Finke, Kerstin: Untersuchung paraloger SEC61-Gene und -Proteine in Eukaryoten

2

Kapitel 2. Einleitung

2.1 Proteintranslokationssysteme

Der Transport von Proteinen ist für einzellige wie vielzellige Organismen von essentieller Bedeutung. Dies gilt für den Import oder Export von Proteinen ebenso wie für den Transport an unterschiedliche Bestimmungsorte innerhalb der Zelle. Dabei müssen oftmals Membranen überquert werden, die zum einen als Abgrenzung der Zelle gegenüber ihrer Umgebung fungieren, zum anderen durch Kompartimentierung auch der räumlichen wie funktionellen Strukturierung des Zellinneren dienen. Die Lipidschichten der Membranen sind nur für kleine unpolare oder ungeladene polare Moleküle permeabel. Alle geladenen oder größeren Moleküle benötigen Transportmoleküle oder Kanäle für die Durchquerung dieser Membranen. Auf diese Weise wird ein kontrollierter Transport ermöglicht.

An Transportsysteme für Proteine werden hohe Anforderungen gestellt, da es sich dabei um den Transport teilweise sehr großer Moleküle handelt. Um eine einwandfreie Funktion der Proteine in ihrer korrekten subzellulären Lokalisation zu gewährleisten, muß Proteintransport zielgerichtet, effizient und mit großer Zuverlässigkeit erfolgen. Fast ein Drittel aller Zellproteine sind Membranproteine, und auch viele lösliche Proteine durchqueren eine oder mehrere Membranen, um ihren finalen Bestimmungsort innerhalb oder außerhalb der Zelle zu erreichen. Somit müssen fast die Hälfte aller in einer durchschnittlichen Zelle synthetisierten Proteine in Membranen integriert oder durch Membranen transloziert werden. Es ist daher nicht verwunderlich, daß sich in den Zellen ausgefeilte Translokationssysteme für den Proteintransport durch diverse Membranen etabliert haben.

Einen vergleichenden Überblick über die verschiedenen Translokationssysteme gibt der Artikel von Schatz und Dobberstein (1996). Die Autoren unterscheiden zwei Hauptgruppen von Proteintransportsystemen: Exportsysteme und Importsysteme (Tab. 1). Als Exportsysteme werden solche Translokatoren verstanden, die Proteine aus dem Zytosol in extrazytosolische Kompartimente wie beispielsweise das Periplasma von Bakterien, das Lumen des Endoplasmatischen Retikulums (ER), das Thylakoidlumen von Chloroplasten oder die innere Mitochondrienmembran transportieren. Demgegenüber transportieren Importsysteme Proteine in Kompartimente, die funktional dem Zytosol äquivalent sind oder sich entwicklungsgeschichtlich von Zytosol ableiten (Endosymbiontentheorie). Dies ist der Fall für die gekoppelten Translokationskanäle der äußeren und inneren Membranen von Mitochondrien und Chloroplasten sowie für die Peroxisomenmembranen. Mitochondrien und Chloroplasten besitzen damit sowohl Export- als auch Importsysteme für den Proteintransport.


3

Tab. 1. Transportsysteme zur Proteintranslokation. Aufgeführt sind die Membranen durch die der Proteintransport stattfindet, sowie in Klammern Ausgangs- und mögliche Zielorte der transportierten Proteine (Einteilung nach Schatz und Dobberstein, 1996).

Exportsysteme

Importsysteme

Innere Membran von Bakterien

(Zytosol Zytoplasmamembran/Periplasma)

Äußere und Innere Membran von Mitochondrien

(Zytosol Matrix/Innere Membran/Äußere

Membran/Intermembranraum)

Membran des Endoplasmatischen Retikulums

(Zytosol ER-Membran/ER-Lumen)

Äußere und Innere Membran von Chloroplasten

(Zytosol Stroma/Innere Membran/Äußere

Membran/Intermembranraum)

Innere Membran von Mitochondrien

(Matrix Innere Membran)

Peroxisomale Membran

(Zytosol Matrix)

Innere Membran von Chloroplasten/Thylakoidmembran

(Stroma Innere Membran/Intermembranraum/

Thylakoidmembran/Thylakoidlumen)

 

Gemeinsam sind allen diesen Transportsystemen folgende Charakteristika:

  1. Die transportierten Proteine tragen in aller Regel eine aminoterminale Signalsequenz, die oftmals noch während des Transportes abgespalten wird.
  2. Auf der cis-Seite der Membran befindet sich ein „Targeting“-System, das die zu transportierenden Proteine zum Translokationskanal geleitet. Dieses besteht zumeist aus zytosolischen Faktoren und in der Membran lokalisierten Rezeptoren.
  3. Der Transport erfolgt durch einen heterooligomeren Transportkanal, der sich sowohl zum Zielkompartiment hin als auch lateral in die Membran öffnen kann.
  4. Ein peripher mit dem Translokationskanal verbundener Protein-Translokationsmotor liefert die Energie für den Transport des Proteins durch Hydrolyse von Nukleosid-Triphosphaten.
  5. In den meisten Fällen bleibt das zu transportierende Protein während der Translokation zumindest teilweise ungefaltet.
  6. Auf der trans-Seite des Translokationskanals befindet sich ein System zur Faltung der transportierten Proteine.

Diese allgemeinen Charakteristika treffen auf die meisten Translokationssysteme und Transportsubstrate zu, es finden sich jedoch auch Ausnahmen: So wurde beispielsweise eine Gruppe von integralen Membranproteinen beschrieben, die keine Signalsequenz, sondern ein carboxyterminal gelegenes hydrophobes Segment besitzen und deren Transportmechanismus sich von denen mit aminoterminaler Signalsequenz unterscheidet (Kutay et al., 1993, 1995). Weitere Beispiele finden sich für den peroxisomalen Transport, der in mehreren Aspekten von dem der übrigen Translokationssysteme abweicht. So können beispielsweise peroxisomale „Targeting“-Sequenzen (PTS) aminoterminal oder carboxyterminal gelegen sein. Darüber hinaus konnte der Import stabil gefalteter, teilweise sogar oligomerisierter Proteine in Peroxisomen gezeigt werden (Walton et al., 1995; Glover et al., 1994).


4

Zahlreiche Komponenten der oben genannten Translokationssysteme sind in den letzten Jahrzehnten identifiziert und zum Teil auch isoliert und charakterisiert worden. Dabei zeigten besonders die untersuchten Exportsysteme eine im Zuge der Evolution starke Konserviertheit der einzelnen Proteinkomponenten. Dies trifft insbesondere für den Vergleich der Translokationssysteme durch die bakterielle Zytoplasmamembran und die Membran des ER in Eukaryoten zu. Aber auch das Translokationssystem in der Thylakoidmembran der Chloroplasten ähnelt stark dem bakteriellen System. Die starke Konservierung der zentralen Komponenten der Translokationssysteme beschränken sich jedoch nicht nur auf Prokaryoten und Eukaryoten, sondern erstrecken sich auch auf Archaebakterien, wie Pohlschröder et al. (1997) in einem aktuellen Übersichtsartikel zeigten.

Da sich die vorliegende Arbeit mit Aspekten der Proteintranslokation durch die ER-Membran in Eukaryoten beschäftigt, soll das hierfür erforderliche Transportsystem im folgenden näher beschrieben werden. Dabei werden auch Vergleiche zum bakteriellen Translokationssystem gezogen.

2.2 Proteintranslokation durch die Membran des Endoplasmatischen Retikulums

Die Synthese eines jeden Proteins beginnt an freien Ribosomen im Zytosol. Proteine, die nicht dort verbleiben sollen, tragen in der Regel an ihrem Aminoterminus sogenannte Signal- oder Leitsequenzen, die sie für den Transport in die unterschiedlichen Kompartimente, wie beispielsweise den Kern, die Plastiden oder die verschiedenen Komponenten des sekretorischen Weges, kennzeichnen. Letztgenannter führt über das ER und den Golgi-Apparat per Vesikeltransport zu Lysosomen, Endosomen, der Zytoplasmamembran oder zum Transport aus der Zelle heraus. Die meisten Proteine, lösliche wie auch Membranproteine, deren finaler Bestimmungsort entlang dieses sekretorischen Weges liegt oder die für den Export aus der Zelle vorgesehen sind, müssen somit zunächst durch die ER-Membran transportiert oder in sie integriert werden.

Die Signalsequenz, die Proteine für den Transport durch die ER-Membran determiniert, ist bei den meisten Proteinen aminoterminal (N-terminal) lokalisiert. Die N-terminalen Signalsequenzen weisen keine strikte Konsensussequenz, sondern eine charakteristische dreigeteilte Struktur auf: Einem positiv geladenen Aminoterminus folgt ein Abschnitt aus mindestens sechs hydrophoben Aminosäureresten und einer eher polaren carboxyterminalen (C-terminalen) Region ohne geladene Aminosäurereste, an deren Ende sich oftmals eine Schnitterkennungsstelle für die Signalpeptidase befindet (von Heijne, 1985). In diesem Fall wird die Signalsequenz auf der luminalen Seite der ER-Membran von dem translozierten Protein abgetrennt. Dies kann noch während des Translokationsvorgangs durch den in der ER-Membran lokalisierten Enzymkomplex der Signalpeptidase geschehen.

Für viele integrale Membranproteine ist die Signalsequenz mit dem ersten Membrananker identisch. Der hydrophobe Abschnitt dieser sogenannten Signalankersequenzen muß lang genug sein, um die Membran zu durchspannen. Die hydrophoben Regionen der meisten Signalanker weisen eine Länge von 20 - 30 Aminosäureresten auf (Nilsson et al., 1994). Diese Transmembransegmente fungieren als „Stop-Transfer“-Sequenzen, d.h. sie werden vom


5

Translokationsapparat erkannt, stoppen die Translokation und bewirken, daß sich die Translokationspore lateral öffnet und das Segment in die Membran entläßt. Es finden sich aber auch integrale Membranproteine, bei denen diese beiden Funktionen getrennt sind und auf eine aminoterminale Signalsequenz eine weiter carboxyterminal gelegene hydrophobe „Stop-Transfer“-Sequenz aus 20 - 30 Aminosäuren folgt. In diesem Fall wird die Translokation durch die Signalsequenz initiiert und die „Stop-Transfer“-Sequenz wird zum ersten Transmembransegment.

Proteine mit aminoterminaler Signalsequenz können auf zweierlei Weise durch die ER-Membran transloziert werden: kotranslational oder posttranslational. Im ersten Fall wird noch während der Translation des Proteins durch das Ribosom die wachsende Polypeptidkette durch die Membran transloziert; im zweiten Fall wird das Protein zunächst im Zytosol vollständig synthetisiert und erst anschließend transloziert. Durch den Einsatz sehr unterschiedlicher methodischer Ansätze konnten in den vergangenen Jahren viele Komponenten, die an der Translokation von Proteinen in das Endoplasmatische Retikulum beteiligt sind, identifiziert, etliche davon gereinigt und hinsichtlich ihrer Funktion getestet werden.

Dazu beigetragen haben:

Darüber hinaus konnten elektrophysiologische Untersuchungen und Fluoreszenz-abschwächungsexperimente das Vorhandensein eines großen, hydrophilen Translokations-kanals von etwa 40 - 60 Å Durchmesser nachweisen (Simon und Blobel, 1991; Crowley et al., 1993, 1994; Hamman et al., 1997). Durch elektronenmikroskopische Bilder schließlich konnten Translokationskanäle als ringförmige Strukturen sichtbar gemacht werden (Hanein et al., 1996).

Wie sich herausstellte, werden einige Komponenten des Translokationsapparates, wie beispielsweise der Translokationskanal für den Transport durch bzw. die Integration in die Membran, sowohl für die ko- als auch für die posttranslationale Translokation genutzt. Andere Komponenten dagegen, wie beispielsweise die benötigten zytosolischen Faktoren, sind für die einzelnen Wege spezifisch. Im folgenden sollen beide Translokationsmodi dargestellt werden.

2.2.1 Die kotranslationale Translokation

Bei der kotranslationalen Translokation sind Translation und Translokation eines Proteins gekoppelt. In einer ersten - als „Targeting“ bezeichneten - Phase muß der Komplex aus Ribosom, mRNA und naszierender Polypeptidkette spezifisch an die ER-Membran transportiert werden (Abbildung 1). Dazu bindet ein Ribonukleoproteinkomplex, das SRP (= Signal Recognition Particle), an die Signalsequenz der naszierenden Polypeptidkette, sobald diese den Tunnel der großen ribosomalen Untereinheit soweit verlassen hat, daß sie zugänglich ist. Die Bindung des SRP an die Signalsequenz bewirkt eine starke Verlangsamung der Proteinsynthese. So wird die vorzeitige Faltung der wachsenden


6

Polypeptidkette verhindert, während das SRP seine zweite Funktion ausführt, nämlich das Ribosom mit der naszierenden Kette an die ER-Membran zu dirigieren. Dort ist der SRP-Rezeptor (auch „docking protein“ genannt) lokalisiert, an den der Komplex aus Ribosom, naszierender Kette und SRP binden kann. Durch die Interaktion zwischen SRP und dem SRP-Rezeptor wird die selektive Bindung des Ribosoms mit der naszierenden Kette an den Translokationskomplex in der ER-Membran ermöglicht. Neuere Arbeiten zeigen, daß die Spezifität dieses „Targeting“-Schrittes an die ER-Membran von zytosolischen Faktoren unabhängig ist und allein auf das Vorhandensein einer funktionellen Signalsequenz und der Bindung des SRP an diese zurückzuführen ist (Neuhof et al., 1998; Raden und Gilmore, 1998). Guanosin-Triphosphat (GTP)-Hydrolyse durch SRP und SRP-Rezeptor, die sich als GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) gegenseitig zu stimulieren scheinen (Powers und Walter, 1995) führt zur Freisetzung von SRP und SRP-Rezeptor, die damit beide für eine weitere „Targeting“-Runde zur Verfügung stehen. Mit der Bindung des Ribosoms und der naszierenden Kette an die Translokationspore kann nun die zweite Phase, die eigentliche Translokation der Polypeptidkette durch die ER-Membran, beginnen.

Im Säugersystem konnte in Rekonstitutionsexperimenten gezeigt werden, daß nur drei Membrankomponenten für den kotranslationalen Transport von Proteinsubstraten in vitro erforderlich sind: der SRP-Rezeptor, das TRAM-Protein (s.u.) und der heterotrimere Sec61p-Komplex (Görlich und Rapoport, 1993). Photochemische Quervernetzungsexperimente zeigten, daß die multimembranspannende alpha-Untereinheit des Komplexes (Sec61alpha) sich während des gesamten Transfers durch die Membran in unmittelbarer Nähe zu der naszierenden Kette befindet (High et al., 1991, 1993a; Kellaris et al., 1991; Görlich et al., 1992b; Mothes et al., 1994; Nicchitta et al., 1995). Aus diesen Experimenten ließ sich schließen, daß der trimere Sec61p-Komplex eine zentrale Rolle bei der Translokation von Proteinen durch die ER-Membran spielt und vermutlich die Hauptkomponente der Translokationspore darstellt. Neuere, elektronenmikroskopische Untersuchungen unterstützen diese Annahme durch den Nachweis ringförmiger Strukturen aus jeweils 3 bis 4 heterotrimeren Sec61p-Komplexen sowohl in rekonstituierten Proteoliposomen als auch in nativen Membranen (Hanein et al., 1996).

Der Sec61p-Komplex bildet nicht nur die Pore, sondern fungiert auch als Ribosomenrezeptor (Kalies et al., 1994). Wie kryoelektronenmikroskopische Bilder zeigen, bildet dabei der aus dem Sec61-Oligomer gebildete Kanal in der ER-Membran eine direkte Verlängerung des Kanals in der großen ribosomalen Untereinheit, durch den das naszierende Polypeptid das Ribosom verläßt (Beckmann et al., 1997). Die Bindung des Ribosoms zum Sec61p-Komplex ist zu Beginn der Translokation nur locker, denn die naszierende Polypeptidkette ist für Proteasen noch zugänglich und unter hohen Salzkonzentrationen extrahierbar. Infolge der Kettenverlängerung durch Translation bildet sich im weiteren eine festere Bindung zwischen Ribosom und Sec61p-Komplex. Nun kann die naszierende Kette weder proteolytisch angegriffen noch durch hohe Salzkonzentrationen extrahiert werden. Dieser Schritt setzt allerdings voraus, daß die naszierende Polypeptidkette eine funktionelle Signalsequenz aufweist. Somit findet hier offenbar im Inneren der Membran ein zweiter Signalsequenz-Erkennungsschritt statt, der schließlich zu einer vollständigen Insertion der naszierenden Kette in den Translokationskanal führt (Jungnickel und Rapoport, 1995).

Der hydrophobe Abschnitt der Signalsequenz befindet sich in dieser frühen Phase der Translokation in unmittelbarer Nähe sowohl zum Sec61p-Komplex als auch zu Lipiden (Martoglio et al., 1995). Untersuchungen von Mothes et al. (1998) deuten darauf hin, daß es


7

Abbildung 1. Modell der kotranslationalen Translokation. Schematisch dargestellt sind das „Targeting“ (mit SRP-Zyklus) des Ribosoms und der naszierenden Kette an die ER-Membran sowie frühe Stadien der Translokation (nach Rapoport et al., 1996, modifiziert). (I) „Targeting“: Sobald die Signalsequenz der wachsenden Polypeptidkette das Ribosom verlassen hat, kann SRP sowohl an die Signalsequenz als auch an das Ribosom binden (Schritt 1). Im 2. Schritt bindet der Komplex aus Ribosom, naszierender Kette und SRP an die ER-Membran. Dies geschieht durch Wechselwirkungen sowohl zum SRP-Rezeptor (SR) als auch zum Sec61p-Komplex, der die Translokationspore bildet. Im folgenden kommt es zu einer kooperativen Bindung von GTP sowohl an SRP als auch an die alpha-Untereinheit des SRP-Rezeptors (SRalpha) (Schritt 3; Rapiejko und Gilmore, 1997). Daraufhin kann die Signalsequenz von SRP auf die alpha-Untereinheit des Sec61p-Komplexes (Sec61alpha) übertragen werden (Schritt 4). Damit ist das „Targeting“ abgeschlossen und die eigentliche Translokation der Polypeptidkette kann beginnen. Durch GTP-Hydrolyse sowohl durch SRP als auch SRalpha kann SRP sich vom SR lösen (Schritt 5). Aufgrund ihrer geringen Affinität zu GDP können SRP und SRalpha in ihren Nukleotid-freien Zustand zurückkehren (Schritt 6) und stehen damit für eine weitere „Targeting“-Runde zur Verfügung.
(II) Translokation: Schritt 7 zeigt die Insertion der naszierenden Kette in die Translokationspore. Dabei hat die Signalsequenz zum Sec61p-Komplex und zusätzlich zur Lipidschicht Kontakt. Das Ribosom ist in dieser Phase nur locker an den Sec61p-Komplex gebunden. Im weiteren nimmt das naszierende Polypeptid im Zuge der Kettenverlängerung eine Loop-Struktur an, und die Signalsequenz wird in einem Erkennungsschritt, in den der Sec61p-Komplex und das TRAM-Protein involviert sind, ein weiteres Mal überprüft. Bei funktioneller Signalsequenz resultiert nun die endgültige Insertion der naszierenden Kette in die Translokationspore: die Signalsequenz ist in Kontakt mit dem TRAM-Protein, das Ribosom ist fest an den Sec61p-Komplex gebunden, und die Translokationspore öffnet sich zum Lumen hin (Schritt 8). Schritt 9 zeigt die Phase der Translokation, in der die Signalsequenz bereits abgeschnitten ist, TRAMp befindet sich nicht länger in unmittelbarer Nähe zu der naszierenden Kette, die mittlerweile eine transmembrane Orientierung angenommen hat. Die wachsende Polypeptidkette wird durch einen kontinuierlichen, nach außen fest versiegelten Kanal aus Ribosom und Sec61p-Komplex durch die Membran transferiert (für weitere Einzelheiten und Referenzen, siehe Text).


8

eine spezifische Bindungsstelle für Signalsequenzen an der Grenzfläche zwischen dem Kanal und den umgebenden Lipiden gibt. In Säugerzellen konnte zudem für den geladenen aminoterminalen Bereich der Signalsequenz der Kontakt zu einem weiteren Membranprotein, TRAMp (Translocating chain-associating membrane protein), nachgewiesen werden (Görlich et al., 1992a; High et al., 1993b; Mothes et al., 1994). Die Funktion des TRAM-Proteins ist bislang nicht eindeutig geklärt. Voigt et al. (1996) zeigten, daß TRAMp für die Translokation der meisten sekretorischen Proteine notwendig ist und daß diese Notwendigkeit durch die Signalsequenz determiniert wird. Zudem könnte TRAMp eine Rolle bei der kotranslationalen Integration von Membranproteinen spielen (Do et al., 1996; Knight und High, 1998).

In dieser frühen Phase der Translokation ist die Translokationspore sowohl zum ER-Lumen als auch durch das Ribosom zum Zytosol hin dicht verschlossen (Crowley et al., 1993). Dabei spielt möglicherweise das luminale Hsp70-Protein BiP („binding to immunoglobulin precursors“) eine wichtige Rolle (Hamman et al., 1998). Die Öffnung der Pore zum ER-Lumen hin findet erst statt, wenn die naszierende Kette eine kritische Länge von mindestens 70 Aminosäureresten erreicht hat (Crowley et al., 1994). Dies entspricht interessanterweise der gleichen Kettenlänge, die für den zweiten Signalsequenz-Erkennungsschritt erforderlich ist (Jungnickel und Rapoport, 1995). Möglicherweise wird der Verschlußmechanismus der Translokationspore also durch die Signalsequenz reguliert.

Im einfachsten Fall des Transportes sekretorischer Proteine kann nach Öffnung der Translokationspore nun die eigentliche Translokation des Proteins erfolgen. Indem das Ribosom den Tunnel des Translokons zum Zytoplasma hin versiegelt, bleibt dem weiter synthetisierten Protein nur eine Richtung, die in das ER-Lumen. Ob das Ribosom die naszierende Kette dabei aktiv durch die Membran schiebt, wie es durch die GTP-betriebene Polypeptid-Elongationsmaschinerie des Ribosoms denkbar wäre, ist bislang unklar. Diskutiert wird auch eine Zugwirkung von Chaperonen der Hsp70-Proteinfamilie im ER-Lumen. Brodsky et al. (1995) beobachteten die Notwendigkeit von Hsp70 (BiP) beim kotranslationalen Transport von Invertase in Hefe-Mikrosomen. Dagegen war im rekonstituierten Säugersystem aus gereinigten Membranproteinen für den kotranslationalen Transport keine Beteiligung von Hsp70 (BiP) erforderlich (Görlich und Rapoport, 1993).

Vergleicht man diese Prozesse der Translokation von Proteinen mit denen der Integration von Membranproteinen in die ER-Membran, so erfordert letztere noch ein weit komplexeres Zusammenspiel der Komponenten der Translokationsmaschinerie. Einige Abschnitte werden in das Lumen transloziert, andere verbleiben im Zytoplasma, und die hydrophoben Segmente, die das Protein letztendlich in der Membran verankern sollen, müssen in der richtigen Orientierung in die Lipidschicht integriert werden. Neuere Arbeiten zeigen, daß dies durch ein strikt reguliertes Aufeinanderfolgen von Bindung, Ablösung und erneuter Bindung des Komplexes aus Ribosom und naszierender Kette an die Translokationspore ermöglicht wird (Mothes et al., 1997; Liao et al., 1997). Dabei ist die Pore zu jedem gegebenen Zeitpunkt in höchstens eine Richtung geöffnet, so daß die Permeabilitätsbarriere gewahrt bleibt (Liao et al., 1997).

Im ER-Lumen erfolgt noch während der Translation und Translokation des Proteins die Abspaltung der Signalsequenz durch den Signalpeptidase-Komplex, sofern eine Schnitterkennungsstelle vorhanden ist. Auch kann gegebenenfalls N-Glykosylierung durch den Oligosaccharyltransferase-Komplex stattfinden. Beide Enzymkomplexe sind


9

vermutlich - zumindest im aktiven Translokon - eng mit dem Transportkanal assoziiert. Durch chemische Quervernetzung konnten kürzlich Interaktionen zwischen der beta-Untereinheit des Sec61p-Komplexes (Sec61beta) und der 25 kD-Untereinheit des Signalpeptidase-Komplexes (SPC25) nachgewiesen werden. Diese waren von der Anwesenheit membrangebundener Ribosomen abhängig. Somit scheint die Rekrutierung des Signalpeptidase-Komplexes an das Translokon induziert zu werden, wenn die Translokation durch Ribosomenbindung an die Membran initiiert wird (Kalies et al., 1998). Ähnliches mag für die Rekrutierung des Oligosaccharyltransferase-Komplexes gelten.

2.2.2 Die posttranslationale Translokation

Die posttranslationale Translokation in Eukaryoten ist bislang am besten in der Hefe Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) untersucht. Dabei werden die unreifen Vorläufer-proteine (Präkursoren) vollständig im Zytosol synthetisiert und vom Ribosom abgelöst, bevor sie durch die ER-Membran transloziert werden (Abbildung 2). Durch Bindung zytosolischer Chaperone der Hsp70-Familie an die Transportsubstrate wird eine vorzeitige Faltung, bei der die Proteine eine transport-inkompetente Konformation annehmen könnten, verhindert. ATP-abhängige Ablösung aus diesen Komplexen kann wiederum zur Freisetzung kurzer, ungefalteter und damit translokationskompetenter Abschnitte der Moleküle führen. Zytosolische Faktoren, die - vergleichbar dem SRP bei der kotranslationalen Translokation - für die Signalsequenzerkennung und das „Targeting“ der Präkursorproteine an die ER-Membran verantwortlich sein könnten, sind für die posttranslationale Translokation bislang nicht bekannt. Mehr weiß man dagegen über die am Transport beteiligten Komponenten in der ER-Membran:

Im Hefesystem konnte gezeigt werden, daß ein Teil der trimeren Sec61p-Komplexe mit dem tetrameren Komplex aus Sec62p, Sec63p, Sec71p und Sec72p im großen Sec-Komplex assoziiert vorliegt, ein anderer Teil dagegen mit membrangebundenen Ribosomen assoziiert ist. Während letzterer ein Intermediat des kotranslationalen Transportes repräsentiert, könnte der heptamere Sec-Komplex die Funktionseinheit für den posttranslationalen Transport von Präkursorproteinen darstellen. Panzner et al. (1995) konnten zeigen, daß im Hefesystem für den posttranslationalen Transport in vitro der gereinigte Sec-Komplex als einzige Membrankomponente zusammen mit ATP und dem luminalen Hsp70-homologen Protein BiP (= Kar2p in Hefe) als stimulierenden Faktor ausreichend ist.

Quervernetzungsstudien von Plath et al. (1998) deuten darauf hin, daß die Signalsequenz des Präkursorproteins in einer ATP- und BiP-unabhängigen Reaktion von dem multimembran-spannenden Sec61p erkannt und gebunden wird. Die spezifische Bindungsstelle für die Signalsequenz liegt dabei an der Grenzfläche von Lipid und Translokationskanal zwischen den Transmembransegmenten 2 und 7 des Sec61p. Während die Signalsequenz an Sec61p gebunden ist, bildet sie eine Helix aus, deren eine Seite in unmittelbarer Nachbarschaft zu Sec62p und Sec71p gelegen ist. Der C-Terminus des Präkursors konnte zudem mit Sec72p quervernetzt werden. Für die übrigen Komponenten des Sec-Komplexes, Sec63p, Sbh1p und Sss1p konnten dagegen keine Quervernetzungsprodukte nachgewiesen werden.

Da die Transportrichtung nicht wie beim kotranslationalen Transport durch den Komplex aus Ribosom und Translokon vorgegeben wird, muß sie durch andere Mechanismen beeinflußt


10

werden. In diesem Fall scheint eine Zugfunktion des Hsp70-Chaperons BiP gesichert. In Anwesenheit von ATP bindet BiP im Lumen an die DnaJ-homologe Domäne des Sec63-Proteins (Scidmore et al., 1993; Lyman und Schekman, 1995, 1997) und damit an den Sec-Komplex. Für den Zugmechanismus gibt es im wesentlichen zwei Modellvorstellungen: Die erste, die sog. „Braunsche Ratsche“ („Brownian ratchet“), geht davon aus, daß BiP an bereits translozierte Abschnitte des Proteins bindet und so einen Rücktransport in Richtung Zytoplasma verhindert. Auf diese Weise würde eine ungerichtete Braunsche Bewegung des zu translozierenden Moleküls im Translokationskanal in einen gerichteten Transport verwandelt. Gemäß diesem Modell wäre allerdings die Translokationsrate durch die Rate, mit der sich gefaltete Proteine spontan entfalten, limitiert. Nach dem zweiten, dem sog. „Translokationsmotor-Modell“ könnte BiP an die translozierende Kette binden und durch eine ATP-getriebene Konformationsänderung aktiv ein Stück des gebundenen Proteins durch die Membran ziehen. So würde BiP direkt zur Entfaltung des Präkursors beitragen. Beide Modelle schließen sich nicht notwendig aus. Möglicherweise richtet sich BiP in seiner Funktionsweise danach, ob das Präkursorprotein in mehr oder weniger stark gefalteter Form vorliegt (Schatz und Dobberstein, 1996).

Abbildung 2. Modell der posttranslationalen Translokation. Zytosolische Chaperone der Hsp70-Proteinfamilie binden im Zytosol an Präkursorproteine, die für den Transport durch die ER-Membran vorgesehen sind (Schritt 1). Die Signalsequenz wird in Abwesenheit von ATP von Sec61p erkannt und gebunden (Schritt 2). Die Insertion in den Translokationskanal erfolgt in einer Loop-Struktur, die Signalsequenz interkaliert dabei an der Grenzfläche zwischen Kanal und Lipiden zwischen die Transmembrandomänen 2 und 7 des Sec61p. Die Signalsequenz befindet sich dabei ebenfalls in unmittelbarer Nachbarschaft zu Sec62p und Sec71p, der C-Terminus des Präkursors zusätzlich noch zu Sec72p. Die eigentliche Translokation der Peptidkette wird in einer ATP-abhängigen Reaktion durch das luminale Hsp70-Protein BiP vermittelt (Schritt 3). Dafür ist eine Wechselwirkung des BiP-Proteins mit der DnaJ-homologen Domäne des Sec63p notwendig. (Schematische Darstellung unter Berücksichtigung der Ergebnisse von Plath et al., 1998)

2.2.3 Ko- versus posttranslationaler Transport

Der Translokationsmodus eines Proteins wird durch verschiedene Faktoren bestimmt. Zum einen scheinen speziesspezifische Prioritäten zu bestehen, die sich möglicherweise durch die Lebensumstände der Zelle bzw. des Organismus erklären lassen. So sind beispielsweise


11

einzellige Lebewesen sehr viel größeren Schwankungen ihrer äußeren Umgebung unterworfen, auf die sie schnell und flexibel reagieren müssen. Im Vergleich dazu halten sich die Einflüsse auf eine einzelne Zelle in einem multizellulären Organismus in einem relativ konstanten Rahmen. Auch die Geschwindigkeit der Polypeptidsynthese kann für die Bevorzugung des einen oder anderen Translokationsmodus eine Rolle spielen. Da die Affinität des SRP zur Signalsequenz mit wachsender Kettenlänge abnimmt (Wiedmann et al., 1987), wird bei hoher Syntheserate das Zeitfenster für die Bindung des SRP an die naszierende Kette sehr klein, so daß es zu einer Bevorzugung des posttranslationalen Transportweges kommt.

Überwiegend kotranslationale Translokation von Proteinen durch die ER-Membran findet man in Säugerzellen. Dabei ist nicht auszuschließen, daß es auch in diesen Zellen ein Sec-abhängiges System für die posttranslationale Translokation gibt, das unter bestimmten Bedingungen oder von einer bestimmten Gruppe von Proteinen benutzt werden kann. Mit großer Sicherheit existiert in Säugerzellen ein Sec-unabhängiges posttranslationales Transportsystem, das (zumindest) für die Integration der Gruppe von Membranproteinen verantwortlich ist, die keine Signalsequenz besitzen und über ein carboxyterminal gelegenes hydrophobes Segment in die ER-Membran integriert werden (sog. „tail-anchored proteins“, Kutay et al., 1995).

In Escherichia coli (E. coli) werden die meisten Proteine posttranslational durch die Zytoplasmamembran transportiert. Dazu bindet das zytosolische Chaperon SecB an vollständig translatierte Vorläuferproteine. SecB interagiert an der Plasmamembran spezifisch mit der zytosolischen ATPase SecA, die wiederum den Transport des Präkursors durch das Translokon vermittelt. Dessen zentrale Einheit wird durch den trimeren SecYEG-Komplex gebildet (vgl. auch Abschnitt 2.3.1). E. coli besitzt jedoch mit einer 4,5 S RNA und den Proteinen Ffh und FtsY auch ein SRP/SRP-Rezeptor-homologes System, das ein kotranslationales „Targeting“ an die Plasmamembran ermöglicht. Im heterologen in vitro-System konnten SRP und SRP-Rezeptor aus Säugerzellen durch die homologen bakteriellen Komponenten ersetzt werden (Powers und Walter, 1997). Die Membrankomponenten des Translokationskomplexes scheinen für beide „Targeting“-Modi dieselben zu sein (Valent et al., 1998). Neuere Arbeiten zeigten, daß der SRP-Weg überwiegend von einer Gruppe von Plasmamembranproteinen genutzt wird (Macfarlane und Müller, 1995; Ulbrandt et al., 1997).

Für die Hefe S. cerevisiae konnte gezeigt werden, daß ein SRP-abhängiger kotranslationaler Transportweg und ein SRP-unabhängiger posttranslationaler Weg parallel in der Zelle existieren. Bei Analysen der Signalsequenzen diverser Präkursorproteine wurde gefunden, daß diese drei distinkte Klassen bilden: Einige Proteine werden SRP-abhängig, andere SRP-unabhängig transportiert, und eine dritte Klasse von Proteinen kann beide Translokationswege benutzen (Ng et al., 1996). Bereits früher wurde beobachtet, daß bei Ausschalten des SRP-abhängigen Weges (durch Deletion einzelner Komponenten des SRP oder des SRP-Rezeptors) nach einiger Zeit eine physiologische Adaptation auftritt: Zellen, die in Abwesenheit von SRP oder SRP-Rezeptor über einen längeren Zeitraum kultiviert wurden, zeigten keine nennenswerten Defekte in der Proteintranslokation mehr. Diese Adaptation wurde nicht durch Suppressormutationen verursacht, sondern war auf einen physiologischen Prozeß zurückzuführen (Ogg et al., 1992). Der SRP-abhängige Translokationsweg kann in diesen Zellen also effektiv umgangen werden. Diese Möglichkeit der Anpassung wird entscheidend dadurch erleichtert, daß beide Wege der Translokation gemeinsame Module wie beispielsweise den die Translokationspore bildenden Sec61p-Komplex nutzen.


12

2.3 Die Komponenten des Translokationsapparates

2.3.1 Entwicklungsgeschichtliche Konservierung

Die Proteintranslokationssysteme in Membranen gleichen phylogenetischen Ursprungs zeigen sich im Vergleich eukaryotischer und prokaryotischer Zellen hoch konserviert. Das trifft in besonderem Maße für den Proteintransport durch die ER-Membran in eukaryotischen Zellen und den Proteinexport durch die Zytoplasmamembran (innere Membran) in Eubakterien und Archaebakterien zu.

Konserviert sind nicht nur die am Transport direkt beteiligten Membranproteine und Proteinkomplexe, sondern auch Komponenten, die beispielsweise für das „Targeting“ des Transportsubstrats an die Membran oder für die Prozessierung des transportierten Proteins verantwortlich sind. Tabelle 2 zeigt einen Vergleich der wichtigsten Komponenten für den Proteintransport durch die eukaryotische ER-Membran bzw. prokaryotische Zytoplasmamembran in den bislang hauptsächlich untersuchten Modellsystemen: Säugerzellen, S. cerevisiae und E. coli; zusätzlich noch in Archaebakterien. Diese stehen beispielhaft für die zahlreichen mittlerweile bekannten homologen Gene und Proteine aus Organismen aller drei Reiche: Eukaryoten, Eubakterien und Archaebakterien. Die weitreichende Konservierung der Translokationssysteme zeigt, daß sich diese Variante des Proteintransports durch Membranen sehr früh in der Evolution entwickelt haben muß.

Ausführlicher eingegangen werden soll an dieser Stelle auf die Komponenten des zentralen Translokationskomplexes, namentlich den die Translokationspore bildenden Sec61-Komplex.

2.3.2 Der trimere Sec61p-Komplex

Der heterotrimere Sec61p-Komplex in Säugerzellen erfüllt, wie bereits in Abschnitt 2.2.2. ausgeführt, im wesentlichen drei Funktionen: die Translokationspore in der ER-Membran wird durch oligomere Ringe des Sec61p-Komplexes gebildet; der Sec61p-Komplex fungiert als Ribosomenrezeptor, und er ist nach dem SRP für einen zweiten Signalsequenz-Erkennungsschritt in der ER-Membran verantwortlich.

Homologe trimere Komplexe zum Säuger-Sec61p-Komplex sind in zahlreichen eukaryotischen und prokaryotischen Organismen gefunden worden. In Saccharomyces cerevisiae besteht dieser Komplex aus Sec61p, Sbh1p und Sss1p (Panzner et al., 1995), die homolog zu der alpha-, beta- bzw. gamma-Untereinheit des Säuger-Sec61p-Komplexes sind (Görlich et al., 1992b; Hartmann et al., 1994, Panzner et al., 1995). Strukturhomologe Proteine zu Sec61alpha/Sec61p bzw. Sec61gamma/Sss1p finden sich bei Bakterien in SecY bzw. SecE. Diese sind Komponenten des heterotrimeren SecYEG-Komplexes, der eine zentrale Rolle im bakteriellen Proteinexport spielt (Stirling et al., 1992, Görlich et al., 1992b, Hartmann et al., 1994). Zwischen Sec61beta/Sbh1p und SecG dagegen besteht keinerlei Homologie. Die in Archaebakterien gefundenen homologen Proteine der alpha- und gamma-Untereinheit sind ausnahmslos den entsprechenden eukaryotischen Untereinheiten näher verwandt als den eubakteriellen. Auch ein Gen mit Ähnlichkeit zu Sec61beta, aber kein SecG-Homolog wurde in Archaebakterien gefunden (Pohlschröder et al., 1997).


13

Tabelle 2. Vergleich der wichtigsten Komponenten für den Proteintransport durch die eukaryotische ER-Membran (Säugerzellen; S. cerevisiae) bzw. prokaryotische Zytoplasmamembran (E. coli; Archaebakterien). Homologe Komponenten finden sich in einer Zeile. Quellen: SRP/SRP-Rezeptor: Walter und Johnson, 1994 und darin zitierte Originalia; The Signal Recognition Particle Database (SRPDB, Larsen et al., 1998). Sec-Komponenten/TRAM/BiP: Rapoport et al., 1996 und darin zitierte Originalia; Pohlschröder et al., 1997; Daimon et al., 1997 (HTP1); H.A. Meyer und E.Hartmann, unveröffentlicht (Säuger-Sec63). Signalpeptidase: Meyer und Hartmann, 1997 und darin zitierte Originalia. Oligosaccharyltransferase: Silberstein und Gilmore, 1996 und darin zitierte Originalia; MacGrogan et al., 1996; Karaoglu et al., 1997; Smith et al., 1997; Zambrowicz et al., 1998.

Funktion

Komponente

Säuger

S. cerevisiae

E. coli

(Eubakterien)

Archae-

bakterien

„Targeting“

SRP

7S-RNA

SRP9

SRP14

SRP19

SRP54

SRP68

SRP72

scR1

Srp14p

Sec65p

Srp21p

Srp54p

Srp68p

Srp72p

4.5S-RNA

P48, Ffh

SRP-RNA

SRP19

SRP54

SecB

 

 

SecB

 

SRP-Rezeptor

(SR)

SRalpha

SRbeta

SRalpha (SR101)

SRbeta

FtsY

SRalpha

Translokation

Sec61-Komplex

Sec61alpha

Sec61beta

Sec61gamma

Sec61p1)

Sbh1p

Sss1p1)

SecY1)

SecE1)

SecG

Sec61alpha

Sec61beta3)

Sec61gamma

Sec62/63-Komplex

HTP12)

Sec63

Sec62p1)

Sec63p1)

Sec71p

Sec72p

 

 

TRAM

TRAMp

 

 

 

SecD/F

 

 

SecD

SecF

SecD

SecF

BiP4)

BiP

Kar2p1)

 

 

SecA5)

 

 

SecA1)

 

Prozessierung

Signalpeptidase-

Komplex

25 kD, SPC25

22 kD, SPC22/23

21 kD, SPC21

18 kD, SPC18

12 kD, SPC12

Spc2p

Spc3p

Sec11p

"

Spc1p

Lep1p

"

Sec11

Oligosaccharyl-transferase-

Komplex

Ribophorin I

Ost5

Ribophorin II

48 kD, OST48

DAD1

Stt3

N33

64 kD, Ost1p

9,5 kD, Ost5p

30 kD, Swp1p

45 kD, Wbp1p

16 kD, Ost2p

78 kD, Stt3p

3,6 kD, Ost4p

34 kD, Ost3p

 

Stt3

1) essentielles Protein

2) Funktionshomologie bislang nicht nachgewiesen

3) mögliches homologes Protein

4) Funktion in Translokation und Faltung

5) Funktion in „Targeting“ und Translokation


14

Der Grad der Homologie differiert für die einzelnen Proteinuntereinheiten der trimeren Komplexe. Am stärksten konserviert sind die alpha-Untereinheiten. Säuger Sec61alpha und Sec61p aus S. cerevisiae weisen 55% identische Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtsequenz auf; in einzelnen Transmembransegmenten und zytoplasmatischen Loops ist die Ähnlichkeit noch weit größer (Görlich et al., 1992b). Die Topologie dieser multimembranspannenden Proteine wurde für SecY und Sec61p aus Hefe experimentell bestimmt (Akiyama und Ito, 1987; Wilkinson et al., 1996), für Sec61alpha aus Säuger wurden mit Hilfe unterschiedlicher Computerprogramme aufgrund von Hydropathie-Plots Vorhersagen erstellt (Görlich et al. 1992b). In allen Fällen ergab sich übereinstimmend, daß es sich bei SecY wie auch bei Sec61alpha aus Säuger und Sec61p aus Hefe um Proteine handelt, die zehn transmembranspannende Segmente aufweisen und deren N- und C-Terminus sich im Zytoplasma befinden. Die multimembranspannenden alpha-Untereinheiten sind daher geradezu prädestiniert für die Bildung der Translokationspore.

Die beta- und gamma-Untereinheiten der trimeren Komplexe in Hefe und Säuger durchspannen die Membran jeweils einfach. Sie gehören zu den Typ-II Membranproteinen, deren C-Terminus sich im Lumen des ER befindet, und zudem zu der Gruppe von ER-Proteinen ohne N-terminale Signalsequenz, die über ein C-terminal gelegenes hydrophobes Segment Sec61-unabhängig in die Membran inserieren (Hartmann et al., 1994). Das Säuger-Sec61gamma und Sss1p aus Hefe sind mit 43% identischen Aminosäureresten relativ stark konserviert, das Säugerprotein kann in Hefezellen die Funktion des Sss1p ersetzen (Hartmann et al., 1994). Sss1p bindet im Bereich der Transmembransegmente 6-8 an Sec61p (Wilkinson et al., 1997). Die Bindungsstelle überlappt somit vermutlich mit der für die Signalsequenz des Transportsubstrats (Plath et al., 1998). Es wurde daher die Hypothese aufgestellt, daß das Sss1p als Ersatz-Signalsequenz fungieren könnte, wenn in Abwesenheit eines Translokationssubstrates der Kanal in seiner geschlossenen Form vorliegt. Die Signalsequenz eines Präkursorproteins könnte das Sss1p von der Sec61p-Bindungsstelle verdrängen und damit den Kanal für den Polypeptidtransport öffnen. Dem Sss1p würde damit die wichtige Aufgabe zufallen, den translokationsinaktiven Kanal zu verschließen (Plath et al., 1998).

Sec61beta und Sbh1p zeigen von allen Untereinheiten der trimeren Komplexe die geringste Ähnlichkeit zueinander, nur 22% der Aminosäurereste sind identisch. Die von der Größe her mittlere Untereinheit des homologen SecY-Komplexes in Escherichia coli, SecG, weist sogar keinerlei Ähnlichkeit mit den eukaryotischen beta-Untereinheiten auf.

Im Grad ihrer Konserviertheit spiegelt sich die (Un-)Entbehrlichkeit der Proteine für die Funktion der Zelle wider; rückblickend läßt sich somit auch die Reihenfolge der Entdeckung, der Hefeproteine verstehen:

Bereits in den achtziger Jahren wurde in Hefe in genetischen Screens auf Defektmutanten in der Sekretion Sec61p als ein an der Translokation in das ER beteiligtes Protein identifiziert (Deshaies und Schekman, 1987). Etliche Präkursoren sekretorischer oder vakuolärer Proteine akkumulierten bei nicht-permissiver Temperatur in der untersuchten temperatur-sensitiven (ts-)Mutante. Deletion des SEC61-Gens ist für die Hefezelle letal.

Dies gilt ebenso für die Deletion des Hefegens SSS1, jedoch wurde Sss1p nicht in einem Screen auf Sekretionsmutanten gefunden, sondern als Multicopy-Suppressor des sec61-ts-Allels (Sss1 steht für Sec sixty-one suppressor 1; Esnault et al., 1993). Depletion des Proteins mit Hilfe eines regulierbaren Promotors vor dem SSS1-Gen führte zur Akkumulation diverser sekretorischer und vakuolärer Proteine im Zytoplasma.


15

Die dritte Komponente in Hefe wurde nicht durch genetische Screens, sondern durch chromatographische Reinigung des ribosomen-assoziierten Sec61p-Komplexes gefunden und als homologes Protein der beta-Untereinheit des trimeren Sec61p-Komplexes aus Säugern identifiziert (Sbh1 = Sec61beta homolog 1; Panzner et al., 1995).

Die Identifizierung der entsprechenden Säugerproteine gelang wie bereits oben genannt durch photochemische Quervernetzungsexperimente (Sec61alpha; Görlich et al., 1992b) und Reinigung des trimeren Komplexes aus Hundepankreas (Sec61beta und -gamma; Görlich und Rapoport, 1993).

2.3.3 Der heptamere Sec-Komplex

In S. cerevisiae findet sich außer dem trimeren Sec61p-Komplex der heptamere Sec-Komplex (vgl. auch Abschnitt 2.2.2.), der sich aus dem trimeren Sec61p-Komplex und dem tetrameren Sec62p/Sec63p-Komplex zusammensetzt. Letzterer besteht aus den Membranproteinen Sec62p, Sec63p, Sec71p und Sec72p (Panzner et al., 1995), von denen SEC62 und SEC63 als essentielle Gene in Screens auf Defektmutanten in der Translokation von Proteinen gefunden wurden (Rothblatt et al., 1989). Sec71p und Sec72p wurden sowohl in genetischen Screens (Green et al., 1992; Kurihara und Silver, 1993) als auch biochemisch als Proteine, die mit Sec62p und Sec63p assoziiert vorliegen, entdeckt (Deshaies et al., 1991; Feldheim et al., 1993; Feldheim und Schekman, 1994). Beide Proteine sind nicht essentiell für die Zelle. Die Deletion des SEC71-Gens führt zur Abwesenheit sowohl des Sec71- als auch des Sec72-Proteins und zeigt phänotypisch ein temperatur-sensitives Wachstum und Translokationsdefekte (Fang und Green, 1994). Deletion des SEC72-Gens resultiert nicht in einem Wachstumsphänotyp aber in der Akkumulation einiger Präkursorproteine (Fang und Green, 1994; Feldheim und Schekman, 1994). Panzner et al. (1995) konnten zeigen, daß sich mit Hilfe des heptameren Sec-Komplexes der posttranslationale Transport von Proteinen im Hefesystem rekonstituieren läßt. Für einen effizienten Transport ist zudem die Anwesenheit von ATP und von luminalem Kar2p (BiP) notwendig.

Möglicherweise existieren ähnliche Komplexe auch in anderen Organismen: Für das Sec62p wurde ein homologes Protein in Drosophila, Dtrp1 (Drosophila translocation protein 1), identifiziert, das nicht nur ein Struktur-, sondern sogar ein Funktionshomologes darstellt (Noel und Cartwright, 1994). Daimon et al. (1997) beschrieben die cDNA eines humanen Gens HTP1 (Human translocation protein 1) kodierend für ein Protein, das eine Identität von 36,3% (Ähnlichkeit von 64,6%) zum Dtrp1 aufweist. Die Transkription dieses Gens konnte in Gewebeproben diverser Organe nachgewiesen werden. Auch ein mögliches Sec63p-Homologes im Menschen wurde gefunden (H.A. Meyer und E. Hartmann, unveröffentlichte Ergebnisse). Für Sec71p oder Sec72p dagegen wurden bislang keine homologen Proteine entdeckt.

2.4 Paraloge SEC61-Gene in Eukaryoten - Problemstellung

In den vorangegangenen Abschnitten wurde die starke entwicklungsgeschichtliche Konservierung der zentralen Komponenten des Translokationsapparates für den Proteintransport durch die ER-Membran dargelegt. Überraschend finden sich in einigen eukaryotischen Organismen innerhalb einer Spezies zwei homologe SEC61-Gene.


16

Abbildung 3. Schema zur Verdeutlichung der Begriffe homolog, ortholog und paralog. Beispielhaft gezeigt ist ein Dendrogramm für fünf homologe Gene (und ggf. deren Genprodukte) aus vier Organismen. Der rote Querbalken markiert ein Genduplikations-ereignis. Die Gene 3a und 3b finden sich innerhalb eines Organismus und sind somit paralog zueinander. Gen 3a und Gen 3b sind jeweils ortholog zu den Genen 1, 2 und 4.

Zur begrifflichen Abgrenzung von Homologen zwischen verschiedenen Spezies, die man als ortholog bezeichnet, spricht man innerhalb einer Spezies von paralogen Genen bzw. Proteinen (Fitch, 1970). Letztere lassen sich auf eine entwicklungsgeschichtlich zurückliegende Gen-duplikation zurückführen und haben sich im folgenden parallel weiterentwickelt.

Im Falle des SEC61 wurden paraloge Gene sowohl in diversen Säugerzellen und in Forelle (Görlich et al., 1992b; S. Prehn und E. Hartmann, unveröffentlicht) als auch in der Hefe S. cerevisiae (Feldmann et al., 1994) gefunden. Stellt man nun die Frage nach der funktionellen Bedeutung paraloger Sec61-Proteine für die Zelle bzw. den Organismus, so ist keine für alle oben genannten Fälle gültige Antwort zu erwarten. Denn während beispielsweise in Säugerzellen die beiden paralogen SEC61alpha-Gene und erst recht die Proteine ein hohes Maß an Übereinstimmung zeigen, unterscheiden sich in der Hefe die beiden Sec61-Proteine sehr deutlich voneinander. Somit kann sich die Untersuchung des Phänomens paraloger SEC61-Gene in den genannten Eukaryoten nicht beispielhaft auf einen Organismus beschränken.

Die vorliegende Arbeit untersucht die paralogen SEC61-Gene und -Proteine in Säugerzellen und in S. cerevisiae und gibt damit erste Antworten auf die Frage nach der funktionellen Bedeutung der paralogen Sec61-Proteine. Bedingt durch die jeweils spezifische Ausgangssituation im Säuger und in der Hefe mußte dabei eine unterschiedliche Vorgehensweise gewählt werden.

Die Experimente im Säugersystem sollten zeigen, daß es sich bei der SEC61-Variante um ein funktionell exprimiertes Gen und nicht um ein Pseudogen handelt. Außerdem konnte in diesem multizellulären Organismus die Möglichkeit der zell- oder gewebespezifischen Expression der beiden paralogen Gene überprüft werden.

In der Hefe S. cerevisiae sollte detailliert analysiert werden, ob das gefundene paraloge Protein Ssh1p (für Sec sixty-one homolog 1) eine dem Sec61p vergleichbare Rolle bei der Proteintranslokation durch die ER-Membran spielt. Einige der dafür zu untersuchenden Aspekte waren beispielsweise die Lokalisation des Proteins und dessen Entbehrlichkeit für das Wachstum der Zelle im allgemeinen und den Proteintransport im besonderen. Des weiteren wurde gefragt, ob das Ssh1p mit denselben Komponenten des Translokationsapparates assoziieren kann wie Sec61p oder möglicherweise mit anderen. In diesem Zusammenhang wurde untersucht, ob auch zu den anderen beiden Untereinheiten des trimeren Sec61-Komplexes paraloge Gene und Proteine existieren. Im Rahmen der Charakterisierung des Ssh1p wurde zudem die Bedeutung der beta-Untereinheiten für die Proteintranslokation durch die ER-Membran näher untersucht.


[Titelseite] [Abkürzungsverzeichnis] [1] [2] [3] [4] [5] [6] [Bibliographie] [Lebenslauf] [Selbständigkeitserklärung] [Danksagung]

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Thu Sep 14 11:45:05 2000