Buchholz, Alexander: “Zirkulierende Thrombozyten im Rahmen der intraarteriellen digitalen Subtraktionsangiographie und der perkutanen transluminalen Angioplastie: Durchflußzytometrische Bestimmung der Aktivierung ex vivo und in vitro“

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Kapitel 3. Patienten und Methoden

3.1. Zusammensetzung der Gruppen

Zur Studie gehörten 5 Patientengruppen:

  1. Die Kontrollgruppe ” KG 1“ schloß 16 stationäre Patienten mit einer PAVK ein, denen wir Blut aus der Cubitalvene entnahmen. An ihnen ließ sich die Thrombozytenaktivierung ohne den Einfluß des Fremdkörperkontaktes durch die Schleusen studieren, welche immer bei der PTA und der intraarteriellen DSA zum Einsatz kamen. Keiner dieser Patienten wurde während einer späteren Intervention untersucht.
  2. Die Kontrollgruppe ”KG2“ umfaßte 25 Probanden. Sie rekrutierten sich aus Patienten einer Station für gastrointestinale Erkrankungen und einer orthopädischen Station der Charité. Kein Patient litt an Hypercholesterinämie, Diabetes mellitus, Arteriosklerose, KHK und Lebererkrankungen. Außerdem wurde darauf geachtet, daß operative Eingriffe länger als zwei Wochen zurücklagen. Die arterielle Hypertonie war kein Ausschlußkriterium für die Zusammenstellung der Gruppe KG2, da bei hypertonen Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden keine relevante Aktivierung von Thrombozyten beobachtet wurde [ 3 ]. Die Durchführung der Blutabnahmen vollzogen wir unter denselben Bedingungen wie bei der Gruppe KG1. Hier untersuchten wir die Thrombozytenaktivierung an Probanden mit gesunden Gefäßen unter Ausschluß wichtiger Risikofaktoren für die PAVK.
  3. Die Gruppe ” KM “ setzte sich aus 24 PAVK-Patienten zusammen, bei denen eine intraarterielle DSA der Bauchaorta und der Arterien im Bereich des Beckens und beider Beine durchgeführt wurde. Die Meßergebnisse der Thrombozytenaktivierung dieser Patienten stammten von Blutentnahmen vor, direkt nach und 4 Stunden nach der DSA und waren in erster Linie vom Einfluß der Gefäß-Punktionen, des Heparins, des KM und des Fremdkörpermaterials der Schleusen abhängig.
  4. Die Gruppe ”PTA“ beinhaltete 22 PAVK-Patienten, welche einer PTA von iliacalen bzw. femoropoplitealen Arterien unterzogen wurden. Die Abnahmebedingungen entsprachen denen der Gruppe ”KM“. Ein zusätzlicher Einfluß auf die Meßergebnisse der Thrombozytenaktivierung bestand in der Dilatation von Gefäßwänden sowie in der Anwendung höherer Heparin- und geringerer KM-Mengen im Vergleich zur intraarteriellen DSA.

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  5. In die Gruppe ” KM und PTA “ wurden 10 Patienten mit PAVK eingeschlossen, bei denen wir jeweils die Folgen sowohl einer intraarteriellen DSA der Bauchaorta und der Becken- und Beinarterien als auch einer wenige Tage später durchgeführten PTA untersuchten. Diese 10 Patienten stammten aus der Gruppe ”KM“ bzw. ”PTA“ und sind mathematisch als zusammengefaßte Teilmengen dieser Gruppen aufzufassen.

Somit gab es 14 Patienten, an denen wir die Thrombozytenaktivierung nur während einer intraarteriellen DSA beobachteten, und 12 Patienten, die wir nur während einer PTA untersuchten. Alle Patienten mit einer PAVK befanden sich im Stadium II nach Fontaine.

Unter Ausnutzung der Meßergebnisse, die von entnommenen Blutproben dieser 5 Patientengruppen gewonnen wurden, war es uns möglich, Einflüsse durch die Abnahmemethode, eine vorbestehende PAVK und durch unterschiedliche Interventionsbedingungen auf die Thrombozytenaktivierung zu analysieren.

3.2. Eigenschaften der Gruppen

Die anamnestischen und paraklinischen Daten (siehe Tabelle 1 ) veranschaulichen, daß alle Gruppen mit PAVK eine einheitliche Altersverteilung aufwiesen, die Gruppe KG 2 war im Durchschnitt um 7 Jahre jünger. Insgesamt waren weniger Frauen als Männer vertreten, was der normalen Verteilung der Geschlechter auf einer angiologischen Station entspricht.

Fast alle Patienten mit einer PAVK befanden sich im Stadium IIb nach Fontaine und wurden, außer bei Kontraindikationen, mit ASS behandelt. Das Rauchen war der häufigste aus der Anamnese entnommene Risikofaktor für eine PAVK in den betroffenen Gruppen. Hier ist anzumerken, daß alle untersuchten Patientinnen mit diesem Krankheitsbild langjährig geraucht hatten. Den zweithäufigsten anamnestischen Risikofaktor stellte die arterielle Hypertonie dar. Es folgten Hypercholesterinämie, Hypertriglyzeridämie, Diabetes mellitus und Hyperurikämie. Adipositas, deren Therapie in der Sekundärprophylaxe der PAVK eine Bedeutung zukommt [ 19 ], trat in den PAVK-Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe ”KG2“ nur geringfügig vermehrt auf.

In der Gruppe KM wurden bei 15 Patienten (63 %) femoropopliteale, bei 2 Patienten (8 %) iliacale und bei 7 Patienten (29 %) sowohl femoropopliteale als auch iliacale Stenosen bzw. Verschlüsse diagnostiziert. In der Gruppe PTA wurden nach antegrader Punktion der Arteria femoralis communis Stenosen (singulär, kalzifizierend, konzentrisch, unter 10 cm Länge) der Arteria femoralis superficialis dilatiert.


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Tabelle 1 Daten aus Anamnese und Paraklinik (Häufigkeit des Auftretens und prozentualer Anteil der Merkmale in den Gruppen, bei der Variablen ”Alter“ arithm. Mittel mit Standardabweichung)

 

KG 1

( n = 16)

KG2

(n = 25)

KM

(n = 24)

PTA

(n = 22)

KM + PTA

(n = 10)

Alter ( arithm.

Mittel in Jahren)

60 ± 11

53 ± 15

61 ± 9

60 ± 9

60 ± 10

Frauen

(n)

2 (12 %)

12 (48 %)

6 (25 %)

5 (23 %)

2 (20 %)

PAVK IIb

(n)

12 (75 %)

0

17 (71 %)

19 (86 %)

8 (80 %)

Raucher

(n)

13 (81 %)

6 (24 %)

19 (79 %)

13 (59 %)

6 (60 %)

art. Hypertonie

(n; > 140/90 mmHg)

8 (50 %)

7 (28 %)

15 (62 %)

12 (54 %)

4 (40 %)

Hypercholesterinämie

(n; > 7,67 mmol/l)

4 (25 %)

0

11 (46 %)

12 (54 %)

5 (50 %)

Hypertriglyzeridämie

(n; > 1,7 mmol/l)

3 (19 %)

1 (4 %)

5 (21 %)

8 (36 %)

3 (30 %)

Diabetes mellitus IIb

(n)

3 (19 %)

0

5 (21 %)

2 (9 %)

1 (10 %)

Hyperurikämie

(n; > 400 µmol/l)

2 (12 %)

1 (4 %)

2 (8 %)

1 (5 %)

0

Adipositas

(n; BMI > 30)

4 (25 %)

7 (28 %)

9 (38 %)

5 (23 %)

4 (40 %)

ASS (300 mg/d)

(n)

11 (69 %)

1 (4 %)

20 (83 %)

18 (82 %)

7 (70 %)


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Die Gruppen mit PAVK , die einer Intervention unterzogen wurden, differierten stark in den KM - und Heparinmengen (siehe Tabelle 2 ). Die Ursache dafür liegt in den Unterschieden zwischen den Eingriffen intraarterielle DSA und PTA begründet: Während einer DSA wird mehr KM benötigt und seltener Heparin appliziert als bei einer PTA.

Tabelle 2 Interventionseinflüsse in den Gruppen ( arithm. Mittel und Standardabweichungen)

KG 1

( n = 16)

KG2

(n = 25)

KM

(n = 24)

PTA

(n = 22)

KM + PTA

(n = 10)

KM-Menge (ml)

0

0

123 ± 39

66 ± 43

KM: 108 ± 32

PTA: 67± 42

Heparinmenge ( I. E. )

0

0

2100 ± 1700

9000 ± 1300

KM:

2000 ± 1200

PTA:

8800 ± 1200

Dilatationsdauer (min)

0

0

0

10 ± 6

KM: 0

PTA: 11 ± 6

3.3. Methode der Blutentnahme und Aufbereitung der Proben

Wie bereits unter 1.2.2 ausgeführt, eignen sich CD 62 und LIMP -CD63 hervorragend als Marker für die Aktivierung zirkulierender Thrombozyten bei flußzytometrischen Messungen der extrinsischen Zellfluoreszenz.

Ziel des Abnahme- und Aufbereitungsverfahrens in dieser Studie war die möglichst artefaktfreie Herstellung von stabilen sowie für den Ort und Zeitpunkt der Thrombozytenaktivierung repräsentativen Vollblutproben der zu untersuchenden Probanden. Für flußzytometrische Messungen wurden diese Proben mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen CD62, CD63 und andere thrombozytäre Antigene gefärbt.


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3.3.1. Abnahme der Proben

Während der intraarteriellen DSA und PTA fand die erste Blutabnahme jeweils aus der arteriellen und der venösen Schleuse statt, unmittelbar nachdem sie in das Gefäß eingeführt worden waren. Erst danach begannen weitere interventionelle Maßnahmen am Patienten ( z. B. Einführen von Kathetern und Drähten, Heparin- und KM -Applikationen, Dilatationen). Direkt nach Beendigung der Eingriffe und Entfernung der DSA- bzw. PTA-Bestecke aus den Gefäßen erfolgte die zweite Blutabnahme aus den Schleusen. Diese verblieben für 4 Stunden in den Gefäßen. Danach vollzogen wir die dritte Blutabnahme am Bett des Patienten in analoger Weise.

Das Blut der Kontrollprobanden wurde nach Anlage einer Oberarmstaubinde und leichter Stauung mit Hilfe einer Venenpunktionskanüle (0,8 x 38 mm; 21 G ) aus der Cubitalvene entnommen. Bei allen Abnahmen strömte das Blut unter sterilen Bedingungen und mit leichter Aspiration langsam in 5ml- EDTA -Monovetten.

3.3.2. Aufbereitung der Proben

3.3.2.1. Verwendete Antikörper und Chemikalien

  1. Tetrapeptid Gly-Pro-Arg-Pro von Sigma Chemie GmbH (Deisenhofen, Deutschland)
  2. Thromboxan A2- Analogon U46619 von Sigma Chemie GmbH (Deisenhofen, Deutschland)
  3. Monoklonale Antikörper von Immunotech (Marseille, Frankreich):
    - isotypische Maus- IgG 1-Kontroll-Antikörper, FITC -markiert, Klon: 679.1Mc7
    - Anti- CD 42b(GPIb)-IgG1 (Maus), R-Phycoerythrin-markiert, Klon: SZ2
    - Anti-CD62P(P-Selectin)-IgG1 (Maus), FITC-markiert, Klon: CLBThromb/6
    - Anti-CD63(LIMP-CD63)-IgG1 (Maus), FITC-markiert, Klon: CLBGran/12
  4. Phosphatpuffer (1000 ml enthielten: 8,182 g Natriumchlorid, 1,78 g Di-Natrium-monohydrogenphosphat Dihydrat)
  5. Das Stabilisierungsmittel CyFixII wurde freundlicherweise von Dr. med. A. Ruf (Institut für Medizinische Labordiagnostik, Klinikum Karlsruhe) zur Verfügung gestellt. Es enthielt 0,15 M Phosphatpuffer (pH-Wert: 7,4) mit Glyoxal 0,2 % ( v/v ) und Formaldehyd 0,4 % ( w/v ) [ 70 ].

3.3.2.2. Fixierung der nativen Thrombozyten

Die Fixierung der nativen Thrombozyten fand unmittelbar nach der Blutabnahme statt. Dazu wurde die EDTA-Monovette leicht geschwenkt und 50 ml pipettierten Blutes im Verhältnis 1 : 2 zu dem Stabilisierungsmittel CyFixII in ein Eppendorf-Gefäß gegeben und gemischt. Nach 10 min Inkubationszeit bei Raumtemperatur erfolgte eine Verdünnung von 50 ml dieses Gemisches


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mit Phosphatpuffer im Verhältnis 1 : 20. Auf solche Art behandelte Blutproben sind für mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur lagerungsstabil [ 70 ]. Es war deshalb nicht nötig, unverzüglich mit ihrer weiteren Aufbereitung zu beginnen. Um die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer unkontrollierten in-vitro-Aktivierung der Thrombozyten zu reduzieren, modifizierten wir in Absprache mit den Autoren die unter [ 70 ] angegebene Methode und verzichteten auf Waschschritte. Durch die sehr schnell vollzogene Fixierung der Plättchen mit Konstanthaltung ihrer Aktivierungs-Oberflächen-Antigene bestand damit die Möglichkeit, den zum Abnahmezeitpunkt bestehenden Status der Thrombozytenaktivierung nahezu unverändert nachzuweisen [ 70 ].

3.3.2.3. In-vitro-Aktivierung und Fixierung der Thrombozyten

Um Aussagen über die Aktivierbarkeit und somit die Sensibilität der Thrombozyten gegenüber Aktivierungsreizen treffen zu können, wurde das Blut jeder entnommenen Probe nicht nur nativ untersucht, sondern zusätzlich mit dem Thromboxan A2- Analogon U46619 aktiviert, dessen Endkonzentration 10 mmol/l betrug [ 67 , 70 ].

Eine Fehlerquelle bei der Messung aktivierter Thrombozyten stellt die Herausbildung größerer Thrombozytenaggregate dar: Aufgrund der Bindung von Fibrinogen und anderer zytoadhäsiver Proteine an die Fibrinogen-Rezeptoren ( GP IIb/IIIa) aktivierter Plättchen erfolgt im Zusammenhang mit der Fibrin-Formation eine Vernetzung von Thrombozyten durch ”Proteinbrücken“.

Diesen Prozeß konnten wir durch den Zusatz des Tetrapeptides Gly-Pro-Arg-Pro , das an Fibrinogen bindet und die Polymerisation von Fibrin-Monomeren inhibiert, blockieren. Gly-Pro-Arg-Pro unterdrückt die Entstehung von Aggregaten wirkungsvoll und hat keinen Einfluß auf die Bindung aktivierungsspezifischer Antikörper an Thrombozyten. Außerdem verhält es sich stabil gegenüber proteolytischen Einflüssen und beeinträchtigt die Thrombinaktivität nicht [ 46 , 54 ].

In einem Eppendorf-Gefäß wurden 45 ml pipettierten EDTA -Blutes mit 45 ml Gly-Pro-Arg-Pro (5 mmol/l) versetzt, bevor die Zugabe von 10 ml U46619 (10-4 mol/l) erfolgte [ 70 ]. Dieser Cocktail verblieb nach guter Durchmischung für 10 Minuten in einem Inkubatorschrank bei 37 °C. Die anschließende Fixierung führten wir in gleicher Weise wie bei den nativen Proben durch.

3.3.2.4. Immunmarkierung der Thrombozyten

Von jedem Abnahmezeitpunkt eines Patienten wurden aus dem arteriellen (nicht bei den Kontrollgruppen) und aus dem venösen Bereich jeweils drei in dieser Art aufbereitete native und aktivierte Blutproben hergestellt. Diese drei Proben gehörten zu einem Set. Stets färbten wir die erste der drei Proben als isotypische Negativkontrolle mit FITC -markierten unspezifischen


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Maus- IgG 1-Antikörpern, die zweite mit FITC-markierten Maus-IgG1-Antikörpern gegen P-Selectin ( CD 62) und die dritte mit FITC-markierten Maus-IgG1-Antikörpern gegen LIMP -CD63. Die Färbung bestand in der Zugabe von 5 ml eines FITC-markierten Antikörpers zu 45 ml der in ein Mikrotiterröhrchen pipettierten Blutprobe. Aus Vorversuchen ging hervor, daß wir damit sättigende Konzentrationen der Antikörper erreichten. Nach einer Inkubationszeit von 15 min bei Raumtemperatur und dunkler Umgebung führten wir die Endverdünnung der Probe, die anschließend für die flußzytometrische Messung bereitstand, mit 450 ml Phosphatpuffer durch.

3.4. Meßmethode

3.4.1. Aufbau und Funktionsweise des Meßgerätes

Die vorbereiteten Blutproben wurden mit einem FACSort -Durchflußzytometer (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) gemessen.

Die Durchflußzytometrie dient der Erfassung physikalischer und chemischer Eigenschaften von Zellen, welche sich in einer Suspension befinden, während sie durch eine Meßregion fließen. Sie ermöglicht es, in einer Vollblutprobe quantitative multiparametrische Bestimmungen der Merkmale mehrerer Tausend Zellen pro Sekunde durchzuführen. Außerdem können anhand der Meßdaten ausgewählte Subpopulationen der Zellen physikalisch voneinander getrennt werden [ 88 ].

Das Durchflußzytometer besteht aus einem Versorgungsteil mit Netzteilen, Vorrats- und Abfallbehältern, einem Analysenteil mit Probenansaugvorrichtung, Durchflußzelle, Laserlichtquelle, Sammeloptiken, Lichtverstärkern und Sortiergerät sowie einer Auswerteinheit, die einen Hewlett-Packard-Computer mit dem Softwareprogramm ”Lysis II“ umfaßt:

Abb. 1: schematische Darstellung des Aufbaus eines Durchflußzytometers (verändert nach [ 88 ])


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Das Durchflußzytometer saugt die Blutproben während der Messung an und führt sie in einem kontinuierlichen Strom der Durchflußkammer zu. Dort werden die Blutzellen hydrodynamisch fokussiert, das heißt mit Hilfe einer Mantelflüssigkeit zentral ausgerichtet. Anschließend erreichen sie eine Enge, in der die Geschwindigkeit des laminaren Stromes sehr stark ansteigt [ 21 ]. In dieser Enge kreuzt jede Blutzelle einzeln einen gebündelten und elliptisch geformten Argon-Laserstrahl mit einer Wellenlänge von 488 nm.

Der Laser arbeitet nach dem Prinzip der angeregten Emission. Tritt eine mit FITC bzw. R-Phycoerythrin markierten Antikörpern beladene Zelle in den Laserstrahl ein, so werden diese Farbstoffe angeregt und strahlen ein Emissionsspektrum mit einem Maximum der relativen Fluoreszenz bei 517 nm (FITC) bzw. 578 nm (R-Phycoerythrin) aus. Damit sind die Emissionsmaxima deutlich voneinander zu unterscheiden und können von entsprechenden Detektoren erfaßt werden. Das Absorptionsspektrum von FITC weist ein Maximum bei 494 nm, das von R-Phycoerythrin ein Maximum bei 565 nm auf und ermöglicht jeweils eine effiziente Anregung durch den Argon-Laserstrahl [ 16 ]. Sammeloptiken fangen das emittierte Licht auf und führen es Lichtverstärkern zu, die ein elektrisches Signal, welches der Fluoreszenzintensität und dem jeweiligen zellulären Parameter proportional ist, zur Auswerteinheit weiterleiten.

Zusätzlich ist der FACSort in der Lage, physikalische Eigenschaften der Zellen anhand des von ihnen gestreuten Lichts zu analysieren. Je nach Anordnung der Streulichtdetektoren unterscheidet man zwischen FSC und SSC .

Der Detektor für FSC befindet sich in einem kleinen Winkel (0,5 - 15°) zur Richtung des Laserstrahls. Mit FSC konnten wir im wesentlichen Aussagen über die Zellgröße treffen. Der Detektor für SSC ist in einem Winkel von 90° zur Achse des Laserstrahls ausgerichtet. SSC charakterisiert hauptsächlich die Granularisierung von Zellen.

Auch die vom Streulicht ausgehenden Impulse werden als elektrische Signale der Auswerteinheit zugeführt [ 88 ].

Die Auswerteinheit stellt die logarithmisch nachverstärkten Fluoreszenz- und Streulichtimpulse entsprechend ihrer Größe mit Hilfe des Softwareprogramms ”Lysis II“ graphisch dar. Wir beurteilten die Aktivierung und Sensibilität der Thrombozyten in Scatterplot-Diagrammen für FSC und SSC sowie in 1-Parameter-Histogrammen für die Fluoreszenz 1 (FL1, FITC).


16

3.4.2. Voreinstellungen des Gerätes

Die Fluoreszenzeinstellungen des Geräts kalibrierten wir regelmäßig mit ”Calibrite-Beads“ und dem Softwareprogramm ”Autocomp“ von Becton Dickinson [ 17 ].

Da in einer normalen Vollblutprobe die Zahl der Erythrozyten etwa zwanzigfach höher als die der Thrombozyten ist, kann bei hohen Flußraten der Effekt auftreten, daß sich mehrere Erythrozyten zur selben Zeit im Beobachtungsraum eines Thrombozyten befinden und die Messung stören [ 5 ]. Aus diesem Grund wurde stets bei sehr geringen Flußraten gemessen (niedrigste Einstellung).

Einen anderen Störfaktor stellen Zelltrümmer (Debris) dar. Diese kleinen Partikel bestehen aus Erythrozyten- und Leukozytenfragmenten, Thrombozytenmikropartikeln und vermutlich auch Immunkomplexen und führen zu fehlerhaften Meßergebnissen [ 5 ]. Durch die Einstellung der Schwelle für FSC auf etwa 10 (siehe Abb. 2 ) verhinderten wir die Einbeziehung von Debris in die Auswertung [ 6 ].

Zellen, die nicht Thrombozyten entsprechen, können zwar keine thrombozytenspezifischen Antikörper binden, jedoch eine erhöhte Autofluoreszenz aufweisen und die Meßergebnisse verfälschen [ 42 ]. Außerdem waren in dieser Studie mit Thrombozyten assoziierte Zellen nicht von Interesse. Beide Arten von Zellen schlossen wir durch einen Prozeß von der Analyse aus, der als gating bezeichnet wird.

3.4.3. Gating der Thrombozytenpopulation

Jede Messung begann mit der Analyse der physikalischen Eigenschaften aller Zellen der Blutprobe im Scatterplot-Diagramm für FSC und SSC . Dabei erschien jeder Partikel ( z. B. Thrombozyt) als ein Punkt, dessen Lage von der Größe des entsprechenden Streulichtimpulses abhing. Aufgrund der spezifischen Eigenschaften der Blutzellen entstand immer ein Bild mit typisch angeordneten Populationen (siehe Abb. 2 ): Während die kleinere Population unten links zum größten Teil Thrombozyten repräsentierte, verkörperte die große Population Erythrozyten und Leukozyten, sowohl einzeln als auch mit Thrombozyten assoziiert.

Um im zweiten Schritt der Messung fast nur Plättchen zu analysieren, zogen wir für jede Probe im Scatterplot-Diagramm eine polygonale Linie (siehe Abb. 2 ) um die Thrombozytenpopulation (gating). Im Vorfeld der Untersuchungen stellten wir sicher, daß mit dieser Methode über 95 % aller Partikel, die sich innerhalb der von der Linie umgrenzten Fläche befanden, und weniger als 5 % aller Partikel außerhalb davon positiv für den thrombozytenspezifischen R-Phycoerythrin-markierten Antikörper gegen GP Ib ( CD 42b) waren.


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Abb. 2: Darstellung der Populationen im Scatterplot-Diagramm für FSC und SSC an einem Beispiel mit Angabe der relativen logarithmischen Streulichtintensität (R GP Ib ist die Region, die über 95 % aller GPIb-positiven Partikel enthält.)

3.4.4. Messung mit FITC -markierten Antikörpern

Zur Messung zogen wir 5000 gefärbte Thrombozyten aus dem Bereich der gekennzeichneten Fläche im Scatterplot-Diagramm für FSC und SSC heran.

Wie oben beschrieben, gehörten jeweils drei gefärbte Proben zu einem Set: eine Probe mit FITC-markierten unspezifischen Maus- IgG 1-Antikörpern als isotypische Negativkontrolle (im folgenden als Isotypkontrolle bezeichnet), eine Probe mit FITC-markierten Maus-IgG1-Antikörpern gegen P-Selectin ( CD 62) und eine Probe mit FITC-markierten Maus-IgG1-Antikörpern gegen LIMP -CD63. Die Analyse eines Sets erfolgte in drei 1-Parameter-Histogrammen für die Fluoreszenz 1. In diesen Diagrammen wurden Thrombozyten mit identischer Fluoreszenzintensität in Klassen zusammengefaßt (siehe Abb. 3 ). Die logarithmische Skalierung machte es uns möglich, kleine Zellpopulationen mit einer großen Spannweite der Werte abzugrenzen [ 88 ].


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Abb. 3: Darstellung der Meßreihe eines Sets in 1-Parameter-Histogrammen für die Fluoreszenz 1 an einem Beispiel. Die Abszisse gibt die Fluoreszenzintensität der Verteilung, die Ordinate die Anzahl von Zellen pro Klasse an. Die Tabellen in der rechten Bildhälfte enthalten ausgewählte statistische Parameter der Verteilungen.

In unsere Auswertung gingen Meßwerte der Fluoreszenzintensität von jeweils 5000 Thrombozyten umfassenden Stichproben ein. Diese Stichproben erfüllten nicht die Kriterien einer Normalverteilung (siehe Abb. 3 ). Daher analysierten wir die von der Auswerteinheit berechneten und für die Charakterisierung quantitativer, nicht normalverteilter Variablen geeigneten Medianwerte der


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Fluoreszenzintensität (siehe Abb. 3). Anhand dieser Medianwerte der Stichproben von Thrombozyten, welche mit Antikörpern gegen CD 62 und CD63 markiert wurden, gewannen wir Informationen über Relativzahlen bzw. prozentuale Anteile aktivierter und sensibilisierter Plättchen in den Blutproben.

3.5. Reproduzierbarkeit der Ergebnisse

Um die Reproduzierbarkeit der mit unserer Methode erhaltenen Daten aus Einzelmessungen zu überprüfen, ermittelten wir die Intra-Assay-Varianz durch eine zwanzigfache Bestimmung von gleichen Proben im gleichen Assay (umfaßt alle Arbeitsschritte von der Abnahme der Proben bis zur Aufarbeitung der Meßdaten). Die errechneten Variationskoeffizienten lagen in den Grenzen von 5 - 10 %. Mit ihrer Kenntnis konnten wir die durchgeführten Einzelmessungen sowie signifikante Abweichungen in den statistischen Analysen bezüglich des Betrages bzw. der Relevanz einschätzen und verzichteten aus Kostengründen auf Mehrfachbestimmungen der Blutproben.

3.6. Statistik

3.6.1. Voraussetzungen

In dieser Studie sollten Aussagen über das Verhalten von kleinen, zufällig aus einer bestimmten Patienten-Grundgesamtheit ausgewählten Patientengruppen getroffen werden. Diese Gruppen hatten Stichprobencharakter. Aufgrund ihrer Merkmale (Werte), die Ergebnisse von Messungen und Anamnesen darstellten, war auf die Merkmalsverteilung in der jeweiligen Patienten-Grundgesamtheit zu schließen. Ebenso waren Eigenschaften innerhalb einer und Unterschiede zwischen verschiedenen Patienten-Grundgesamtheiten zu untersuchen. Um diese Forderungen zu erfüllen, führten wir eine statistische Auswertung aller Daten mit Hilfe des Softwareprogramms ” SPSS “ durch. Im einzelnen arbeiteten wir mit Ein-, Zwei- und Mehrstichproben-Signifikanztests sowie mit dem ”Modell der bivariaten Korrelation nach Spearman“.

Konnten wir die Nullhypothese in einem Test bei festgelegter Irrtumswahrscheinlichkeit (Fehler a bzw. Signifikanzniveau) berechtigt zurückweisen, bestand ein signifikanter Unterschied. Durften wir die Nullhypothese nicht ablehnen, so bedeutete das noch nicht, daß wir sie annahmen, sondern nur, daß das Stichprobenergebnis nicht im Widerspruch zu ihr stand. Es war nicht möglich, mit einem Test anhand des Nichtvorhandenseins signifikanter Unterschiede einen Nachweis für die Gleichheit von Stichproben zu erbringen, da bei festgelegtem kleinen Fehler a die Gefahr des Auftretens des Fehlers b, der die Annahme einer ungültigen Nullhypothese kennzeichnet, zu groß wird [ 77 ].


20

Beim Testen auf Signifikanz trat in der Studie öfter der Fall ein, daß wir ein und dieselbe Stichprobe (Variable) in mehrere Paarvergleiche einbezogen. Da diese Stichprobe möglicherweise Extremfälle beinhaltete und somit selbst ein seltenes Ereignis in bezug auf die Nullhypothese darstellte, hätten sich bei ihrer wiederholten Verwendung fehlerhafte Testurteile häufen können. Das verhinderten wir durch eine Korrektur der Irrtumswahrscheinlichkeit [ 45 ]. Eine einfache Methode hierfür war die ”Alpha-Adjustierung nach Bonferroni“: Dabei dividierten wir die Irrtumswahrscheinlichkeit durch die Anzahl der Paarvergleiche, zu welchen die Stichprobe herangezogen werden sollte. Die nach diesem Verfahren jeweils korrigierte Irrtumswahrscheinlichkeit der Zweistichprobentests wird im Kapitel Ergebnisse erläutert.

Mit dem ”Ein-Stichproben-Kolmogorov-Smirnov-Test [ 50 ]“ und der festgesetzten Irrtumswahrscheinlichkeit p = 0,05 überprüften wir, ob die Stichproben einer normalverteilten Grundgesamtheit entstammten und aufgrund dessen für parametrische Testverfahren geeignet waren. Der Test zeigte, daß nur ca. 5 % aller Variablen diese Eignung aufwiesen, so daß wir in Anbetracht einer einheitlichen Methodik ausschließlich parameterfreie Testverfahren anwendeten.

3.6.2. Vergleiche zwischen den Gruppen

Hier fand eine Betrachtung von Merkmalsverteilungen zwischen verschiedenen Patientengruppen (Kontrollgruppen und Interventionsgruppen) statt. Da sich diese Gruppen untereinander nicht beeinflußten, wendeten wir Testverfahren für unabhängige Stichproben an.

Um festzustellen, bei welchen Variablen der Gruppen signifikante Unterschiede auftraten, führten wir den für mehrere Stichproben geeigneten ”Kruskal-Wallis H-Test“ mit der festgelegten Irrtumswahrscheinlichkeit p = 0,05 durch. Für den Vergleich zweier einzelner Gruppen und die Einschätzung, ob ein Anstieg oder eine Abnahme der Niveaus der Meßwerte eintrat, setzten wir den ”U-Test von Mann und Whitney“ ein [ 50 ].

3.6.3. Vergleiche innerhalb der Gruppen

An dieser Stelle untersuchten wir die Merkmalsverteilungen innerhalb einer Patientengruppe. Die in die Analyse einbezogenen Meßwerte stammten von Proben unterschiedlicher Entnahmezeitpunkte (vor, direkt nach und 4 Stunden nach einer Intervention) aus einem bestimmten Gefäß oder von Proben unterschiedlicher Gefäße (arteriell und venös), die wir zu einem bestimmten Zeitpunkt entnahmen. Diese Meßwerte hingen voneinander ab und erforderten Testverfahren für abhängige Stichproben.


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Ähnlich wie bei den Tests für unabhängige Stichproben diente uns zum Aufsuchen von signifikanten Unterschieden zwischen den drei Abnahmezeitpunkten zuerst ein Prüfverfahren für mehrere Stichproben, der ”Friedman-Test“ mit der festgesetzten Irrtumswahrscheinlichkeit p = 0,05. Mit dem ”Wilcoxon-Test (Matched pairs signed rank test)“ beurteilten wir die Tendenz dieser Unterschiede [ 50 ].

3.6.4. Vergleiche zwischen den Interventionen

Hier verglichen wir die Interventionen KM und PTA direkt miteinander, indem wir Patienten untersuchten, welche beiden Eingriffen unterzogen wurden (Gruppe ”KM und PTA“). Da wir dieselben Patienten bei unterschiedlichen Eingriffen beobachteten, hingen alle Meßwerte voneinander ab. Somit wendeten wir, wie auch bei den Testverfahren innerhalb der Gruppen, den ”Wilcoxon-Test“ mit der festgelegten Irrtumswahrscheinlichkeit p = 0,05 an. Um unterschiedliche Auswirkungen der Interventionen auf die Thrombozytenaktivierung zu analysieren, setzten wir relative prozentuale Differenzen zwischen den Abnahmezeitpunkten in den Test ein. Sie wurden nach folgender Formel gebildet: 100 [(Zeitpunkt 1 - Zeitpunkt 2) / Zeitpunkt 1].

3.6.5. Bivariate Korrelation nach Spearman

Die Rohdaten verdeutlichten, daß die Patienten innerhalb der Gruppen nicht in allen Interventionsbedingungen miteinander übereinstimmten. Aufgrund dessen bestand die Möglichkeit, daß ein Zusammenhang zwischen den Meßwerten und voneinander abweichenden Dilatationszeiten und -strecken sowie KM - und Heparinmengen existierte und somit unterschiedliche Interventionsbedingungen einen Einfluß auf die Meßwerte ausübten.

Mit dem in dieser Studie angewendeten ”Modell der bivariaten Korrelation nach Spearman“ quantifizierten wir die Stärke der linearen Beziehung zwischen zwei Variablen. Dieses Modell ist für ordinal- und intervallskalierte Daten geeignet, die nicht den Normalitätsvoraussetzungen entsprechen. Der Spearman`sche Korrelationskoeffizient r kann Werte zwischen -1 und +1 annehmen. Das Vorzeichen kennzeichnet einen positiven oder negativen linearen Zusammenhang zwischen zwei Variablen, der absolute Wert zeigt die Stärke dieses Zusammenhangs an. Der Wert 0 bedeutet, daß die beiden Variablen in keiner linearen Beziehung zueinander stehen [ 77 ]. Auch hier gingen relative prozentuale Differenzen zwischen den Abnahmezeitpunkten in die Berechnungen ein, die Irrtumswahrscheinlichkeit für den Korrelationskoeffizienten r setzten wir auf p = 0,05 fest.


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