Borrmann, Steffen: Regulation der endothelialen NO-Synthase unter Hypoxie und proinflammatorischer Stimulation in pulmonal-arteriellen Endothelzellen

Aus der Abteilung für Pneumologie des Universitätsklinikums Charité der Humboldt-Universität zu Berlin Direktor PD. Dr. Ch. Witt und der Abteilung für Pulmologie des Allgemeinen Krankenhauses der Universität Wien Direktor Prof. Dr. L.-H. Block


Dissertation
Regulation der endothelialen NO-Synthase unter Hypoxie und proinflammatorischer Stimulation in pulmonal-arteriellen Endothelzellen

Zur Erlangung des akademischen Grades doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité, der Humboldt-Universtät zu Berlin

von Herrn Steffen Borrmann ,
geb. am 27. 09. 1970 in Görlitz

Dekan: Prof. Dr. med. M. Dietel

Gutachter:
Prof. Dr. Wauer, Charité, Kinderklinik
Prof. Dr. Kühn, Humboldt-Universität, Fachbereich Biochemie
PD Dr. Schneider-Mergener, Charite, Immunologie

eingereicht: Februar, 1998

Datum der Promotion: 9. Oktober 1998

Zusammenfassung

Die Lage des Endothels zwischen dem Blutkompartment und den reagierenden glatten Gefässmuskelzellen prädisponiert zu einer interaktiven Rolle in der Regulation des Blutdruckes und -flusses. Wachsende Beweise zeigen eine Schlüsselstellung des für den endothelium-derived relaxing factor (EDRF) verantwortlich gemachte Stickstoffmonoxid ( NO ) in dem Prozess des Aufrechterhalten einer niedrigen Gefässspannung und Blutdruckes. Das katalysierende Enzym ist die endotheliale NO-Synthase.

Chronische Hypoxie und inflammatorische Stimulation wurden als Bedingungen beschrieben, die zu einer pulmonalen Hypertonie und einer Gefässhypertrophie (vascular remodeling) der Arteriolen führen.

Ich habe die Frage untersucht, ob die endotheliale NO-Synthase ( eNOS ) einer Kontrolle durch diese Faktoren unterliegt.

Dazu wurde eine Kultur von humanen pulmonal-arteriellen Endothelzellen etabliert und deren Verhalten unter den oben beschriebenen Bedingungen im Vergleich zu Kontrollbedingungen getestet. Zu verschiedenen Zeiten (nach 24, 48 bzw. 96 Stunden) wurden jeweils die Gesamt-RNA und -Proteinmenge aus den Zellen isoliert und die eNOS - mRNA und die eNOS -Aktivität spezifisch mittels northern und western blotting semiquantitativ bestimmt. Zusätzlich wurde die mRNA-Expression von vasokonstriktiven bzw. -proliferativen Mediatoren (Endothelin-1 und Interleukin-8) mit spezifischen northern blotting beobachtet.

Die Versuche zeigten einen Abfall der eNOS -Aktivität und eine Expression von potenten Vasokonstriktoren und Wachstumsfaktoren unter niedrigen Sauerstoffkonzentrationen und Stimulation mit proinflammatorischen Mediatoren ( IL-1 beta, LPS und TNF alpha). Die Ergebnisse schlagen weiter vor, dass die Regulation der eNOS -Aktivität auf transkriptioneller Ebene besteht, da die eNOS -mRNA bis auf nicht mehr detektierbare Mengen reduziert wird. Die Effekte werden durch gemeinsame Stimulation mit Hypoxie und proinflammatorischen Mediatoren verstärkt.

Die Bedeutung einer wirkungsvollen Therapie der pulmonalen Hypertonie ist groß. Die inhalative NO-Substitutionstherapie findet bereits Anwendung im intensivmedizinischen Bereich zur Therapie des ”acute respiratory distress syndrom“ (ARDS; Weitzberg, 1993 ), in der Neonatologie zur Therapie der ”persistent pulmonary hypertension of the newborn“ (PPHN; Roberts, 1992 ) und in der Pulmologie zur Senkung einer bestehenden pulmonalen Hypertonie ( Pebke-Zaba, 1991 ).

Ein therapeutischer Ansatz, der auch durch diese Arbeit vorgeschlagen wird, stellt eine pharmakologische Manipulation dar, die das gestörte Gleichgewicht der Genregulation wiederherstellen kann. Potentielle Wirkstoffe sind körpereigene Hormone bzw. deren Derivate (Estrogenderivate), die ein Aufrechterhalten der Basisexpression der eNOS bewirken. Antagonisten der vasokonstriktorischen Mediatoren können einen helfenden Effekt besitzen.

Eine offene Frage ist ebenfalls: Bestehen Mutationen der eNOS , die zu der Ausbildung einer pulmonalen Hypertonie prädisponieren? Wenn das der Fall ist, und eine Diagnose dieses Defektes bei Risikopatien-

ten möglich ist, könnte durch eine früh begonnene Therapie mit einem pharmakologischen Aktivator der eNOS der Entwicklung einer fixierten Hypertonie entgegengewirkt werden.

Schlagwörter:
Lunge, Endothel, Stickstoffmonoxyd, Hypertonie

Abstract

Regulation of the endothelial nitric oxide synthase under hypoxia and proinflammatory stimulation in human pulmonary artery endothelial cells

Endothelium-derived relaxing factor is thought to produce and maintain vascular relaxation. Nitric oxide accounts for the biological activity of EDRF and is produced by the endothelial nitric oxide synthase. Chronic hypoxia and proinflammatory stimulators such as LPS (Lipopolysaccharides from Pseudomonas aeroginosa) and Il-1beta (Interleukin-1beta) have been shown to produce pulmonary hypertension and to induce vascular remodeling of small pulmonary arteries in animal models (Rabinovitch, 1979 and Graham, 1990). The purpose of this study was to characterize the influence of these factors on the regulation of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in human pulmonary artery endothelial cells (HPAEC). To adress this question I established a culture of HPAEC and exposed the cell lines to hypoxia (3% O2), Il-1beta, TNFalpha and LPS either alone or to hypoxia in combination with Il-1beta, TNFalpha or LPS. The mRNA and whole protein were extracted to the following time points: 24, 48 and 96 hours after begin of exposion. The eNOS mRNA and protein expression were analyzed using northern and western blotting techniques. Additionally, monitoring of the mRNA expression of the vasoconstructive and vasoproliferative mediators endothelin-1 (ET-1) and interleukin-8 (Il-8) were performed using northern blotting. The presented data show that hypoxia and proinflammatory stimulators as well as the combination of both induce a downregulation of the eNOS protein. The parallel downregulation of the eNOS mRNA strongly suggests that this regulation takes place at the transcriptional level. The same stimuli upregulate the ET-1 and Il-8 mRNA.

These findings indicate that the reciprocal regulation of vasodilators and vasoconstrictors contribute to the pathomechanisms involved in the development of pulmonary hypertension.

Keywords:
lung, endothel, nitric oxide, hypertension


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteRegulation der endothelialen NO-Synthase unter Hypoxie und proinflammatorischer Stimulation in pulmonal-arteriellen Endothelzellen
1 Einführung
1.1.Pulmonale Hypertension: Pathogenese und Ätiologie
1.2.NO - ein physiologischer Mediator und Effektor des Endothels
1.3.Endotheliale versus induzierbare NO Synthase
1.4.Endotheliale NO-Synthase - Vermittler der basalen Gefäßdilatation
1.5.Regulation der eNOS
1.6.Kritische Balance der Zytokine und Wachstumsfaktoren.
2 Hypothese
3 Material und Methoden
3.1.Zellisolation und Zellkultur
3.2.Charakterisierung der Zellen
3.3.Vitalitätstest der Zellen
3.4.Proteinextraktion
3.5.RNA-Extraktion
3.6.cDNA-Sonden
3.7.mRNA-Analyse
3.8.Proteinanalyse
4 Ergebnisse
4.1.Hypoxie-induzierte, zeitabhängige Abnahme der eNOS mRNA und des eNOS Proteins
4.2.IL-1beta und LPS verringern die Expression der eNOS mRNA und des eNOS Proteins zeitabhängig
4.3.Proinflammatorische Mediatoren verstärken die Unterdrückung der Expression der eNOS mRNA und des eNOS Proteins unter Hypoxie
4.4.Hypoxie, IL-1beta und TNF stimulieren die Expression von Endothelin-1 mRNA
4.5.IL-1beta und TNFalpha induzieren IL-8 mRNA allein und synergistisch mit Hypoxie
4.6.Keine iNOS nachweisbar
5 Diskussion
6 Zusammenfassung
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen
Danksagung
Bibliographie Literaturverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Vereinfachtes Modell der allosterischen Regulation der endothelialen ”konstitutiven“ NO Synthase. Die Bindung der Kofaktoren FAD (Flavinadenindinucleotid) und FMN (Flavinmononukleotid) überführt die inaktiven NOS Monomere in ein inaktives Dimer, an den als weitere prostethische Gruppen Häm und Tetrahydrobiopterin (BH4) und das Substrat L-Arginin binden. Ausgelöst durch die Erhöhung des intrazellularen Ca2+-Spiegels ändert der gebundene Ca2+/Calmodulinkomplex die Konformation des inaktiven Dimers hin zu seiner katalytisch aktiven Form. Dieser Prozess dauert nur Minuten.
Abbildung 2: Pulmonal-arterielle Endothelzellen in konfluenter Kultur. Aufsicht mit 20facher Vergrösserung im Phasenkontrastlicht.
Abbildung 3: Charakterisierung der Endothelzellkultur mittels indirekter Immunfloureszenz (Anti-von Willebrand-Faktor). Gleicher Ausschnitt wie Abb. 2.
Abbildung 4: Analyse der eNOS mRNA Expression in HPAEC mittels ”northern blotting“ unter Normoxie (N) oder Hypoxie (H) allein (Medium) bzw. den zusätzlichen proinflammatorischen Stimuli Interleukin-1beta (IL-1beta) oder Lipopolysaccharid (LPS) von Pseudomonas aeroginosa. Die Analyse der GAPDH mRNA Expression diente als interner Standard. Zeitpunkte der Messungen waren 24, 48 und 96 Stunden. Die Extraktion und die Analyse der mRNA erfolgte wie unter Material und Methoden beschrieben.
Abbildung 5: Auswertung der relativen Induktion der eNOS mRNA mittels Densitometrie der Banden im ”northern blot“ und Normalisierung zu GAPDH.
Abbildung 6: Analyse der eNOS Protein Expression in HPAEC mittels western blotting. Die Zellen waren entweder unstimuliert oder stimuliert mit Interleukin-1beta (IL-1beta) oder Lipopolysaccharid (LPS) von Pseudomonas aeroginosa jeweils in Kombination mit Normoxie (N) oder Hypoxie (H). Zeitpunkte der Messungen waren 24, 48 und 96 Stunden. Der eNOS Marker ist mit ”M“ gekennzeichnet. Die Extraktion und die Analyse des Proteins erfolgte wie unter Material und Methoden beschrieben.
Abbildung 7: Densitrometrische Auswertung der eNOS Proteinanalyse.
Abbildung 8: Analyse der Endothelin-1 (ET-1) und Interleukin-8 (IL-8) mRNA Expression in HPAEC mittels ”northern blotting“. Die Zellen wurden unter Normoxie (N) oder Hypoxie (H) mit Interleukin-1beta (IL-1beta), Lipopolysaccharid (LPS) von Pseudomonas aeroginosa oder Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha) stimuliert. Normoxie und Hypoxie ohne Stimulierung bilden die Ausgangsbedingungen (Medium). Als interne Kontrolle ist die GAPDH mRNA Analyse gezeigt.
Abbildung 9: Densitrometrische Auswertung der ET-1 mRNA Expression in HPAEC normalisiert zu GAPDH unstimuliert sowie unter Stimulation mit LPS, TNFalpha und IL-1beta. Normoxische Bedingungen werden durch weiße, hypoxische durch schwarze Balken angezeigt.
Abbildung 10: Vereinfachtes Flussdiagramm der Kontrolle der endothelialen NO Synthase bzw. der (parakrinen) Regulation der Relaxation der glatten Gefäßmuskelzellen durch NO. Agonisten wie Acetylcholin, Bradykinin oder mechanische Stimuli wie ”shear stress“ induzieren die NO Synthase durch eine Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Spiegels. Eine Steigerung der NO Konzentration in der Endothelzelle ist die Folge. Das NO diffundiert in die umliegenden glatten Muskelzellen und stimuliert dort die zytoplasmatische Guanylatzyklase. Der erhöhte cGMP Spiegel in den Muskelzellen ist für deren Relaxation verantwortlich. Eine verminderte Expression der eNOS mRNA unter Hypoxie und durch proinflammatorische Stimuli verhindert die Dilatation des Gefäßes.

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