26

Kapitel 5. Diskussion

Die Pathogenese der pulmonalen Hypertonie ist spekulativ. Wachsende Beweise deuten auf eine Schlüsselrolle des NO bei der Aufrechterhaltung des physiologischen Perfusions-/Ventilationsverhältnisses. Das vaskuläre und bronchiale NO stammt neben dem vom Endothel produzierten von der Ca²⁺-unabhängigen, induzierbaren NO-Synthase ( iNOS ) im Brochialepithelium ( Guo, 1995 ) und von der Ca²⁺-abhängigen, neuronalen Isoform der NO-Synthase ( nNOS ) aus den efferenten Nervenendigungen im Lungengewebe ( Schmidt, 1994 ). Mehrere Studien haben gezeigt, daß endotheliales NO entscheidend für die Aufrechterhaltung eines niedrigen Druckes im pulmonalen Kreislauf verantwortlich ist ( Dinh-Xuan, 1991 ). Pulmonale Hypertonie ist mit einer verringerten Expression der endothelialen NO-Synthase assoziiert ( Giaid, 1995 ).

In der vorliegenden Arbeit wurde evaluiert, ob Bedingungen, die bei pulmonaler Hypertonie auftreten, eine Abnahme der endothelialen NO-Synthase in menschlichen pulmonalen Endothelzellen hervorrufen können und ob diese Faktoren sich gegenseitig in der Wirkung verstärken.

Die Daten zeigen klar, daß proinflammatorische Mediatoren, Interleukin-1, Tumor Necrosis Factor und Lipopolysaccharid von Pseudomonas aeroginosa, eine Verringerung der eNOS mRNA und des eNOS Protein Expression hervorrufen und diesen Effekt unter Hypoxie steigern. Unter den gleichen Bedingungen wurde eine Induktion von vasokonstriktiven und proliferationssteigernden Mediatoren - Endothelin-1 und Interleukin-8 - nachgewiesen. Daß heißt, unter Hypoxie und proinflammatorischer Stimulierung kommt es zu einer reziproken Regulation entscheidender Mediatoren der Gefäßwand im pulmonalen System und zu einer Verschiebung der physiologischen Balance zugunsten der Vasopressoren und Wachstumsstimulatoren. Dieses pathologische Gleichgewicht scheint auf transkriptioneller Ebene fixiert zu sein. Es konnte gezeigt werden, daß dieser Effekt zeitabhängig ist und nach 96 Stunden (bzw. 48 Stunden bei ET-1 und IL-8 ) sein Maximum erreicht.

Spekulativ bleibt, ob die Supression des Vasodilators NO und die Induktion der Vasokonstriktoren ET-1 und IL-8 einen neuen ”steady state“ darstellt oder ob es sich um eine transiente Störung der Genregulation handelt mit der Möglichkeit einer Gegensteuerung bzw. der Induktion antagonistischer Transkriptionsfaktoren. Berichte über die Induktion der endothelialen NO-Synthase nach verlängerter Hypoxie in der Rattenlunge (Shaul, 1995) sind für das menschliche pulmonale System nur begrenzt übertragbar, wobei festzuhalten ist, daß durch die Untersuchung einer Endothelzell-Monokultur in vitro möglicherweise beeinflussende Wechselwirkungen in vivo ausgeschlossen bleiben.

Durch die Experimente ungeklärt ist die Frage, ob es sich bei dem Abfall der eNOS mRNA um eine transkriptionelle und/oder posttranskriptionelle Kontrolle der Expression handelt und ob die de novo-Synthese eines Transkriptionsfaktors beteiligt ist. Versuche mit Actinomycin D und Cycloheximid wurden nicht durchgeführt. Phelan, 1996 ) zeigten, daß in Anwesenheit von Actinomycin D keine Supression der eNOS Transkripte erfolgte und schlossen daher auf eine notwendige Induktion eines reprimierenden Transkriptionsfaktoren unter Hypoxie. Für die TNF -stimulierte Reprimierung wurde vorgeschlagen, daß sie zumindest zum Teil durch die posttranskriptionelle Destabilisierung der eNOS mRNA

27

Die als internen Standard zur mRNA-Quantifizierung gemessene Expression der mRNA des glykolytischen Enzyms Glyzerinaldehyde-3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH) war unter allen Versuchsbedingungen konstant. Eine Induktion durch Hypoxie, wie von Graven, 1994 beschrieben, konnte nicht beobachtet werden und die Berrechnung der mRNA-Menge konne somit verifiziert werden.

Ein Vergleich der Kinetik der Regulation der eNOS mRNA mit der des Proteins unter Hypoxie legt nahe, daß die Reprimierung des Proteins stärker als die der mRNA-Transkription ist. Ein möglicher Mechanismus könnte eine posttranslationelle Destabilisierung des Proteins sein, die auch die beobachtete ”Induktion“ unter Hypoxie nach 48 h als intermittierende ”Stabilisierung“ erklären würde. Erwähnt werden muß in diesem Zusammenhang, daß die Sensitivität bzw. die Quantifizierung der Proteinmenge mit der Methode des ”western blotting“ eingeschränkt ist.

Wahrscheinlich ist die katalytische Funktion der NO-Synthase ein weiteres Angriffsziel der hypoxischen Steuerung der NO-Bildung, die die physiologische Relevanz der Kontrolle bestimmt. Von den drei Kosubstraten der eNOS (L-Arginin, NADPH und O₂) ist für L-Arginin die Möglichkeit des Substratmangels durch Hemmung der Biosynthese aus L-Zitrullin unter Hypoxie beschrieben worden ( Su, 1995 ). In den Experimenten konnte diese Möglichkeit ausgeschlossen werden, da das Endothelzellbasalmedium L-Arginin enthält. Obwohl naheliegend, ist die Sauerstoffkonzentration unter der 3%igen Hypoxie nicht Reaktionsgeschwindigkeit-limitierend. Im hypoxischen Medium liegt die Sauerstoffkonzentration ca. bei 36 µmol und der k_m-Wert von O₂ für die eNOS wird mit ca. 7,7 µmol angegeben ( Rengasamy, 1996 ). Für pathophysiologische Bedingungen, die eine niedrigere Sauerstoffkonzentration im Gewebe involvieren, ist eine Abschwächung der NO-Produktion aber möglich. Ausgleichend könnte das Potential zur Endprodukthemmung wirken (Ausschluß der negativen Rückkopplung durch NO unter Hypoxie) ( Ravichandran, 1995 ). In den Versuchen korrelierten die aus den Überständen der Zellkulturen bestimmten NO₂/NO₃-Konzentrationen (Metaboliten des NO) mit der Kinetik der Proteinregulation (Daten nicht gezeigt). (Dem liegt die Annahme zugrunde, dass es sich bei dem gemessenen NO ausschließlich um von der eNOS produziertes NO handelt, da keine iNOS mRNA in den HPAEC detektierbar war.)

Betonen möchte ich die funktionelle Eigenheit der pulmonal-arteriellen Endothelzellen. Es gibt große phänotypische Differenzen zwischen Endothelzellen, die von verschiedenen Spezies, Geweben oder Organen isoliert werden. So ist in mikrovaskulären Endothelzellen aus dem Herz (CMEC) von Ratten keine eNOS nachweisbar ( Balligand, 1995 ). Bedeutung gewinnt obige Feststellung bei der differenzierten Expression von eNOS versus iNOS (inducible NOS). In Endothelzellen von Ratten stimuliert IL-1 die Produktion von NO₂/NO₃ ( Kanno, 1994 ). Die Analyse mittels ”northern blotting“ zeigte die Induktion von iNOS mRNA ( Kanno, 1994 ). Menschliche Endothelzellen aus der Aorta (AOEC) hingegen besitzen unter IL-1 Stimulation keine detektierbare iNOS Aktivität ( MacNaul, 1993 ), die eNOS mRNA wurde unter den gleichen Bedingungen reprimiert. Bovine Endothelzellen aus der Aorta (BAEC), über 24 h einer 1%igen

28

Die unter Hypoxie und Inflammation unterdrückte NO-Freisetzung aus den Endothelzellen verhindert die von NO verursachte Dilatation der glatten Muskelzellen (vascular smooth muscle cells, VSMC ) durch die fehlende Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase und folgendem niedrigen cGMP Spiegel in den VSMC ( Abb. 8 ). Möglich ist, daß dieser Effekt durch folgende Gegensteuerungsmöglichkeiten abgeschwächt werden kann. (1) IL-1 stimuliert in den VSMC die iNOS Expression und erhöht daher den intrazellulären NO und in der Folge den cGMP Spiegel ( Spink, 19 95). (2) Hypoxie induziert in den VSMC das Hämoxygenase-1 (HO-1) Gen ( Morita, 1995 ). Die HO-1 katalysiert die Bildung von Kohlenmonoxid (CO), welches ebenfalls die Guanylatzyklase stimuliert. (3) Die hypoxische Regulation von ET-1 in den Endothelzellen steht unter negativer Kontrolle des in den VSMC gebildeten CO ( Morita, 1995 ).

In den kultivierten pulmonal-arteriellen Endothelzellen konnte keine cGMP -Aktivität gemessen mit einem RIA (radio immuno assay) unter Ruhebedingungen und unter Stimulation mit einem Ca²⁺-Ionophor (A 23187) oder einem NO-Donor (Na²⁺-Nitroprussid) nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Die physiologische Relevanz ist unklar, könnte aber in Hinblick auf das oben gesagte bzw. das in der Abbildung 10 vorgeschlagene Modell der parakrinen Wirkungsweise des endothelialen NO (keine iNOS !) bedeutsam sein.

Stewart, 1991 ) maßen in der Arteria pulmonalis von Patienten mit pulmonaler Hypertonie erhöhte Endothelin-1 Plasmaspiegel und stellten die Frage, ob ET-1 Marker oder Mediator der pulmonalel Hypertonie sei. Die vorliegenden Daten stützen die Theorie, wonach die Induktion von vasopressiven und -modulierenden Genen wie ET-1 und IL-8 , auslösbar durch eine in vivo Situation simulierenden Bedingungen (Hypoxie und Entzündung), ursächlich am Pathomechanismus des ”vascular remodeling“ - des fehlregulierten Wachstums - beteiligt sind (s. a. Giaid, 1995 ). Weitere Gefäß-modulierende, angiogenetische und durch Hypoxie in Endothelzellen stimulierbare Faktoren sind gut charakterisiert worden, vor allem der vascular endothelial growth factor (VEGF; Shweiki, 1992 ).

29

Abbildung 10: Vereinfachtes Flussdiagramm der Kontrolle der endothelialen NO Synthase bzw. der (parakrinen) Regulation der Relaxation der glatten Gefäßmuskelzellen durch NO. Agonisten wie Acetylcholin, Bradykinin oder mechanische Stimuli wie ”shear stress“ induzieren die NO Synthase durch eine Erhöhung des intrazellulären Ca²⁺-Spiegels. Eine Steigerung der NO Konzentration in der Endothelzelle ist die Folge. Das NO diffundiert in die umliegenden glatten Muskelzellen und stimuliert dort die zytoplasmatische Guanylatzyklase. Der erhöhte cGMP Spiegel in den Muskelzellen ist für deren Relaxation verantwortlich. Eine verminderte Expression der eNOS mRNA unter Hypoxie und durch proinflammatorische Stimuli verhindert die Dilatation des Gefäßes.

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.