Buchholz, Alexander: “Zirkulierende Thrombozyten im Rahmen der intraarteriellen digitalen Subtraktionsangiographie und der perkutanen transluminalen Angioplastie: Durchflußzytometrische Bestimmung der Aktivierung ex vivo und in vitro“

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Kapitel 1. Einleitung

1.1. PAVK

1.1.1. Definition

Die PAVK umfaßt stenosierende oder okkludierende Veränderungen der Aorta und der die Extremitäten versorgenden Arterien. Diese Veränderungen sind zu 95 % arteriosklerotisch bedingt und betreffen in ungefähr 90 % der Fälle die unteren Extremitäten. In etwa der Hälfte der Krankheitsfälle mit Durchblutungsstörungen der Beine liegt eine PAVK vom Oberschenkeltyp, in etwa 30 % vom Beckentyp und in 20 % vom peripheren Typ vor. Männer leiden an der PAVK bis zu fünfmal häufiger als Frauen. Von erheblicher klinischer Relevanz ist die Koinzidenz der PAVK mit zerebralen und kardialen Durchblutungsstörungen [ 19 ].

Die Existenz bestimmter Risikofaktoren begünstigt die Entwicklung einer PAVK: Zigarettenrauchen, arterielle Hypertonie, Hypercholesterinämie, Diabetes mellitus und Hyperurikämie sind gesicherte, allgemein anerkannte Risikofaktoren [ 8 , 19 ].

Ein wichtiges klinisches und für das Stadium II nach Fontaine charakteristisches Symptom der PAVK stellen belastungsabhängige Schmerzen dar. Bei Auftreten in den unteren Extremitäten werden sie als Claudicatio intermittens bezeichnet. Die Claudicatio intermittens macht sich nur bei Muskelarbeit, jedoch nicht in Ruhe bemerkbar und ist durch eine meßbare Belastung, z. B. eine bestimmte Gehstrecke, reproduzierbar auszulösen. Im Stadium IIa nach Fontaine beträgt die schmerzfreie Gehstrecke über 200 Meter, im Stadium II b liegt sie darunter [ 8 ]. Beim weiteren Fortschreiten der PAVK kommt es zu Ruheschmerzen (Stadium III) und schließlich zu trophischen Läsionen (Stadium IV).

1.1.2. Diagnostik

Bei Patienten mit einer PAVK werden neben der Anamnese-Erhebung und der klinischen Untersuchung zunächst nichtinvasive apparative Untersuchungstechniken (z. B. Duplexsonographie, Dopplerdruckmessung der Knöchelarterien, Bestimmung des brachiopedalen Druckgradienten, continuous-wave-Doppler der peripheren Gefäße und im Stadium II nach Fontaine Laufbandergometrie) angewendet [ 8 ]. Zur genauen Beurteilung von Gefäßstenosen bzw. -verschlüssen und weiteren invasiven Therapieplanung kommt am häufigsten die intraarterielle DSA der Aorta und der Becken- und Beinarterien zum Einsatz. Dabei wird nach perkutaner Punktion der Arteria femoralis communis in Seldinger-Technik über eine retrograd plazierte Schleuse ein Katheter in die Aorta abdominalis vorgeschoben, KM unter hohen Drücken eingespritzt und eine Serie von Röntgenbildern mit digitaler Bildverstärker-Fernseh-Technik erstellt und nachbearbeitet [ 87 ].


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1.1.3. Therapie

Neben der Minimierung bzw. Ausschaltung der wichtigsten Risikofaktoren gehören im Stadium IIb - IV nach Fontaine die Pharmakotherapie sowie lumeneröffnende Maßnahmen zu den allgemeinen Behandlungsprinzipien der PAVK [ 19 ]. In Abhängigkeit von der Klinik und der Lokalisation der Stenosen bzw. Verschlüsse hat sich als Methode der ersten Wahl zur Lumeneröffnung die PTA durchgesetzt, welche auf der Grundlage der Pionierarbeiten von Dotter, Grüntzig, Schneider und Wierny entwickelt wurde [ 8 , 66 ]. Bei der PTA wird in der Regel ebenfalls die Arteria femoralis communis punktiert, dann eine Schleuse plaziert und Heparin bis zu einer Menge von 10000 I. E. injiziert. Mittels eines Führungsdrahtes erfolgt die Überwindung der Stenose oder des Verschlusses. Nach Überprüfung der korrekten Lage des Drahtes unter angiographischer Durchleuchtungskontrolle läßt sich ein Ballon-Katheter in evakuiertem Zustand in die zuvor markierte stenosierte oder verschlossene Stelle des Gefäßes einführen. Durch Füllung des Ballons wirken Drücke bis zu 106 Pa, und das arteriosklerotische Verschlußmaterial wird infolge mehrmaliger Dilatationen in die Gefäßwand gepreßt. Unter Durchleuchtung mit KM ist es möglich, den Erfolg jeder Dilatationsserie zu kontrollieren. Zur Dokumentation der Ergebnisse werden im Anschluß an die PTA Kontrollangiogramme in DSA -Technik angefertigt [ 52 ].

Somit stellt die Angioplastie eine ”kontrollierte Verletzung“ der Gefäßwand dar. Dabei treten radiäre Einrisse in den arteriosklerotischen Plaques und der normalen Intima auf, und es kommt zu einer Überdehnung der Media. Die Überstreckung der Muskelfibrillen resultiert in einer permanenten örtlichen Ektasie. Die Dehiszenz zwischen steifer Plaque und elastischer Media wird als Dissektion bezeichnet und in ungefähr 50 % der Fälle auf Kontrollangiogrammen beobachtet. Der Heilungsprozeß ist nach ca. sechs Wochen abgeschlossen [ 31 ].

1.2. Bedeutung der Thrombozyten

1.2.1. Pathogenese der Arteriosklerose

Unter den verschiedenen Hypothesen zur Pathogenese der Arteriosklerose sind die ”Klon-Wachstums“-Theorie und die ”Inkrustations“- sowie die ”response-to-injury“-Hypothese am anerkanntesten [ 8 ]. Eine Endothelläsion kann den initialen Faktor arteriosklerotischer Umbauvorgänge darstellen. Vermutliche Auslöser sind erhöhte Serumcholesterinspiegel, Strömungsabnormitäten und chemische Reize wie Kohlenmonoxid. Die Endothelverletzung führt neben einer Thrombozytenanhaftung und lokalen Aktivierung des Gerinnungssystems zu einer Stimulation und Proliferation von Myozyten. PDGF wird von Endothelien, Thrombozyten, Myozyten und anderen Zellen freigesetzt, induziert eine unmittelbare Aktivierung und Aggregation weiterer


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Plättchen und fördert die Formation fibröser Plaques. Unter ungünstigen Bedingungen entwickelt sich in den Plaques infolge Sauerstoffmangels eine zentrale Nekrose, in deren Nachbarschaft sich Kalksalze ablagern. In fortgeschrittenen Stadien können die Plaques einreißen, so daß arteriosklerotische Läsionen entstehen, die dann von einem Thrombus abgedeckt werden. Verdickungen der Arterienwand durch Intimaödeme, die Proliferation glatter Muskelzellen und intraluminäre Thromben sind in der Lage, ein Gefäß bis zum völligen Verschluß einzuengen [ 19 , 37 ].

Es liegen Hinweise dafür vor, daß eine lokale Anlagerung von Thrombozyten auch an Gefäßwände mit strukturell intaktem, jedoch funktionell geschädigtem Endothel möglich ist, welches Adhäsionsmoleküle wie PECAM expremiert und nur unzureichende Mengen an EDRF freisetzt [ 68 ]. Weiterhin können Plättchen mittels Zytokinen wie CD 154 und IL -1 auf direktem Weg lokale entzündliche Reaktionen der Gefäßwand auslösen und arteriosklerotische Veränderungen beschleunigen [ 32 , 51 ].

1.2.2. Aktivierung der Thrombozyten

Sowohl in der Pathogenese der PAVK als auch infolge einer Angioplastie werden arteriosklerotische Plaques eingerissen und subendotheliale Strukturen freigelegt. Diese Strukturen führen besonders in stenosierten Gefäßregionen mit verringertem Blutfluß aufgrund ihrer hochgradig thrombogenen Eigenschaften zu einer starken Anlagerung und Aktivierung von Thrombozyten [ 7 , 12 ]. Gleichzeitig wird an der verletzten Stelle durch die Aktivierung des ex- und intrinsischen Gerinnungssystems Thrombin gebildet, welches einen starken Agonisten für die Plättchenaktivierung und einen mitogenen Faktor für verschiedene Zellen darstellt. Nach einer Läsion endothelialer Strukturen laufen folgende Prozesse ab [ 71 ]:

1. Adhäsion nichtaktivierter Plättchen an subendotheliale zytoadhäsive Proteine (Kollagen, vWF , Fibronektin, Laminin, Thrombospondin und Vitronektin)

Der Oberflächen-Rezeptor GP Ib-IX, ein Mitglied der LRG (Leuzinreiche GP) - Genfamilie der Thrombozyten, ist verantwortlich für die Adhäsion nichtaktivierter Plättchen an den vWF des Subendothels und für die indirekte Bindung von Thrombozyten an Kollagen [ 15 , 85 ]. Außerdem besitzt dieser Rezeptor Bindungsstellen für Thrombin und könnte aufgrund dessen eine Bedeutung für die Aktivierung zirkulierender Plättchen haben [ 61 , 71 ]. GPIb-IX ist thrombozytenspezifisch und daher für eine Markierung von Plättchen durch Antikörper gegen GPIb geeignet [ 1 ]. GPIb wird während der Aktivierung der Thrombozyten downreguliert [ 54 ] und spielt eine wichtige Rolle für die Aggregation von Plättchen, wenn sie hohen Schergeschwindigkeiten ausgesetzt sind [ 15 ]. Die Bindung von GPIb an vWF bewirkt eine Konformationsänderung des Rezeptors


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GPIIb/IIIa, welcher dadurch, aber auch durch den Kontakt mit Liganden und im Rahmen der Aktivierung seine funktionelle Form annehmen kann [ 86 ]. GPIIb/IIIa, ein kalziumabhängiger Rezeptor der Thrombozyten, gehört zur Genfamilie der Integrine und ist nach seiner Konformationsänderung in der Lage, Proteine wie Fibrinogen, vWF, Fibronektin und Vitronektin zu binden [ 15 , 49 ]. Andere am Prozeß der Adhäsion beteiligte Integrine der Thrombozyten sind der Fibronektin-Rezeptor GPIc/IIa, der Vitronektin-Rezeptor und GPIV, der keiner Genfamilie zugeordnet werden kann und vermutlich einen Thrombospondin-Rezeptor verkörpert [ 15 ]. Der Integrin-Rezeptor alpha2beta1 bindet im aktivierten Zustand spezifisch an lösliches Kollagen, einen anderen Kollagen-Rezeptor stellt wahrscheinlich GP VI dar [ 38 , 85 ].

2. Aktivierung adhäsiver Thrombozyten, welche proaggregatorische Substanzen wie ADP und Thromboxan A2 freisetzen

Nach der Anlagerung an Kollagen ändern die Thrombozyten ihre normale diskoide Gestalt, indem sie in eine sphärische Form übergehen. Dieser Prozeß wird durch Kontraktionen von Mikrofilamenten verursacht und beinhaltet wahrscheinlich auch eine Änderung in der Anordnung eines peripheren Bandes von Mikrotubuli. Dem Zusammenbau und der Interaktion von Aktinfilamenten folgt eine Ausbildung dendritischer pseudopodienartiger Zellausläufer, wodurch die Plättchen zum Ausbreiten (spreading) befähigt werden [ 15 ].

Die Kontraktion forciert den Ablauf der Sekretion, welche einen exozytotischen Vorgang beschreibt, bei dem in Granula gespeicherte Produkte in das den Thrombozyten umgebende extrazelluläre Milieu gelangen. Plättchen besitzen drei Arten von Speichergranula: a-Granula, Lysosomen und die dichten d-Granula. In den a-Granula sind Gerinnungsfaktoren, thrombozytenspezifische Proteine, Wachstumsfaktoren ( PDGF ) und GP (Thrombospondin, Fibronektin) enthalten, die Lysosomen speichern hydrolytische Enzyme und die d-Granula energiereiche Phosphate, Kationen sowie Serotonin. Im Rahmen der Exozytose verschmelzen die Membranen der Granula und Lysosomen mit der Plasmamembran der Thrombozyten, entleeren ihren Inhalt in den extrazellulären Raum und präsentieren neue spezifische Epitope auf der Oberfläche der Plättchen. Zu diesen Epitopen gehören die GP P-Selectin und LIMP - CD 63, welche aufgrund ihrer stimulierungsabhängigen Expression hervorragende Marker für die Aktivierung von Thrombozyten bei flußzytometrischen Messungen der extrinsischen Zellfluoreszenz darstellen [ 15 ].

P-Selectin, auch PADGEM , GMP -140 und CD62 genannt, gehört zur Genfamilie der Selektine und befindet sich bei ruhenden Plättchen in der Membran der a-Granula, konnte aber auch in Membranen der d-Granula, in den Palade-Weibel-Körperchen von Endothelzellen und in Zellen


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lymphatischer Gewebe nachgewiesen werden [ 53 , 61 ]. Die biologische Funktion dieses GP beruht wahrscheinlich auf seiner Eigenschaft, eine Bindung mit Leukozyten einzugehen, sie zu aktivieren und Zell-Zell-Interaktionen zu ermöglichen, die auch für die Pathogenese der Arteriosklerose von Bedeutung sein könnten [ 62 , 79 ].

Das GP LIMP-CD63 ist in der Membran der thrombozytären Lysosomen lokalisiert und scheint identisch mit ME491, einem Melanom-assoziierten Antigen, zu sein. Außerdem wurde seine Analogie mit einem neuroglandulären Antigen und mit Granulophysin, welches sich in den d-Granula der Plättchen befindet, nachgewiesen [ 60 ]. Weiterhin wird LIMP-CD63 von Granulozyten und Makrophagen sowie von lymphatischen Zellen expremiert [ 53 ]. Seine biologische Funktion ist noch nicht geklärt. Man vermutet, daß eine stark glykolysierte Domäne dieses Moleküls die Membranen der Granula in den Zellen vor enzymatischer Verdauung schützt [ 28 ].

3. Thrombinproduktion

Infolge der Aktivierung des ex- und intrinsischen plasmatischen Blutgerinnungssystems entsteht durch Komplexbildung der Prothrombinaktivator, welcher Prothrombin in Thrombin umwandelt. Thrombin stellt wie auch Kollagen und Trypsin einen starken Agonisten für die Plättchenaktivierung dar, forciert die Adhäsion von Thrombozyten an Endothelzellen über den Rezeptor GP IIb/IIIa und kann die Sekretion aller drei Arten von Speichergranula auslösen. Im Gegensatz dazu sind mäßige (Thromboxan A2) und schwache Agonisten ( ADP , Epinephrin, Vasopressin, Serotonin und PAF ) nur zum Triggern der Sekretion von a- und d-Granula befähigt [ 15 , 47 ].

4. Aktivierung weiterer Plättchen in der Umgebung der Läsion (durch Thrombin, ADP und Thromboxan A2), welche daraufhin Rezeptoren für Adhäsionsmoleküle exponieren

Die Freisetzung gespeicherter Produkte (vor allem ADP, Serotonin und Fibrinogen) aus Thrombozytengranula im Rahmen der Sekretion geht einher mit Änderungen der rheologischen Eigenschaften des Blutes in unmittelbarer Umgebung der Gefäßverletzung. Beide Prozesse führen zu einer Kollision nicht aktivierter mit aktivierten Thrombozyten und schaffen die Voraussetzungen für einen engen Kontakt zwischen den Zellen sowie die Formation von Plättchenaggregaten [ 15 ].

5. Akkumulation von Thrombozyten durch Plättchen-Ligand-Interaktionen

Hier steht neben anderen zytoadhäsiven Proteinen die Bindung von Fibrinogen und vWF an den Rezeptor GPIIb/IIIa an erster Stelle. Im Ergebnis dieser Bindung werden ”Proteinbrücken“ zwischen Thrombozyten ausgebildet, die auf diese Weise immer mehr vernetzten und Aggregate ausbilden [ 61 ].


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6. Stabilisierung des Plättchenthrombus durch Thrombin-katalysierte Fibrin-Formation

Die Prozesse Adhäsion, Kontraktion, Sekretion und Aggregation stellen die fundamentalen Mechanismen der Thrombozytenaktivierung dar und können relativ unabhängig voneinander ablaufen. Die Anzahl involvierter Plättchen, das Ausmaß ihrer individuellen Reaktion und die Menge der freigesetzten Sekrete sind abhängig von der Art und der Intensität des aktivierenden Stimulus und der Sensibilität der Thrombozytenpopulation [ 15 ].

1.2.3. Klinische Relevanz

Die Thrombozyten haben eine zentrale Bedeutung für die Pathogenese der PAVK . Weiterhin werden sie bei Patienten mit instabiler Angina pectoris, Myokardinfarkt und transitorischen ischämischen Attacken sowie nach angioplastischen und operativen Eingriffen als Verursacher okklusiver vaskulärer Komplikationen in Betracht gezogen [ 67 , 78 ]:

Es wurde nachgewiesen, daß eine starke Expression von P-Selectin auf die Aktivierung von Thrombozyten schließen läßt und einen Indikator für das Risiko akuter kardialer Komplikationen bei Patienten mit KHK darstellt [ 37 ]. Die Aktivierung von Plättchen durch eine lokale Schädigung von Gefäßen oder eine akute hämodynamische Störung ist das auslösende Ereignis für eine Okklusion von Koronararterien, in deren Folge sich ein Myokardinfarkt entwickelt. Es zeigte sich, daß Patienten nach einem Myokardinfarkt eine erhöhte Relativzahl zirkulierender aktivierter Thrombozyten mit einem vergrößerten Volumen und einer verstärkten Expression von LIMP - CD 63 aufweisen [ 24 , 74 ]. Außerdem führen PTCA [ 24 , 71 ] und Bypass-Operationen [ 5 , 58 ] zu einer Aktivierung zirkulierender Thrombozyten. Prospektive Studien erbrachten den Beweis, daß die Expression von P-Selectin und LIMP-CD63 Informationen für die Vorhersage okklusiver vaskulärer Ereignisse nach einer Angioplastie von Koronargefäßen liefert [ 83 , 36 ].

Für die Entstehung von Reokklusionen dilatierter Gefäße nach einer PTA werden wandständige Thromben sowie von Plättchen freigesetzte Wachstumsfaktoren ( z. B. PDGF ) verantwortlich gemacht. Die Formation der Thromben ist auf eine Anlagerung aktivierter Thrombozyten zurückzuführen, thrombozytäre Wachstumsfaktoren infiltrieren die Gefäßwände und induzieren eine Migration und Proliferation glatter Muskelzellen in der Media [ 56 ].


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