fragmenten mit einer Größe von 567 bp und 57 bp
Abbildung 6 Elektrophoretische Kontrolle der NotI/PstI-Restriktionsanalyse der Plasmide pUC19/RhoACC5-193 von Klon A 1 - 2 und Klon D 1 4
Spur 1 : genomische DNA von Klon A 1
Spur 2 : Plasmid von A 2, Vektorlänge ist korrekt ( 2800 bp ), aber Fragment ( ca. 700 bp ) ist größer als erwartet
Spur 3 : Plasmid von D 1, Vektor ( 2800 bp ) und Fragment ( 624 bp ) der erwarteten Länge
Spur 4 : 100 bp-DNA-Längenmarker
Spur 5 : Plasmid von D 2, Vektor und Fragment korrekter Länge
Spur 6 : Plasmid von D 3, Vektor und Fragment korrekter Länge
Spur 7 : Plasmid von D 4, Vektor und Fragment korrekter Länge
Spur 8 : 1 kb-DNA-Längenmarker
Abbildung 7 Elektrophoretische Kontrolle der EcoRI/Eco32I-Restriktionsanalyse der Plasmide pUC19/RhoACC5-193 und pKC3/RhoA1-193
Spur 1 : Restriktion des Plasmids pUC19/RhoACC5-193 führt zu einem Fragment von 171 bp und einem Vektor von ca. 3300 bp
Spur 2 : Restriktion des Plasmids pKC3/RhoA1-193 führt zu einem Fragment von 183 bp und einem Vektor von ca. 4000 bp
Abbildung 8 Nachweis der funktionellen Aktivität des Konstrukts RhoAd
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; verstärkte Ausbildung von ”stress fibers“ in der transfizierten Zelle
Abbildung 9 Nachweis der funktionellen Aktivität des Konstrukts RhoCd
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; verstärkte Ausbildung von ”stresss fibers“ in der transfizierten Zelle
Abbildung 10 Rekrutierungsverhalten des Konstrukts RhoAd während der Invasion von Shigella flexneri in HeLa-Zellen
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt; keine Rekrutierung von RhoAd an die bakterielle Eintrittsstelle
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; lokale Anreicherung von F-Aktin am Invasionslocus von S. flexneri ( Bildmitte )
Abbildung 11 Rekrutierungsverhalten des Konstrukts RhoCd während der Invasion von Shigella flexneri in HeLa-Zellen
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt; keine Rekrutierung von RhoCd an die bakterielle Eintrittsstelle
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; Invasionslocus von S. flexneri ( Bildmitte )
Abbildung 12 Nachweis der funktionellen Aktivität des Konstrukts RhoABd
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; verstärkte Ausbildung von ”stress fibers“ in der transfizierten Zelle
Abbildung 13 Rekrutierungsverhalten des Konstrukts RhoABd während der Invasion von Shigella flexneri in HeLa-Zellen
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt; keine Rekrutierung von RhoABd an die bakterielle Eintrittsstelle
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; lokale Anreicherung von F-Aktin am Invasionslocus von S. flexneri ( Bildmitte )
Abbildung 14 Nachweis der funktionellen Aktivität des Konstrukts RhoACA
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; verstärkte Ausbildung von ”stress fibers“ in der transfizierten Zelle
Abbildung 15 Nachweis der funktionellen Aktivität des Konstrukts RhoACC
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt; wie bei Kalziumphosphat-Transfektion häufig auftretend, sind zwei benachbarte Zellen transfiziert
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; verstärkte Ausbildung von ”stress fibers“ in den transfizierten Zelle
Abbildung 16 Rekrutierungsverhalten des Konstrukts RhoACA während der Invasion von Shigella flexneri in HeLa-Zellen
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt; Rekrutierung von RhoACA an die bakterielle Eintrittsstelle mit deutlicher Anreicherung in den zellulären Protrusionen ( Bildmitte )
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; lokale Anreicherung von Rekrutierung von RhoACA an die F-Aktin am Invasionslocus von S. flexneri ( Bildmitte )
Abbildung 17 Rekrutierungsverhalten des Konstrukts RhoACC während der Invasion von Shigella flexneri in HeLa-Zellen
a) Rot: In HeLa-Zellen exprimiertes Konstrukt; RhoACC weist das Rekrutierungsmuster von RhoC auf mit Anreicherung in den zellulären Protrusionen am Invasionslocus von S. flexneri
b) Grün: F-Aktin-Färbung gleiche Stelle; lokale Anreicherung von F-Aktin am bakteriellen Eintrittsort ( Bildmitte )

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