Brachold, Ralf: “DNA-Polymorphismus des endothelialen leukozytären Adhäsionsmoleküls bei Patienten älter als 50 Jahre mit interventionsbedürftigen Koronararterienstenosen“

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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1. Patienten

Zwischen September und Dezember 1995 unterzogen sich 53 Patienten (männlich = 45, weiblich = 8) mit koronarer Herzkrankheit den nachfolgend beschriebenen Untersuchungen. Das Alter der beobachteten Personen, bezogen auf den Untersuchungszeitraum, betrug mehr als fünfzig Jahre. (Durchschnitt:63,038; Median:63 Jahre). Die Symptomatik mit Angina pectoris-Beschwerden und die charakteristischen Veränderungen im Ruhe- bzw. Belastungselektrokardiogramm in Form von horizontalen oder deszendierenden ST-Streckensenkungen, T-Negativierungen bzw. ST-Streckenhebungen führten zur Erkennung der koronaren Herzkrankheit bei den Beobachteten ( siehe ). 30 der Betrachteten (männlich = 24, weiblich = 6) erlitten vor ihrem Krankenhaus-aufenthalt einen Myokardinfarkt. Dieser konnte zusätzlich zum klinischen Befund und den schon genannten EKG-Veränderungen durch den typischen Anstieg der Serumenzyme Creatinkinase (CK), myokardspezifischer Creatin-kinase (CK-MB), der Aspartat-Aminotransferase (ASAT) und der Alanin-Amino-transferase (ALAT) sowie des Myoglobins (MYO) gesichert werden ( siehe ). Um die Diagnose koronare Herzkrankheit zu verifizieren und das weitere therapeutische Vorgehen festzulegen, erfolgte bei allen Patienten eine Herzkatheteruntersuchung mit Laevokardiografie (Ventrikulografie) und selektiver Koronarangiografie. Bei der Darstellung der Herzkranzarterien mittels Kontrastmittel zeigten sich bei allen Probanden hämodynamisch wirksame Stenosen von über fünfzig Prozent des Lumens mindestens einer Koronar-arterie aufgrund einer atherosklerotisch bedingten koronaren Herzkrankheit. Diese Befunde erforderten ein interventionelles Vorgehen zur Verbesserung der koronaren Durchblutung und somit Erhöhung der ventrikulären Pumpfunktion, die zur Steigerung der Lebenserwartung und Senkung der Mortalität der betroffenen Personen beiträgt ( siehe ). Die Art der Behandlung wurde nach der Morphologie der Herzkranzarterien, der Lage der nachgewiesenen Verengung im koronaren Strombett und der allgemeinen Klinik der Patienten gewählt. Zur Anwendung kam entweder ein kardiologisch-interventionelles Verfahren, meist in Form einer perkutanen transluminalen Koronarangioplastie, oder ein kardiochirurgischer Eingriff in Form einer koronararteriellen Bypassoperation. Die Einschlußkriterien waren somit definiert als :

  1. Alter > 50 Jahre
  2. interventionsbedürftige KHK

Nach Erfüllung dieser Kriterien erfolgten die weiteren Erhebungen dieser Studie. Dazu gehörten:

  1. Patienteninterview
  2. spezifische Blutanalysen.

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3.2. Patienteninterview

Während des anamnestischen Gespräches sollten folgende Punkte eruiert werden:

Eigenanamnese

Angina pectoris

Ja / Nein

Wenn ja, seit wann ?

Myokardinfarkt

Ja / Nein

Wenn ja, wann ?

Bypassoperation

Ja / Nein

 

PTCA

Ja / Nein

 

Familienanamnese

Hypertonus

Ja / Nein

Herzkrankheiten

(Angina pectoris / Myokardinfarkt)

Ja / Nein

Des weiteren gaben die Befragten Auskunft über allgemeine Risikofaktoren der koronaren Herzkrankheit ( siehe , siehe ), welche zur Komplettierung der Anamnese beitrugen.

Risikofaktoren

Nikotinabusus

Ja / Nein

Wenn ja, seit wann ?

Wenn ja, wieviel ?

Arterielle Hypertonie

Ja / Nein

Wenn ja, seit wann ?

Wenn ja, wie hoch ?

Body Mass Index

(Körpergröße / Körpergewicht)

   

Die Eintragung der erfragten Sachverhalte in das Studienprotokoll beendeten das Interview. Nach Abschluß des Patientengespräches, der Aufklärung über die Teilnahme an der Studie und der Einwilligung durch den Probanden erfolgte eine venöse Blutentnahme. Durch Punktion einer peripheren Vene konnten:

  1. 10 ml Nativblut
  2. 10 ml EDTA-Blut

gewonnen werden.


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3.3. Blutanalyse

3.3.1. Biochemische Untersuchung

Das Nativblut wurde einer klinisch-chemischen Analyse zugeführt. Hierbei sollte in erster Linie eine Fettstoffwechselstörung aufgedeckt werden. Die Bedeutung dieser Stoffwechselstörungen bei der Entstehung der Atherosklerose konnten zahlreiche Studien hinreichend belegen ( siehe ). Zudem trug die Bestimmung des Nüchternblutzuckers zur Erkennung eines Diabetes mellitus bei. Mit dem Gerät BM/Hitachi 747 der Firma Hitachi und den entsprechenden Reagenzien der Firma Boehringer/Mannheim ließen sich:

  1. der Cholesterin-,
  2. der Triglycerid-,
  3. der Glucose-,
  4. der HDL-Cholesterin- und
  5. der Lipoprotein(a)-spiegel

ermitteln.

Bei der Bestimmung des Cholesteringehaltes kam die Cholesterinoxidase-PAP-Methode zur Anwendung ( siehe ). Zur Kontrolle des Triglyceridwertes diente die Glycerinphosphatoxidase-PAP-Methode ( siehe ). Die Höhe der Blutglucose ließ sich mit dem Hexokinase-Verfahren nachweisen ( siehe ). Mittels der Phosphorwolframsäure-Fällung und anschließender Cholesterinoxidase-PAP-Bestimmung ist der HDL-Cholesterinspiegel festgestellt worden ( siehe ). Die Bestimmung des Lipoproteins(a) war mit der Immunturbidimetrie durchfürbar ( siehe , siehe ). Um die biochemische Analyse zu vervollständigen und das atherogene Potential zu quantifizieren, sollte auch die Bestimmung des LDL-Cholesterinspiegels erfolgen. LDL-Cholesterin ließ sich rechnerisch aus dem Gesamt-Cholesterin, den Triglyceriden und dem HDL-Cholesterinwert mit Hilfe der Friedewald-Formel :

LDL-Chol. = Chol. _ HDL-Chol. _ (TG : 2,2) (mmol/l)

LDL-Chol. = Chol. _ HDL-Chol. _ (TG : 5) (mg/dl)

ermitteln ( siehe ). Diese Näherungsformel durfte zur Anwendung kommen, wenn es sich um Nüchternserum ohne Chylomikronen handelte und die Triglyceride unter 5 mmol/l (500 mg/dl) lagen ( siehe ). Da bei dieser Studie die Friedewald-Formel angewandt wurde, lassen sich auch fehlende LDL-Werte erklären, da in diesen Fällen der Triglyceridspiegel über dem zulässigen Wert von 5 mmol/l (500 mg/dl) gelegen hat. Nach Abschluß der biochemischen Analyse wurden die Parameter zur weiteren Erfassung in das Studienprotokoll eingetragen.


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3.3.2. Molekularbiologische Analyse

Das EDTA-Blut wurde einer genetischen Untersuchung unterzogen. Sie diente der Erkennung der S128R-Mutation der EGF-Domäne des E-Selectins, welcher kürzlich in einer klinischen Studie mit dem Auftreten einer vorzeitigen Atherosklerose assoziiert werden konnte ( siehe , siehe ). Dazu gehörten:

  1. DNA-Präparation
  2. Polymerasekettenreaktion
  3. Single-strand-conformation-polymorphism-Gel-Elektrophorese
  4. Silberfärbung des SSCP-Gels.

Bei der DNA-Präparation kam das Genomic-Tip-Kit der Firma QUIAGEN zur Anwendung. ”Blut ist eine komplexe Mischung aus Zellen, Proteinen, Metaboliten und vielen anderen Substanzen. Rund 45% des Blutvolumens besteht aus Zellen, davon sind 99% Erythrozyten. Erythrozyten und Thrombozyten (ca. 0,5% der zellulären Bestandteile) enthalten keine Zellkerne und sind somit für die Präparation der genomischen DNA unbrauchbar. Die einzigen Blutzellen, die Zellkerne besitzen und sich daher für die DNA-Präparation eignen, sind die Leukozyten (rund 0,3%).“ ( siehe )

Vor der Präparation mußten einige Puffer hergestellt werden, deren Zusammensetzung hier kurz dargelegt ist.

Puffer C1

Saccharose

320 mmol/l

(Zellyse-Puffer)

Magnesiumchlorid

5 mmol/l

ph 7,5

Tris-Base

10 mmol/l

 

Triton X-100

1 %

Puffer G2

GuHCl

800mmol/l

(Komplettlyse-Puffer)

EDTA

30 mmol/l

ph 8,0

Tris-Base

30 mmol/l

 

Tween-20%

5 %

 

Triton X-100

0,5 %

Puffer QBT

Natriumchlorid

750 mmol/l

(Equilibrationspuffer)

MOPS

50 mmol/l

ph 7,0

Ethanol

15 %

 

Triton X-100

0,15 %

Puffer QC

Natriumchlorid

1 mol/l

(Waschpuffer)

MOPS

50 mmol/l

ph 7,0

Ethanol

15 %

Puffer QF

Natriumchlorid

1,25 mol/l

(Elutionspuffer)

Tris-Base

50 mmol/l

ph 8,5

Ethanol

15 %


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Im ersten Schritt der Präparation erfolgte die Zellyse. Dazu mußte das Blut mit dem Puffer C1 und Aqua dest. gemischt und für zehn Minuten auf Eis inkubiert werden. Daran schloß sich eine Zentrifugation bei 1300 g und 4°C für eine Viertelstunde an. Nach Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren des Zellkernpellets wiederholte sich der ganze Vorgang. Danach wurde das Pellet im Puffer G2 gelöst und Protease (QUIAGEN) hinzugefügt. Durch Inkubation der Probe für ca. eine Stunde ließen sich die Zellkerne lysieren und die Proteine in kleinere Fragmente spalten. Der Puffer QBT diente im folgenden Schritt zum Equilibrieren des QIAGEN Genomic-Tips. Die Probe mußte nun in das equilibrierte Genomic-Tip appliziert werden, woraufhin zweimaliges Waschen des Tips mit dem Puffer QC durchfürbar war. Nachdem ein geeignetes Auffangröhrchen unter dem Genomic-Tip plaziert wurde, ließ sich die DNA durch den Puffer QF eluieren. ”Das Prinzip des QUIAGEN Genomic-Tip-Kits basiert auf einem patentierten Anionenaustauscherharz, welches in einem speziellen Vorgang auf ein makroporöses Silikatgel mit einer Partikelgröße von annähernd 100 µm aufgetragen wird. Die hohe Dichte von Anionenaustauschergruppen auf dem QUIAGEN-Harz führt zu einem ausgedehnten Separationsbereich (bis zu einer 1,6 M NaCl-Lösung) für doppelsträngige DNA, bei einem Elutionspunkt von ph 7,0. Konventionelle Anionenaustauscher, die auf Zellulose, Dextran oder Agarose basieren, besitzen dagegen nur einen Separationsbereich bis ca. 0,4 M NaCl-Lösung, an welchem die doppelsträngige DNA eluiert. Die Bindung und Elution vieler Substanzen ist somit auf einen engen Bereich der NaCl-Konzentration begrenzt. Da sich die Elutionshöhepunkte von Proteinen, RNA und DNA weitgehend überlagern ist eine zufriedenstellende Trennung nicht erreichbar. Somit sind die Separations- und Reinheitsqualitäten des QUIAGEN-Harzes weitaus höher als bei konventionellen Anionenaustauscherharzen.“ ( siehe )

Für weitere Angaben sei hier auf das QUIAGEN Genomic DNA Handbook July 1995 S.14/15, S.33-35, S.42-44 verwiesen ( siehe ). Anschließend erfolgte die Zugabe von Isopropanol zur Präzipitation der DNA. Nach Ultrazentrifugation bei 5000 g über 15 Minuten und Verwerfen des Überstandes wurde das DNA-Pellet getrocknet und zur Konservierung in einem geeigneten Puffer (in diesem Fall SSC-Puffer) gelöst. Zur Konzentrationsbestimmung mußte die Probe im Verhältnis 1:20 verdünnt und die Extinktion bei 260 nm ermittelt werden. Daraus ergab sich das Volumen an DNA-Lösung, um die in der nachfolgenden PCR erforderliche Menge von 250 ng einsetzen zu können.

Die Polymerasekettenreaktion diente der Amplifikation der zu untersuchenden DNA. ”Sie ist ein vielzyklischer Vorgang, der sich in drei Schritte pro Zyklus aufteilt. Im ersten Schritt (Denaturierung) wird die Ziel-DNA der Probe durch Hitzedenaturierung bei 95°C von doppelsträngiger nativer DNA in ihre zwei zueinander komplementären Einzelstränge gespalten. Der zweite Schritt (Annealing) ist die Hybridisierung der DNA-Einzelstränge mit zwei Oligonukleotiden (Primer), wovon jeweils eines zu einem der zu vermehrenden DNA-Einzelstränge komplementär sein muß. Dies geschieht bei Temperaturen von 37-65°C.“ ( siehe )


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”Im dritten Schritt (Extension) dienen die zuvor gebildeten Hybride als Synthesestart für ein DNA-bildendes Enzym, die Taq-Polymerase. Bei ihrem Temperaturoptimum von 72°C verlängert sie in Anwesenheit von überschüssigen Desoxyribonukleotiden die angelagerten Primer. Jeder angelagerte Primer ergibt einen neuen DNA-Einzelstrang. Nach der Bildung neuer komplementärer Einzelstränge startet ein weiterer neuer Zyklus. Das Prinzip der PCR besteht darin, daß neu synthetisierte DNA nach der Spaltung sofort wieder Ziele für Primer-Anlagerungen und deren Verlängerung sind und somit eine Amplifikation gewährleistet ist. Voraussetzung dafür sind der Überschuß an Primer und Desoxyribonukleotiden im Ansatz sowie die Thermostabilität der Taq-Polymerase.“ ( siehe ) Die PCR ließ sich mit dem PHC-3 Thermal Cycler der Firma Techne durchführen. Nach einer initialen Denaturierung für fünf Minuten bei 95°C, folgten 30 Zyklen:

Denaturierung

(30 Sekunden bei 95°C),

Annealing

(60 Sekunden bei 58°C) und

Extension

(60 Sekunden bei 72°C)

sowie eine abschließende Extension für fünf Minuten bei 72°C.

Im Reaktionsansatz (50 µl) waren enthalten:

DNA

250 ng

Kaliumchlorid

50 mmol

Tris-Puffer

10 mmol ph 9,0

Magnesiumchlorid

1,5 mmol

Desoxyribonukleotide (CTAG)

0,2 mol

Primer (auf- und abwärts)

15 pmol

Triton X-100

0,1 %

Taq-Polymerase

2,5 U

Die Primersequenzen der flankierenden Introns des Exons 4, welches für die EGF-Domäne des E-Selectins kodiert, sind die folgenden:

5´-Richtung : 5´-AGT AAT AGT CCT CCT CAT CAT G-3´

3´-Gegenrichtung : 5´-ACC ATC TCA AGT GAA GAA AGA G-3´ ( siehe , siehe ).

Die SSCP-Gel-Elektrophorese diente dem Nachweis der S128R-Mutation, indem die unterschiedliche Beweglichkeit der DNA-Einzelstränge von PCR-Produkten auf nicht denaturierenden Gelen ausgenutzt wurde. Das Prinzip erklärt sich wie folgt: Eine Einzelstrang-DNA hat in nicht denaturiertem Zustand eine gefaltete Struktur, die von ihrer Nukleotidsequenz abhängig ist. Bei Veränderungen in der Basenfolge, wie dies bei Punktmutationen der Fall ist, kann sich eine andere Faltung der DNA ergeben. Diese führt aufgrund variierter Beweglichkeit bei einer Gel-Elektrophorese zur Modifikation des Bandenmusters der DNA-Stränge. Durch ein Markierungsverfahren, wie zum Beispiel Silberfärbung, lassen sich die Banden sichtbar machen. Andere Methoden der Visualisierung sind radioaktive oder Fluoreszenz-Markierung der Primer.


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Durchführung:

a) Herstellung des 5%igen Polyacrylamid-Gels:

  1. saubere Glasplatten mit 96%igem Ethanol abreiben
  2. Slot-Platte mit Dichlorsilan silikonisieren
  3. Gel-Support-Film (QUIAGEN) auf der hydrophoben Seite mit Aqua dest. anfeuchten, auf die andere Glasplatte legen und durch das angebrachte Papier fest anstreichen
  4. Papier entfernen und Spacer auf die Slot-Platte legen
  5. beide Platten so zusammenlegen, daß der Film zwischen beiden Glasplatten an der offenen Seite hervorsteht, mit Klammern befestigen
  6. Gießen des Gels
  7. Polymerisation über eine Stunde in waagerechter Lage

Zusammensetzung der Gellösung:

Acrylamid

2,475 g

Bisacrylamid

0,025 g

TBE-Puffer

4,5 ml

Glycerol

2,5 ml

Aqua dest. auffüllen auf

50 ml

Ammoniumpersulfat

15 mg

TEMED (Tetramethyl-Ethylendiamin)

45 µl

Zusammensetzung des TBE-Puffers:

Tris

121,14 g

Borsäure

61,83 g

EDTA

7,5 g

Aqua dest. auffüllen auf

100 ml

b) Gel-Elektrophorese:

  1. Kryostat auf gewünschte Temperatur einstellen (12 bzw. 20°C) und zum Kühlen der Keramikplatte einschalten
  2. 1000 ml Laufpuffer in die seitlichen Pufferkammern füllen
  3. polymerisiertes Gel (auf Supportfilm) aus den Glasplatten herausnehmen
  4. 1-2 ml von tausendfach verdünntem Triton X-100 auf die Keramikplatte der Apparatur geben und Supportfilm blasenfrei auflegen
  5. als Verbindung zwischen Gel und Laufpuffer Schwammtücher je 1 cm breit auf das Gel auflegen und mit der Glasplatte abdecken, Kammerdeckel schließen und bei 10 Watt (300 V) ca. 20-30 min vorlaufen lassen (Prä-Elektrophorese)
  6. 1 µl PCR-Ansatz und 9 µl Formamid/EDTA (1 ml FA/EDTA = 960 µl FA + 40 µl 0,5 M EDTA) vortexen, fünf Minuten bei 95°C inkubieren, danach auf Eis geben und kurz darauf bei 9300 g einige Sekunden zentrifugieren
  7. je 5 µl der vorbereiteten Probe auf das SSCP-Gel auftragen
  8. zur Kontrolle des Gellaufs in eine Gelbahn 3 µl Farbstoff (Xylen-Cyanol) geben
  9. Probeneinlauf bei 10 Watt (300 V) für 15-20 min
  10. dann Lauf auf 25 Watt (500 V) hochregulieren bis der Farbstoff das Gelende erreicht hat (ca.3-4 h)

Zusammensetzung des Laufpuffers:

TBE-Puffer

180 ml

Glycerol

100 ml

Aqua dest. auffüllen auf

2000 ml


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Die Visualisierung erfolgte mittels Silberfärbung des SSCP-Gels ( siehe , siehe ). Dazu wurde eine Ethanol-Essigsäurelösung (10% Ethanol; 0,5% Eisessig) auf das Gel gegeben und dieses auf einem Horizontal-Wipptisch drei Minuten geschüttelt. Der ganze Vorgang mußte nach Verwerfen der verbrauchten Lösung wiederholt werden. Der zweite Schritt bestand aus der Inkubation des Gels in einer Silbernitratlösung (0,1% AgNO3) für zehn Minuten. Im dritten Teilabschnitt der Färbung ließ sich durch Zugabe einer Natriumhydroxid/ Natrium-Borhydrid/Formaldehyd-Lösung (1% NaOH; 0,01% NaBH4; 0,15% Formaldehyd) das an die DNA gebundene Silber sichtbar machen. Zur Fixierung der Gelbanden kam eine Natriumbikarbonatlösung (0,75% Na2CO3) zur Anwendung. Zwischen den einzelnen Schritten folgte nach Verwerfen der Lösungen eine ausgiebige Spülung mit Aqua destillata. Danach wurde das Gel entweder getrocknet oder feucht in Folie geschweißt.

3.4. Statistische Auswertung

Die statistische Datenanalyse erfolgte mit dem Statistikpaketprogramm SPSS für PC, Version 4.1. Die absoluten und relativen Häufigkeiten der kategorialen Merkmale wurden bestimmt. Mit dem U-Test nach Mann und Whitney sowie dem Rangsummentest nach Wilcoxon ließen sich folgende Merkmale hinsichtlich der Häufigkeit des Auftretens untersuchen:

  1. Lebensalter
  2. Body Mass Index
  3. Nikotinkonsum
  4. Blutglucose
  5. LDL-Cholesterin
  6. HDL-Cholesterin
  7. Lipoprotein(a)

Die Vergleiche bezüglich der Häufigkeit des Auftretens eines Merkmals ließen sich mit der Chi2-Kontingenztafel-Untersuchung nach Pearson durchgeführen. Dies betraf die Parameter:

  1. Geschlecht
  2. Myokardinfarkt
  3. Hypertonie
  4. Cholesterin
  5. Triglyceride
  6. Familienanamnese

Hierbei erfolgte die Testung auf Unabhängigkeit bzw. Homogenität. Einheitlich wurde als Signifikanzniveau für die Irrtumswahrscheinlichkeit p = 0,05 festgelegt ( siehe ).


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