Borrmann, Steffen: Regulation der endothelialen NO-Synthase unter Hypoxie und proinflammatorischer Stimulation in pulmonal-arteriellen Endothelzellen

3

Kapitel 1. Einführung

1.1. Pulmonale Hypertension: Pathogenese und Ätiologie

Die Ursachen der pulmonalen Hypertonie gliedern sich in primäre, d. h. vererbte oder idiopathische, und in sekundäre, d. h. erworbene Formen. Das Verständnis der Physiologie der pulmonalen arteriellen Gefäße und ihrer pathophysiologischen Veränderungen ist essentiell für die Annäherung an eine Diagnose und Therapie dieser Erkrankung.

Unter physiologischen Bedingungen ist das pulmonal-arterielle Gefäßbett eine Hochfluß-, Niedrigdruck- und Niedrigwiderstandstrombahn. Dieses ermöglicht dem rechten Ventrikel ein hohes Herzzeitvolumen selbst unter Belastungsbedingungen zu gewährleisten. So sind z. B. bei körperlicher Anstrengung die pulmonaren Gefäße befähigt, sich zu dilatieren und zuvor geschlossene Gefäße können zusätzlich rekrutiert werden, sodaß trotz großer Steigerungen im pulmonalen Blutfluß der arterielle Druck im kleinen Kreislauf nur minimal steigt.

Entscheidend für alle hypertensiven Zustände im kleinen Kreislauf ist eine Abnahme des Gesamtquerschnittes des pulmonal-arteriellen Gefäßbettes. Initial manifestiert sich diese Störung nur in einem Verlust der Rekrutierbarkeit und Dilatation der kleinen Widerstandsgefäße. Unter Ruhebedingungen wird sich daher der Pulmonalisdruck kaum erhöhen, aber unter Belastung ist eine Druck- und Widerstandsteigerung die Folge.

Wenn der Gesamtquerschnitt des pulmonal-arteriellen Gefäßsystems weiter abnimmt, kann sich der Hochdruck im kleinen Kreislauf fixieren. Durch den Anstieg des ”afterloads“ kommt es zu einer konzentrischen Hypertrophie des rechten Ventrikels, um den erhöhten Widerstand im Lungenkreislauf zu überwinden.

Die Fähigkeit der hypertrophierten rechten Kammer ein adäquates Herzzeitvolumen angesichts des erhöhten ”afterloads“ aufrecht zu erhalten, bestimmt den Verlauf und die Prognose aller chronischen Formen der pulmonalen Hypertension. Bei einer gering ausgeprägten Hypertension ist das Schlagvolumen adäquat an einen erhöhten Bedarf angepaßt und die resultierenden Symptome minimal. Ein Druckanstieg im kleinen Kreislauf führt in eine Situation, in welcher der hypertrophierte, dilatierte rechte Ventrikel selbst unter Ruhebedingungen nicht in der Lage ist, das Schlagvolumen den erhöhten Bedarf anzupassen. Das morphologische und funktionelle Korrelat wird mit ”Cor pulmonale“ bezeichnet. Diese Patienten entwickeln Belastungssymptome wie Dyspnoe und Müdigkeit. Ein akutes Rechtsherzversagen tritt ein, wenn der ”afterload“ eine kritische Grenze überschreitet.

Die Reduktion des Gesamtquerschnittes der Pulmonalarterien ist ein Resultat verschiedener Prozesse: Vasokonstriktion, Obstruktion und/oder Obliteration. Die zellbiologischen Veränderungen der pulmonalen Gefäße und des umgebenen Bindegewebes - plexiforme Lesionen der Intima, Mediahypertrophie und interstitielle Fibrose, besonders der Arterien mit weniger als 100 µm im Durchmesser - sind die Endpunkte aller Formen chronischer pulmonaler Hypertonie ( Heath, 1993 und Pietra, 1989 ). Sie weisen gleiche pathohistologische Muster auf, wie sie unter Ischämie und Inflammation zu beobachten sind.


4

Das Endothel, an der Schnittstelle zwischen zirkulierendem Blut und glatten Gefäßmuskelzellen gelegen, spielt die Schlüsselrolle bei der Regulation der Gefäßfunktionen. Das Endothel ist das grösste endokrine Organ. Zu dessen Funktionen gehören die Erhaltung des physiologischen Gefäßtonus ( Furchgott, 1980 ), die Kontrolle des Gerinnungssystems ( Radomski, 1993 ) und des Wachstums sowie die Kontraktilität der glatten Muskelzellen ( Peiró, 1995 und Kourembanas, 1990 und Kourembanas, 1991 ), Mechanismen, deren Fehlregulierung als auslösende Faktoren pulmonaler Hypertonie betrachtet werden.

Da das pulmonale Gefäßbett am nächsten zur Atmosphäre liegt, ist es einzigartig befähigt auf wechselnde Sauerstoffkonzentrationen zu antworten. Während akute Hypoxie durch Reflex-gesteuerte Vasokonstriktion zu einem schnellem Anstieg des Widerstandes im kleinen Kreislauf führt, ist eine verlängerte, chronische Hypoxie von einem Prozess begleitet, der als ”vascular remodeling“ bezeichnet wird. Hypoxie verursacht in Rattenmodellen pulmonale Hypertonie ( Rabinovitch, 1979 ). Chronische Hypoxie ist eine Ursache der bei pulmonaler Hypertonie zu beobachtenden interstitiellen Fibrose durch die Akkumulation extrazellulärer Matrixproteine bzw. den gesteigerten Abbau elastischer Fasern ( Stenmark, 1994 ). Die hypoxische Kontraktion der pulmonalen Arterien ist endothelabhängig bzw. eine Hypoxie unterdrückt die cholinerge Relaxation des Endothels ( Demiryurek, 1993 ).

Eine chronische Entzündungsreaktion und die resultierende Zirkulation bakterieller Lipopolysaccharide ( LPS von Pseudomonas aeroginosa) und proinflammatorischer Zytokine wie Interleukin-1beta ( IL-1 beta) sind von einer Erhöhung des pulmonalen Druckes gefolgt, wie in Rattenversuchen gezeigt wurde ( Graham, 1990 ). Das ARDS (acute/adult respiratory distress syndrome) ist durch eine neutrophile Invasion des Lungengewebes gekennzeichnet und wird von einer pulmonalen Hypertonie begleitet ( Steinberg, 1994 ). Entzündungsmediatoren demonstrierten eine Verschlechterung dieser Situation ( Terashima, 1994 ).


5

1.2. NO - ein physiologischer Mediator und Effektor des Endothels

Die Bedeutung des Endothels als Quelle einer unstabilen Substanz, die die Vasorelaxation von isolierten Aortenringen nach Stimulierung mit Acetylcholin vermittelt, wurde 1980 erstmals beschrieben ( Furchgott, 1980 ) und führte 1987 zur Identifikation von Stickstoffmonoxid ( NO ) als ”endothelium-derived relaxing factor“ (EDRF; Palmer, 1987 ). Neben der direkten Relaxation der glatten Gefäßmuskeln (Ignarro, 1991) limitiert NO die Proliferation dieser Zellen ( Garg, 1989 ). NO inhibiert die Entzündungs-induzierte Aktivierung der Endothelzellen und reduziert die Expression von Adhesionsmolekülen für Lymphozyten und Monozyten (vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1) und für neutrophile Granulozyten (intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1) ( De Caterina, 1995 ). NO senkt die Aggregationsneigung und die Adhesion der Plättchen ( Radomski, 1990 und Radomski, 1993 , Sneddon, 1988 ), und verhindert die Chemotaxis von Monozyten ( Bath, 1991 ).

NO interagiert mit seinen Zielen durch kovalente Modifizierungen von [FeS]n-und Thiolgruppen-haltigen Proteinen und durch Redoxreaktionen mit Radikalen ( Stamler, 1994 ). Die Aktivierung des Enzyms Guanylatzyklase, die viele der Zielzellantworten (Vasodilatation, Hemmung der Plättchenaggregation und Wachstumsinhibierung) durch den ”second messenger“ cGMP (cyclic guanosine monophosphate) vermittelt, erfolgt durch Wechselwirkung mit der Hämgruppe (Stamler, 1994 und Clementi, 1995 ). Obwohl NO ein extrem kurzlebiges Molekül (t1/2 \|[ap ]\| 25 ms) ist, wirkt es sowohl autokrin als auch parakrin ( Lancaster, 1994 ) und bildet zusammen mit cGMP ein universelles Signaltransduktionssystem.

Neben den Gefäß-protektiven Funktionen ist das Radikal NO zytotoxisch im Rahmen der Immunantwort ( Karupiah, 1993 ). Entscheidend, ob NO protektiv oder toxisch wirkt, sind die Konzentration des NO und der Redoxstatus der Zelle. Gesteuert wird die Produktion des NO durch verschiedene Signale bzw. -transduktionssysteme, deren Wege konvergieren, daß heißt, sie nutzen das NO als ubiquitären chemischen Botenstoff. Dieses erklärt die gegensätzlichen Wirkungen des NO.


6

1.3. Endotheliale versus induzierbare NO Synthase

Katalysator der NO-Produktion ist die NO-Synthase. Zwei Isoformen sind im Endothel identifiziert worden: die endotheliale und die induzierbare NO-Synthase ( eNOS / iNOS ; Nathan, 1994 ). Beide Formen weisen verschiedene Kinetik, Regulation und Verteilung im Gewebe auf. Während die eNOS als konstitutiv exprimiertes Enzym beschrieben ist (s. u.), wird die iNOS bei einer Infektion oder Entzündungsreaktion, das heißt, im Rahmen der Zellimmunität induziert. Die Umsatzrate vmax der eNOS ist um ein Viefaches geringer als die der iNOS , die eine ”high-output“-Kinetik aufweist ( Nathan, 1992 ). Die iNOS kann durch proinflammatorisches Stimulation (z. B. Interleukin-1beta) in Endothelzellen stimuliert werden ( Kanno, 1994 ). Die Aktivität der iNOS ist Ca2+-unabhängig und bleibt über Tage erhalten ( Nathan, 1994 ). Die dabei erreichte intrazelluläre NO-Konzentration ist zytotoxisch ( Stenger, 1994 ). Zelltod und Gewebsschädigung sind die Folge.

1.4. Endotheliale NO-Synthase - Vermittler der basalen Gefäßdilatation

Janssens, 1992 ) isolierten eine cDNA , die für die menschliche endotheliale NO-Synthase ( eNOS ) kodiert, Ca2+-abhängig ist und konstitutiv (s. u.) in Endothelzellen exprimiert wird. Das eNOS -Gen spannt sich über 21kb genomische DNA , kodiert eine mRNA mit 26 Exons und 4052 Nukleotiden.

Die Charakterisierung der proximalen 5’-Promoterregion zeigte, daß der eNOS -Promoter keine TATA-Box in ausreichender Entfernung für den Initiationskomplex ( Robinson, 1994 ) enthält, aber Elemente besitzt, die mit einem konstitutiv exprimierten Gen übereinstimmen (SP1- und GATA-Motive) ( Marsden, 1993 ). Huang, 1995 unterbrachen das eNOS -Gen der Maus und fanden bei den homozygoten ”knockout“-Mäusen lebensfähige Tiere, bei denen kein NO nachweisbar war und die eine Hypertonie entwickelten. Die Autoren schlossen daraus auf die Vermittlung der basalen Vasodilatation durch die eNOS .

Substrat der eNOS ist die Aminosäure L-Arginin, die zu L-Zitrullin und NO reduziert wird. Die Reaktion erfordert molekularen Sauerstoff und reduzierende Äquivalente in Form von NADPH als Kosubstrate ( Marletta, 1994 ). Die Aktivität der eNOS ist streng durch den intrazellularen Ca2+-Spiegel kontrolliert. Agonist-hervorgerufene Erhöhung der Konzentration von intrazellularem Ca2+ steuert die Bindung des Ca2+/Calmodulin-Komplex an die eNOS und erzeugt eine Konformationsänderung, die das Enzym in seine aktive Form überführt (Nathan, 1994a). Dieser Effekt ist transient (Minuten). Die eNOS ist charakterisiert durch eine ”low-output“-Kinetik, wie es für

Homöostasemechanismen mit einer Moment-zu-Moment Anpassung (Blutdruckregulation) typisch ist (Nathan, 1992).

Das Molekulargewicht des Monomers der humanen endothelialen NO-Synthase beträgt \|[ap ]\|133 kDa bei der Proteinauftrennung in SDS-Polyacrylamid-Gel (Marletta, 1994). Im nativen Zustand ist die eNOS ein Homodimer (Marletta, 1994).


7

1.5. Regulation der eNOS

Die Kontrolle der eNOS ist auf transkriptioneller, posttranskriptioneller und posttranslationaler Ebene beschrieben worden. Dieses widerspricht der gebräuchlichen Definition eines ”konstitutiv“ exprimierten Gens, weshalb ich die endotheliale ”konstitutive“ NO Synthase (ecNOS) immer kurz als endotheliale ( eNOS ) bezeichnen werde. Dieses genügt den Anforderungen an eine eindeutige Nomenklatur, da die eNOS ausschließlich im Endothel nachgewiesen wurde.

Die Daten über die Regulation der endothelialen NO-Synthase durch eine Erniedrigung des physiologischen Sauerstoffpartialdruckes (PaO2), eine Situation, die bei pulmonaler Hypertonie vorherrscht, sind widersprüchlich. Während eine Abnahme der eNOS mRNA -Transkription unter Hypoxie in Endothelzellkulturen ( HUVEC , human umbilical vein endothelial cells) beobachtet werden konnte ( McQuillan, 1994 ), wurde bei In-vivo-Versuchen in Ratten unter verlängerter Hypoxie zwar ein Abfall der NO-Produktion, aber ein Steigerung der eNOS -Expression gezeigt ( Shaul, 1995 ). Liao, 1995 ) berichten, daß eine Senkung des O2 von 20% auf 3% zu einer Verkürzung der eNOS mRNA-Halbwertszeit von 46 auf 24h in bovinen Endothelzellen führt (BPAEC, bovine pumonary artery endothelial cells).

Proinflammatorische Mediatoren wie Interleukin-1beta ( IL-1 beta), Tumor Necrosis Factor alpha ( TNF alpha) und Interferon gamma (IFNgamma) haben die Fähigkeit der Verminderung der eNOS in AOEC (human aortic endothelial cells) bzw. LPS in einem Rattenmodell gezeigt ( MacNaul, 1993 und Liu, 1996 ), hingegen aber wurde eine absolute Aktivitätssteigerung, gemessen als Konversion von [14C]L-Arginin zu [14C]L-Zitrullin, unter Stimulierung mit TNF alpha und INF gammabeschrieben, obwohl die ”steady state“-Konzentration der eNOS mRNA um 94% fiel ( Rosenkranz-Weiss, 1994 ). Für diesen Effekt wurde eine gesteigerte Konzentration von Tetrahydrobiopterin (BH4), einem der Kofaktoren der eNOS , verantwortlich gemacht (Rosenkranz-Weiss, 1995).

Die eNOS ist im unphosphorylierten Zustand in der Zytoplasmamembran lokalisiert und unterliegt so offenbar neben der transkriptionellen ”shear stress“-induzierten Transkriptionssteigerung einer direkten ”shear stress“-Regulation ( Pohl, 1991 und Uematsu, 1995 ). Eine Agonist-stimulierte Phosphorylierung kann eine Translokation in das Zytoplasma hervorrufen ( Michel, 1993 ). Die physiologische Bedeutung dieser Regulation ist unklar. In den Experimenten wurden die Proteine aus diesem Grund als ”whole cell extracts“ präpariert.

Ein wichtiger Punkt betrifft ebenfalls die in proliferierenden Zellkulturen beobachtete Steigerung sowohl der eNOS mRNA als auch des Proteins ( Arnal, 1994 ), weshalb die Versuche ausschließlich mit Kontakt-inhibierten, konfluenten HPAEC -Kulturen durchgeführt wurden .


8

Abbildung 1: Vereinfachtes Modell der allosterischen Regulation der endothelialen ”konstitutiven“ NO Synthase. Die Bindung der Kofaktoren FAD (Flavinadenindinucleotid) und FMN (Flavinmononukleotid) überführt die inaktiven NOS Monomere in ein inaktives Dimer, an den als weitere prostethische Gruppen Häm und Tetrahydrobiopterin (BH4) und das Substrat L-Arginin binden. Ausgelöst durch die Erhöhung des intrazellularen Ca2+-Spiegels ändert der gebundene Ca2+/Calmodulinkomplex die Konformation des inaktiven Dimers hin zu seiner katalytisch aktiven Form. Dieser Prozess dauert nur Minuten.


9

1.6. Kritische Balance der Zytokine und Wachstumsfaktoren.

Die verantwortlichen zellulären Mechanismen der Hypoxie-induzierten vaskulären Veränderungen sind komplex und die Wechselwirkungen zwischen den Zellen ähneln den klassischen embryonalen Gewebeinteraktionen. Diese reziproken Wirkungen werden Rezeptor-vermittelt durch intrazelluläre ”Programme“ (Signaltransduktion) für die Genexpression geregelt und betreffen wie in der Embryonalentwicklung Wachstumsfaktoren, Entzündungsmediatoren und chemische Botenstoffe, zum Beispiel NO ( Kourembanas, 1994 ).

O’Brien, 1984 zeigte, daß der Überstand von kultivierten Endothelzellen eine Substanz enthält, die pulmonale Arterienringe kontraktiert. Nachfolgend konnte Endothelin-1 ( ET-1 ) als ein Peptid mit 21 Aminosäuren identifiziert werden. Endothelin-1 ist der potenteste derzeit bekannte Vasokonstriktor ( Yanagisawa, 1988 ) und ist, neben des mitogenen Effektes auf die glatten Gefäßmuskelzellen ( VSMC ), als Stimulator der perivaskulärer Zellproliferation beschrieben worden ( Schiffers, 1994 ). Hypoxie stimuliert die Transkription der ET-1 mRNA in HUVEC ( Kourembanas, 1991 ). Bedeutend für die Interaktionen unter hypoxischen Bedingungen ist, daß NO die Expression von ET-1 in HUVEC (via cGMP ) vermindern kann ( Kourembanas, 1993 ). IL-1 beta induziert die Sekretion von ET-1 in humanen Endothelzellkulturen ( Yoshizumi, 1990 ).

Interleukin-8 ( IL-8 ) ist gleich dem Endothelin-1 ein bedeutendes Mitogen für die VSMC und wirkt darüber hinaus in diesen Zellen chemotaktisch ( Yue, 1994 ) und wird von Endothelzellen nach Stimulierung mit verschiedenen Zytokinen bzw. unter Hypoxie produziert ( Karakurum, 1994 ). Die potentielle pathologische Signifikanz von IL-8 unter hypoxischen Konditionen wird durch den protektiven Effekt von Antikörpern gegen IL-8 in einem Ischämiemodell der Lunge deutlich ( Sekido, 1993 ).


[Titelseite] [1] [2] [3] [4] [5] [6] [Abkürzungsverzeichnis] [Danksagung] [Bibliographie]

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiDi DTD Version 1.1
a subset from ETD-ML Version 1.1
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Mon Mar 8 12:30:53 1999