Buchholz, Alexander: “Zirkulierende Thrombozyten im Rahmen der intraarteriellen digitalen Subtraktionsangiographie und der perkutanen transluminalen Angioplastie: Durchflußzytometrische Bestimmung der Aktivierung ex vivo und in vitro“

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Kapitel 5. Diskussion

In dieser Studie untersuchten wir die Aktivierung und Sensibilität zirkulierender Thrombozyten bei gesunden Probanden und bei PAVK -Patienten sowie im Rahmen der Interventionen DSA und PTA im Bereich der unteren Extremitäten. Dabei analysierten wir die Plättchenaktivierung ex vivo und in vitro mit der Methode der Durchflußzytometrie und einer statistischen Auswertung von Meß- und Interventionsdaten verschiedener Patientengruppen.

Wir fanden heraus, daß Patienten mit PAVK signifikant mehr aktivierte und sensibilisierte Plättchen als gesunde Probanden aufwiesen. Die Methode der Blutentnahme aus arteriellen und venösen Schleusen übte im Vergleich zur peripheren Venenpunktion keinen nachweisbaren Einfluß auf unsere Ergebnisse aus. Wir beobachteten zum Zeitpunkt 4 h nach den Interventionen DSA und PTA signifikante Änderungen in der Aktivität und Sensibilität der Thrombozyten. Nachweisbare Unterschiede in der Plättchenaktivierung zwischen dem arteriellen und venösen Strombereich ließen sich jedoch zu einem bestimmten Zeitpunkt nicht aufzeigen. Beim Vergleich der Interventionen PTA und DSA ergab sich direkt nach den Eingriffen eine signifikante Differenz in der Thrombozytenaktivierung. Schließlich belegten wir den signifikanten Einfluß verschiedener Interventionsbedingungen auf die Aktivierung und Sensibilität der Plättchen.

Bei der Analyse unserer Meßdaten fiel auf, daß die statistisch belegten Unterschiede besonders bei den Vergleichen innerhalb der Gruppen sehr geringe Beträge aufwiesen. Für die Einschätzung der klinischen Bedeutung unserer Ergebnisse müßten sensiblere Methoden entwickelt werden, die z. B. die Interaktion zwischen Thrombozyten und Leukozyten erfassen können.

5.1. Vergleiche mit den Kontrollgruppen

5.1.1. Vergleich zwischen den Gruppen KG 1 und KG2

In der Gruppe KG1 waren Patienten mit einer PAVK ohne interventionelle Manipulationen (DSA, PTA) zusammengefaßt, während die Gruppe KG2 aus gesunden Probanden bestand. Bei beiden Gruppen fand die Abnahme der Blutproben unter denselben Bedingungen aus einer peripheren Vene statt. Ein Vergleich zwischen diesen Gruppen wurde durchgeführt, um Aussagen über die systemische Thrombozytenaktivierung bei Patienten mit PAVK und bei Normalprobanden treffen zu können.

Thrombozyten von Patienten mit einer KHK unterschieden sich von Plättchen gesunder Probanden durch eine verstärkte Expression der Aktivierungsantigene CD 62 und GP 53 sowie des Rezeptors GPIIb/IIIa in seiner funktionellen Form [ 10 , 59 ].


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In dieser Studie beobachteten wir, daß Patienten mit PAVK einen signifikant höheren systemischen prozentualen Anteil aktivierter und sensibilisierter Thrombozyten aufwiesen als gesunde Probanden (siehe 4.1.1 ).

Die Gruppen KG 1 und KG2 differierten nicht nur hinsichtlich der PAVK, sondern auch in einigen aus den Anamnesen entnommenen Daten (siehe 3.2 ):

5.1.1.1. Alter der Patienten

Alle Gruppen mit PAVK hatten per se eine homogene Altersverteilung, nur die Gruppe KG2 war etwas jünger. Das beeinflußt die Aussagen und klinische Relevanz dieser Studie nicht, da das Alter für die Primär- und auch Spätergebnisse einer PTA nur eine geringe Bedeutung hat: Der Vergleich der Langzeitergebnisse nach erfolgreicher PTA in Abhängigkeit vom Alter ließ eine statistische Signifikanz nur zwischen Patienten unter 50 und über 70 Jahren erkennen [ 92 ].

5.1.1.2. ASS-Einfluß

Die medikamentöse Behandlung mit ASS ist eine Standardtherapie der PAVK, welcher alle betroffenen Patienten dieser Studie, außer bei Kontraindikationen, unterzogen wurden.

ASS hatte in Dosen von 160 mg/d bis 300 mg/d in vivo und in vitro weder auf die Expression von CD 62 und CD63 noch auf die Bindung von Fibrinogen an Thrombozyten einen Einfluß [ 14 , 39 ]. Mit der Azetylierung der Zyklooxygenase und der daraus folgenden Hemmung der Thromboxan A2- Bildung war ASS nicht in der Lage, stärkere thrombozytenaktivierende Stimuli wie die Einwirkung von Thrombin oder Kollagen an verletzten Gefäßwänden zu unterdrücken [ 14 ]. Auch die hämostatischen und präthrombotischen Plättchenfunktionen verhielten sich resistent gegenüber ASS [ 73 ]. Außerdem konnte gezeigt werden, daß dieses Medikament keinen Einfluß auf das Verhalten der Thrombozyten gegenüber hohen Schergeschwindigkeiten [ 42 ] und auf die Plättchenaggregation während einer PTA hatte [ 56 ].

Somit ist anzunehmen, daß zwischen den Meßergebnissen dieser Studie und der Einnahme von ASS kein Zusammenhang bestand.

5.1.1.3. Lipoproteine

Eine Hypercholesterinämie und Hypertriglyzeridämie waren in den Patientengruppen mit PAVK stärker vertreten als in der Normalgruppe KG2.

Zirkulierende Lipoproteine konnten eine Adhäsion von Thrombozyten in vitro verursachen, wobei VLDL stärker wirkte als HDL und LDL . Vermutlich wurde dieser Vorgang durch den Integrin-Oberflächenrezeptor der Plättchen GP IIb/IIIa ermöglicht [ 44 ]. Außerdem verhinderte eine


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Hypercholesterinämie die Thrombozyten- und ADP -induzierte endothelabhängige Relaxation in Koronararterien des Schweins [ 84 ]. Angioplastisch geschädigte Arterienwände von Kaninchen mit einer Hypercholesterinämie zeigten im Vergleich zu Kaninchen ohne Fettstoffwechselstörungen eine gesteigerte Expression des GP Thrombospondin-1, welches nach Gefäßverletzungen synthetisiert wird und eine funktionelle Rolle bei der Migration und Proliferation glatter Muskelzellen, der Aktivierung von Plasmin sowie bei der Angiogenese spielt [ 69 ]. Patienten mit einer Hypercholesterinämie wiesen, wahrscheinlich bedingt durch endotheliale Dysfunktionen und eine persistierende Thrombozytenaktivierung, höhere Werte zirkulierenden P-Selectins (P-Selectin, welches sich von der Zellmembran gelöst hat) auf als gesunde Probanden [ 20 ]. Insbesondere bei Patienten mit einer Hypercholesterinämie und begleitender Erhöhung der Plasma-Triglyzeride konnte, verglichen mit Kontrollprobanden, eine intensivere Thromboxan-Synthese und Plättchensekretion nachgewiesen werden [ 9 ].

Diese Prozesse können das Fortschreiten der Arteriosklerose beschleunigen und ursächlich für die Unterschiede zwischen den Gruppen KG 1 und KG2 sein.

5.1.1.4. Nikotinabusus

Das Rauchen ist der wichtigste Risikofaktor für die PAVK und KHK .

Anhand eines Modells, in dem eine physiologische Blutzirkulation unter den Bedingungen von Gefäßstenosen und Intimaeinrissen simuliert wurde, konnte man nachweisen, daß bei Patienten mit KHK nach dem Rauchen von Zigaretten die Thromboseneigung von Thrombozyten akut zunahm. Weiterhin war nach dem Rauchen eine stärkere Plättchenaggregation nach Thrombinstimulation trotz ASS -Therapie zu beobachten. Die Freisetzung endogener Katecholamine, eine vermehrte Thromboxan-Synthese der Thrombozyten und eine erhöhte Empfindlichkeit der Plättchen gegenüber Agonisten wurden dafür verantwortlich gemacht [ 34 ]. Bei KHK-Patienten mit Hypertriglyzeridämie oder Hypercholesterinämie und niedrigen HDL -Werten verstärkte das Rauchen die spontane und die durch ADP induzierte Thrombozytenaggregation [ 63 ].

Diese Beobachtungen könnten eine Ursache für die höhere Relativzahl aktivierter und sensibilisierter Thrombozyten in der PAVK-Gruppe KG1 gegenüber der Normalgruppe KG2 darstellen.

5.1.1.5. Diabetes mellitus

Diabetes mellitus war in dieser Studie aus folgenden Gründen ein Ausschlußkriterium für die Auswahl der Probanden der Normalgruppe KG2:

Bei dieser Krankheit bewirken hyperaktive Thrombozyten an verletzten Endothelschichten zusammen mit einer erhöhten Verfügbarkeit thrombogener Agonisten und einer eingeschränkten


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Funktion von Gerinnungshemmern sowie des fibrinolytischen Systems einen hyperkoagulablen Status der Patienten. Die hyperaktiven Plättchen sind die Hauptkomponente des präthrombotischen Geschehens, da sie Mikroembolisationen von Kapillaren verursachen, lokale Gefäßläsionen ausdehnen und akute arterielle Thrombosen auslösen. Bei Diabetikern zirkulieren große Thrombozyten mit intensiver Thromboxan-Synthese und einem hohen Gehalt an plättchenspezifischen Proteinen und zytoadhäsiven Oberflächenrezeptoren ( GP Ib und GPIIb/IIIa), wobei die Gesamtplättchenzahl meist im normalen Bereich liegt. Die Ursache dafür könnte in einer Änderung der megakaryozytären Thrombopoese bestehen.

Anhand gesteigerter Expression von CD 62 und CD63 wurde gezeigt, daß Patienten mit Diabetes mellitus stärker aktivierte Plättchen als gesunde Probanden aufwiesen [ 82 ]. Die vermehrte Aktivierung war schon in frühen Stadien der Krankheit, bei noch nicht apparenten vaskulären Läsionen, beweisbar [ 80 , 81 ]. Bei Patienten in der Initialphase der Pathogenese des Diabetes mellitus Typ I waren höhere Werte zirkulierenden P-Selectins meßbar als bei Kontrollprobanden [ 43 ].

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß sich die Unterschiede im Alter und der ASS -Medikation zwischen den Gruppen nicht auf die Ergebnisse dieser Studie auswirken. Die Risikofaktoren für eine PAVK Hypercholesterinämie, Hypertriglyzeridämie, Nikotinabusus und Diabetes mellitus haben jedoch einen Einfluß auf die Plättchenfunktionen und waren in der Gruppe KG 1 sowie den anderen PAVK-Gruppen gegenüber der Gruppe gesunder Probanden erhöht. Die hohe Anzahl von Risikofaktoren könnte eine Ursache für die in unserer Studie nachgewiesene systemisch gesteigerte Relativzahl aktivierter und sensibilisierter Thrombozyten bei Patienten mit PAVK gegenüber gesunden Probanden darstellen. Möglicherweise forcieren diese Thrombozyten aufgrund ihrer vermehrten Aktivierung und verstärkten Reaktion auf Aktivierungsreize die Genese der PAVK.

5.1.2. Vergleich der Gruppe KG1 mit den Gruppen KM und PTA

Thrombozyten werden durch einen Kontakt mit verschiedenen körperfremden Materialien in ihrer Funktion beeinflußt. Das Wachstum von Plättchenthromben auf Fremdkörperoberflächen ist ein Resultat der Adhäsion einer ersten Thrombozytenschicht und einer darauf folgenden Paradhäsion und Supradhäsion von immer mehr Schichten von Thrombozyten. Der Rezeptor GPIIb/IIIa ist verantwortlich für die Adhäsion der ersten Schicht, die Paradhäsion wird durch die Interaktion von GPIb mit vWF verursacht, während der Mechanismus der Supradhäsion noch unbekannt ist [ 23 , 26 ]. Außerdem wurde eine erhöhte Expression von CD62 und CD63 bei Plättchen beobachtet, die mit verschiedenen Materialien in Berührung kamen [ 25 , 65 ].


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Bei Untersuchungen der Thrombozytenaktivierung ist es aufgrund dieser Beobachtungen wichtig zu wissen, ob die Abnahmemethode durch den Kontakt des Blutes mit dem Abnahmebesteck zu einer artifiziellen Aktivierung der Plättchen führt. Es wurde gezeigt, daß die Verwendung heparinisierter Katheter keine Thrombozytenaktivierung verursachte [ 2 , 71 ].

In dieser Studie führten wir einen Vergleich zwischen zwei verschiedenen Patientengruppen durch, um die Abhängigkeit der Abnahmemethode auf die Plättchenaktivierung zu untersuchen:

Die Gruppe KG 1 umfaßte Patienten mit PAVK ohne interventionelle Manipulationen durch eine intraarterielle DSA oder PTA , bei denen die Blutabnahme aus der Cubitalvene mit einer Kanüle erfolgte. In den beiden Gruppen KM und PTA waren Patienten mit PAVK zusammengefaßt, denen vor und unmittelbar nach den Eingriffen DSA bzw. PTA sowie 4 Stunden später Blutproben aus Schleusen entnommen wurden. Für den Vergleich wurden die aus den peripheren Abnahmen stammenden Blutproben der Gruppe KG1 und die jeweils aus den venösen Schleusen vor den Interventionen entnommenen Blutproben der Gruppen KM und PTA herangezogen. Anhand dieses Vergleichs war es möglich, den Einfluß der Abnahmemethode auf den prozentualen Anteil aktivierter und sensibilisierter Thrombozyten in den Blutproben zu beurteilen.

Es stellte sich heraus, daß zwischen den mit einer Kanüle entnommenen und den aus einer venösen Schleuse stammenden Blutproben keine signifikanten Unterschiede in der Relativzahl aktivierter und sensibilisierter Thrombozyten bestanden (siehe 4.1.2 ). Das bedeutet, daß sich die Gewinnung der Blutproben aus Schleusen im Vergleich zur Entnahme mittels Kanüle nicht nachweisbar auf den prozentualen Anteil aktivierter und sensibilisierter Plättchen auswirkte und somit ein Einfluß der Abnahmemethode auf die Thrombozytenaktivierung nicht belegt werden konnte.

Dieses Ergebnis spricht im Zusammenhang mit der durchgeführten Aufbereitungs- und Fixierungsmethode für die Eignung von sich in unmittelbarer Nähe zum manipulierten Gefäßabschnitt befindenden Schleusen zur Probenentnahme, um den Zustand der Thrombozyten während der intraarteriellen DSA und PTA ex vivo und in vitro zu untersuchen.

5.2. Vergleiche innerhalb der Gruppen KM und PTA

Den Gruppen KM und PTA gehörten Patienten mit PAVK an, denen vor und direkt nach den Eingriffen intraarterielle DSA bzw. PTA sowie 4 Stunden später Blutproben aus arteriellen und venösen Schleusen entnommen wurden. Wir führten einen Vergleich zwischen den Proben verschiedener Abnahmezeitpunkte durch, um den Einfluß der jeweiligen Intervention auf die Thrombozytenaktivierung zu beurteilen. Die Proben aus dem arteriellen und venösen Stromgebiet wurden miteinander verglichen, um herauszufinden, ob Unterschiede in der Thrombozyten-


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aktivierung zwischen den Gefäßabschnitten bestanden, die dem Ort der Manipulation vor- und nachgeschaltet waren.

Die venösen Werte charakterisierten in beiden Gruppen die Eigenschaften der Thrombozyten im lokalen Effluat des manipulierten Gefäßabschnittes. Aufgrund der verschiedenen Punktionsrichtungen kennzeichneten die arteriellen Werte der Gruppe PTA die Plättcheneigenschaften in der systemischen arteriellen Zirkulation, während die arteriellen Werte der Gruppe KM diese Eigenschaften am Beginn des manipulierten arteriellen Stromgebietes beschrieben.

5.2.1. Vergleich der 3 Abnahmezeitpunkte in der Gruppe KM

Den wichtigsten Einflußfaktor auf die Meßergebnisse dieser Gruppe stellte das KM dar. Zur Anwendung kamen die nichtionischen niederosmolaren Präparate Ultravist 300 (Iopromid) und Solutrast 370 (Iopamidol). Beide gehören zur Gruppe der trijodierten nichtionischen Monomere. Nichtionische niederosmolare KM werden bevorzugt verwendet, da sie eine geringere molekulare Toxizität und einen höheren Wirksamkeitsindex aufweisen als ionische Präparate [ 22 ]. Außerdem verursachen sie weniger Nebenwirkungen wie lokale Schmerzen und Wärmegefühle, Übelkeit und Erbrechen, Hypotension, Thoraxschmerzen und Kurzatmigkeit [ 2 ]. Der Einsatz nichtionischer anstelle ionischer KM war jedoch bei invasiven Untersuchungen an Patienten mit einem höheren Thromboserisiko behaftet [ 18 ]. Es wurde beschrieben, daß nichtionische KM in vitro eine starke Aktivierung sowie Aggregation von Plättchen hervorriefen und die thrombozytäre Expression von CD 62 und CD63 massiv steigerten, ohne das Bindungsverhalten von Antikörpern an diese Epitope zu beeinflussen [ 13 , 29 ]. Die durch nichtionische KM bewirkte Thrombozytenaktivierung beruhte vermutlich zu 25 % auf der verminderten Ionenstärke und zu 75 % auf der vermehrten Osmolalität des KM-Blut-Gemisches im Vergleich zu Vollblut [ 30 ].

Im Gegensatz dazu wiesen ionische KM antikoagulatorische Eigenschaften auf und reduzierten das Risiko ischämischer Komplikationen nach einer PTCA [ 27 , 29 ]. Sie verursachten eine Aktivierung, jedoch keine Aggregation von Plättchen. Ionische KM hemmten die Anlagerung von Thrombin an Thrombozyten und damit die thrombininduzierte Plättchenaktivierung [ 29 , 48 ].

Folgende Mechanismen könnten im Zusammenhang mit den Wechselwirkungen zwischen KM und Thrombozyten stehen [ 22 ]:

  1. Durch die hohen Injektionsgeschwindigkeiten steigt der Anteil von KM im Blut in der Umgebung der Katheterspitze auf bis zu 50 % an [ 13 , 29 ].
  2. Zunehmende Konzentrationen des KM führen zu einer vermehrten Viskosität und Verlangsamung des Blutflusses im Endstromgebiet.

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  3. Daraus ergibt sich eine verlängerte Ischämiedauer im betreffenden Gefäßabschnitt sowie eine längere Kontaktzeit des KM mit den Endothelien, wodurch eine vermutete toxische Schädigung der Gefäße gefördert wird.
  4. Eine verlängerte Kontaktzeit des KM mit den Endothelien und Blut führt wahrscheinlich zur lokalen Freisetzung prothrombotischer und vasoaktiver Substanzen, welche die Plättchenaktivierung und ihre Aggregation fördern [ 13 ].

Der Vergleich der 3 Abnahmezeitpunkte in der Gruppe KM (siehe 4.2.1 ) zeigte, daß die nativen Blutproben aus dem arteriellen Bereich und dem lokalen Effluat zum Zeitpunkt 4 h nach der DSA eine signifikant geringere Relativzahl aktivierter Thrombozyten als unmittelbar nach der DSA aufwiesen.

Der sowohl arteriell als auch venös verminderte prozentuale Anteil aktivierter Thrombozyten zum Zeitpunkt 4 h nach der DSA könnte auf einer verkürzten Lebensdauer zirkulierender Plättchen beruhen [ 17 ]. Es wurde beschrieben, daß die mittlere Lebensdauer von Thrombozyten infolge einer PTA durch einen gesteigerten Abbau in der Milz von 185 auf 145 Stunden sank [ 57 ]. Eventuell waren bereits präinterventionell aktivierte Plättchen in besonderem Maße von einer frühzeitigen Konsumption betroffen [ 40 ].

Aus der zum Zeitpunkt 4 h nach der DSA im lokalen Effluat nachweisbaren Abnahme der Relativzahl aktivierter Thrombozyten entwickelten wir die Theorie der Anlagerung von Plättchen an Gefäßwände des arteriellen bzw. peripheren Stromgebietes oder an andere Blutzellen:

Möglicherweise waren 4 Stunden nach der intraarteriellen DSA weniger aktivierte Plättchen im lokalen Effluat als vor der Intervention aufzufinden, weil einige Thrombozyten während der Passage der manipulierten Gefäße sehr stark aktiviert wurden und aufgrund einer folgenden Anlagerung an arterielle bzw. periphere Gefäßstrukturen die venöse Schleuse nicht mehr erreichen konnten.

Denkbar ist außerdem, daß sich einige im alterierten Gefäßabschnitt aktivierte Plättchen an Leukozyten (bevorzugt Monozyten und neutrophile Granulozyten) sowie Erythrozyten anlagerten [ 5 , 55 ] und demzufolge von der Meßmethode nicht mehr erfaßt wurden.

Da die statistisch belegten Unterschiede jedoch nur sehr geringe Beträge aufwiesen (in einigen Fällen in der Größenordnung des Variationskoeffizienten der Intra-Assay-Varianz) und im prozentualen Anteil aktivierter Thrombozyten zwischen dem arteriellen und venösen Stromgebiet keine nachweisbaren signifikanten Differenzen bestanden (siehe 4.2.3 ), nahm die Anlagerung aktivierter Plättchen bei der intraarteriellen DSA wahrscheinlich nur ein geringes Ausmaß an.


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Die in vitro aktivierten arteriellen Proben ließen zum Zeitpunkt 4 h nach der DSA eine signifikant höhere Relativzahl sensibilisierter Thrombozyten in bezug auf das Ausgangsniveau erkennen. Bei den in vitro aktivierten venösen Proben zeigte sich zum Zeitpunkt 4 h nach der DSA zusätzlich ein signifikant gestiegener prozentualer Anteil sensibilisierter Thrombozyten im Vergleich zum Zeitpunkt unmittelbar nach der Intervention (siehe 4.2.1 ).

Daraus läßt sich ableiten, daß die intraarterielle DSA die Sensibilität von Thrombozyten gegenüber Aktivierungsreizen im arteriellen Bereich und im lokalen Effluat steigerte. In Anbetracht folgender Gründe gehen wir jedoch davon aus, daß dieser Prozeß nicht zu einer Anlagerung sensibilisierter Plättchen an Gefäßoberflächen bzw. andere Blutzellen führte:

  1. Die statistisch belegten Unterschiede waren durch geringe Beträge gekennzeichnet.
  2. Es ließen sich zu keinem Zeitpunkt signifikante Differenzen in den Relativzahlen sensibilisierter Plättchen zwischen dem arteriellen und venösen Bereich aufzeigen (siehe 4.2.3 ).
  3. Höhere Mengen an während der intraarteriellen DSA zugeführtem KM korrelierten zwar nachweisbar mit einem Sensibilitätsabfall der Thrombozyten im lokalen Effluat zum Zeitpunkt 4 h nach der Intervention (siehe 4.4.2.1 ), die Sensibilität stieg jedoch insgesamt.

Zusammenfassend kann anhand unserer Daten festgestellt werden, daß die intraarterielle DSA einen signifikanten Einfluß auf die Aktivierung und Sensibilität der Thrombozyten am Beginn der manipulierten Gefäßabschnitte und im lokalen Effluat ausübt. Dieser Einfluß wird zum Zeitpunkt 4 h nach der DSA nachweisbar, äußert sich in einem geringen Abfall der Relativzahl aktivierter sowie in einem leichten Anstieg des prozentualen Anteils sensibilisierter Plättchen und ist eine Folge der KM- und Heparin-Applikation, da alle anderen Einflußfaktoren konstant blieben. Der Abfall der Aktivierung beruht wahrscheinlich auf einer verkürzten Lebensdauer zirkulierender Thrombozyten oder auf einer geringe Ausmaße annehmenden Anlagerung von Plättchen an arterielle bzw. periphere Gefäßstrukturen oder an andere Blutzellen. Die vermehrte Sensibilität von Plättchen führt vermutlich nicht zu einer Anlagerung.

5.2.2. Vergleich der 3 Abnahmezeitpunkte in der Gruppe PTA

Zirkulierende Thrombozyten werden aktiviert, wenn sie z. B. Koronargefäße passieren, welche infolge einer PTCA Endothelläsionen aufzeigen [ 71 ]. Weiterhin wurde beobachtet, daß die Expression von CD 62 auf zirkulierenden Plättchen 4 - 8 Stunden nach einer PTCA sank, um nach 24 - 48 Stunden wieder anzusteigen. Der Abfall der Expression wurde auf eine Sequestration und verringerte Lebensdauer stark aktivierter Plättchen, der spätere Anstieg auf einen Nachschub von Thrombozyten aus dem Knochenmark zurückgeführt [ 24 ]. Ähnliche Ergebnisse liegen von By-


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pass-Operationen vor: Patienten hatten nach einer kardiopulmonalen Bypass-Operation vorübergehend erhöhte Werte aktivierter, CD62-positiver Thrombozyten [ 5 , 17 ].

Beim Vergleich der 3 Abnahmezeitpunkte in der Gruppe PTA (siehe 4.2.2 ) wurde deutlich, daß die nativen venösen Blutproben zum Zeitpunkt 4 h nach dem Eingriff eine signifikant geringere Relativzahl aktivierter Thrombozyten als direkt nach der PTA aufwiesen. Die nativen arteriellen Proben zeigten zum Zeitpunkt 4 h nach PTA einen signifikanten Abfall des prozentualen Anteils aktivierter Plättchen in bezug auf die Ausgangswerte.

Die Tatsache, daß ein Abfall der Relativzahl aktivierter Thrombozyten zum Zeitpunkt 4 h nach der PTA im lokalen Effluat nachzuweisen war, unterstützt unsere Theorie der Anlagerung:

Aktivierte Plättchen erschienen in einem geringeren prozentualen Anteil im lokalen Effluat, da sie im manipulierten Gefäßgebiet sehr stark aktiviert wurden und sich an Gefäßstrukturen im arteriellen bzw. peripheren Bereich anlagerten. Alternativ bestand die Möglichkeit, daß sich diese Thrombozyten im lokalen Effluat nicht mehr nachweisen ließen, weil sie aufgrund der starken Aktivierung Komplexe mit anderen Blutzellen ausbildeten und sich im Scatterplot-Diagramm für FSC und SSC außerhalb des markierten Meßbereiches befanden.

Auch eine verkürzte Lebensdauer zirkulierender aktivierter Thrombozyten könnte die beschriebenen Ergebnisse im arteriellen und venösen Stromgebiet erklären.

Folgende Gründe sprechen jedoch dafür, daß diese Prozesse zum Zeitpunkt 4 h nach der PTA vermutlich nur ein geringes Ausmaß annahmen:

  1. Die Beträge der statistisch belegten Unterschiede waren auch hier nur sehr gering.
  2. Es bestanden zu keinem Zeitpunkt signifikante Differenzen in bezug auf den prozentualen Anteil aktivierter Thrombozyten zwischen der systemischen arteriellen Zirkulation und dem lokalen Effluat (siehe 4.2.4 ). Somit konnte die Hypothese der Anlagerung bzw. Komplexbildung nicht erhärtet werden.
  3. Höhere Mengen an zugeführtem KM korrelierten signifikant mit einem Ansteigen der Relativzahl aktivierter Plättchen im lokalen Effluat zum Zeitpunkt 4 h nach der PTA (siehe 4.4.4.1 ).

Anhand der in vitro aktivierten arteriellen und venösen Blutproben ließen sich beim Vergleich der 3 Abnahmezeitpunkte in der Gruppe PTA keine signifikanten Unterschiede im prozentualen Anteil sensibilisierter Thrombozyten erkennen (siehe 4.2.2 ). Außerdem wichen die Relativzahlen sensibilisierter Plättchen im arteriellen und venösen Stromgebiet nicht signifikant voneinander ab (siehe 4.2.4 ). Demzufolge konnten wir einen Einfluß der PTA auf die Sensibilität zirkulierender Plättchen nicht nachweisen.


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Unsere Ergebnisse lassen sich folgendermaßen zusammenfassen:

Die PTA hat eine signifikante Auswirkung auf die Aktivierung von Plättchen in der systemischen arteriellen Zirkulation und im lokalen Effluat. Dieser Einfluß äußert sich in einem nachweisbaren Abfall der Thrombozytenaktivierung zum Zeitpunkt 4 h nach der PTA und ist sowohl eine Folge des zugeführten KM als auch der Dilatation der Gefäßwände. Die PTA führt vermutlich zu einer nur geringe Ausmaße annehmenden Anlagerung aktivierter Plättchen an arterielle bzw. periphere Gefäßstrukturen oder andere Blutzellen. Auch eine verkürzte Lebensdauer zirkulierender Thrombozyten könnte als Ursache für unsere Beobachtungen in Frage kommen. Auf die Sensibilität zirkulierender Plättchen übt die PTA keinen beweisbaren Einfluß aus.

In der Pathogenese der Thrombozytenaktivierung während der PTA ergänzen sich die Effekte der Gefäßschädigung und des KM : Der Prozeß der Ballon-Dilatation verursacht eine lokale Überdehnung eines Gefäßabschnittes. Dieses Barotrauma kann zu Mikro- und Makrodissektionen der Gefäßwand führen. Nach der folgenden angiographischen Gefäßdarstellung ist es möglich, daß innerhalb der Dissektionen sehr hohe KM-Konzentrationen über längere Zeit auftreten und zusammen mit den freigelegten subendothelialen Strukturen und der lokalen Thrombingeneration eine Aktivierung der Thrombozyten bewirken [ 13 ].

5.2.3. Vergleich der arteriellen mit den venösen Werten in der Gruppe KM

In der Gruppe KM ließ sich zu keinem Zeitpunkt der Beweis für eine signifikante Differenz in der Relativzahl aktivierter und sensibilisierter Plättchen zwischen dem arteriellen Stromgebiet und dem venösen lokalen Effluat der alterierten Gefäßabschnitte erbringen (siehe 4.2.3 ).

In dieser Studie kann demzufolge innerhalb der Gruppe KM kein beweisbarer Unterschied in der Thrombozytenaktivierung zwischen den Gefäßgebieten, die dem Ort der Manipulation vor- und nachgeschaltet waren, festgestellt werden. Die Schlußfolgerungen daraus wurden unter 5.2.1 diskutiert.

5.2.4. Vergleich der arteriellen mit den venösen Werten in der Gruppe PTA

Auch in der Gruppe PTA bestand zu keinem Abnahmezeitpunkt eine signifikante Differenz im prozentualen Anteil aktivierter und sensibilisierter Thrombozyten zwischen dem arteriellen und venösen Stromgebiet (siehe 4.2.4 ).

Somit existieren auch bei der Intervention PTA keine nachweisbaren Unterschiede in der Plättchenaktivierung zwischen den Gefäßabschnitten, welche dem Ort der Manipulation vorausgingen oder folgten (siehe 5.2.2 ).


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5.3. Vergleich der Gruppe KM mit der Gruppe PTA

Die Intervention PTA beeinflußt die Thrombozytenaktivierung, der Eingriff intraarterielle DSA zusätzlich die Sensibilität der Plättchen.

In der Gruppe KM wird dieser Einfluß jeweils zum Zeitpunkt 4 h nach der DSA nachweisbar. Dabei kommt es jedoch wahrscheinlich nur zu einer sehr geringfügigen Anlagerung aktivierter Thrombozyten an Gefäßstrukturen bzw. andere Blutzellen oder zu einer Herabsetzung der Lebensdauer zirkulierender aktivierter Plättchen. Die vermehrte Sensibilität von Thrombozyten führt vermutlich nicht zu einer Anlagerung.

Die PTA wirkt sich auf die Aktivierung der Plättchen zum Zeitpunkt 4 h nach der Intervention aus, führt dabei vermutlich aber auch nur in einem sehr geringen Ausmaß zu einer Anlagerung von Thrombozyten bzw. verkürzten Lebensdauer zirkulierender aktivierter Plättchen.

Während in der Gruppe KM das KM den wichtigsten Einflußfaktor darstellte, wirkten auf die Meßergebnisse der Gruppe PTA nachweisbar die Faktoren KM und Gefäßdilatation ein. Hier wurden die beiden Interventionen anhand relativer prozentualer Differenzen direkt miteinander verglichen, um herauszufinden, ob einer der beiden Eingriffe eine stärkere Aktivierung, Sensibilisierung oder Anlagerung der Thrombozyten verursachte.

Beim Vergleich der nativen arteriellen Proben zwischen den Gruppen KM und PTA anhand der relativen prozentualen vor-nach-Differenzen wurde deutlich, daß die Verteilung der Differenzen bei der Gruppe KM nahezu vollständig im negativen Bereich lag, während sie sich bei der Gruppe PTA mehr auf den positiven Bereich erstreckte (siehe 4.3.1.1 ). Dieser Unterschied war signifikant. Die negative Lage der Differenzen wurde bei der intraarteriellen DSA von höheren Werten unmittelbar nach dem Eingriff verursacht. Bei der PTA hingegen waren kleinere Werte direkt nach der Intervention für die positive Lage der Differenzen verantwortlich.

Diese Beobachtungen führen zu folgenden Schlußfolgerungen:

  1. Bei der intraarteriellen DSA kam es unmittelbar nach dem Eingriff zu einem Anstieg der Relativzahl zirkulierender aktivierter Thrombozyten im arteriellen Stromgebiet.
  2. Direkt nach der PTA sank der prozentuale Anteil aktivierter Plättchen in der systemischen arteriellen Zirkulation.
  3. In dieser Wirkung unterschieden sich die beiden Interventionen signifikant voneinander.

Alle anderen Vergleiche, auch die der in vitro aktivierten Proben, wiesen keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Eingriffen nach.


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Die intraarterielle DSA bewirkte unmittelbar nach dem Eingriff eine Zunahme der Relativzahl zirkulierender aktivierter Thrombozyten im arteriellen Stromgebiet.

Diese Beobachtung spricht für eine Aktivierung, jedoch gegen eine Anlagerung von Plättchen und unterstützt die oben beschriebenen Ergebnisse (siehe 5.2.1 ).

Direkt nach der PTA kam es zu einer Senkung des prozentualen Anteils aktivierter Thrombozyten in der systemischen arteriellen Zirkulation. Somit äußerte sich der Einfluß der PTA auf die Thrombozytenaktivierung in einem unmittelbar nach und 4 h nach (siehe 5.2.2 ) der Intervention belegbaren Abfall der Relativzahl aktivierter Plättchen. Dieser Abfall könnte auf eine Anlagerung bzw. eine verkürzte Lebensdauer aktivierter Thrombozyten zurückzuführen sein.

Da die Theorie der Anlagerung durch den Vergleich der arteriellen mit den venösen Werten (siehe 5.2.4 ) nicht unterstützt wird, ist vermutlich nur eine kleine Menge aktivierter Thrombozyten direkt nach dem Eingriff zum Anlagern befähigt.

Die Gruppen KM und PTA wichen hinsichtlich der relativen prozentualen Differenzen zwischen den Zeitpunkten vor und 4 h nach den Eingriffen nicht signifikant voneinander ab (siehe 4.3.2 ). Deshalb ist es nicht möglich, einen Unterschied zwischen den Interventionen, der sich auf diese Differenzen bezieht, nachzuweisen. Das könnte auf eine Abschwächung des Einflusses der intraarteriellen DSA und der PTA auf die Prozesse der Aktivierung und Sensibilisierung von Thrombozyten in den 4 Stunden nach den Eingriffen hindeuten.

5.4. Einflüsse auf die Gruppen KM und PTA

Die bisherigen Ergebnisse ließen erkennen, daß die intraarterielle DSA und die PTA geringe qualitative Veränderungen der Aktivierung und der Sensibilität von Thrombozyten hervorrufen. Mit dem ”Modell der bivariaten Korrelation nach Spearman“ sollte überprüft werden, ob die gemessenen Werte in den Gruppen KM und PTA von der Quantität unterschiedlicher Interventionsbedingungen (Mengen an Heparin und KM, Dilatationszeiten und -strecken) abhängen.

5.4.1. Einflüsse auf die Gruppe KM

5.4.1.1. Einfluß der KM-Menge

In unserer Studie bestand ein signifikanter Zusammenhang zwischen der während der DSA zugeführten KM-Menge und dem prozentualen Anteil sensibilisierter Thrombozyten im venösen Stromgebiet zum Zeitpunkt 4 h nach der Intervention in bezug auf die Ausgangswerte. Steigende KM-Mengen gingen dabei mit einer kleiner werdenden Relativzahl sensibili-


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sierter Plättchen im lokalen Effluat einher (siehe 4.4.2.1 ). Dieser Zusammenhang könnte auf eine Anlagerung sensibilisierter Thrombozyten bzw. ihre verkürzte Lebensdauer hindeuten. Trotzdem ist der Einfluß des KM auf die Anlagerung und Lebensdauer von Plättchen im Rahmen der intraarteriellen DSA als gering einzuschätzen, da die Sensibilität der Plättchen insgesamt zunahm (siehe 5.2.1 ) und eine Einwirkung der KM-Menge auf den prozentualen Anteil aktivierter Thrombozyten zum Zeitpunkt 4 h nach der DSA nicht nachweisbar war (siehe 4.4.2.1 ). Weiterhin korrelierten die Werte unmittelbar nach der Intervention nicht signifikant mit der KM-Menge (siehe 4.4.1.1 ).

Die bisherigen Beobachtungen lassen eine nur unbedeutende qualitative und quantitative Wirkung des KM, welches den wichtigsten Einflußfaktor während der intraarteriellen DSA darstellt, auf die Aktivierung und die Sensibilität von Plättchen vermuten. Zu ähnlichen Ergebnissen gelangte eine Studie, welche die Aktivierung von Thrombozyten und Leukozyten im Rahmen einer Koronarangiographie sowie einer PTCA untersuchte [ 75 ].

5.4.1.2. Einfluß der Heparinmenge

Wir registrierten eine signifikante Abhängigkeit der Relativzahl aktivierter Thrombozyten von der Heparinmenge im venösen Stromgebiet direkt nach und 4 h nach der intraarteriellen DSA im Vergleich zu den Ausgangswerten. Größere applizierte Mengen an Heparin führten zu einem Anstieg des prozentualen Anteils aktivierter Plättchen im lokalen Effluat unmittelbar nach und 4 h nach dem Eingriff in bezug auf das Ausgangsniveau (siehe 4.4.1.2 und 4.4.2.2 ).

Eine heparininduzierte Thrombozytenaktivierung konnte in vivo und in vitro nachgewiesen werden und kam als Ursache für die begrenzte Effektivität des Heparins hinsichtlich der Prävention arterieller Thrombosen in Frage [ 4 , 90 ]. In vitro wurde jedoch gezeigt, daß Heparin in sehr hohen Dosen (100 I. E./ml) die Expression von CD 62 und die Downregulation von GP Ib unabhängig von der Interaktion mit Antithrombin III und der Gerinnungskaskade hemmte und einen potenten Inhibitor der Aktivierung und Degranulation von Thrombozyten darstellte [ 67 ]. Andererseits wurde beschrieben, daß Heparin in den üblichen Konzentrationen keinen Einfluß auf die Degranulation hatte [ 13 , 71 ] und nicht in der Lage war, die Aktivierung und Aggregation von Plättchen zu verhindern [ 29 ].

Wahrscheinlich ist in dieser Studie der Einfluß des Heparins auf die Meßwerte der Gruppe KM unbedeutend, da ein Anstieg der Zahl aktivierter Plättchen im lokalen Effluat gegen eine Anlagerung spricht und nur jeder dritte Patient während der intraarteriellen DSA Heparin erhielt. Außerdem wirkt sich die Heparinmenge während der Intervention nicht nachweisbar auf die Meßwerte der in vitro aktivierten Proben aus (siehe 4.4.1.2 und 4.4.2.2 ).


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5.4.2. Einflüsse auf die Gruppe PTA

5.4.2.1. Einfluß der KM -Menge

Es konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen der während der PTA applizierten KM-Menge und der Relativzahl aktivierter Thrombozyten im arteriellen Stromgebiet unmittelbar nach der PTA in bezug auf das Ausgangsniveau nachgewiesen werden (siehe 4.4.3.1 ). Steigende KM-Mengen führten zu einem verringerten prozentualen Anteil aktivierter Plättchen in der systemischen arteriellen Zirkulation direkt nach der Intervention im Vergleich zu den Ausgangswerten. Die KM-Menge übte aufgrund dieses Ergebnisses einen Einfluß auf den oben beschriebenen Abfall der Relativzahl aktivierter Thrombozyten unmittelbar nach der PTA (siehe 5.3 ) aus. Das Ausmaß dieses Einflusses ist jedoch als gering einzuschätzen, da selbst doppelte Mengen an KM, die bei der intraarteriellen DSA zum Einsatz kamen, vermutlich nur unbedeutend auf die Aktivierung und Anlagerung von Plättchen sowie ihre Lebensdauer einwirken (siehe 5.4.1.1 ).

Weiterhin bestand ein signifikanter Zusammenhang zwischen der KM-Menge und dem prozentualen Anteil aktivierter Thrombozyten im venösen Stromgebiet zum Zeitpunkt 4 h nach der PTA in bezug auf die Ausgangswerte (siehe 4.4.4.1 ). Wachsende KM-Mengen bewirkten eine Zunahme der Relativzahl aktivierter Plättchen im lokalen Effluat. Diese Beobachtung wurde unter 5.2.2 diskutiert.

Anhand der in vitro aktivierten Proben konnte eine Abhängigkeit der Sensibilität zirkulierender Plättchen von der Menge an zugeführtem KM nicht bewiesen werden (siehe 4.4.3.1 und 4.4.4.1 ).

5.4.2.2. Einfluß der Dilatation

Es bestand ein nachweisbarer signifikanter Einfluß des Dilatationsindexes auf den prozentualen Anteil aktivierter Thrombozyten im arteriellen Stromgebiet direkt nach der PTA im Vergleich zum Ausgangsniveau (siehe 4.4.3.2 ). Längere Dilatationszeiten und zunehmende Ballonlängen führten zu einer verminderten Relativzahl aktivierter Plättchen in der systemischen arteriellen Zirkulation unmittelbar nach der PTA in bezug auf die Werte vor der Intervention. Hier waren die Meßwerte der nativen venösen und der in vitro aktivierten Proben sowie die relativen prozentualen Differenzen, die zwischen den Meßwerten vor und 4 Stunden nach der PTA bestanden, nicht in der Lage, eine Abhängigkeit vom Dilatationsindex zu beweisen (siehe 4.4.3.2 und 4.4.4.2 ).

Diese Beobachtungen machen deutlich, daß die beschriebene Verringerung des prozentualen Anteils aktivierter Thrombozyten direkt nach der PTA (siehe 5.3 ) von der Dilatationsdauer und der Ballonlänge abhängt. Der nachweisbare Abfall der Relativzahl aktivierter Plättchen im arteriellen Stromgebiet kann wahrscheinlich auf eine Anlagerung aktivierter Thrombozyten an Gefäßstruk-


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turen bzw. an andere Blutzellen oder auf eine verminderte Lebensdauer zirkulierender Plättchen zurückgeführt werden. Offenbar ist jedoch nur eine kleine Zahl aktivierter Thrombozyten direkt nach der PTA zum Anlagern befähigt, da sich die Theorie der Anlagerung durch den Vergleich der arteriellen mit den venösen Werten nicht erhärten läßt (siehe 5.2.4 ).

Da eine Wirkung des Heparins auf die Plättchen nicht nachzuweisen (siehe 4.4.3.3 und 4.4.4.3 ) und die Bedeutung des KM nur als sehr gering zu bewerten ist (siehe 5.4.2.1 ), stellt die Dilatation der Gefäßwände den wichtigsten Einflußfaktor auf die Thrombozytenaktivierung bei der PTA dar. Ähnliche Ergebnisse liegen von einer Studie vor, in der die Interventionen Koronarangiographie und PTCA hinsichtlich der Plättchenaktivierung miteinander verglichen wurden [ 35 ].

Wir konnten zwischen dem Dilatationsindex und der Relativzahl aktivierter Thrombozyten im arteriellen Stromgebiet zum Zeitpunkt 4 Stunden nach der PTA bezüglich des Ausgangsniveaus keine signifikanten Unterschiede nachweisen (siehe 4.4.4.2 und 5.3 ).

Deshalb gehen wir davon aus, daß sich der Einfluß der PTA auf die Prozesse der Aktivierung und Anlagerung von Thrombozyten in den 4 Stunden nach der Intervention abschwächt.

5.4.2.3. Einfluß der Heparinmenge

Unterschiedliche während der PTA verabreichte Heparinmengen wirkten sich nicht beweisbar auf die Aktivierung und die Sensibilität der Plättchen aus. Diese Beobachtung unterstützt die Vermutung des geringfügigen Einflusses des Heparins auf die Meßwerte der Gruppe KM.

5.5. Methodenkritik

5.5.1. Anforderungen an die Methode

Eine Methode, die geeignet ist, zirkulierende aktivierte Thrombozyten ex vivo zu untersuchen, soll folgende Bedingungen erfüllen [ 76 ]:

  1. Die aktivierten Thrombozyten müssen möglichst aus dem Gefäß entnommen werden, in welches sie nach der Passage des Ortes der Aktivierung abströmen.
  2. Die Abnahme- und Aufbereitungsprozedur darf keinen zusätzlichen Aktivierungs-Stimulus ausüben.
  3. Die Thrombozyten müssen in einen stabilen Zustand gebracht werden, der bis zum Abschluß der Analyse andauert.

Weiterhin muß die Meßmethode die Voraussetzung dafür schaffen, Informationen über Prozesse der Thrombozytenaktivierung zu erhalten.


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5.5.2. Abnahme der Blutproben

Während und unmittelbar nach den Interventionen intraarterielle DSA und PTA erreichten wir durch die Blutabnahme aus den Schleusen eine geringe Distanz zwischen Aktivierungs- und Entnahmeort der Thrombozyten. Die arterielle Schleuse (in der Arteria femoralis communis) befand sich vor dem bzw. am Beginn des manipulierten Gefäßgebietes und die venöse Schleuse (in der Vena femoralis) im Abstrombereich. Bei den Kontrollgruppen gelang es, mit den durch periphere Venenpunktionen erhaltenen Blutproben Aussagen über das allgemeine Niveau der Plättchenaktivierung zu treffen und Vergleiche mit den Blutproben anzustellen, die wir mit Hilfe einer venösen Schleuse entnahmen.

Werden strömende Thrombozyten hohen Schergeschwindigkeiten ausgesetzt, hat das eine Aktivierung, Adhäsion und Aggregation der Plättchen zur Folge. Je mehr die Schergeschwindigkeiten ansteigen und je länger dieser Einfluß auf die Thrombozyten einwirkt, desto größer ist das Ausmaß der genannten Wirkungen [ 64 ]. Ein initiales Ereignis im Prozeß der strömungsinduzierten Plättchenaggregation scheint die Bindung von vWF an GP Ib zu sein [ 41 ], im weiteren Verlauf bilden sich neben Thrombozytenaggregaten auch Formationen thrombozytärer Mikropartikel heraus [ 33 , 42 ]. Um die physiologischen Schergeschwindigkeiten von 106 - 500 s-1 [ 34 ] nicht zu überschreiten, führten wir die Abnahmen unter minimaler Aspiration durch.

Mit den Agonisten ADP und Phorbolmyristatazetat stimulierte Thrombozyten zeigten in EDTA -Blut so gut wie keine Aggregation im Gegensatz zu dramatischen Anstiegen der Aggregation in Heparin- und Zitratblut [ 6 , 72 ]. Aus diesem Grund kam in dieser Studie EDTA als Antikoagulans zur Anwendung.

Die in unserer Studie vermutete Anlagerung aktivierter und sensibilisierter Thrombozyten infolge einer DSA und PTA könnte näher untersucht werden, wenn die Blutproben statt aus Schleusen mit Hilfe von Kathetern präinterventionell proximal und postinterventionell distal der manipulierten arteriellen Gefäßabschnitte entnommen würden, was in der Durchführung und ethisch problematisch ist.

5.5.3. Aufbereitung der Blutproben

Durch die mit dem Stabilisierungsmittel CyFixII unmittelbar nach der Abnahme der Blutproben durchgeführte Fixierung der nativen Proben konnten die spezifischen, für die Aktivierung der Thrombozyten charakteristischen Epitope bis zur Messung mit wenig Aufwand konstant gehalten werden. Das gleiche galt für die in vitro aktivierten Proben. Das weitverbreitete Fixierungsmittel Formaldehyd wendeten wir in dieser Studie nicht in reiner Form an, da ein dosisabhängiger Ef-


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fekt auf die Expression von CD 62 und CD63 nachgewiesen wurde, der mit üblichen Konzentrationen zu ungenauen Messungen führte [ 11 ].

Nach Modifizierung der unter [ 70 ] angegebenen Methode waren keine weitergehende Präparationen der Plättchen wie z. B. Waschschritte erforderlich, welche den Zustand ihrer Aktivierung hätten beeinflussen können. Indem wir den Blutproben vor ihrer in-vitro-Aktivierung das Tetrapeptid Gly-Pro-Arg-Pro zusetzten, vermieden wir die Entstehung von Thrombozytenaggregaten und damit eine Hauptfehlerquelle bei der Messung aktivierter Plättchen.

5.5.4. Messung der Blutproben

Mit der in dieser Studie angewendeten Durchflußzytometrie konnten spezifische physikalische und chemische Eigenschaften von mehreren Tausend einzelnen Zellen pro Sekunde analysiert werden. Ein sehr großer Vorteil dieser Methode bestand in der Verarbeitung von Vollblutproben, da die Zellen in ihrer natürlichen Umgebung weniger anfällig gegenüber Störfaktoren waren und keine aufwendigen Techniken zur Aufbereitung bzw. Trennung einzelner Zellpopulationen angewendet werden mußten. Die Immunmarkierung mit den für aktivierte Thrombozyten spezifischen Antikörpern zusammen mit der durchgeführten Abnahmemethode erlaubte die Bestimmung des Ortes und der Zeit der Aktivierung der Plättchen während der Interventionen. Die Sensitivität dieser Methode war so hoch, daß bei entsprechend gefärbten Proben 2 aktivierte Plättchen unter 100 Thrombozyten noch erkannt werden konnten [ 5 , 17 ].

P-Selectin ( CD 62) und LIMP -CD63 sind Membran-Bestandteile von Thrombozytengranula und haben die Eigenschaft, nicht auf der Zelloberfläche ruhender Plättchen zu erscheinen. Nach der Aktivierung der Thrombozyten verschmelzen die Granula-Membranen im Rahmen der Exozytose mit der Oberflächenmembran der Plättchen, so daß die beiden GP als Oberflächen-Antigene zur Verfügung stehen. Deshalb waren die in unserer Studie verwendeten Antikörper gegen CD62 und CD63 dafür geeignet, als Aktivierungsmarker zu fungieren [ 11 ]. Da die beiden Antigene erst in einem relativ späten Stadium der Thrombozytenaktivierung, nach der Degranularisierung, erschienen, war es uns nicht möglich, frühzeitige durch die Aktivierung ausgelöste Veränderungen von Zellstrukturen zu analysieren [ 5 ]. Das könnte eine Ursache für die überwiegend sehr geringen Beträge der bei der Datenanalyse in unserer Studie nachgewiesenen statistisch signifikanten Differenzen darstellen. Für eine Bestimmung der Eigenschaften nur schwach aktivierter Plättchen sowie zur Differenzierung prä- und postinterventionell aktivierter Thrombozyten müßten Methoden entwickelt werden, welche frühere Phasen im Prozeß der Aktivierung und Sensibilisierung von Plättchen erfassen.


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Die Verwendung von direkt mit FITC bzw. R-Phycoerythrin konjugierten Antikörpern machte den Einsatz zusätzlicher Antikörper und weiterer Aufbereitungsprozeduren, die eine unkontrollierte in-vitro-Aktivierung der Thrombozyten hätten verursachen können, überflüssig. Da die Antikörper eine monoklonale Abstammung besaßen, verringerte sich die Wahrscheinlichkeit des Auftretens unspezifischer Bindungen [ 76 ]. Die Konstanz der unspezifischen Bindungen überprüften wir durch die statistische Auswertung der Meßwerte jeweils mitgeführter Blutproben, welche mit FITC-markierten isotypischen Maus- IgG 1-Kontroll-Antikörpern gefärbt waren (Isotypkontrollen).

Es wurde gezeigt, daß die Erfassung der Formveränderung von Plättchen einen sensibleren Indikator für die in-vitro-Aktivierung darstellt als die Untersuchung der Expression aktivierungsspezifischer Oberflächen-Antigene. Da die Formveränderung jedoch reversibel ist, konnten wir sie nicht als Grundlage für die Bewertung in vivo aktivierter Thrombozyten heranziehen. Die Bestimmung der Expression spezifischer Oberflächen-Antigene hingegen hat für klinische Aussagen über die Eigenschaften von Thrombozyten in vivo eine höhere Sensitivität [ 70 ]. Deshalb bildete sie die Grundlage für die Meßmethode in dieser Studie und wurde auch für die Analyse der in vitro aktivierten Plättchen verwendet, um vergleichbare Daten zu erhalten.

Ein Problem bei der Analyse der Thrombozyten in einem Durchflußzytometer stellt die richtige Eingrenzung der Thrombozytenpopulation im Scatterplot-Diagramm für FSC und SSC dar (gating, siehe 3.4.3 ). Dabei müssen folgende Faktoren berücksichtigt werden:

  1. Das Streulicht ist nicht nur von vorgegebenen Faktoren wie Wellenlänge und Gestalt des Laserstrahles sowie der Anordnung der Detektoren abhängig, sondern auch von veränderlichen Größen wie dem Zellvolumen, der Gestalt und inneren Struktur der Zellen, ihrer Orientierung im Strom der Durchflußkammer und dem Brechungsindex von Zytoplasma und Nukleus [ 88 ]. Somit spielten bei unseren Messungen zufällige Einflüsse eine Rolle, deren Ausmaß wir durch die Erfassung großer Zellzahlen begrenzten.
  2. Wenn die Anregung der Emission durch einen Laserstrahl mit einer Wellenlänge von 488 nm erfolgt, entspricht die Autofluoreszenz einer Zelle durchschnittlich der Fluoreszenz von 10000 FITC -Molekülen und ist der wichtigste die Sensitivität limitierende Faktor bei Messungen der extrinsischen Zellfluoreszenz [ 16 ]. Da wir größere Zellen mit einer höheren Autofluoreszenz (wie z. B. Leukozyten) durch die Eingrenzung der Thrombozytenpopulation von der Analyse ausschlossen, verringerte sich dieser Einfluß.

    72

  3. GP Ib ( CD 42b), ein Bestandteil des GPIb-IX-Komplexes, ist ein auf nicht aktivierten Plättchen in konstanter Menge vorhandener thrombozytenspezifischer Oberflächenrezeptor, der infolge einer Aktivierung mit Agonisten in vitro als auch durch eine Verletzung von Gefäßwänden in vivo unabhängig von der Degranulation downreguliert wird [ 1 , 54 ]. Trotz der Downregulation ist es mit Hilfe von spezifischen mit R-Phycoerythrin markierten Antikörpern gegen dieses GP möglich, Thrombozyten im Scatterplot-Diagramm zuverlässig zu definieren [ 6 ]. Eine Reduktion der Expression von GPIb um 50 % hatte keinen Einfluß auf das Adhäsionsverhalten strömender Thrombozyten [ 91 ]. Dennoch besteht eine Beschränkung unserer Methode darin, Ereignisse in der umgrenzten polygonalen Region (siehe 3.4.3 ) als GPIb-positive Partikel charakterisieren zu müssen und nicht als einzelne Thrombozyten [ 6 ]. Durch die vorgenommene Eingrenzung der Thrombozytenpopulation verhinderten wir jedoch die Einbeziehung eventuell noch vorhandener größerer Thrombozytenaggregate in die Messungen.

5.5.5. Statistik

Die Reproduzierbarkeit unserer Ergebnisse überprüften wir im Vorfeld der Untersuchungen mit der Bestimmung der Intra-Assay-Varianz an Meßreihen gleicher Blutproben. So konnten wir die durchgeführten Einzelmessungen sowie signifikante Abweichungen in den statistischen Analysen bezüglich des Betrages bzw. der Relevanz beurteilen und verzichteten aus Kostengründen auf Mehrfachbestimmungen.

Eine Einschränkung in der Methode der statistischen Datenanalyse bestand darin, nur Aussagen über Relativzahlen, nicht hingegen über absolute Werte, aktivierter und sensibilisierter Thrombozyten treffen zu können. Weiterhin waren die Beträge der in unserer Studie aufgezeigten signifikanten Differenzen in der Plättchenaktivierung oftmals sehr gering und lagen in einigen Fällen in der Größenordnung der Intra-Assay-Varianz mit errechneten Variationskoeffizienten von 5 - 10 %. Die Ursache könnte in der Eigenschaft unserer verwendeten Antikörper gegen CD 62 und CD63 begründet liegen, relativ späte Stadien in der Thrombozytenaktivierung zu erfassen und somit keine Informationen über frühzeitige Prozesse in der Aktivierung zirkulierender Plättchen bereitzustellen.

Für die Einschätzung der klinischen Bedeutung unserer Ergebnisse wäre es notwendig, Methoden zu entwickeln, die Angaben über absolute Zahlen aktivierter und sensibilisierter Thrombozyten bereitstellen und frühzeitige Veränderungen im Prozeß der Plättchenaktivierung registrieren. Das Auftreten okklusiver vaskulärer Komplikationen nach den Interventionen DSA und PTA müßte anhand prospektiver Studien analysiert werden.


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