Borrmann, Steffen: Regulation der endothelialen NO-Synthase unter Hypoxie und proinflammatorischer Stimulation in pulmonal-arteriellen Endothelzellen

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Kapitel 4. Ergebnisse

4.1. Hypoxie-induzierte, zeitabhängige Abnahme der eNOS mRNA und des eNOS Proteins

Unter hypoxischen Bedingungen verringert sich die Menge der eNOS mRNA und des eNOS Proteins gegenüber normoxischen Konditionen, wie im ”northern“ und ”western blotting“ nachgewiesen wurde. Diese Verringerung konnte nach 24, 48 und 96 h für die mRNA und nachgewiesen werden. Die Kinetik der eNOS Protein-Expression unter Hypoxie zeigte einen Abnahme der Proteinmenge nach 24 h und verstärkt nach 96 h, während eine transiente Induktion gemessen nach 48 h nachwiesen wurde (Abbildungen 4-7).

4.2. IL-1beta und LPS verringern die Expression der eNOS mRNA und des eNOS Proteins zeitabhängig

Interleukin-1beta und Lipopolysaccharid von Pseudomonas aeroginosa verringern die Menge an eNOS mRNA und eNOS Protein. Die Verringerung konnte mittels ”northern“ und ”western blotting“ nach 24, 48 und 96 h nachgewiesen werden. Interleukin-1beta war potenter als LPS und induzierte bereits nach 24 h eine deutliche Abnahme, die sich nach 48 h verstärkte und nach 96 h zu einer fast vollständigen Unterdrückung der Expression des eNOS Proteins führte (Abbildungen 4-7).

4.3. Proinflammatorische Mediatoren verstärken die Unterdrückung der Expression der eNOS mRNA und des eNOS Proteins unter Hypoxie

Die Analyse der eNOS mRNA mittels mRNA- und Proteinanalyse zeigte, daß der Hypoxie-induzierte Abfall der eNOS mRNA durch die zusätzliche proinflammatorische Stimulation (Interleukin-1beta und Lipopolysaccharid von Pseudomonas aeroginosa) nach 24 und 48 h weiter verstärkt wird und diese zu einem nahezu kompletten Verschwinden des eNOS Proteins nach 96 h führen. Dieser Effekt war unter IL-1 beta stärker als unter LPS (Abbildungen 4-7).

4.4. Hypoxie, IL-1beta und TNF stimulieren die Expression von Endothelin-1 mRNA

Hypoxie induziert die Expression der Endothelin-1 mRNA nach 48 h. Interleukin-1beta und Tumor Necrosis Factor alpha induzieren die Expression der Endothelin-1 mRNA, gemessen durch ”northern blotting“, wobei Interleukin-1beta nach 24 h die größte Induktion zeigte, die bereits nach 48 h deutlich abgeschwächt war. Tumor Necrosis Factor alpha zeigte erst nach 48 h eine Induktion, die aber weniger ausgeprägt war als die von Interleukin-1beta nach 24 h. Hypoxie und TNF alpha wirken synergistisch bei der Steigerung der ET-1 mRNA. Nach 24 h war die Expression der Endothelin-1 mRNA unter Hypoxie und dem proinflammatorischen Mediator TNF alpha höher als unter den beiden Bedingungen allein (Abbildungen 8 und 9).

4.5. IL-1beta und TNFalpha induzieren IL-8 mRNA allein und synergistisch mit Hypoxie

Interleukin-1beta und Tumor Necrosis Factor alpha induzieren die Expression von Interleukin-8 mRNA. Dieser


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Effekt wird durch Hypoxie noch verstärkt und war in der Kombination mit TNF alpha am stärksten (Abbildung 8).

4.6. Keine iNOS nachweisbar

Unter Normalbedingungen sowie unter Hypoxie und proinflammatorischer Stimulation ist keine iNOS mRNA in pulmonal-arteriellen Endothelzellen nachweisbar. Die Hybridisierung der ”northern blots“ mit der iNOS cDNA -Sonde zeigte ein negatives Ergebnis (keine Abbildung).

Abbildung 4: Analyse der eNOS mRNA Expression in HPAEC mittels ”northern blotting“ unter Normoxie (N) oder Hypoxie (H) allein (Medium) bzw. den zusätzlichen proinflammatorischen Stimuli Interleukin-1beta (IL-1beta) oder Lipopolysaccharid (LPS) von Pseudomonas aeroginosa. Die Analyse der GAPDH mRNA Expression diente als interner Standard. Zeitpunkte der Messungen waren 24, 48 und 96 Stunden. Die Extraktion und die Analyse der mRNA erfolgte wie unter Material und Methoden beschrieben.


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Abbildung 5: Auswertung der relativen Induktion der eNOS mRNA mittels Densitometrie der Banden im ”northern blot“ und Normalisierung zu GAPDH.

Abbildung 6: Analyse der eNOS Protein Expression in HPAEC mittels western blotting. Die Zellen waren entweder unstimuliert oder stimuliert mit Interleukin-1beta (IL-1beta) oder Lipopolysaccharid (LPS) von Pseudomonas aeroginosa jeweils in Kombination mit Normoxie (N) oder Hypoxie (H). Zeitpunkte der Messungen waren 24, 48 und 96 Stunden. Der eNOS Marker ist mit ”M“ gekennzeichnet. Die Extraktion und die Analyse des Proteins erfolgte wie unter Material und Methoden beschrieben.


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Abbildung 7: Densitrometrische Auswertung der eNOS Proteinanalyse.


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Abbildung 8: Analyse der Endothelin-1 (ET-1) und Interleukin-8 (IL-8) mRNA Expression in HPAEC mittels ”northern blotting“. Die Zellen wurden unter Normoxie (N) oder Hypoxie (H) mit Interleukin-1beta (IL-1beta), Lipopolysaccharid (LPS) von Pseudomonas aeroginosa oder Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha) stimuliert. Normoxie und Hypoxie ohne Stimulierung bilden die Ausgangsbedingungen (Medium). Als interne Kontrolle ist die GAPDH mRNA Analyse gezeigt.


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Abbildung 9: Densitrometrische Auswertung der ET-1 mRNA Expression in HPAEC normalisiert zu GAPDH unstimuliert sowie unter Stimulation mit LPS, TNFalpha und IL-1beta. Normoxische Bedingungen werden durch weiße, hypoxische durch schwarze Balken angezeigt.


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