Finke, Kerstin: Untersuchung paraloger SEC61-Gene und -Proteine in Eukaryoten

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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Zwei SEC61alpha-Gene in Säugerzellen

Nach der Entdeckung des Sec61alphap in Säugerzellen wurden im Zuge der Klonierung des dafür kodierenden Gens überraschend auch Teilsequenzen gefunden, die auf die Existenz eines zweiten, paralogen SEC61alpha-Gens hindeuteten (Görlich et al., 1992b). In Abgrenzung zum SEC61alpha-I-Gen, das für das bekannte Sec61alpha-Protein kodiert, wird im folgenden das paraloge Gen mit SEC61alpha-II bezeichnet. Beide Gene wiesen in den vorhandenen Teilsequenzen ein hohes Maß an Identität auf, jedoch wurde beim „Screening“ von cDNA-Banken diverser Säugerspezies nicht ein einziger vollständiger Klon des SEC61alpha-II-Gens gefunden. Dabei gab es unter den isolierten Klonen nicht nur unvollständige, sondern auch falsch gespleißte mit fehlendem Exon, Rasterschub oder nicht-herausgeschnittenem Intron. Abbildung 4 zeigt schematisch die zu Beginn der Arbeit vorliegenden Klone aus drei cDNA-Banken.

Abbildung 4. Übersicht über die zu Beginn der Arbeit vorliegenden Klone der beiden SEC61alpha-Gene aus drei Säugerspezies. Die Klone der beiden humanen Gene HS-SEC61alpha-I und -II (HS-1 und HS-2) stammen aus dem Screening einer cDNA-Bank aus HeLa-Zellen, die Sequenzen der Gene RN-SEC61alpha-I und -II (RN-1 und RN-2) aus dem Screening einer cDNA-Bank aus Ratten-Leber und die Sequenzen der Gene CF-SEC61alpha-I und -II (CF-1 und CF-2) aus dem Screening einer cDNA-Bank aus MDCK-Zellen (Madin-Darby-canine kidney-Zellen). RN-2 ist ein falsch gespleißter Klon mit Rasterschub. CF-2 sind zwei einzelne, unvollständige Klone. Balken markieren kodierende Sequenzabschnitte, Linien die flankierenden nicht-kodierenden Bereiche. Die Länge der jeweiligen Abschnitte ist durch die Anzahl der Nukleotide angegeben. Der vollständig kodierende Bereich ist für beide Gene 1431 bp (Basenpaare) lang.

3.1.1 Vergleich der Nukleinsäure- und Proteinsequenzen

Um einen Sequenzvergleich der paralogen SEC61alpha-Gene im gesamten kodierenden Bereich und auf Proteinebene zu ermöglichen, war es notwendig, die Teilsequenzen der SEC61alpha-II-Gene zu ergänzen. Zudem warf das Auffinden von ausschließlich unvollständigen Klonen des SEC61alpha-II-Gens in den untersuchten cDNA-Banken die Frage auf, ob für dieses Gen überhaupt ein durchgängiges offenes Leseraster („open reading frame“, ORF) existiert, von dem das Gen in voller Länge transkribiert werden könnte. Daher wurde in einem ersten Schritt überprüft, ob sich die fehlenden Sequenzabschnitte mittels der Methode der RT-PCR (reverse transcribed-polymerase chain reaction) nachweisen ließen. Dazu wurde RNA aus


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verschiedenen Säugerzellen revers transkribiert und die resultierende cDNA (komplementäre DNA) als Ausgangspunkt für die Amplifikation der ausgewählten Sequenzabschnitte durch PCR benutzt. Genabschnitte im Bereich des Stop-Kodons sowie der 3´-nicht-translatierten Regionen wurden durch die Methode des 3´-race (vgl. Abschnitt 5.2.6.) amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden anschließend über ein Agarose-Gel gereinigt und sequenziert.

Auf diese Weise konnte die Sequenz des humanen SEC61alpha-II-Gens vervollständigt und nachfolgend ein Klon in voller Länge generiert werden. Für die entsprechenden Gene in Ratte und Hund ließ sich der fehlende Sequenzabschnitt zwischen Nukleotid 462 und 615 (vgl. Abb. 4) durch die RT-PCR amplifizieren. Darüber hinaus wurden mit gleicher Methode die Sequenzen der beiden SEC61alpha-Gene aus Maus ermittelt (jeweils mit Ausnahme des äußersten 5´-kodierenden Bereiches). Komplettiert werden diese durch kürzlich in der NCBI GenBank publizierte EST (expressed sequence tag)-Sequenzen (vgl. Legende zu Abb. 5). Somit liegt zum jetzigen Zeitpunkt die vollständige Sequenzinformation der beiden paralogen SEC61alpha-Gene, sowohl für den Menschen als auch für die Maus, vor. Die Lokalisation der beiden humanen Gene konnte mit Hilfe der NCBI-Datenbank ebenfalls ermittelt werden: Das SEC61alpha-I-Gen ist auf Chromosom 3, das SEC61alpha-II-Gen auf Chromosom 10 lokalisiert.

Die ergänzten Sequenzen in den vier genannten Säugerspezies wurden für den Vergleich der SEC61alpha-Gene und im weiteren der davon kodierten Proteine zugrunde gelegt. Abbildung 5 zeigt den Vergleich auf Nukleinsäureebene beispielhaft für die kodierenden Bereiche der beiden paralogen SEC61alpha-Gene aus Maus. Ein Vergleich der SEC61alpha-Gene aller vier untersuchten Säugerspezies findet sich unter 6.2. im Anhang.

Das SEC61alpha-II-Gen zeichnet sich durch eine außerordentlich hohe Konserviertheit im Vergleich der verschiedenen Spezies aus, was entschieden gegen die Annahme eines Pseudogens spricht. So findet man auf Nukleinsäureebene bei den beiden paralogen SEC61alpha-Genen innerhalb einer Spezies zwischen 77 und 79 % identische Nukleotide, während das Ausmaß der Identität im Vergleich der vier Säugerspezies für die homologen SEC61alpha-I-Gene 85 - 90 % und für die homologen SEC61alpha-II-Gene sogar bis zu 94 % beträgt.

Tabelle 3. GC-Gehalt der untersuchten Säuger-SEC61alpha-Gene

Säugerspezies

GC-Gehalt

SEC61alpha-I

SEC61alpha-II

Mensch

51 %

46 %

Hund

53 %

43 % a)

Ratte

53 %

49 % b)

Maus

53 %

46 %

a) Nukleotide 1 - 1245 des kodierenden Bereiches

b) Nukleotide 277 - 1431 des kodierenden Bereiches

Die acht untersuchten SEC61alpha-Gene wurden auch hinsichtlich ihres GC-Gehaltes analysiert Wie Tabelle 3 zeigt, weisen die homologen SEC61alpha-I-Gene durchweg einen GC-Gehalt von über 50% auf, während der GC-Gehalt der SEC61alpha-II-Gene für alle vier unter-suchten Spezies unter 50% liegt.

Noch deutlicher wird die starke Konserviertheit auf Proteinebene: Die Sec61alpha-I-Proteine wie auch die Sec61alpha-II-Proteine sind - soweit die Sequenzen bekannt sind - im Vergleich der verschiedenen Spezies zu 100 % konserviert (mit einer Ausnahme: das Sec61alpha-I-Protein aus dem Hund weist an Position 343 einen Austausch - Histidin statt Tryptophan - im Vergleich zu allen übrigen Sec61alpha-Proteinen auf). Im Vergleich zwischen Sec61alpha-Ip und Sec61alpha-IIp finden sich 31 konservierte Austausche bei einer Gesamtlänge von 476 Aminosäureresten, das entspricht einer Identität der beiden Proteine von 93,5 % (Abbildung 6). Die Austausche finden sich über das gesamte Protein verteilt, etwa ein Drittel davon liegen in dem gemäß der Hydrophobizitätsanalysen vorhergesagten luminalen Loop zwischen den Transmembran-regionen sieben und acht (TM7 und TM8). Bei der Mehrzahl der Austausche handelt es sich um sehr ähnliche Aminosäurereste.


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Abbildung 5. Vergleich der DNA-Sequenzen der kodierenden Region des SEC61alpha-I-Gens (MM-1) und des SEC61alpha-II-Gens (MM-2) der Maus. Identische Nukleinsäurereste sind grau unterlegt. Unterstreichung mit einer Wellenlinie markiert Genabschnitte, deren Sequenzinformation aus ESTs (expressed sequence tags) stammt, die in der GenBank des NCBI veröffentlicht sind (Marra, M. et al., Mouse EST Project; für MM-1: Acc.No. AA410008 und AA245328; für MM-2: Acc.No. AI006571).


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Abbildung 6. Vergleich der Aminosäuresequenzen der beiden Sec61alpha-Proteine, die durch die Gene SEC61alpha-I und SEC61alpha-II in Säugerzellen kodiert werden. Fett gedruckte Sequenzen markieren membranspannende Segmente, farbig markierte Aminosäurereste kennzeichnen Unterschiede zwischen beiden Sequenzen

Die Sequenzanalysen konnten somit zum einen zeigen, daß das SEC61alpha-II-Gen einen durchgängigen ORF besitzt, zum anderen konnte nachgewiesen werden, daß die Austausche zwischen den beiden paralogen Sec61alpha-Proteinen in allen untersuchten Spezies konserviert sind. Das SEC61alpha-II-Gen unterliegt also offenbar ebenfalls einem Selektionsdruck. Beide Argumente sprechen dafür, daß es sich bei dem SEC61alpha-II-Gen nicht um ein Pseudogen, sondern um ein funktionell exprimiertes Gen handelt. Damit stellt sich die Frage nach der Bedeutung zweier nahezu identischer Proteine für die Zelle bzw. den Organismus. Gleichzeitig werden die Schwierigkeiten bei der Untersuchung offenbar: Da zum Zeitpunkt der Untersuchungen keine zwischen den beiden Proteinen differenzierende Peptidantikörper zur Verfügung standen, wurde der Versuch unternommen, auf RNA-Ebene per Northern Blotting zu einer differenzierenden Analyse zu gelangen, was jedoch nicht erfolgreich war. Erst mit der bereits oben genannten Methode der RT-PCR gelang es, zwischen den beiden SEC61alpha-Transkripten zu unterscheiden, und so die Expression beider Gene zu untersuchen.


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3.1.2 Analyse der Expression beider SEC61alpha-Gene mittels RT-PCR

Die Expression der beiden SEC61alpha-Gene wurde in einer ersten Auswahl verschiedener Organe (Hirn, Herz, Niere, Leber und Milz) und acht Embryonalstadien (Tag 8,5 bis Tag 15,5) der Maus sowie diversen Zellinien und zwei Primärkulturen (Astrozyten und Hippocampusneuronen) unterschiedlicher Spezies untersucht. Dazu wurde aus den Geweben und Zellen RNA isoliert und revers transkribiert. Die resultierende cDNA war Ausgangspunkt für PCR-Reaktionen mit für die beiden Gene jeweils spezifischen (= typ-spezifischen) Primerpaaren. Die resultierenden PCR-Produkte wurden in Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt, daraus isoliert und durch Sequenzierung auf ihre Typ-Spezifität hin überprüft. In allen Fällen erhielt man bei Einsatz typ-spezifischer Primer eindeutig entweder Fragmente des SEC61alpha-I-Gens oder des SEC61alpha-II-Gens. In den Kontrollansätzen mit gemischten Primerkombinationen, d.h. ein Primer spezifisch für das SEC61alpha-I-Gen und der zweite spezifisch für das SEC61alpha-II-Gen, waren keine PCR-Produkte nachweisbar (nicht gezeigt). Weiterhin wurde kontrolliert, ob die PCR-Produkte tatsächlich auf revers transkribierte RNA zurückgingen und nicht auf möglicherweise kontaminierende genomische DNA in den RNA-Präparationen: Für jede eingesetzte RNA wurde bei der reversen Transkription parallel ein Kontrollansatz mitgeführt, der alle Bestandteile für die Reaktion mit Ausnahme der Reversen Transkriptase enthielt. Die anschließenden PCR-Reaktionen mit Material aus den Kontrollansätzen ergaben in keinem Fall ein PCR-Produkt (nicht gezeigt). Dies zeigt, daß das SEC61alpha-II-Gen tatsächlich transkribiert und daher sehr wahrscheinlich auch translatiert wird. Somit erlaubt die hier gewählte Methode der RT-PCR eine differenzielle Analyse der beiden Gene in den untersuchten Zellen und Geweben.

Bekannter Nachteil dieser semi-quantitativen Methode ist es, daß sie lediglich relative Mengenabschätzungen der beiden Transkripte im Vergleich verschiedener Gewebe und Zellen erlaubt, da die Menge des gebildeten PCR-Produktes nicht allein von der Menge der zu amplifizierenden cDNA, sondern von einer Reihe weiterer, sehr unterschiedlicher Faktoren abhängt. Dabei spielen nicht nur die Länge des zu amplifizierenden Bereichs und die Faltung des Ausgangsmoleküls, sondern auch die Primer selbst eine entscheidende Rolle. In den vorliegenden Untersuchungen zeigten einige der verwendeten Primer beispielsweise eine sehr hohe, von der Sequenz her nicht erwartete Speziesspezifität, so daß sich allein deswegen ein direkter Vergleich der gebildeten Mengen an PCR-Produkt zwischen den beiden SEC61alpha-Genen verbietet, auch wenn die Primer aus den jeweils identischen Bereichen stammen. Verschärft wird der Einfluß dieser Faktoren auf die Menge an PCR-Produkt dadurch, daß es sich bei dieser Reaktion nicht um eine lineare, sondern eine exponentielle Amplifikation handelt. Aus diesem Grund wurde die Zahl der Reaktionszyklen möglichst klein gehalten.

Die Expression der beiden SEC61alpha-Gene in den untersuchten Zellen und Geweben wurde mit Primerkombinationen analysiert, die zur Amplifikation unterschiedlicher Bereiche der kodierenden Region beider Gene führten. Eine Übersicht der verwendeten Primerkombinationen einschließlich der Kontrollen ist in Abschnitt 5.2.5. gezeigt. Die Ergebnisse der Analysen für die einzelnen Gene waren für unterschiedliche Fragmente reproduzierbar, das Mengenverhältnis der Amplifikationsprodukte von SEC61alpha-I und SEC61alpha-II war allerdings aus den bereits oben genannten Gründen nicht stabil.

In Abbildung 7 ist beispielhaft das Ergebnis einer RT-PCR-Analyse der beiden Gene mit typ- und speziesspezifischen Primern, die die Amplifikation nahezu der gesamten kodierenden Region der beiden Gene erlauben, gezeigt. Als interner Standard für die Vergleichbarkeit der


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eingesetzten cDNA-Mengen in die PCR-Reaktion wurde zusätzlich zu den beiden SEC61alpha-Genen das in Zellen konstitutiv exprimierte HPRT-Gen (kodierend für Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase) per PCR amplifiziert. Gezeigt sind die Ergebnisse der Untersuchung an den Mausorganen und für die Maus-Embryonalstadien.

Es zeigte sich, daß SEC61alpha-II in allen Proben neben SEC61alpha-I nachweisbar war. Schließt man von der Bandenstärke in der RT-PCR auf das Expressionsniveau der Gene in den Zellen, so wird im Vergleich der verschiedenen Mausorgane SEC61alpha-I in allen Organen etwa gleich stark exprimiert, während das Expressionsniveau von SEC61alpha-II sich zwischen den Organen unterscheidet: In der Hirnprobe liegt demnach relativ viel SEC61alpha-II-RNA vor, in Herz und Niere etwas weniger, in Leber und Milz von den getesteten Organen am wenigsten (Abb. 7, Bahnen 1 bis 6).

Da sich Organe aus sehr heterogenen Zellverbänden zusammensetzen können, besteht die Möglichkeit, daß einzelne Zellen/Zellarten ein völlig anderes Verhältnis der Expressionshöhe beider Gene aufweisen als das Organ als Ganzes, oder daß sie sogar im Extremfall nur die ein oder andere Variante des SEC61alpha-Gens exprimieren. Dies wurde in erster Näherung getestet, indem Zellen aus einzelnen Hirnarealen, dem Bulbus, Teilen des Großhirns, dem Cerebellum und dem „Rest“hirn, untersucht wurden. Die Ergebnisse unterschieden sich nicht nennenswert von denen für das Gesamtorgan, bestätigen jedoch die relativ starke Expression des SEC61alpha-II-Gens in Hirngewebe im Vergleich zu den übrigen Organen (Abb. 7, Bahnen 1 und 15 bis 18 versus Bahnen 2 bis 6). Die getesteten Primärkulturen und Zellinien, die z.T monoclonal, zumindest aber oligoclonal sind, zeigten ebenfalls keine Abweichung von den Ergebnissen aus den Mausorganen: In allen wurde SEC61alpha-II neben SEC61alpha-I exprimiert (nicht gezeigt). Auch die untersuchten Embryonalstadien wiesen keinerlei auffällige Expressions-charakteristika der beiden SEC61alpha-Gene auf. Die Stärke der Expression nahm für beide Gene (sowie für HPRT) kontinuierlich von Tag 8,5 nach Tag 15,5 ab (Abb. 7, Bahnen 7 bis 14).

Abbildung 7. Expression der beiden SEC61alpha-Gene in diversen Geweben der Maus. Für die Untersuchung der Expression der beiden Gene wurde Gesamt-RNA verschiedener Organe sowie PolyA+-RNA aus 8 Embryonal-stadien revers transkribiert und die resultierende cDNA mit typ- und speziesspezifischen Oligonukleotiden für die beiden SEC61alpha-Gene per PCR amplifiziert. Für die Amplifikation des SEC61alpha-I-Gens wurde das Primerpaar 1181/757, für die des SEC61alpha-II-Gens das Primerpaar 1182/758 eingesetzt. Die verwendeten Oligonukleotide führten zur Amplifikation nahezu des gesamten kodierenden Bereiches (1350 bp) der beiden Gene. Zum Vergleich der eingesetzten Mengen an RNA bzw. cDNA in den einzelnen Ansätzen wurde als Kontrolle ein 246 bp-Fragment des konstitutiv exprimierten HPRT-Gens amplifiziert (mit dem Primerpaar 825/824). L-Milz, Milz aus einer an einem Lymphom erkrankten Maus; Ed8,5, Embryonaltag 8,5 usw.. Als DNA-Größenmarker wurde der 1kb-DNA-Marker der Fa. Gibco verwendet. Die Sequenzen der hier verwendeten Primer sowie der für andere RT-PCR-Experimente eingesetzten Primer findet sich in Abschnitt 5.2.5.


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Auffällig an den RT-PCR-Produkten für SEC61alpha-II war, daß sich bei jeder Primerkombination zusätzlich zu dem Hauptprodukt in voller Länge noch verkürzte Nebenbanden ergaben. Sequenzierung dieser Banden zeigte, daß es sich um Fragmente mit fehlenden Exons handelt, wie sie auch beim „Screening“ der cDNA-Banken gefunden wurden, dort allerdings ausschließlich, so daß vor Durchführung der RT-PCR-Experimente nicht klar war, ob ein Volle-Länge-Transkript des SEC61alpha-II-Gens überhaupt in den Zellen gebildet wird. Gemäß der Bandenstärke der PCR-Produkte scheint dies jedoch überwiegend der Fall zu sein, auch wenn immer ein deutlicher Anteil der verkürzten Produkte nachweisbar war. Welche Bedeutung diese unvollständigen Moleküle haben, ob es sich einfach um falsch gespleißte oder aber um alternativ gespleißte, funktionelle Varianten des Sec61alpha-II-Moleküls handelt, ist bislang unklar. Immerhin war dieses Phänomen in allen untersuchten Spezies zu beobachten, unabhängig davon, ob RNA aus Organen, Primär- oder Zellkulturen untersucht wurde.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Ergebnisse der RT-PCR-Experimente weitere Hinweise darauf geben, daß das SEC61alpha-II-Gen in Säugerzellen funktionell exprimiert wird. Es ist sehr wahrscheinlich, daß die auf RNA-Ebene nachgewiesenen Transkripte in voller Länge auch zu funktionellen Proteinen translatiert werden. Im Unterschied zum SEC61alpha-I-Gen zeigten sich in den untersuchten Zellen und Geweben starke Unterschiede in der Expressionshöhe des SEC61alpha-II-Gens, zudem wies das Auftreten verkürzter PCR-Produkte darauf hin, daß ein Teil der SEC61alpha-II-Transkripte unvollständig vorliegt. Deren mögliche Bedeutung ist bislang vollkommen unklar.

Für zukünftige Untersuchungen wird es essentiell sein, eine Nachweismethode auf Proteinebene zu etablieren. Zur Gewinnung eines peptidspezifischen Antikörpers gegen den äußersten C-Terminus des Sec61alpha-II-Proteins wurden daher Kaninchen mit dem Peptid Cys-KEQAEVGGMGALFF-NH2 immunisiert. Die vollständige Charakterisierung des affinitätsgereinigten Antiserums insbesondere im Hinblick auf mögliche Kreuzreaktivität mit dem Peptidantikörper gegen den C-Terminus des Sec61alpha-I-Proteins (KEQSEVGSMGALLF) ist bislang noch nicht abgeschlossen. Jedoch geben die ersten Untersuchungen Hinweise darauf, daß das Antiserum gegen den C-Terminus des Sec61alpha-II-Proteins zwar ein Protein der erwarteten Größe erkennt, aber nicht mit dem Sec61alpha-I-Protein kreuzreagiert (A. Wittstruck und E. Hartmann, persönliche Mitteilung). Sollte umgekehrt ebenfalls keine Kreuzreaktivität des Antiserums gegen den C-Terminus der Sec61alpha-I-Proteins mit dem Sec61alpha-II-Protein bestehen (was zu zeigen bleibt), so ständen zwei spezifische Peptidantikörper für weitere Analysen der beiden Sec61alpha-Proteine in Säugerzellen zur Verfügung.


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3.2 SEC61-Paraloge in der Hefe S. cerevisiae

3.2.1 Das Ssh1-Protein

Auch in der Hefe S. cerevisiae finden sich paraloge SEC61-Gene und -Proteine. Ein dem SEC61 nahe verwandtes Gen wurde 1993 von E. Hartmann und S. Prehn entdeckt und mit SSH1 (Sec sixty-one homolog 1) bezeichnet (GenBank Acc.No. U05336). Im Rahmen des S. cerevisiae-Sequenzierungsprojektes wurde dieses Gen bei der Sequenzierung des Hefe-Chromosoms II auch von anderen als SEC61-homologes Gen identifiziert (Feldmann et al., 1994). Abweichend von der Situation in Säugerzellen unterscheiden sich die paralogen Proteine in der Hefe deutlich voneinander. Das Protein Ssh1p weist etwa 30% identische Aminosäuren sowohl im Vergleich zu Sec61p aus Hefe als auch zu Sec61alpha aus Säugerzellen auf (vgl. Tab. 4). Somit ist der Grad der Identität zwischen dem Säuger Sec61alpha und Sec61p mit 55% stärker als zwischen Ssh1p und Sec61p. Wie für die bereits bekannten Sec61-Proteine ergibt die Computeranalyse der Sequenz des Ssh1-Proteins ebenfalls 10 hydrophobe Segmente, über die das Protein in der Membran verankert sein könnte. Abbildung 8 zeigt den Vergleich der beiden Hefeproteine Ssh1p und Sec61p miteinander sowie jedes der beiden Proteine mit dem Säuger Sec61alpha-I-Protein. Zytoplasmatische und luminale Bereiche sowie die membrandurchspannenden hydrophoben Segmente sind farblich gekennzeichnet. Interessanterweise zeigen die vorhergesagten zytoplasmatischen Bereiche im Vergleich zwischen Sec61p und Ssh1p eine Identität von etwa 45%, oft in Gruppen von 5-7 Aminosäuren, während die Transmembransegmente und die luminalen Bereiche mit jeweils etwa 27% Identität erheblich weniger Ähnlichkeit aufweisen. Dies deutet auf gemeinsame Bindungspartner im Zytoplasma hin. Die Konservierung des Sec61p aus Hefe und des Sec61alpha aus Säugerzellen ist mit 47% im zytoplasmatischen Bereich etwa genauso stark wie die der beiden Hefeproteine. Im Unterschied zu diesen liegt jedoch für Sec61p und Sec61alpha der Grad der Identität in den Transmembransegmenten und den luminalen Bereichen noch weit höher als in den zytoplasmatischen Bereichen der Proteine (Tabelle 4).

Tabelle 4. Konservierung der Sec61-Proteine aus Hefe und Säugerzellen bezüglich ihrer gemäß der putativen Membrananker vorhergesagten subzellulären Lokalisation. Zyt., zytoplasmatische Bereiche; Lum., luminale Bereiche; TM, Transmembranbereiche.

Proteine im Vergleich

Grad der Identität (in %)

Zyt.

Lum.

TM

gesamt

Sec61p/Ssh1p

45

27

27

32

Sec61p/Sec61alphap

47

54

61

55

Ssh1p/Sec61alphap

38

21

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Mit dem Ssh1p findet sich in S. cerevisiae somit ein zum Sec61p paraloges, jedoch von diesem deutlich verschiedenes Protein. Dieses soll in den folgenden Abschnitten, jeweils im direkten Vergleich mit Sec61p, bezüglich seiner Lokalisation, möglicher Funktionen und Interaktionspartner umfassend charakterisiert werden.

3.2.1.1 Lokalisierung des Ssh1p in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums

Es stellte sich zunächst die Frage, ob das dem Sec61p strukturell sehr ähnliche Protein Ssh1p wie dieses in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert ist und somit möglicherweise ebenfalls für den Proteintransport durch diese Membran eine Rolle spielt.


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Abbildung 8. Vergleich der Aminosäuresequenzen von Ssh1p und Sec61p aus S. cerevisiae. Entsprechend ihrer Lokalisation sind die Proteinabschnitte farblich abgesetzt: rotgedruckte, unterstrichene Sequenzabschnitte markieren die Position der putativen Membrananker, in schwarzer Schrift erscheinen die zytoplasmatischen, in blauer Schrift die luminalen Protein-segmente. Punkte über bzw. unter den Sequenzen markieren Positionen mit identischen Aminosäureresten im Vergleich zum Säuger SEC61alpha-I-Protein. Membrananker für Ssh1p kalkuliert mit MEMSAT.


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Alternativ war denkbar, daß Ssh1p an Transportvorgängen in andere Zellkompartimente als das ER beteiligt sein könnte. Die Lokalisation des Proteins wurde durch Immunfluoreszenz untersucht. Es zeigte sich, daß zwei im Rahmen dieser Arbeit gegen das Ssh1-Protein hergestellte, peptidspezifische Antikörper zum einen gegen den N-Terminus, zum anderen gegen den C-Terminus des Proteins (vgl. auch 3.2.3.1.) für diese Untersuchung nicht geeignet waren. Deshalb wurde eine markierte Version des Ssh1-Proteins konstruiert, bei der das Protein ein c-Myc-Epitop an seinem C-Terminus trägt (Ssh1Myc). Die Expression des Gens für dieses markierte Protein in Hefezellen geschah mit Hilfe eines ARS/CEN Vektors unter der Kontrolle seines natürlichen Promotors. Antikörper gegen das c-Myc-Epitop wurden für die

Abbildung 9. Lokalisierung des Ssh1p in der ER-Membran. Die indirekte Immunfluoreszenz wurde anhand von haploiden Zellen durchgeführt, die entweder die Myc-markierte Version des Ssh1-Proteins, Ssh1Myc, exprimiert von dem Plasmid pKF15, trugen (die zwei oberen Reihen) oder anhand von Zellen, die den Kontrollvektor pRS414 trugen (untere Reihe). Als Kontrolle für die spezifische Anfärbung der ER-Membran (obere Reihe) wurden die Zellen mit Antikörpern gegen das luminale ER-Protein Kar2p inkubiert. Die Zellen der unteren beiden Reihen wurden mit 9E10 Antikörpern spezifisch für das c-Myc-Epitop inkubiert. Zusätzlich wurden alle Proben mit DAPI gefärbt, um die Position der Kerne anzuzeigen (rechte vertikale Reihe).


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Lokalisierung des Ssh1Myc-Proteins in den Zellen durch Immunfluoreszenz eingesetzt. Diese Antikörper wurden aus dem Überstand der Hybridomzellinie GE10 gewonnen und über eine Protein G-Sepharose-Säule gereinigt.

Wie Abbildung 9 zeigt, unterscheidet sich das Färbemuster nicht von dem des luminalen ER-Proteins Kar2p, das als Referenzprotein verwendet wurde. Angefärbt wird im wesentlichen eine ringförmige perinukleäre Region. Zum Vergleich ist eine Kernfärbung mit 4´,6-Diamidino-2-Phenylindol Dihydrochlorid (DAPI) gezeigt. Kontrollzellen, die Ssh1Myc nicht exprimieren, werden durch den c-Myc spezifischen Antikörper nicht angefärbt. Somit ist Ssh1p offenbar ebenfalls in der ER-Membran lokalisiert.

3.2.1.2 Deletion des SSH1-Gens

In einem nächsten Schritt wurde untersucht, ob das SSH1-Gen ebenso wie sein Paraloges, das SEC61-Gen, für die Hefezelle essentiell ist. Dazu wurde eine Mutante erzeugt, in welcher der überwiegende Teil der kodierenden Region des SSH1-Gens entfernt und durch ein Fragment, das das LEU2-Gen als Selektionsmarker enthält, ersetzt wurde (Deltassh1::LEU2). Die Deletion wurde durch Southern Blot überprüft (nicht gezeigt). Aus Abbildung 10 geht hervor, daß die Deletion des SSH1-Gens nicht letal ist. Jedoch wachsen die Mutanten mit einer Verdopp-lungszeit von 125-130 min langsamer als die Wildtyp (wt)-Zellen, deren Zahl sich in 90 min verdoppelt. Besonders deutlich wird das verlangsamte Wachstum des Deltassh1-Stammes beim Vergleich der Koloniegröße auf Agarplatten. Die Kolonien des Deletionsstammes sind bei Wachstum auf Vollmedium wesentlich kleiner als die des wt-Stammes (vgl. dazu Abb. 15A).

Abbildung 10. Wachstumsphänotyp der SSH1-Deletionsmutante. Zellen eines wt-Stammes und einer Deltassh1-Mutante wurden hinsichtlich ihres Wachstumsverhaltens bei 30°C in Vollmedium getestet. Dargestellt ist die Absorption (Optische Dichte) der Kulturen bei 600 nm (OD600nm), halblogarithmisch aufgetragen in Abhängigkeit von der Zeit. Die Verdopplungszeit wurde aus der Steigung der Geraden während der Phase des exponentiellen Wachstums ermittelt.


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3.2.1.3 Genetische Interaktion zwischen SSH1 und SEC61

Wie der vorangegangene Abschnitt zeigt, besteht ein wesentlicher Unterschied zwischen Ssh1p und Sec61p darin, daß Ssh1p im Gegensatz zu Sec61p für die Hefezelle nicht essentiell ist. Immerhin wäre aufgrund der gleichen Lokalisation beider Proteine und ihrer ähnlichen Struktur denkbar, daß sie vergleichbare Funktionen ausüben. Es stellte sich daher die Frage, ob zwischen SEC61 und SSH1 genetische Interaktionen bestehen. Dazu wurde ein Deltassh1::ADE2 Deletionskonstrukt in einen Stamm eingeführt, der ein temperatur-sensitives (ts-) Allel des SEC61-Gens trägt (sec61-2; Deshaies und Schekman, 1987). Die Kombination beider Mutationen in der resultierenden Doppelmutante sec61-2 Deltassh1 zeigte in der Tat einen synthetisch letalen Phänotyp: Bei 36°C wachsen Zellen der sec61-2-Mutante noch weitestgehend normal, der ts-Phänotyp zeigt sich erst bei über 37°C, die Zellen der Doppelmutante waren in ihrem Wachstum jedoch schon bei 36°C erheblich beeinträchtigt (Abbildung 11). Daraus läßt sich ableiten, daß Ssh1p und Sec61p zumindest teilweise überlappende Funktionen besitzen müssen.

Abbildung 11. Genetische Interaktion zwischen SEC61 und SSH1. Zellen eines wt-Stammes, einer ts-Mutante bezüglich SEC61 (sec61-2), einer SSH1-Deletionsmutante (Deltassh1) sowie einer Doppelmutante (sec61-2 Deltassh1) wurden auf Wachstum bei 36°C auf Platten mit Vollmedium getestet.

3.2.1.4 Einfluß der SSH1-Deletion auf die Akkumulation von Präkursoren

Wenn Ssh1p eine Funktion beim Proteintransport durch die ER-Membran innehat, wie es durch die genetische Interaktion zwischen SSH1 und SEC61 nahegelegt wird, so sollte es in der Deletionsmutante Deltassh1 möglicherweise zu einer Akkumulation unprozessierter Präkursorproteine kommen. Um dies zu prüfen, wurden nach einer Puls-Markierung mit [35S]-Methionin Hefezellextrakte hergestellt, die für Immunpräzipitationen mit Antikörpern gegen


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das sekretorische Protein alpha-Faktor oder das luminale Protein Kar2p verwendet wurden. Als Positivkontrolle wurde die temperatur-sensitive Mutante sec61-2, als Negativkontrolle ein wt-Stamm eingesetzt. Für beide untersuchten Proteine zeigte die Deltassh1-Mutante keinen Unterschied zum wt-Stamm, d.h. es konnte im Gegensatz zur sec61-2-Mutante keine Akkumulation von unprozessierten Präkursoren nachgewiesen werden (nicht gezeigt).

Um auszuschließen, daß dieses Ergebnis auf einer Adaptation der Zelle an das Fehlen des Ssh1-Proteins beruht, wurde untersucht, ob der direkte Entzug des Proteins zu Präkursorakkumulation führen würde. Dazu wurde in den ssh1-Deletionsstamm ein ARS/CEN-Plasmid eingebracht, welches das SSH1-Gen unter Kontrolle des induzierbaren GAL10-Promotors trägt (pTX88). In Galaktose-haltigem Medium ist das Expressionsniveau an Ssh1p in diesen Zellen mit dem in wt-Zellen vergleichbar (Abbildung 12, Bahn 2 versus 5). Austausch der Kohlenstoffquelle von Galaktose gegen Glucose führt zum Abschalten des GAL10-Promotors. Diese Abschaltung ist allerdings nicht absolut vollständig, d.h. eine geringe Restexpression von etwa 1-5% des Ausgangsniveaus bleibt erhalten und ist nach 8-10 h erreicht (Bahn 4).

Zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Abschaltung des Promotors wurde eine Puls-Markierung der Zellen mit [35S]-Methionin durchgeführt. Die anschließend präparierten Zellextrakte wurden für Immunpräzipitationen mit den oben genannten Antikörpern eingesetzt. Um ein weiteres Transportsubstrat zu testen, wurden zusätzlich Immunpräzipi-tationen mit Antikörpern gegen Invertase durchgeführt. Das Invertase-Gen wird allerdings bei Vorhandensein von Glucose als Kohlenstoffquelle von den Zellen nicht exprimiert. Daher wurden für diese dritte Immunpräzipitation Zellextrakte aus Zellen gewonnen, die etwa 20-25 min vor der Puls-Markierung in Medium mit nur 0,1% Glucose inkubiert wurden, um eine Derepression des Invertase-Gens zu bewirken.

Als Positivkontrolle wurde wieder die sec61-2-Mutante verwendet, als Negativkontrolle ein wt-Stamm, der wie der zu untersuchende Stamm von Galaktose auf Glucose umgesetzt und zu verschiedenen Zeitpunkten nach diesem Wechsel untersucht wurde.

Abbildung 12. Untersuchung auf Akkumulation von Prä-kursorproteinen nach Entzug des Ssh1-Proteins. Mutante Zellen, die das SSH1-Gen unter Kontrolle eines Galak-tose-induzierbaren Promotors trugen, und Zellen eines wt-Stammes wurden 0, 7 und 13 h nach Austausch der Kohlenstoffquelle von Galak-tose durch Glucose auf ihren Gehalt an Ssh1-Protein hin untersucht. Dies geschah durch Immunoblotting von Membranpräparationen (entsprechend 1 OD600nm) der Zellen zum jeweiligen Zeit-punkt. Für die Untersuchung auf Präkursorakkumulation wurden die Zellen für 10 min mit [35S]-Methionin markiert, anschließend wurden Zellextrakte präpariert, die für die Immunpräzipitation mit dem Antikörper gegen den alpha-Faktor eingesetzt wurden. Als Positivkontrolle wurden Zellen des temperatur-sensitiven sec61-2-Stammes verwendet, die für 2 h bei der nicht-permissiven Temperatur (38°C) inkubiert wurden, bevor sie für die Immunpräzipitation radioaktiv markiert wurden. Die gefällten Proteine wurden mittels SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. ppalphaF bezeichnet den akkumulierten Präpro-alpha-Faktor, der Stern markiert unspezifische Banden, die durch die Ssh1p-Antikörper erkannt werden.


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In diesem Experiment nach direktem Entzug des Ssh1-Proteins konnte keine Präkursor-akkumulation für zwei der drei untersuchten Proteine, nämlich Kar2p und Invertase, festgestellt werden (nicht gezeigt). Lediglich für den Präpro-alpha-Faktor (ppalphaF) wurde 13 h nach Abschalten des Gal10-Promotors eine sehr schwache Bande (Abb. 12, Bahn 4) detektiert. Der Vergleich mit der Positivkontrolle (Bahn 1) zeigt jedoch, daß selbst hier kaum von einer nennenswerten Präkursorakkumulation gesprochen werden kann.

Das Ergebnis der Untersuchung kann eine Beteiligung des Ssh1p an der Proteintranslokation durch die ER-Membran nicht nachweisen, schließt sie jedoch auch nicht aus. Da für alle drei getesteten Substrate bekannt ist, daß sie Sec61p-abhängig transportiert werden, ist ein starker Akkumulationseffekt nach Deletion des SSH1-Gens ohnehin nicht zu erwarten. Vorstellbar wären allerdings indirekte Effekte, verursacht dadurch, daß Proteine, die normalerweise Ssh1p für ihre Translokation benötigen, auf den vom Präpro-alpha-Faktor benutzten Weg der Sec61p-vermittelten Translokation ausweichen müssen. Die marginale Beeinträchtigung der Translokation des Präpro-alpha-Faktors infolge des Ssh1p-Entzugs könnte so verstanden werden.

3.2.2 Paraloge beta-Untereinheiten

Im Zuge der weiteren Charakterisierung des Ssh1p und seiner Funktion wurde untersucht, ob es - vergleichbar dem Sec61p - in der ER-Membran mit weiteren Proteinen assoziiert vorliegt. In diesem Zusammenhang wurde zunächst geprüft, ob möglicherweise ebenfalls paraloge Gene und Proteine der beta- und gamma-Untereinheit des trimeren Sec61p-Komplexes existieren. In der Tat konnte auch für das Gen der beta-Untereinheit des Sec61p-Komplexes, SBH1, in der Datenbank ein paraloges Gen gefunden werden, das mit SBH2 (Sec61 beta homolog 2) bezeichnet wurde. Beide Gene sind auf Chromosom V des S. cerevisiae Genoms lokalisiert (GenBank Acc. No. SCE9747 und SCE9537). SBH2 kodiert für ein Protein von 9,6 kD, das zum Sbh1p zu 52% identisch ist (Abb. 13). Die Identität zwischen Sbh2p und Sec61beta im Säuger liegt mit 23% etwas niedriger als die zwischen Sbh1p und Sec61beta (30%). Wie die beiden anderen beta-Untereinheiten durchspannt auch Sbh2p die Membran vermutlich einmal mit einem C-terminal gelegenen hydrophoben Segment, wobei der Aminoterminus auf der zytoplasmatischen Seite gelegen ist.

<b>Abbildung 13.</b>
Vergleich der Aminosäuresequenzen der beta-Untereinheiten aus S. cerevisiae, Sbh1p (Panzner et al., 1995) und Sbh2p (diese Arbeit) sowie Sec61beta aus Canis familiaris (Hartmann et al., 1994). Vertikale Linien zwischen den Sequenzen bezeichnen identische Aminosäurereste, Doppelpunkte und Punkte zeigen starke bzw. schwache Ähnlichkeiten. Die unterstrichenen Sequenzen markieren die Position der putativen Membrananker.

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3.2.2.1 Deletion der SBH-Gene

Um zu untersuchen, ob ähnlich wie bei dem paralogen Paar Sec61p/Ssh1p auch bei den beiden beta- Untereinheiten nur eines der Proteine für das Wachstum der Hefezelle essentiell ist, wurden Deletionskonstrukte beider Gene hergestellt und zunächst jeweils einzeln in diploide wt-Stämme eingeführt. Der größte Teil der kodierenden Region des SBH1-Gens war durch das HIS3-Gen (Deltasbh1::HIS3), der des SBH2-Gens durch das ADE2-Gen (Deltasbh2::ADE2) ersetzt worden. Nach Sporulation dieser diploiden Stämme wurden Tetradenanalysen durchgeführt, die für beide Mutanten in allen Fällen vier lebensfähige Sporen ergaben. Sowohl die Deltasbh1-Mutanten als auch die Deltasbh2-Mutanten wuchsen bei allen getesteten Temperaturen auf festem Medium (Abbildung 14) sowie in Flüssigkultur (nicht gezeigt) wie der wt-Stamm. Dies war insbesondere für die Deltasbh1-Mutante sehr unerwartet, da somit Sbh1p als einzige Komponente des trimeren Sec61p-Komplexes nicht essentiell für das Wachstum der Hefezelle ist. Um die Möglichkeit zu testen, daß die Deletion des SBH1-Gens zumindest teilweise von Sbh2p kompensiert werden kann, wurde eine Doppelmutante untersucht, in der beide Gene, SBH1 und SBH2, deletiert waren. Auch diese war lebensfähig, zeigte aber einen starken temperatur-sensitiven Wachstumsphänotyp: Die Zellen wuchsen wie wt-Zellen bei 30°C, jedoch nur sehr eingeschränkt bei 37°C (Abbildung 14).

Abbildung 14. Test der Deletionsmutanten von Sbh1p und Sbh2p auf Wachstumsdefekte. Das Wachstum von Zellen eines wt-Stammes und der Deletionsmutanten Deltasbh1und Deltasbh2 sowie der Doppelmutante Deltasbh1 Deltasbh2 wurde bei 30°C und 37°C auf Agarplatten mit Vollmedium getestet.

Die Analyse der Deletionsstämme wurde auf zwei weitere Doppeldeletionsmutanten ausgedehnt: Deltassh1 Deltasbh1 sowie Deltassh1 Deltasbh2 zeigten keinen temperaturabhängigen Wachstumsdefekt (nicht gezeigt), sondern lediglich den der Deltassh1-Mutante (Abbildung 15A). Die Tabelle in Abbildung 15B zeigt zusammenfassend die Wachstumsraten diverser Deletionsmutanten bei 30°C in Flüssigkultur. Für den wt-Stamm sowie die sbh1- und sbh2-Einzel- und Doppeldeletionsmutanten ergeben sich Verdopplungszeiten von etwa 1,5 h, während die Deletion des SSH1-Gens, entweder allein oder in Kombination mit einer der beiden beta-Untereinheiten, eine Verlängerung der Verdopplungszeit auf etwa 2 h bewirkt.


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Abbildung 15. (A) Das Wachstum von Zellen eines wt-Stammes sowie der Mutanten Deltassh1, Deltassh1 Deltasbh2 und Deltassh1 Deltasbh1 wurde bei 30°C auf Agarplatten mit Vollmedium getestet. (B) Verdopplungszeiten diverser Mutanten bei Wachstum in Vollmedium bei 30°C in Flüssigkultur. Zellen eines wt-Stammes sowie diverser Deletionsmutanten wurden aus über Nacht gewachsenen Vorkulturen in Vollmedium mit einer optischen Dichte OD600nm von 0,15 angeimpft und bei 30°C schüttelnd inkubiert. Pro Stamm wurden jeweils drei Kulturen parallel untersucht. Im Untersuchungszeitraum von 12 h wurden zur Bestimmung der optischen Dichte der Kulturflüssigkeit bei 600 nm Proben im Abstand von etwa 1,5 h entnommen. Die Ermittlung der Verdopplungszeit erfolgte nach halblogarithmischer Auftragung der OD600nm in Abhängigkeit von der Inkubationszeit. Die oben angegebenen Werte stellen Mittelwerte dar (in Klammern die Standardabweichung). Die Ergebnisse dieses Experiments stehen repräsentativ für zahlreiche andere Untersuchungen.

3.2.2.2 Beteiligung von Sbh1p und Sbh2p an der Proteintranslokation

Da die mögliche Rolle der paralogen Proteine Sbh1p und Sbh2p bei der Proteintranslokation zum Zeitpunkt der experimentellen Durchführung dieser Arbeit nicht untersucht war, wurden die Deletionsmutanten Deltasbh1 und Deltasbh2 sowie die Doppelmutante sowohl bei 30°C als auch bei 38°C auf Akkumulation von Präkursorformen der Proteine alpha-Faktor und Kar2 untersucht wie in Abschnitt 3.2.1.4. für die Deltassh1-Mutante beschrieben. Als Kontrolle wurde wiederum die ts-Mutante sec61-2 verwendet. Die Ergebnisse unterschieden sich für beide Temperaturen nicht, wie in Abbildung 16 exemplarisch für 38°C dargestellt ist: Akkumulation der unprozessierten Präkursorform von Kar2p konnte nicht für die Einzelmutanten Deltasbh1 (Abb. 16, Bahn 2) oder Deltasbh2 (Bahn 3), jedoch für die Doppelmutante Deltasbh1 Deltasbh2 (Bahn 4) nachgewiesen werden, wenn auch nicht so stark wie in der sec61-2-Mutante (Bahn 5). Im Falle des alpha-Faktors konnte so gut wie kein Protein aus wt-Zellen (Bahn 1) immunpräzipitiert werden, da die Präkursorform des alpha-Faktors (Präpro-alpha-Faktor, ppalphaF) sehr schnell prozessiert und transportiert wird. Wie schon zuvor bei Kar2p, ist auch für den ppalphaF eine Akkumulation in der Doppelmutante (Bahn 4) zu beobachten, hier ebenfalls nicht so stark wie in der sec61-2-Mutante (Bahn 5). Interessanterweise zeigt auch die Einzelmutante Deltasbh1 eine gewisse Akkumulation des ppalphaF, im Gegensatz zu der Mutante Deltasbh2 (Bahn 3 versus Bahn 2).

Die Deletionsmutanten wurden ebenfalls auf Defekte in der posttranslationalen Proteintranslokation in vitro untersucht (K. Plath, nicht gezeigt). Dazu wurden Mikrosomen aus wt-Zellen und aus den Deletionsmutanten (bei 30°C gewachsen) isoliert und auf die

Abbildung 16. Präkursorakkumulation in den Sbh1p- und Sbh2p-Deletionsmutanten. Zellen eines wt-Stammes, der Deletionsmutanten Deltasbh1 und Deltasbh2 sowie der Doppelmutante Deltasbh1 Deltasbh2 wuchsen bei 30°C bis zur exponentiellen Phase und wurden dann für 2 h bei 38°C inkubiert. Anschließend wurden sie für 10 min mit [35S]-Methionin markiert. Zellextrakte wurden hergestellt und für Immunpräzipitationen mit Antikörpern gegen Kar2p oder alpha-Faktor verwendet. Die gefällten Proteine wurden mittels SDS-PAGE und Autoradiographie mit 10%igen (Kar2p) bzw. 15%igen (alpha-Faktor) Polyacrylamidgelen analy-siert. preKar2 und ppalphaF sind die jeweiligen Präkursoren von Kar2p und alpha-Faktor.


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Translokation von ppalphaF und des bakteriellen Proteins proOmpA getestet, die beide in einem in vitro-Translationssystem synthetisiert worden waren. In diesen Experimenten wurden nicht-sättigende Mengen von Mikrosomen eingesetzt (Sec62p wurde als Referenz benutzt und in Immunoblots quantifiziert), und die Menge an protease-geschütztem und somit transloziertem Protein wurde in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt. Mikrosomen aus der Doppelmutante Deltasbh1 Deltasbh2 transportierten beide Proteine mit einer im Vergleich zum wt-Stamm 2-5fach reduzierten Rate. Bei Verwendung von sättigenden Mengen an Mikrosomen war kein signifikanter Unterschied mehr feststellbar.

Insgesamt zeigen die Analysen der Deletionsstämme, daß beide beta-Proteine, Sbh1p und Sbh2p, an der Proteintranslokation über die ER-Membran beteiligt, jedoch nicht essentiell für sie sind.

3.2.3 Der Ssh1p-Komplex

Den bisher dargelegten Ergebnissen zufolge spielen sowohl das Sec61p-Paraloge Ssh1p als auch das Sbh1p-Paraloge Sbh2p eine Rolle bei der Translokation von Proteinen über die ER-Membran. Es stellte sich im weiteren die Frage, ob die Assoziationseigenschaften dieser beiden Proteine ebenfalls denen von Sec61p bzw. Sbh1p vergleichbar sind. Hierzu wurde untersucht, mit welchen Bindungspartnern Ssh1p bzw. Sbh2p in der ER-Membran assoziieren können, ob ein vom Sec61p-Komplex distinkter Komplex mit den neu gefundenen Komponenten existiert, oder ob die jeweils paralogen Untereinheiten möglicherweise austauschbar sind.


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3.2.3.1 Herstellung peptidspezifischer Antikörper gegen Ssh1p und Sbh2p und Immunoblot-Analyse diverser Deletionsstämme

Für diese Untersuchungen wurden peptidspezifische Antikörper gegen den C-Terminus des Ssh1-Proteins sowie gegen den N-Terminus des Sbh2-Proteins hergestellt, deren Spezifität in Immunoblots mit Membranen aus wt-Zellen und den entsprechenden Deletionsstämmen (Deltassh1 bzw. Deltasbh2) überprüft wurde (Abbildung 17). Die Antikörper gegen Ssh1p erkennen mehrere dicht beieinander liegende Banden (Bahn 4), die sich in ihrer elektrophoretischen Mobilität ähnlich wie Sec61p (Bahn 1-3) verhalten. In Deltassh1-Stämmen fehlen alle diese Banden (Bahn 5), so daß man davon ausgehen kann, daß sie alle Ssh1p repräsentieren. Ein weiterer peptidspezifischer Antikörper, diesmal gegen den N-Terminus des Ssh1-Proteins zeigte das gleiche Phänomen (nicht gezeigt). Der Grund für die Heterogenität ist bislang ungeklärt. Die Antikörper gegen Sbh2p erkennen eine Bande von etwa 10 kD (Bahn 4), die in Stämmen fehlte, in denen das SBH2-Gen deletiert war (Bahn 6). Diese Antikörper waren spezifisch für Sbh2p im Gegensatz zu denen gegen Sbh1p, die eine Kreuzreaktivität zu Sbh2p aufweisen (Bahn 1).

Abbildung 17. Spezifität der Antikörper gegen Ssh1p und Sbh2p. Membranen wurden aus exponentiell wachsenden Zellen eines wt-Stammes bzw. der Mutanten Deltassh1 und Deltasbh2 präpariert und durch SDS-PAGE mit 13%igen Polyacrylamidgelen aufge-trennt, bevor sie für Immunoblots mit Antikörpern gegen Ssh1p und Sbh2p bzw. Sec61p und Sbh1p eingesetzt wurden. Die Punkte markieren die Position von Sbh2p, mit dem die Antikörper gegen Sbh1p im Blot kreuzreagieren, die Sterne unspezi-fische Banden, die durch die Antikörper gegen Ssh1p erkannt werden.

Auffällig ist, daß die Deletion des SSH1-Gens zu einem drastischen Absinken des Sbh2p-Gehalts in den Zellen führt (Bahn 2). Möglicherweise wird Sbh2p erst durch die Interaktion mit Ssh1p stabilisiert. Umgekehrt ist dies nicht der Fall: Deltasbh2-Zellen weisen normale Mengen an Ssh1p auf (Bahn 3). Die Immunoblotanalyse wurde auf weitere Deletionsstämme ausgedehnt (Abbildung 18).


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Abbildung 18. Immunoblot-Analyse diverser SSH1-, SBH1- und SBH2-Deletionsmutanten. Untersuchung der Mutanten wie in der Legende zu Abb. 17 beschrieben.

Dabei zeigte sich interessanterweise, daß bei Deletion des SBH1-Gens zusätzlich zum SSH1-Gen der Sbh2p-Gehalt nicht reduziert, sondern in wt-Mengen vorhanden war (Bahn 5). Sowohl Sec61p als auch Sbh1p blieben in ihrer Expression unbeeinflußt, wenn das SSH1- oder SBH2-Gen deletiert waren (Bahnen 2, 4 und 6).

3.2.3.2 Der Ssh1p-Komplex in wt-Zellen

Die Antikörper wurden im folgenden für Koimmunpräzipitationen eingesetzt, um zu klären, welche Proteine miteinander assoziieren. Dazu wurden Hefemikrosomen aus Zellen eines wt-Stammes in Digitonin solubilisiert und der Extrakt nach Zentrifugation mit Antikörpern gegen Ssh1p und Sbh2p sowie Sec61p, Sbh1p, Sss1p, Sec62p und Sec71p immunpräzipitiert. Anschließend erfolgte die elektrophoretische Auftrennung der Präzipitate in SDS-Gelen. Die daraus hergestellten Blots wurden mit diversen Antikörpern inkubiert. Abbildung 19 zeigt das Ergebnis dieser Analyse.

Wie erwartet präzipitierten die Antikörper gegen Sec61p, Sbh1p und Sss1p wechselseitig alle drei Untereinheiten des trimeren Sec61p-Komplexes (Bahnen 1-3). Die Antikörper gegen Sbh1p und Sss1p fällten zudem noch Sec62p, Sec71p und Sec72p (Bahnen 2 und 3) als Komponenten des heptameren Sec-Komplexes. Umgekehrt präzipitierten die Antikörper gegen Sec62p und Sec71p alle Untereinheiten des trimeren Sec61p-Komplexes sowie die übrigen des Sec-Komplexes (Bahnen 6 und 7). Unerwartet war, daß die Antikörper gegen Sec61p nur Sbh1p und Sss1p, nicht aber die übrigen Komponenten des Sec-Komplexes Sec62p, Sec71p und Sec72p präzipitierten. Möglicherweise blockieren hier die zur Immun-präzipitation eingesetzten Antikörper den Teil des Sec61-Proteins, der für die Wechsel-wirkung mit dem tetrameren Sec62p/Sec63p-Komplex verantwortlich ist. Umgekehrt wurde Sec61p, wie oben schon gesagt, durch die Antikörper gegen Sec62p und Sec71p gefällt.


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Abbildung 19. Untersuchung der Assoziation von Translokationskompo-nenten durch Koimmunpräzipitation. Mikrosomen aus wt-Zellen wurden mit Digitonin solubilisiert, Aliquots dieses Detergenzextraktes entsprechend 10 eq Mikrosomen (eq, 1 Äquivqalent ist definiert als 1 µl einer Membran-suspension mit OD280nm von 50) wurden mit diversen Antikörpern immunpräzipitiert. Das gefällte Material wurde durch SDS-PAGE aufgetrennt und die kopräzipitierten Proteine mittels diverser Antikörper analysiert. Der Stern rechts markiert die Position der schweren Kette der Immunglobuline; die Punkte kennzeichnen Proteinbanden, die durch die Kreuzreaktivität der gegen Sbh1p gerichteten Antikörper mit Sbh2p in der Immunpräzipitation (Bahn 2) und/oder im Blot (Sbh1p-Detektion) verursacht werden. Grün bzw. rot eingerahmt sind die Banden, die die Assoziation der Komponenten des trimeren Sec61p-Komplexes bzw. des trimeren Ssh1p-Komplexes widerspiegeln.

Die Antikörper gegen die neuen Proteine Ssh1p und Sbh2p präzipitierten wechselseitig beide Proteine und zudem Sss1p (Bahnen 4 und 5). Umgekehrt wurden Ssh1p und Sbh2p auch durch die Antikörper gegen Sss1p gefällt, die wie oben bereits gesagt auch alle Komponenten des Sec61p- und des Sec-Komplexes präzipitierten (Bahn 3). Daraus läßt sich schlußfolgern, das Sss1p nicht nur Bestandteil dieser beiden Komplexe, sondern auch eines neuen trimeren Komplexes bestehend aus Ssh1p, Sbh2p und Sss1p ist. Dieser Komplex scheint aber distinkt vom Sec61p-Komplex zu sein, da Antikörper gegen Sec61p weder Ssh1p noch Sbh2p präzipitierten (Bahn 1). Für die Antikörper gegen Sbh1p war das zwar zu einem geringen Teil der Fall (Bahn 2), was aber sehr wahrscheinlich auf die bereits oben genannte Kreuzreaktivität des Antikörpers mit Sbh2p zurückzuführen ist. Umgekehrt konnten weder Sec61p und Sbh1p noch die übrigen Komponenten des großen Sec-Komplexes durch Antikörper gegen Ssh1p oder Sbh2p gefällt werden (Bahnen 4 und 5). Antikörper gegen Sec62p oder Sec71p wiederum präzipitierten weder Ssh1p noch Sbh2p (Bahnen 6 und 7).

Den Ergebnissen der Immunpräzipitationen zufolge, ist Sss1p als einzige Komponente allen genannten Komplexen gemeinsam. Auch wenn sich in der Datenbank keine Hinweise auf ein paraloges Sss1- Protein finden ließen, war denkbar, daß die gamma-Untereinheiten der beiden trimeren Komplexe nicht identisch sind, sondern zwei paraloge Proteine von demselben peptidspezifischen Antikörperserum erkannt werden. Um dies zu untersuchen, wurden Membranen aus einem Hefestamm (YTX80) präpariert, in dem das SSS1-Gen deletiert ist und die essentielle Funktion des Proteins durch das Sec61gamma-

Abbildung 20. Immunoblotanalyse eines wt-Stammes und der Mutante YTX80 (Deltasss1:ADE2 pGAL-Sec61gamma) mit Antiseren gegen Sss1p und das Säuger Sec61gamma-Protein.


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Protein aus Säugern kompensiert wird (Hartmann et al., 1994). Im Immunoblot konnte für diese Membranen bei Einsatz der Antikörper gegen Sss1p keine Bande nachgewiesen werden (Abbildung 20). Dies zeigte, daß es in S. cerevisiae kein zweites, zum Sss1p paraloges Protein gibt, das durch das verwendete Antiserum erkannt wird. Somit muß die dritte Untereinheit des Ssh1p-Komplexes in der Tat Sss1p sein.

Zusammenfassend ergibt sich daraus folgendes Bild:

Vom trimeren Sec61p-Komplex klar abgegrenzt bilden die neu entdeckten Proteine Ssh1p und Sbh2p zusammen mit Sss1p einen distinkten trimeren Komplex, im folgenden der Ssh1p-Komplex genannt. Dieser kann zumindest unter den gewählten Immunpräzipitationsbedingungen mit dem tetrameren Sec62p/Sec63p-Komplex offenbar nicht zu einem stabilen heptameren Komplex assoziieren. Dies schließt jedoch nicht aus, daß der Ssh1p-Komplex mit weiteren Proteinen in der ER-Membran assoziiert vorliegen könnte.

Um dies zu untersuchen, wurde der Ssh1p-Komplex mittels Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt (S. Panzner und K. Plath). Dazu wurde ein Digitoninextrakt aus Hefemikrosomen an einer Q-Sepharose-Säule chromatographiert, wie bei Panzner et al. (1995) beschrieben. Diese Säule bindet den heptameren Sec-Komplex, während der trimere Sec61p-Komplex und der Ssh1p-Komplex sich im Durchlauf befinden. Die letzteren wurden im folgenden an SP-Sepharose gebunden und mit steigendem Salzgradienten eluiert. Abbildung 21 (K. Plath) zeigt zum einen ein Coomassie-gefärbtes Gel der eluierten Fraktionen (A), zum anderen einen Immunoblot eben dieser Fraktionen, der mit Antikörpern gegen die Komponenten der trimeren Sec61- und Ssh1p-Komplexe inkubiert wurde (B).

Der trimere Sec61p-Komplex eluierte hauptsächlich in den Fraktionen 10 und 11 (Pfeil 1), wie mittels der Antikörper gegen Sec61p, Sbh1p und Sss1p im Immunoblot erkennbar ist (Abb. 21B). Das Coomassie-gefärbte Gel zeigt in diesen Fraktionen noch zusätzliche Proteine, die jedoch nicht exakt koeluieren. Das Ssh1-Protein eluierte in drei Peaks. Der mittlere davon in Fraktion 12 (Pfeil 2), stellt den trimeren Komplex aus Ssh1p, Sbh2p und Sss1p dar. In den Fraktionen 15 und 16 (Pfeil 3) findet sich ebenfalls ein trimerer Ssh1p-Komplex, bei dem allerdings das Sbh2-Protein in einer verkürzten, möglicherweise degradierten Form vorliegt. Proteinsequenzierung ergab, daß dieser Sbh2p-Variante im Vergleich zum vollständigen Protein die ersten 15 Aminosäurereste am N-Terminus fehlen (siehe auch Legende zu Abbildung 21). Hierdurch läßt sich auch erklären, warum dieses verkürzte Protein von den peptidspezifischen Antikörpern, die gegen den N-Terminus gerichtet sind, nicht erkannt wird (Abb. 21B, Fraktionen 15 und 16). Das Coomassie-gefärbte Gel zeigt, daß in den Fraktionen, in denen die beiden trimeren Ssh1p-Komplexe eluierten, keine weiteren Proteine in nennenswerten Mengen zu finden waren, so daß davon ausgegangen werden kann, daß der Ssh1p-Komplex tatsächlich nur aus den drei identifizierten


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Komponenten besteht. Ein geringer Teil des Ssh1-Proteins eluierte in den Fraktionen 6 und 7 (Pfeil 4), was jedoch nur im Immunoblot, nicht im Coomassie-gefärbten Gel zu erkennen war. Hierbei handelte es sich um einen dimeren Komplex aus Ssh1p und Sss1p. Ob dieser dimere Komplex ebenso wie der trimere Ssh1p-Komplex mit dem verkürzten Sbh2-Protein in vivo in der Hefezelle existiert und dort möglicherweise eine Rolle beim Auf- und Abbau des vollständigen trimeren Ssh1p-Komplexes spielt, oder ob es sich bei diesen Varianten lediglich um Reinigungsartefakte handelt, ist bislang nicht geklärt.

Abbildung 21. Reinigung des Ssh1p-Komplexes. Gezeigt ist der letzte Reinigungsschritt, in dem die Proteine auf einer SP-Sepharose-Säule aufgetrennt wurden. (A) Die Proteine aus den einzelnen Fraktionen, jeweils 1000 eq Mikrosomen entsprechend, wurden in einem SDS-Gel aufgetrennt und mit Coomassie Blau angefärbt. Die numerierten Pfeile über dem Gel markieren die Position der verschiedenen Komplexe: Pfeil 1, trimerer Sec61p-Komplex aus Sec61p (kleiner Pfeil), Sbh1p (mittleres Dreieck) und Sss1p (unteres Dreieck); Pfeil 2, trimerer Ssh1p-Komplex aus Ssh1p (Kreis), Sbh2p und Sss1p (Dreiecke, die beiden Proteine ko-migrieren); Pfeil 3, Ssh1p-Komplex aus Ssh1p (Kreis), Sss1p (linkes Dreieck, die obere Bande) und einer N-terminal verkürzten Form des Sbh2p (rechtes Dreieck, die untere Bande; die N-terminale Sequenz dieses Proteins wurde bestimmt als RRQAQSIKEKQAKQTPT und entspricht damit Sbh2p, beginnend mit Aminosäure-rest 16 des vollständigen Proteins). (B) Immunoblot-Analyse der in (A) gezeigten Fraktionen mit diversen Antikörpern. Die eingesetz-ten Proben entsprechen jeweils 20 eq Mikrosomen. Die numerierten Pfeile über dem Gel markieren die Position der verschiedenen Komplexe. Pfeil 4, dimerer Komplex aus Ssh1p und Sss1p, der nur in geringen Mengen vorkommt (nicht sichtbar auf dem in (A) gezeigten Coomassie-gefärbten Gel). Der Punkt kennzeichnet eine Proteinbande, die durch die Kreuzreaktivität der gegen Sbh1p gerichteten Antikörper mit Sbh2p im Blot verursacht wird.


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3.2.3.3 Austauschbarkeit der beta-Untereinheiten

Die Ergebnisse des vorangegangenen Abschnitts zeigten, daß der trimere Sec61p-Komplex und der trimere Ssh1p-Komplex normalerweise als distinkte Komplexe in der Hefezelle vorliegen. Uns interessierte nun, ob ein Austausch der paralogen Untereinheiten prinzipiell möglich ist, ob es also Bedingungen gibt, unter denen sich Mischkomplexe aus Komponenten beider trimeren Komplexe bilden. Da die gamma-Untereinheit in beiden Komplexen identisch ist und die alpha-Untereinheiten Sec61p und Ssh1p nicht austauschbar sind (vgl. dazu beispielsweise Abschnitt 3.2.1.2.), konzentrierte sich die Untersuchung auf die beiden nicht-essentiellen beta-Untereinheiten Sbh1p und Sbh2p. Es stellte sich die Frage, ob bei Deletion einer beta-Untereinheit der beiden trimeren Komplexe das jeweils paraloge Protein die Funktion des fehlenden übernehmen würde. Um dies zu untersuchen, wurden Digitoninextrakte aus Deltasbh1- bzw. Deltasbh2-Deletionsstämmen für Koimmunpräzipitations-experimente ähnlich wie für den wt-Stamm (vgl. Abb. 19) eingesetzt. Abbildung 22 zeigt, daß Antikörper gegen Sec61p nicht Sbh2p präzipitierten, wenn Sbh1p fehlte (Bahn 1), und daß umgekehrt, Antikörper gegen Ssh1p nicht Sbh1p präzipitierten, wenn Sbh2p fehlte (Bahn 10). Die Kontrollen zeigten, daß die verbleibende beta-Untereinheit mit ihren normalen Partnern assoziierte (Bahnen 3-5 und 7-9) und nicht mit der alpha-Untereinheit des jeweils paralogen Komplexes. Wie im wt-Stamm kam es auch hier in keinem Fall zu einer Assoziation von

Abbildung 22. Koimmunpräzipitation von Translokationskomponenten in beta-Deletionsstämmen. Mikrosomen aus Mutanten, denen entweder das SBH1-Gen (Bahnen 1-6), das SBH2-Gen (Bahnen 7-12) oder beide (Bahnen 13-18) fehlten, wurden in Digitonin solubilisiert. Aliquots dieses Detergenzextraktes, entsprechend jeweils 10 eq Mikrosomen, wurden für Immunpräzipitationen mit diversen Antikörpern eingesetzt. Das gefällte Material wurde in SDS-Gelen aufgetrennt und die kopräzipitierten Proteine durch Immunoblot mit verschiedenen Antikörpern analysiert. Die Sterne markieren die Position der schweren Kette der Immunglobuline, die Punkte kennzeichnen Proteinbanden, die durch die Kreuzreaktivität der gegen Sbh1p gerichteten Antikörper mit Sbh2p in der Immunpräzipitation verursacht werden. Grün bzw. rot eingerahmt sind die Banden, die die Assoziation der Komponenten des Sec61p- bzw. Ssh1p-Komplexes widerspiegeln.


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Sec62p zu den Komponenten des Ssh1p-Komplexes. Das Vorliegen dimerer Komplexe in den untersuchten Einzeldeletionsstämmen wurde durch Kofraktionierung der Proteine an SP-Sepharose bestätigt (K. Plath, nicht gezeigt). In gleicher Weise wurde die Doppeldeletionsmutante Deltasbh1 Deltasbh2 untersucht (Bahnen 13-18). In diesem Fall liegen sowohl der Sec61p- als auch der Ssh1p-Komplex in dimerer Form vor.

In den beta-Einzel- und -Doppeldeletionsmutanten konnten somit keine Hinweise auf die mögliche Austauschbarkeit der beta-Untereinheiten Sbh1p und Sbh2p gefunden werden. Die Untersuchung diesbezüglich wurde jedoch noch auf eine weitere Mutante ausgedehnt, die sich bereits in der Imunoblotanalyse hinsichtlich des Sbh2p auffällig gezeigt hatte (vgl. Abschnitt 3.2.3.1.): Während in der Mutante Deltassh1 der Gehalt an Sbh2p gegenüber dem Wildtyp drastisch reduziert ist, ist er in der Doppeldeletionsmutante Deltassh1 Deltasbh1 dem in wt-Zellen vergleichbar (Abbildung 18, Bahnen 1 und 5). Tatsächlich zeigten Koimmunpräzipitations-experimente mit Extrakten aus der Mutante Deltassh1 Deltasbh1 (Abbildung 23; Bahnen 13-18), daß unter diesen Bedingungen Antikörper gegen Sbh2p Sec61p kopräzipitierten (Bahn 17) und

Abbildung 23. Ein mutanter Sec61p-Komplex in der Deletionsmutante Deltassh1 Deltasbh1. Mikrosomen aus wt-Zellen oder aus Mutanten, denen entweder das SSH1-Gen oder das SSH1- und das SBH1-Gen fehlten, wurden in Digitonin solubilisiert. Aliquots dieses Detergenzextraktes, entsprechend jeweils 10 eq Mikrosomen, wurden für Immunpräzipitationen mit diversen Antikörpern eingesetzt. Die Auftrennung des gefällten Materials erfolgte in SDS-Gelen, die Analyse der kopräzipitierten Proteine anschließend durch Immunoblot mit verschiedenen Antikörpern. Die Punkte kennzeichnen Proteinbanden, die durch die Kreuzreaktivität der gegen Sbh1p gerichteten Antikörper mit Sbh2p in der Immunpräzipitation (Bahnen 2 und 14) und/oder im Blot (Sbh1p-Detektion) verursacht werden. Grün bzw. rot eingerahmt sind die Banden, die die Assoziation der Komponenten des trimeren Sec61p-Komplexes bzw. des trimeren Ssh1p-Komplexes widerspiegeln.

umgekehrt Sbh2p mit Antikörpern gegen Sec61p gefällt werden konnte (Bahn 13). Zum direkten Vergleich sind Koimmunpräzipitationen aus Extrakten von wt-Zellen (Bahnen 1-6) und dem Deletionsstamm Deltassh1 (Bahnen 7-12) gezeigt. Einzig in der Mutante Deltassh1 Deltasbh1 konnte Sbh2p auch durch die Antikörper gegen Sec62p präzipitiert werden (Bahn 18).


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Die Untersuchung dieser Mutante ergab somit, daß eine Assoziation der beta-Untereinheit des einen Komplexes mit den Komponenten des anderen möglich ist: Sbh2p assoziiert mit Sec61p, wenn beiden Proteinen der ursprüngliche Partner fehlt.

Zudem ist offenbar die Assoziation dieses mutanten trimeren Sec61p-Komplexes mit dem tetrameren Sec62p/Sec63p-Komplex zum großen Sec-Komplex möglich und wird durch Sbh2p nicht behindert. Dies deutet darauf hin, daß Sequenz- oder Struktur-eigenschaften des Ssh1p selbst für die mangelnde Assoziationsfähigkeit des trimeren Ssh1p-Komplexes mit dem Sec62p/Sec63p-Komplex verantwortlich sind.

Zusammengefaßt zeigen die in diesem Abschnitt dargestellten Ergebnisse, daß normalerweise die beta-Untereinheiten zwischen den Komplexen nicht ausgetauscht werden, sondern daß distinkte dimere und trimere Komplexe nebeneinander in der Zelle existieren können. Prinzipiell scheint ein Austausch jedoch möglich zu sein.

3.2.3.4 Der Ssh1p-Komplex in der ts-Mutante sec61-2

Die bislang dargestellten Untersuchungen zum Assoziationsverhalten des Ssh1p-Komplexes ließen keine Bindung zum Sec62p/Sec63p-Komplex erkennen, wie sie für den Sec61p-Komplex nachweisbar ist. Es stellte sich die Frage, ob der Ssh1p-Komplex den Sec61p-Komplex im heptameren Sec-Komplex ersetzen würde, falls durch Mutation des Sec61p oder Reduktion des zellulären Sec61p-Gehaltes die Assoziationsmöglichkeiten der Komponenten des Sec61p-Komplexes mit denen des Sec62p/Sec63p-Komplexes beeinträchtigt wären.

Diese Bedingungen finden sich in der temperatur-senitiven Mutante sec61-2: Die Mutation des Sec61p resultiert in verstärkter Dissoziation des trimeren Sec61p-Komplexes. Die Destabilisierung der Bindung zwischen den einzelnen Komponenten führt zu einem schnelleren Abbau des mutanten Sec61p ebenso wie des Sss1p. Der Gehalt beider Proteine ist in dieser Mutante gegenüber dem Wildtyp deutlich verringert. Erstaunlicherweise trifft dies nicht für die dritte Komponente des trimeren Sec61p-Komplexes, Sbh1p, zu. Ebenso finden sich alle Komponenten des tetrameren Sec62p/Sec63p-Komplexes in der Mutante in gleichen Mengen wie in Wildtyp-Zellen (Esnault et al., 1994; Biederer et al., 1996).

Untersucht wurde im folgenden, in welcher Zusammensetzung die einzelnen Komplexe in der ts-Mutante sec61-2 vorliegen. Zu diesem Zweck wurden rauhe Mikrosomen aus sec61-2-Zellen isoliert, die bei 30°C gewachsen und nachfolgend für 2 h bei der nicht-permissiven Temperatur 38°C inkubiert worden waren. Daraus gewonnene Digitoninextrakte wurden für


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Koimmunpräzipitationen mit diversen Antikörpern verwendet. Die Präzipitate wurden im Immunoblot analysiert.

Die Ergebnisse in Abbildung 24 zeigen das Bild des destabilisierten Sec61p-Komplexes in den sec61-2-Zellen: Die Antikörper gegen Sec61p präzipitieren nur Sec61p selbst, weder Sbh1p noch Sss1p (Bahn1). Der Grund dafür könnte darin liegen, daß das mutante Sec61p nur äußerst labile Wechselwirkungen zu anderen Proteinen eingehen kann und daß die Bindung des Antikörpers an das sec61-2-Protein jede andere Assoziation unmöglich macht. Umgekehrt wird das mutante Sec61p durch Antikörper gegen alle drei Komponenten des trimeren Sec61p-Komplexes ebenso wie durch Antikörper gegen Sec62p präzipitiert (Sec61-Detektion; lange Exposition !), so daß man davon ausgehen kann, daß in den Zellen, wenn auch in geringen Mengen, sowohl der trimere Sec61p-Komplex als auch der heptamere Sec-Komplex zu finden ist.

Abbildung 24. Immunpräzipitationen von Translokationskomponenten aus der ts-Mutante sec61-2. Mikrosomen wurden aus Zellen der ts-Mutante sec61-2 nach 2-stündiger Inkubation bei der nicht-permissiven Temperatur von 38°C isoliert. Daraus hergestellte Digitoninextrakte wurden für Immunpräzipitationen mit diversen Antikörpern eingesetzt. Das gefällte Material, entsprechend 10 eq Mikrosomen, wurde im SDS-Gel aufgetrennt und im Immunoblot mit diversen Antikörpern analysiert. Die Punkte kennzeichnen Proteinbanden, die durch die Kreuzreaktivität der gegen Sbh1p gerichteten Antikörper mit Sbh2p im Blot verursacht werden. Grün bzw. rot eingerahmt sind die Banden, die die Assoziation der Komponenten des trimeren Sec61p-Komplexes bzw. des trimeren Ssh1p-Komplexes widerspiegeln.

Sbh1p scheint bei unvermindertem zellulären Gehalt im Vergleich zu Wildtyp-Zellen (vgl. Biederer et al., 1996) überwiegend isoliert vorzuliegen: Antikörper gegen Sbh1p präzipitieren im wesentlichen nur Sbh1p selbst (Bahn 2), die übrigen Komponenten des Sec61p-Komplexes und des Sec62p/Sec63p-Komplexes nur in sehr geringem Maße (detektierbar nur in langen Expositionen der Blots). Sbh1p ist somit entweder ohne Assoziation mit anderen Proteinen in der ER-Membran stabil, oder es wird durch andere, bislang nicht bekannte Membranproteine stabilisiert.

Der zelluläre Gehalt des Sss1p ist, wie bereits oben gesagt, ebenso wie der des Sec61p in der sec61-2-Mutante reduziert. Das verbleibende Sss1p findet sich ähnlich wie das Sbh1p zu einem geringen Teil im Sec61p- bzw. Sec-Komplex wieder (Bahn 3), zum größten Teil ist es jedoch in dem Ssh1p-Komplex assoziiert (Bahnen 3-5).

Der Ssh1p-Komplex liegt wie in wt-Zellen in seiner trimeren Form vor (Bahnen 3-5), eine Assoziation mit Komponenten des tetrameren Sec62p/Sec63p-Komplexes ist nicht nachweisbar. Letzterer scheint, soweit es die Analyse zuläßt, hauptsächlich in seiner tetrameren Form und zu einem geringen Anteil auch als Sec-Komplex vorzuliegen: Sec62p,


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Sec71p und Sec72p werden durch Antikörper gegen Sec62p (Bahn 6) und in geringerem Maße auch von Antikörpern gegen Sss1p und Sbh1p präzipitiert (Bahnen 2 und 3).

Unverändert scheint also auch unter diesen Bedingungen der Ssh1p-Komplex - obwohl er in weitaus stabilerer Form als der trimere Sec61p-Komplex in den sec61-2-Zellen vorliegt - keine Assoziation mit dem hier überwiegend freien tetrameren Sec62p/Sec63p-Komplex eingehen zu können. Berücksichtigt werden muß allerdings bei der Interpretation der Ergebnisse, daß es aufgrund der labilen Wechselwirkungen des mutanten Sec61p zu den anderen Membranproteinen innerhalb der Komplexe bereits unter den Reinigungsbedingungen zur Dissoziation eines Großteils der Komplexe kommen könnte. Möglicherweise liegt somit in vivo ein weitaus größerer Teil der Komponenten des trimeren Sec61p-Komplexes und des heptameren Sec-Komplexes assoziiert vor, als es die Ergebnisse der Koimmunpräzipitationsexperimente widerspiegeln.

3.2.3.5 Ribosomenassoziation des Ssh1p-Komplexes

Der Sec61p-Komplex findet sich in S. cerevisiae zum Teil als trimerer Komplex mit membrangebundenen Ribosomen assoziiert, zum Teil als Bestandteil des heptameren Sec-Komplexes. Mit Hilfe des letzteren konnte der posttranslationale Transport in vitro rekonstituiert werden. Somit fungiert vermutlich der trimere, ribosomen-assoziierte Sec61p-Komplex als Translokationskomplex im kotranslationalen Transport, während der heptamere Sec-Komplex eine Rolle in der posttranslationalen Translokation spielt (Panzner et al., 1995). Die bisherigen Untersuchungen des Ssh1p-Komplexes in dieser Arbeit ergaben keine Hinweise auf eine Assoziation des trimeren Ssh1p-Komplexes mit dem Sec62p/Sec63p-Komplex. Somit wäre vorstellbar, daß der Ssh1p-Komplex möglicherweise, wie der trimere Sec61p-Komplex, eine Funktion in der kotranslationalen Translokation hat. Daher wurde abschließend geprüft, ob der Ssh1p-Komplex mit membrangebundenen Ribosomen assoziiert vorliegt.

Dazu wurden rauhe Mikrosomen aus exponentiell wachsenden Hefezellen mit Digitonin solubilisiert. Aus diesem Extrakt wurde durch Zentrifugation eine Überstandsfraktion (Digitoninextrakt, DE) und ein Ribosomenpellet gewonnen. Die Ablösung ribosomen-gebundener Membranproteine erfolgte anschließend durch Behandlung mit Puromycin unter hohen Salzkonzentrationen. Die so erhaltene Proteinfraktion wird als RAMP-Fraktion (für ribosomen-assozierte Membranproteine) bezeichnet. Sowohl die DE- als auch die RAMP-Fraktion wurden im Immunoblot mit diversen Antikörpern untersucht (Abbildung 25A)

Wie schon aus früheren Experimenten bekannt (Panzner et al., 1995) fand sich Sec62p als Repräsentant des großen Sec-Komplexes fast ausschließlich in der DE-Fraktion, während die Komponenten des trimeren Sec61p-Komplexes sowohl in der DE- als auch in der RAMP-Fraktion zu finden waren. Ssh1p und Sbh2p verhielten sich ähnlich, auch sie waren in beiden Fraktionen vertreten und lagen somit zum Teil in ribosomen-assoziierter Form vor. Immunpräzipitationen der RAMPs mit Antikörpern gegen die Komponenten des Sec61p- und des Ssh1p-Komplexes zeigten, daß nur die jeweils zugehörigen Komponenten der einzelnen Komplexe, also Sec61p, Sbh1p und Sss1p bzw. Ssh1p, Sbh2p und Sss1p, präzipitiert wurden (Abbildung 25B). Somit ergab sich, daß jeder der beiden trimeren Komplexe für sich an Ribosomen gebunden ist. Antikörper gegen Sec62p konnten die Komponenten der beiden trimeren Komplexe aus der RAMP-Fraktion nicht präzipitieren.


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Abbildung 25. Der Ssh1p-Komplex findet sich in Assoziation mit membrangebundenen Ribosomen. (A) Hefemikrosomen (RM, rauhe Mikrosomen) wurden in einem Hochsalzpuffer, der 0,8 M Kaliumacetat enthielt, gewaschen, um periphere Membranproteine zu entfernen, und danach in Digitonin solubilisiert. Die anschließende Zentrifugation ergab einen Überstand, den Digitoninextrakt (DE) und ein Pellet, das die Ribosomen und mit ihnen assoziierte Membranproteine enthielt. Letztere wurden aus dem Pellet durch Behandlung mit Puromycin unter hohen Salzkonzentrationen herausgelöst (RAMP). Aliquots entsprechend 10 eq Mikrosomen wurden per SDS-PAGE und Immunoblot mit diversen Antikörpern analysiert. (B) Die RAMP-Fraktion (jeweils 20 eq Mikrosomen entsprechend) wurde für Koimmunpräzipitationsexperimente mit Antikörpern gegen Sec61p, Sbh1p, Sss1p, Ssh1p, Sbh2p und Sec62p eingesetzt. Die Analyse des gefällten Materials erfolgte durch SDS-PAGE und Immunoblot mit diversen Antikörpern. Die Sterne markieren die Position der schweren Kette der Immunglobuline, die Punkte kennzeichnen Proteinbanden, die durch die Kreuzreaktivität der gegen Sbh1p gerichteten Antikörper mit Sbh2p in der Immunpräzipitation (Bahn 2) und/oder im Blot (Sbh1p-Detektion) verursacht werden. Grün bzw. rot eingerahmt sind die Banden, die die Assoziation der Komponenten des trimeren Sec61p-Komplexes bzw. des trimeren Ssh1p-Komplexes widerspiegeln.

Insgesamt ergaben die Untersuchungen somit, daß es sich bei dem Ssh1p-Komplex um einen eigenständigen trimeren Komplex handelt, der unabhängig vom trimeren Sec61p-Komplex in ribosomengebundener Form vorliegen kann. Dies und die Tatsache, daß der Ssh1p-Komplex zumindest unter den gewählten Präzipitationsbedingungen keine Assoziation mit dem tetrameren Sec62p/Sec63p-Komplex zeigte, macht eine Funktion im kotranslationalen Transport der Hefezelle wahrscheinlich.


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Thu Sep 14 11:45:05 2000