Borrmann, Steffen: Regulation der endothelialen NO-Synthase unter Hypoxie und proinflammatorischer Stimulation in pulmonal-arteriellen Endothelzellen

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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1. Zellisolation und Zellkultur

Menschliche pulmonale arterielle Endothelzellen ( HPAEC ) wurden von ca. 1-2cm langen Segmenten der intrapulmonalen Aufzweigungen der Arteria pulmonalis isoliert. Die Arterien entstammen Patienten, die im Rahmen der Entfernung eines Bronchialkarzinoms einer Lob- oder Pneumektomie unterzogen wurden. Die Operationen fanden in der Abteilung für Herz- und Thoraxchirurgie am Allgemeinen Krankenhaus der Stadt Wien statt. Die Entnahme eines Gewebestückes ist durch die Ethikkommission der Universität Wien bestätigt worden.

Alle Arbeitsschritte mit der Endothelzellkultur wurden ausschließlich mit sterilen Materialien und in einer Sterilbank mit laminalen Luftzug ausgeführt. Sofort im Anschluß an die Präparation der Arterie wurde diese in 0,5%iger Kollagenaselösung (Kollagenase Typ IV von Clostridium histolyticum, Sigma) für 20 min bei 37°C inkubiert. Die Endothelzellen wurden mit einem ”cell scraper“ gelöst und die Gewebestücke entfernt. Die Zellsuspension wurde für 5 min bei 1000 U/min und Raumtemperatur (RT) zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend verworfen und die Zellen mit Endothelzellmedium (s. u.) resuspendiert und in eine mit 1%iger Gelatine beschichtete 25 cm2-Primärgewebekulturflasche (Falcon, Becton Dickinson, Bedford, MA) überführt. Nach der lichtmikroskopischen Kontrolle des Anwachsens der Zellen nach durchschnittlich 2 Wochen (neben Endothelzellen auch glatte Muskelzellen und Fibroblasten) konnten die Endothelzellen mittels der ”magnetic beads isolation method“ ( Jackson, 1990 ) von den kontaminierenden Zellen separiert werden. Nach der Ablösung der Zellen mit 0,5%iger Trypsinlösung (Clonetics, San Diego, CA), Zentrifugation s. o., Absaugens des Überstandes und Resuspension der Zellen in 200µl HBSS (Hanks’ balanced salt solution, Sigma) mit 5% FCS (GIBCO BRL, Paisley, UK) wurden die nachfolgenden Schritte in einem Eppendorfröhrchen durchgeführt. Die Zellsuspension wurde mit 50µl der Stocklösung der mit Lektin-beschichteten ”magnetic Beads“ (5 µg Lektin/107 beads, Stockkonzentration: 5x108 beads/ml) für 10 min auf Eis inkubiert (Lektin von Ulex Europaeus UEA I, Sigma und DYNABEADS M-450 von Dynal, Oslo, Norwegen). Da nur die Endothelzellen einen Rezeptor für Lektin besitzen, ist es möglich durch nachfolgende Waschschritte (HBSS mit 5% FCS) in einer Magnetkammer diese zu isolieren. Die an die ”beads“ gebundenen Endothelzellen wurden mit Endothelzellmedium in Suspension gebracht und in einer mit 1%iger Gelatine beschichtete 25 cm2-Primärgewebekulturflasche kultiviert ( Abb.2 ). Die ”Beads“ lösen sich bei den folgenden Passagen von den Zellen.

Die Zellen wurden im subkonfluenten Zustand durch Ablösung mit 0,5%iger Trypsinlösung (max. Inkubationszeit 5 min), Zentrifugation (s. o.) und nach erfolgter Resuspension in Endothelzellmedium im Flächenverhältnis von 1:3 passagiert. Die Zellkultur wurde nach der ersten Passage in mit 1%iger Gelatine beschichteten 75 cm2-Gewebekulturflaschen (Falcon, Becton Dickinson, Bedford, MA) geführt. Die optimale Zellproliferation wurde mit angereicherten Endothelzellbasalmedium (Promo Cell, Heidelberg) erzielt und folgende Endkonzentration enthielt: 50 µg/ml ECGS (endothelial cell growth supplement, Becton Dickinson, Bedford, MA), 5 Einheiten/ml Heparin (Sigma), 60 ng/ml Streptomycin, 100 ng/ml


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Penicillin, 50 ng/ml Amphotericin B und 20% fötales Kälberserum (alles GIBCO BRL, Paisley, UK) enthielt. Die Kultur erfolgte in Brutschränken (Heraeus, Hanau, Deutschland) bei 37°C, 99%iger H20-Sättigung und 5% CO2.

Zusätzlich wurde eine Zellinie mit “single-donor“ HPAEC geführt. Die Zellen wurden von der Firma Clonetics (San Diego, CA) gekauft und nach den gleichen Prinzipien behandelt wie beschrieben. Für die RNA- und Proteinpräparation wurden die Zellen bis zur Konfluenz kultiviert und zwischen den Passagen 5-8 verwendet.

Für die Experimente wurden die Zellen entweder zur Kontrolle nur mit Endothelzellbasalmedium oder mit der Zugabe von rekombinanten menschlichen IL-1 beta (2,5 ng/ml, Endogen, Cambridge, MA) und TNF alpha (2,5 ng/ml, R&D Systems, Abingdon, UK) sowie LPS von Pseudomonas aeroginosa (10 ng/ml, Sigma) inkubiert. Die Versuche wurden unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen durchgeführt. Die Hypoxie wurde mit einem Sauerstoffgehalt von 3% erreicht.

3.2. Charakterisierung der Zellen

Die Zellinien wurden mit der Indirekten Immunfloureszenz mittels eines monoklonalen Antikörpes gegen den humanen endothelialen Faktor VIII (Anti-von Willebrand-Faktor, Boehringer Mannheim) auf Spezifität und Reinheit der Kultur getestet. Es handelt sich dabei um eine Standartprozedur zur Identifizierung von Endothelzellen ( Wagner, 1984 ). Die Visualisierung erfolgte mit einem zweiten Antikörper gegen Maus-IgG (Boehringer Mannheim), der mit Flourescein konjugiert ist. Die Charakterisierung der Zellen wurde entsprechend den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Nach der Subkultivierung der Zellen in ”chamber slides“ (Nunc, Roskilde, Dänemark), Waschen mit PBS, Fixation mit Methanol (-20°C) wurden die Zellen erst mit der Anti-von Willebrand Faktor Antikörper-Lösung (Verdünnung 1:10) und nach Wegwaschens der Lösung mittels PBS mit der Anti-Maus-IgG Antikörper-Lösung (Verdünnung 1:10) für je 30 min bei 37°C inkubiert. Die Erfolgskontrolle wurde unter einem Floureszenzlichtmikroskop (Olympus, Japan) durchgeführt.

Die für die Versuche verwendeten Zellinien waren für Faktor VIII-Färbung uniform positiv.


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Abbildung 2: Pulmonal-arterielle Endothelzellen in konfluenter Kultur. Aufsicht mit 20facher Vergrösserung im Phasenkontrastlicht.

Abbildung 3: Charakterisierung der Endothelzellkultur mittels indirekter Immunfloureszenz (Anti-von Willebrand-Faktor). Gleicher Ausschnitt wie Abb. 2.


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3.3. Vitalitätstest der Zellen

Um die Lebensfähigkeit der Zellen unter den Versuchsbedingungen zu untersuchen, wurde eine Testreihe mit Trypanblaufärbung vorgenommen. Trypanblau penetriert während des 5minütigen Versuchs nur abgestorbene Zellen, deren Anfärbung unter einem Lichtmikroskop beobachtbar ist. Für die Versuche wurden die Zellen in 6-Loch-Platten (Nunc, Roskilde, Dänemark) bis zur Konfluenz kultiviert. Das Medium wurde zur Vermeidung einer Interferenz des Trypanblaus mit dem Serum abgesaugt und die Zellen mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen 5 min mit einer 0,5%igen Trypanblau-PBS-Lösung inkubiert und das Färbeverhalten unter dem Lichtmikroskop (Olympus, Japan) ausgewertet. Zusätzlich wurde die Zellmorphologie abgeschätzt und über ein Videosystem aufgezeichnet (CUE, Galai Production, Israel).

Unter allen Bedingungen konnte keine morphologische Veränderung des typischen ”Kopfsteinpflaster“-Muster festgestellt werden. Die Zellen ließen sich nicht mit Trypanblau anfärben.

3.4. Proteinextraktion

Die Proteinextraktion wurde nach der Gefrierschockmethode durchgeführt. Nach dem Waschen mit kalten PBS (phosphate-buffered saline) wurden die Zellen vom Boden abgekratzt, zentrifugiert (1600 U/min, 6 min, RT), der Überstand verworfen, das Zellpellet in einem Proteaseinhibitionspuffer (Volumenverhältnis Pellet/Puffer ca. 1/1-1,5) resuspendiert und auf Eis gegeben. Der Puffer enthält 20 mM Hepes, 0,4 M NaCl, 25% Glycerol, 1 mM EDTA, 0,5 mM NaF, 0,5 mM DTT, sowie 1 mM PMSF, 2 µg/ml Leupeptin, 2 µg/ml Aproptin, 10 µg/ml Trypsininhibitor und 2 µg/ml Benzamidchlorid (Sigma), die direkt vor der Verwendung pipettiert wurden. Die Zellsuspension wurde zweimal in flüssigen Stickstoff (-147°C) zum Aufbrechen der Zellen Schock-gefroren, anschließend jeweils aufgetaut und danach auf Eis inkubiert (20 min). Nach der Zentrifugation (15.000 rpm, 15 min, 4°C) der aufgebrochenen Zellen und Aliquotierung der Überstände konnten die Proteinextrakte bis zur Verwendung bei -70°C gelagert werden.

3.5. RNA-Extraktion

Der RNA-Gesamtgehalt der Zellen wurde folgend der Guanidiniumthiozyanat-Phenol-Chloroform-Methode (Chomszynski, 1987) extrahiert. Zuerst wurden die Zellen mit Solution D lysiert und anschließend mittels eines cell scrapers gesammelt und in ein Eppendorfröhrchen zur kompletten Lysis transferiert. In der folgenden Reihenfolge wurden 2 M Acetat-Chlorid (pH 4), H2O-gesättigtes Phenol und Chloroform-Isoamylalkohol ( Volumenverhältnis 49:1) zugegeben. Nach jedem Pipettierschritt wurde die Lösung kurz gemischt und anschließend für 15 min auf Eis gegeben. Nach der Zentrifugation für 20 min bei 10.000 rpm und 4°C wurde die obere wässrige Phase, die die RNA enthält, in ein neues Eppendorfröhrchen überführt und über Nacht (Mindestendauer 1 h) mit Isopropanol (100%) bei -70°C präzipitiert.


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Es schloß sich eine Zentrifugation für 20 min bei 10.000 rpm und 4°C an, der Überstand wurde verworfen und das RNA-Pellet wurde in Solution D resuspendiert, bevor die RNA ein weiteres Mal mit Isopropanol bei -20°C für mindestens 1 h präzipitiert wurde. Anschließend an die Zentrifugation für 10 min bei 10.000 rpm und 4°C folgten zwei Waschschritte mit 75%igen Ethanol und intermediären, bzw. abschließenden Zentrifugieren für 5 min bei 10.000 rpm und 4°C. Zum Abschluß wurde das RNA-Pellet für die Dauer von 10 min in einem Vakuumexsikkator getrocknet und in TE (10mM Tris, 5mM EDTA, pH 7,4) für 15 min bei 55°C inkubiert. Ein RNAse-Inhibitor (20 Einheiten/Probe, Boehriger Mannheim) wurde vor der Lagerung bei -20°C hinzugegeben.

3.6. cDNA-Sonden

Das pHuNOSendo PM21-Plasmid mit dem 2,18 kb eNOS cDNA -Fragment wurde freundlicherweise von P.A. Marsden (Department of Molecular and Medical Genetics, University of Toronto, Ontario) zur Verfügung gestellt. Durch ein Verdau mit der Restriktionsendonuklease EcoRI (Boehringer Mannheim) wurde das cDNA -Fragment herausgeschnitten. Von M. Yanagisawa stammte (Howard Hughes Medical Institute, University of Texas) das pHET91-Plasmid, aus dem mit EcoRI ein ein 0,85 kb cDNA -Fragment für die Detektion von ET-1 mRNA geschnitten wurde. Ein IL-8 289 kb cDNA -Fragment wurde mittels der reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) aus den RNA-Extrakten der Endothelzellen hergestellt. Die spezifischen Primer mit folgenden Sequenzen, 5’Primer: 5’-ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT-3’ und 3’Primer: 5’-TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC-3’, wurden von Clontech (Palo Alto, CA) gekauft. Die 258 kb iNOS cDNA wurde mit gekauften Primern (Clontech) ebenfalls mittels RT-PCR amplifiziert. Der 5’Primer hatte die Sequenz: 5’-CGGTGCTGTATTTCCTTACGAGGCGAAGAAGG-3’ und der 3’Primer: 5’-GGTGCTGCTTGTTAGGAGGTCAAGTAAAGGGC-3’. Als interner Standard diente eine GAPDH cDNA zur Detektion der konstitutiv exprimierten GAPDH mRNA (Glyzerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase).

Die cDNA -Fragmente wurden mit [alpha32P]dCTP durch ”random priming“ zu einer spezifischen Aktivität von 1,6 x 109 dpm/µg markiert. Das Procedere wurde in einer Radioaktivität-abschirmenden Kammer (Beta work tank, Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) durchgeführt. Es wurde ein kommerzieller Kit (Random Primed DNA Labeling Kit, Boehringer Mannheim) verwendet und das Protokoll folgte den Empfehlungen des Herstellers. Die Methode basiert auf der Hybridisierung eines Hexanukleotid-Mix aller Basensequenzkombinationen zu der zu markierenden cDNA ( Feinberg, 1984 ). Der komplementäre Stang wird von den 3’Enden der hybridisierten Hexanukleotide mit dem Klenow-Fragmentes der DNA Polymerase I (labeling grade) von E. coli synthetisiert. Die im Reaktionsmix enthaltenen [alpha32P]dCTP-Nukleotide werden in den neuen Strang inkorperiert. Die cDNA wird zusammen mit dem Hexanukleotidmix durch Erhitzen auf 100°C denaturiert und das ”annealing“ der Primer beim Abkühlen auf Eis wird auf diesem Wege erleichtert. Der Reaktionsansatz enthielt in der Endkonzentration je 0,075 mM dATP, dGTP und dTTP, 1x Hexanukleotid-Mix, 50 µCi [alpha32P]dCTP, 2 Einheiten Klenow-Enzym, die cDNA und


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wurde für mindestens 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz kurz auf 70°C erwärmt, um das Klenow-Enzym (Exonukleaseaktivität) zu inaktivieren. Die überschüssigen dNTP wurden mittels einer Gelsäule (Sephadex G50 Spin Column, Pharmacia) von der cDNA separiert. Vor der Hybridisierung wurde die cDNA durch Erhitzen auf 100°C denaturiert.

3.7. mRNA-Analyse

Die Analyse der mRNA -Expression wurde durch die Größen-abhängige Fraktionierung mittels einer Agarose/Formaldehyd-Gelelektrophorese, anschließendem Transfer auf eine Nylonmembran und Hybridisierung mit den 32P-radiomarkierten cDNA -Sonden durchgeführt (”northern blotting“). Um Kontaminationen mit den ubiquitären RNAsen zu vermeiden, wurden nur RNAse-freie, sterile Glasswaren und Pipettenspitzen sowie Diethylpyrocarbonat (DEPC) -behandeltes Wasser für die Lösungsherstellung verwendet.

Die Standardisierung der mRNA-Proben erfolgte durch eine photometrische Messung der Extrakte bei 260 und 280 nm (UV-Spektrometer, LKB Biochrom 4060, Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). Das Verhältnis der Extinktionen bei 260 und 280 nm wurde für die Kontrolle eventueller Proteinkontaminationen in den mRNA-Extrakten ausgewertet und sollte in dem Bereich von 1,7 bis 2 liegen. Die Qualität der RNA wurde durch den Lauf eines Probegels unter nicht-denaturierenden Konditionen (1% Agarose, 0,08 µg/ml Ethidiumbromid) mit Aliquots der Proben (1 µl) getestet.

Die Separation der mRNA durch die Gelelektrophorese wurde durch denaturierende Bedingungen erreicht, um die Bildung sekundärer Strukturen durch intramolekulare Basenpaarungen zu verhindern. Denaturierung wird durch die Addition von Formaldehyd zu den RNA-Extrakten und dem Laufgel erreicht. Alle Schritte bis zum Starten des Gels, wenn nicht anders erwähnt, wurden auf Eis ausgeführt. Nach der Anpassung der Probenvolumina mit H2O an gleiche RNA-Mengen entsprechend den Extinktionsmessungen wurden die Proben mit einem denaturierenden Samplepuffer (2,2 M Formaldehyd, 1x MOPS [3-{N-Morpholino}-Propansulfonsäure, 50% Formamid, 0,08 µg/ml Ethidiumbromid) für 15 min bei 55°C inkubiert und mit einem ”loading buffer“ (0,05% Bromphenolblau und Glycerol 10%) versetzt. Das Laufgel enthielt 1% Agarose, 2,2 M Formaldehyd (7%) und 1x MOPS. Als Laufpuffer wurde ein 1x MOPS-Puffer verwendet. Nach dem Laden mit gleichen Mengen an RNA (10 µg) lief das Gel mit 5 V/cm bis das Bromphenolblau ca. 2/3 von der Länge migriert war (Gelapparatur von Bio-Rad, Wide Mini Sub Cell, Hercules, CA). Die RNA-Banden (18 S und 28 S) wurden anschließend unter einem UV-Transilluminator visualisiert, nach gleicher Beladung des Gels beurteilt und fotografiert (Polaroid MP 4+, Cambridge, MA).

Vor dem ”blotting“ der aufgetrennten RNA wurde das Gel gewaschen (H2O), um einen Effizienzverlust durch eine Interferenz des Formaldehyds mit der Membran vorzubeugen. Der Transfer wurde in einer Vacuumblot-Apparatur (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) vorgenommen. Das Procedere entsprach den Empfehlungen des Herstellers. Durch das Anlegen eines Vacuums von 55 mbar wird die RNA aus dem Gel auf die Membran gesogen. Um die Transfereffektivität zu verbessern (partielle RNA-Hydrolyse- und Spaltung), wird das Gel (unter Vacuum) jeweils 5 min mit H2O, 50 mM NaOH und 1,5 M


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NaCl inkubiert. Nach der Equilibrierung mit 0,1 M Tris-Cl- (pH7,4) für 5 min wurde die RNA mit 20x SSC-Puffer (saline-sodium citrate) auf eine Nylonmembran (Hybond N oder N+, Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) transferiert (2 h), im Anschluß mit 2x SSC gespült und 10 min bei 70°C getrocknet. Die folgende UV-Bestrahlung (254 nm) der Membran in einem UV-Transilluminator (GS Gene Linker, Bio-Rad, Hercules, CA) führt zu einer kovalenten Bindung der RNA an die Nylonmembran (”UV cross linking“) und ermöglicht das ”reprobing“ der Membran. Die Transfereffektivität wurde unter UV-Licht beurteilt (18 S und 28 S Banden) und fotografiert (Polaroid MP 4+).

Die Membran wurde mit 150 µg/ml denaturierter (100°C) salmon sperm DNA und 150 µg/ml yeast tRNA in der Hybridisierungslösung (50% Formamid, 6x SSC, 5x Denhardt, 0,5% SDS) prähybridisiert, d. h. gegen unspezifische Bindungen geblockt. Die Prozedur wurde mindestens 4 h in einem rotierenden Hybridisierungsofen (Mini Oven MK II, Hybaid, Teddington, UK) bei 42°C durchgeführt. Anschließend folgte die Inkubation mit den 32P-radiomarkierten cDNA -Sonden (2,5 ng/ml in Hybridisierungspuffer) über mindestens 16 h bei 42°C im Hybridisierungsofen. Das Waschen mit 2x SSC/0,1 % SDS (sodium dodecyl sulfate) für 15 min bei RT und 0,2x SSC/0,1 SDS für 10 min bei 60 °C entfernt die nicht gebundenen cDNA -Sonden.

Zur Analyse der Hybridisierung wurde ein PhosphorImager (Molecular Dynamics, Krefeld) verwendet. Das Prinzip der Detektion ist die indirekte Autoradiographie, da 32P ein zu starker beta-Strahler für die direkte Exposition ist. Die Membran wurde in einer Autoradiographiekassette exponiert, dessen Schirm anschließend von einem Laser abgetastet und das Ergebnis mit der ImageQuant-Software (Molecular Dynamics) ausgewertet. Zusätzlich wurde ein Autoradiographiefilm (Hyperfilm ECL, Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) belichtet. Als internen Standard der Messungen wurde die Expression des glykolytischen Enzyms Glyzerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase ( GAPDH ) gemessen. Für die Tabellenauswertung wurden die relativen Mengenangaben der mRNA jeweils zu der zusätzlich bestimmten GAPDH mRNA-Menge des gleichen Films normalisiert und als Relativwert angegeben.

3.8. Proteinanalyse

Die Proteine wurden durch die eindimensionale, kontinuierliche SDS/polyacrylamide gel electrophoresis (SDS/PAGE) aufgetrennt. Pro Probe/Schacht wurden gleiche Mengen Protein (100 µg) aufgetrennt. Danach erfolgte der Transfer der aufgetrennten Proteine auf eine Nitrozellulosemembran und die Immunodetektion durch einen primären spezifischen Antikörper und über die an den sekundären Antikörper gekoppelte, Peroxidase katalysierte Chemiluminiszenz (”western blotting“).

Eine gleiche Beladung bei der Größenfraktionierung der Proteine durch die Gelelektrophorese wurde mittels der Bestimmung der Proteinkonzentrationen nach Bradford, 1976 der einzelnen Proben sichergestellt. Dazu wurde ein kommerzieller Kit (Bio-Rad protein assay, Bio-Rad, Hercules, CA) verwendet. Die Extinktionsmessung fand mit einem automatischen UV-Spektrometer statt (LKB Biochrom 4060, Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). Der Angleich der Proteinkonzentrationen der Proben erfolgte


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durch entsprechende Verdünnung mit H2O. Die Proteine wurden mit einem 3x Tris-Glycin-Puffer (pH 6,8) im Volumenverhältnis von 1:3 (Puffer/Proteinlösung) versetzt und für 5 min bei 95°C denaturiert. Dem Puffer wurde zuvor reduzierendes beta-Mercaptoethanol zugesetzt. Alle Schritte bis zum Laden des Gels wurden auf Eis ausgeführt.

Als Trenngel wurde eine geringe Acrylamidkonzentration von 8% (”light separating gel“) gewählt, um die Auftrennung bzw. Auflösung zu verbessern (Molekulargewicht des eNOS -Monomers 133 kDa). Ein 1x Tris-Glycin-Puffer (pH 7,2) wurde als Elektrodenlösung verwendet. Die Protokolle zur Herstellung der Puffer und des Trenn- sowie Sammelgels sind andernorts beschrieben ( Ausubel, 1994 ). Die Proteinlösungen wurden ”tauchend“ in die Gelschächte pipettiert. Zur Identifizierung der Banden wurde jedes Gel mit einem Molekulargewichtsmarker (Rainbow, Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) geladen und um ein gleichmäßiges Wandern der Proteinfront (”blue juice“) zu gewährleisten, wurden in die seitlichen, nicht mit Protein beladenen Schächte gleiche Volumina 3x Tris-Glycin-Puffer (pH 6,8) gegeben. Das Gel lief mit einer Spannung von 100 V über ca. 1 h (Elektrophoreseapparatur von Hoefer, Serie P 600, San Francisco, CA).

Anschließend an die Kalibrierung des Gels in einem Transferpuffer (48 mM Tris, 39 mM Glycin, 1,3 mM SDS, 20% Methanol, pH 8,3) für 30 min wurden die aufgetrennten Proteine auf eine Nitrozellulosemembran (Hybond-ECL, Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) geblottet. Die Prozedur dauerte 1 h mit einem ”semi dry blotter“ (Trans-Blot SD, Bio-Rad, Hercules, CA).

Die Effektivität des Transfers wurde durch eine transiente Färbung der Nitrozellulosemembran mit Ponceau S beurteilt und fotographisch festgehalten (Polaroid MP 4+, Cambridge, MA). Die Färbung wird bei den folgenden Waschschritten vollständig entfernt und eine Interferenz mit den Antikörperbindungen ist auszuschließen.

Die Immunodetektion des eNOS Proteins erfolgte in zwei Schritten mit einem primären spezifischen Antikörper gegen das C-terminale Ende des eNOS -Monomers von der Maus (Anti- eNOS , Transduction Laboratories, Lexington, KY) und einem sekundären Peroxidase-konjugierten Antikörper gegen das Maus-IgG Fc-Fragment (Anti-Maus, Boehringer Mannheim). Die unspezifischen Bindungsstellen wurden zuvor durch dreimaliges Waschen für je 15 min mit einer ”blocking solution“ (5% Magermilchtrockenpulver in PBS, pH 7,5) geblockt. Die Membran wurde mit einer 1:2500-Verdünnung des Anti- eNOS in blocking solution bei 4°C über Nacht inkubiert. Der nicht gebundene Anti- eNOS wurde anschließend mit PBS-Tween (0,1% Tween, pH 7,5) weggewaschen. Der Anti-Maus wurde in PBS verdünnt (1:2500) und die Membran wurde bei RT für 1 h mit der Lösung inkubiert. Das Procedere wurde durch das Auswaschen des sekundären Antikörpers mit PBS abgeschlossen.

Die gebundenen sekundären Antikörper wurden mittels der enhanced chemiluminescence (ECL, Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) detektiert. Das Protokoll folgte den Empfehlungen des Herstellers. Kurz, die Peroxidase/Wasserstoffperoxid (H2O2) katalysierte Oxidation des Luminols unter alkalischen Bedingungen führt durch den folgenden Verfall des oxidierten, angeregten Zustand des Luminols zur Emission von Licht mit einem Maximum bei einer Wellenlänge von 428 nm. Nach einminütiger Inkubationszeit wurde ein Autoradiographiefilm (Hyperfilm ECL) belichtet. Die Exposition des Films dauerte


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zwischen 5 bis 30 min und wurde in einer Dunkelkammer vorgenommen. Die Densitrometrie wurde mit der ImageQuant-Software (Molecular Dynamics) ausgeführt.
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