Finke, Kerstin: Untersuchung paraloger SEC61-Gene und -Proteine in Eukaryoten

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Kapitel 4. Diskussion

Das Phänomen paraloger Gene und Proteine findet sich in prokaryotischen wie eukaryotischen Zellen gleichermaßen. Es läßt sich ursächlich auf Genduplikationsereignisse zurückführen, denen eine wichtige Rolle bei der Evolution von Makromolekülen zukommt. Nachweisen lassen sich Duplikationen einzelner Gene oder auch nur Gensegmente ebenso wie Duplikationen ganzer Chromsomenabschnitte, und zwar sowohl innerhalb eines Chromosoms (intrachromosomal) als auch zwischen verschiedenen Chromosomen (interchromosomal). Viele paraloge Gene sind gar infolge der Duplikation des gesamten Genoms eines Organismus entstanden. So wird beispielweise angenommen, daß das Säugergenom das Resultat mehrerer Genomduplikationen im Zuge der Evolution der Chordata ist (Lundin, 1993). Auf die Tetraploidisierung (Entstehung eines vierfachen Chromosomensatzes) folgte stets die Wiederherstellung des diploiden Zustandes unter Deletion der meisten, jedoch nicht aller duplizierten Gene. Auch für S. cerevisiae wird postuliert, daß das Hefegenom in seiner heutigen Form das Produkt einer Genomduplikation ist, die nach der Abspaltung von Saccharomyces von Klyveromyces datiert wird. Hier blieb ebenfalls nur ein geringer Teil der Gene als Duplikat erhalten, die meisten wurden im Laufe der Zeit wieder deletiert. Dem Modell zufolge machen die Genpaare, die sich auf dieses Duplikationsereignis zurückführen lassen, 13 % aller Hefeproteine aus (Wolfe und Shields, 1997).

Die in dieser Arbeit untersuchten paralogen Paare SEC61/SSH1 und SBH1/SBH2 scheinen allerdings nicht zu den Resultaten dieser Genomduplikation zu gehören, da zumindest die Gene SSH1, SBH1 und SBH2 sich keiner der bislang identifizierten 55 duplizierten chromosomalen Regionen des Hefegenoms zuordnen lassen (K.H. Wolfe und D.C. Shields, http://acer.gen.tcd.ie/~khwolfe/yeast/, Yeast Gene Duplications Project). Zudem sind homologe Gene des SSH1 und des SBH2 mittlerweile auch in Candida albicans identifiziert worden (Candida albicans Sequencing Project, http://candida.stanford.edu/), was für eine Duplikation der entsprechenden Ursprungsgene vor der Aufspaltung der Sproßhefen (Saccharomycetales) in Candidaceae und Saccharomycetaceae spricht. Zu der letztgenannten Familie gehört neben der Gattung Saccharomyces unter anderem auch Kluyveromyces. Somit wären die Duplikationen, auf die sich die hier beschriebenen paralogen Paare zurückführen lassen, weitaus früher zu datieren als die oben genannte für Saccharomyces postulierte Genomduplikation.

Duplizierte SEC61-Gene finden sich in sehr unterschiedlichen Bereichen der Eukaryoten. Vergleich der Gene zeigt, daß sie auf mehrere unabhängige Duplikationsereignisse im Laufe der Evolution zurückzuführen sind. Bislang lassen sich mindestens drei solcher Ereignisse nachweisen: Neben den in dieser Arbeit beschriebenen Duplikationen des SEC61-Gens in Hefen und in Säugerzellen, findet man auch in Arabidopsis thaliana zwei paraloge SEC61-Gene, die durch eine von den beiden erstgenannten unabhängige Duplikation entstanden sind (E. Hartmann, persönliche Mitteilung). Trotz der unterschiedlichen Lebensformen war die SEC61-Duplikation offenbar in allen genannten Fällen von selektivem Vorteil, so daß die Duplikate im folgenden erhalten blieben.


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4.1 Die paralogen SEC61alpha-Gene in Säugerzellen

Die beiden SEC61alpha-Gene und deren Genprodukte in Säugerzellen sind im Gegensatz zu den paralogen Hefegenen SEC61 und SSH1, die sich deutlich voneinander unterscheiden, hochgradig konserviert: Auf Nukleinsäureebene beträgt die Identität je nach Spezies zwischen 70 und 75%, auf Proteinebene gar 94%. Die Ursache für diese hohe Konserviertheit könnte darin liegen, daß das Duplikationsereignis, aus dem diese beiden Gene hervorgingen, entwicklungsgeschichtlich noch nicht sehr weit zurückliegt. Vorstellbar ist aber auch, daß auf den Genen ein hoher Selektionsdruck liegt. Möglicherweise sind die Komponenten des Translokationsapparates im Säuger so weit optimiert und aufeinander abgestimmt, daß keine größeren Variationen der einzelnen Moleküle mehr toleriert werden können.

Daraus ergibt sich die Frage, welche Bedeutung zwei nahezu identische Gene (und vermutlich auch Proteine) für die Säugerzelle haben. Ein paraloges Sec61alpha-Protein könnte möglicherweise eine vergleichbare Funktion wie das bereits bekannte Sec61alpha-Ip jedoch in einem anderen subzellulären Kompartiment ausüben. Dagegen sprechen allerdings erste Experimente, das Sec61alpha-IIp in MDCK-Zellen per Immunfluoreszenz nachzuweisen. Gegen Sec61alpha-IIp gerichtete Antikörper ergaben dasselbe Färbemuster wie Antikörper gegen Sec61alpha-Ip (nicht gezeigt). Die Interpretation dieser Ergebnisse muß jedoch mit Vorsicht erfolgen, da die Spezifität des Antiserums gegen den C-Terminus des Sec61alpha-IIp bislang nicht vollständig nachgewiesen ist (vgl. Abschnitt 3.1.2.).

Bei gleicher Lokalisation der paralogen Sec61alpha-Proteine im ER wäre auch eine durch bestimmte Faktoren induzierbare Expression des einen oder anderen Gens denkbar. Zudem werden in multizellulären Organismen zahlreiche Gene zelltyp-spezifisch exprimiert. In der Tat geben die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit Hinweise auf eine Funktion des SEC61alpha-II-Gens als regulierbare Einheit, um den Bedarf von Zellen an Translokationseinheiten individuell einstellen zu können:

Die Untersuchung der Expression beider Gene in verschiedenen Organen und Zellinien mittels RT-PCR (vgl. Abb. 7) ergab in allen Fällen ein relativ konstantes Expressionsniveau für das SEC61alpha-I-Gen, während das des SEC61alpha-II-Gens deutliche Unterschiede zwischen einzelnen Organen zeigte. Dabei war unter allen bislang getesteten Bedingungen die Expression beider Gene nachweisbar. Dies schließt jedoch die Möglichkeit einer zelltyp-spezifischen Expression des SEC61alpha-II-Gens nicht aus, da die Untersuchungen bislang nicht an einzelnen Zellen durchgeführt wurden. Somit lassen sich die Ergebnisse dahingehend interpretieren, daß sich neben der konstitutiven Expression des SEC61alpha-I-Gens die regulierte Expression des SEC61alpha-II-Gens findet, letztere entweder in allen Zellen oder zelltyp-spezifisch. Außer diesen beiden Möglichkeiten wäre als dritte eine zelltyp-spezifische, aber konstitutive Expression des SEC61alpha-II-Gens denkbar.

Für eine zelltyp-spezifische Expression spricht auch die Analyse des GC-Gehaltes beider SEC61alpha-Gene in den vier untersuchten Säugerspezies. In allen Fällen wurde überein-stimmend für das SEC61alpha-I-Gen ein hoher GC-Gehalt (> 50 %) und für das SEC61alpha-II-Gen ein niedrigerer GC-Gehalt (< 50 %) ermittelt (vgl. Tab. 3). Häufig findet man sog. „Haushaltsgene“ („housekeeping genes“), die in allen Zellen exprimiert werden, in Bereichen der Säugerchromosomen, die sich durch einen relativ hohen GC-Gehalt auszeichnen, während zelltyp-spezifisch exprimierte Gene eher in AT-reichen Regionen lokalisiert sind (Craig und Bickmore, 1993).


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Abgesehen von der unterschiedlichen Expressionshöhe in den einzelnen Organen fiel das SEC61alpha-II-Gen durch die Bildung mehrerer distinkter verkürzter Transkripte neben dem Volle-Länge-Transkript auf, deren Bedeutung bislang völlig unklar ist. Die Möglichkeit, variante Isoformen des Sec61alpha-IIp zu produzieren, erscheint insofern nicht sehr wahrscheinlich, als es in der Regel in den verkürzten Formen zu einem Rasterschub kommt, der kurze Zeit später zum Kettenabbruch führt. Auf der Basis der bisher zu Sec61alpha-\|[Igr ]\|p vorliegenden funktionellen Daten ist schwer vorstellbar, welche Rolle diese verkürzten Proteine des Sec61alpha-IIp spielen könnten.

Für eine weitere Analyse der unterschiedlichen Funktionen der beiden paralogen SEC61alpha-Gene bzw. Proteine in Säugerzellen wird der Einsatz alternativer Nachweismethoden, die eine bessere Quantifizierbarkeit der Genexpression als die RT-PCR erlauben, erforderlich sein. Darüber hinaus könnte eine Analyse der Promotorregion beider SEC61alpha-Gene unter Umständen Aufschlüsse über die Regulierbarkeit ihrer Expression und vermittels dieser auf potentiell unterschiedliche Funktionen geben.

Mit Abschluß der vollständigen Charakterisierung der Antikörper gegen den C-Treminus des Sec61alpha-IIp stehen möglicherweise zwei spezifische Antiseren gegen die paralogen Sec61alpha-Proteine zur Verfügung, die Untersuchungen auf Proteinebene erlauben werden. Diese sollten eingesetzt werden, um zu untersuchen, ob das Sec61alpha-IIp mit denselben Proteinen in der ER-Membran interagiert wie das Sec61alpha-Ip, oder ob sich für die kleineren Untereinheiten des Sec61-Komplexes im Säuger ebenfalls paraloge Gene und Proteine finden. Letzteres würde im Säugersystem die Voraussetzung für die Bildung von distinkten Komplexen vergleichbar denen in S. cerevisiae sein.

Ob die verkürzten Transkripte des SEC61alpha-II-Gens zu varianten Formen des SEC61alpha-IIp translatiert werden, ließe sich mit diesen gegen den äußersten C-Terminus gerichteten Antikörpern allerdings nicht untersuchen. Auch bei anderen Methoden, zumal wenn der Nachweis keine Rückschlüsse auf die Größe des nachgewiesenen Moleküls erlaubt (z.B. bei in-situ-Hybridisierungen), bleibt der Aspekt der verkürzten Transkripte (und damit potentiell auch verkürzten Proteine) des SEC61alpha-II-Gens bei der Interpretation der Ergebnisse stets zu berücksichtigen.

4.2 Der Ssh1p-Komplex - ein zweiter aktiver Translokations-komplex in der ER-Membran von S. cerevisiae

Für die Hefe S. cerevisiae konnte die vorliegende Arbeit nicht nur die Existenz zweier paraloger SEC61-Gene und -Proteine nachweisen, sondern darüber hinaus zeigen, daß das zum Sec61p paraloge Ssh1p Bestandteil eines zweiten trimeren Komplexes ist, der neben dem bislang bekannten translokationsaktiven Sec61p-Komplex existiert. Die Komponenten dieses Ssh1p-Komplexes sind zu denen des Sec61p-Komplexes in unterschiedlichem Maße identisch: Die paralogen alpha-Untereinheiten, Sec61p und Ssh1p, mit ihren jeweils zehn prognostizierten membranspannenden Segmenten unterscheiden sich mit einer Identität von 30% bezogen auf die Gesamtlänge der Proteine deutlich voneinander, insbesondere wenn man


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berücksichtigt, daß Sec61p in Hefe und Sec61alphap in Säugerzellen zu mehr als 50% identisch sind. Dagegen sind sich die beiden paralogen beta-Untereinheiten, Sbh1p und Sbh2p, mit etwa 50% Identität erheblich ähnlicher. Der Grad der Identität zum Säugerprotein Sec61betap liegt für beide Proteine mit 30% (Sbh1p) bzw. 23% (Sbh2p) niedriger als der zwischen den beiden Hefeproteinen. Die jeweils dritte Untereinheit ist mit Sss1p für beide trimere Hefekomplexe gleich.

Die Analyse der beiden trimeren Komplexe durch Immunpräzipitation mit Antiseren gegen die einzelnen Komponenten zeigte, daß beide im wesentlichen als distinkte Komplexe in der Hefezelle vorliegen (Abb. 19). Selbst die sehr ähnlichen beta-Untereinheiten werden in der Regel nicht ausgetauscht. Sogar bei Fehlen einer beta-Untereinheit wird diese nicht durch das paraloge Protein ersetzt (Abb. 22), es sei denn, die zu dem verbleibenden beta-Protein gehörende alpha-Untereinheit wurde ebenfalls deletiert, wie in der Mutante Deltassh1 Deltasbh1 geschehen (Abb. 23). Nur unter diesen artifiziellen Bedingungen konnte eine Assoziation der beta-Untereinheit des einen trimeren Komplexes, in diesem Fall Sbh2p, mit den Komponenten des paralogen trimeren Komplexes, hier Sec61p und Sss1p, nachgewiesen werden. Das Experiment zeigte, daß ein Austausch der beta-Untereinheiten prinzipiell möglich ist, jedoch normalerweise nicht oder nur unterhalb der Nachweisgrenze dieser Methode stattfindet. Die beiden trimeren Komplexe existieren somit in der Tat unabhängig voneinander in der Zelle.

Aus dem Vergleich des Ssh1p-Komplexes mit dem Sec61p-Komplex ergaben sich viele übereinstimmende Eigenschaften beider Komplexe und ihrer Komponenten, es fanden sich aber auch gravierende Unterschiede:

Wie der Sec61p-Komplex ist auch der Ssh1p-Komplex in der Membran des ER lokalisiert. Darauf weisen die Immunfluoreszenz-Untersuchungen, die eine Kolokalisation des Ssh1p mit dem ER-Markerprotein Kar2p zeigten (Abb. 9), ebenso hin wie das in beiden Komplexen vorkommende Protein Sss1p und die Austauschbarkeit der beta-Untereinheiten in der Mutante Deltassh1 Deltasbh1 (Abb. 19, 20 und 23). Somit liegt nahe, eine dem Sec61p-Komplex vergleichbare Funktion des Ssh1p-Komplexes bei der Translokation von Proteinen durch die ER-Membran zu postulieren.

Im Unterschied zu Sec61p ist Ssh1p jedoch für die Hefezellen nicht essentiell, wenn es auch für normale Wachstumsraten erforderlich ist. Bei Zellen ohne Ssh1p-Komplex wurde eine verlängerte Verdopplungszeit im Vergleich zu Wildtyp-Zellen beobachtet. Deletion der beta-Untereinheit Sbh2p zeigte keinerlei Phänotyp. Das gleiche gilt allerdings auch für die Deletion der beta-Untereinheit des Sec61p-Komplexes, Sbh1p. Wurden dagegen sowohl Sbh1p als auch Sbh2p deletiert, ergaben sich deutliche Wachstumsdefekte bei erhöhten Temperaturen (Abb. 14), was dafür spricht, daß Sbh2p zur Translokationskapazität der Zelle beiträgt. Ähnlich zeigten Doppelmutanten, die zum einen ein temperatur-sensitives Allel des SEC61-Gens trugen (sec61-2) und in denen zum anderen das SSH1-Gen deletiert war, eine starke Beeinträchtigung des Wachstums bei Temperaturen, bei denen sec61-2-Zellen noch kaum betroffen sind (synthetisch letaler Phänotyp, Abb. 11). Da der Phänotyp der sec61-2-Mutante durch Degradation des Sec61-Proteins verursacht wird (Sommer und Jentsch, 1993; Esnault et al., 1994; Biederer et al., 1996), liegt die Erklärung nahe, daß der synthetisch letale Phänotyp dadurch zustande kommt, daß unter limitierenden Konzentrationen von Sec61p die Rolle des Ssh1p für die Zelle essentiell wird.


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Diverse Deletionsmutanten wurden auf die Akkumulation von Präkursorproteinen in vivo untersucht. Weder für die Deletionsmutante Deltassh1 noch für die Mutante Deltasbh2 konnte die Akkumulation eines der getesteten Substrate nachgewiesen werden. Die Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit denen von Ng et al. (1996), die im Deltassh1-Stamm bei insgesamt neun untersuchten Präkursoren keinerlei Akkumulation fanden. Ähnlich wie in der vorliegenden Arbeit wurden jedoch auch dort ausschließlich Substrate getestet, die bekanntermaßen Sec61-abhängig transportiert werden und somit keine Akkumulation nach Deletion des Ssh1p erwarten lassen.

Unerwartet war, daß auch bei Deletion der beta-Untereinheit des Sec61p-Komplexes, Sbh1p, keine Akkumulation von Kar2p und nur eine marginale Akkumulation von Präproalphafaktor (ppalphaF) beobachtet werden konnte. Lediglich für die Mutante, in der beide beta-Proteine, Sbh1p und Sbh2p, deletiert waren, ließ sich eine nennenswerte, wenn auch nicht starke Akkumulation von Präkursoren des alpha-Faktors und von Kar2p nachweisen. Diese Doppelmutante zeigte zudem in Untersuchungen auf Defekte bei der posttranslationalen Translokation in vitro eine 2-5fach reduzierte Transportrate im Vergleich zum Wildtyp (K. Plath, nicht gezeigt).

Vor allem die Untersuchungen der Doppelmutanten sec61-2 Deltassh1 und Deltasbh1 Deltasbh2 weisen somit auf eine Funktion des Ssh1p-Komplexes bei der Translokation von Proteinen über die ER-Membran hin. Der meist nur marginale Phänotyp der Einzelmutanten Deltassh1, Deltasbh2 aber auch Deltasbh1 in vivo sowohl im Hinblick auf Wachstumsdefekte als auch auf die Akkumulation von Präkursoren mag auch ein Grund dafür sein, daß diese Komponenten in genetischen Screens auf Mutanten mit Translokationsdefekten nicht gefunden wurden.

Überdies spielt der Ssh1p-Komplex, obgleich er für normale Wachstumsraten benötigt wird, offenbar eine erheblich eingeschränktere Rolle bei der Translokation als der Sec61p-Komplex. Dies ist zunächst insofern unerwartet, als sich beide Komplexe in den Hefemikrosomen in annähernd gleichen Mengen nachweisen lassen, soweit es sich nach partieller Reinigung beider Komplexe in Coomassie-gefärbten Gelen abschätzen läßt (Steffen Panzner, persönl. Mitteilung und Abbildung 21a).

Ein weiterer gravierender Unterschied findet sich im Assoziationsvermögen beider Komplexe: Während ein Teil des Sec61p-Komplexes zusammen mit dem Sec62p/Sec63p-Komplex im heptameren Sec-Komplex assoziiert vorliegt, kann der Ssh1p-Komplex offenbar keine Verbindung mit dem tetrameren Sec62p/Sec63p-Komplex eingehen, zumindest keine, die unter den gewählten Extraktions- und Immunpräzipitationsbedingungen stabil gewesen wäre (Abb. 19). Dies geschah auch nicht unter Bedingungen, unter denen Sec61p einer erhöhten Degradationsrate unterworfen ist, wie beispielsweise in der sec61-2-Mutante (Abb. 24). Der Grund dafür muß in Strukturunterschieden der alpha-Untereinheiten beider Komplexe, Sec61p und Ssh1p, liegen, da in der Doppeldeletionsmutante Deltasbh1 Deltasbh2 ebenfalls das unterschiedliche Assoziationsverhalten der beiden (in dem Fall dimeren) Komplexe beobachtet werden konnte und das Sbh2-Protein in der Mutante Deltassh1 Deltasbh1 das Sbh1p auch im heptameren Komplex ersetzen konnte (Abb. 22 und 23).

Die Bedeutung des heptameren Sec-Komplexes für die Proteintranslokation der Hefezelle wird unter anderem dadurch belegt, daß mit Sec62p und Sec63p zwei weitere Proteine beteiligt sind, die durch essentielle Hefegene kodiert werden (Deshaies und Schekman, 1989; Sadler et al., 1989) und die sich zudem beide fast ausschließlich in diesem Komplex finden (Panzner et al., 1995). Da gezeigt werden konnte, daß nur der heptamere Sec-Komplex, nicht


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aber der trimere Sec61p-Komplex die Fähigkeit zur posttranslationalen Translokation von Proteinen in rekonstituierte Proteoliposomen besitzt (Panzner et al., 1995), liegt die Vermutung nahe, daß der trimere Ssh1p-Komplex keine Rolle bei der posttranslationalen Translokation spielt.

Für eine Rolle des Ssh1p-Komplexes im kotranslationalen Transport dagegen spricht, daß ein Teil der Komplexe nach Solubilisierung von rauhen Mikrosomen in Detergenz mit Ribosomen assoziiert vorgefunden wurde und von diesen durch Behandlung mit Puromycin unter hohen Salzkonzentrationen freigesetzt werden konnte (Abb. 25). Diese Eigenschaften sind auch von den Sec61-Komplexen in Hefe und Säugern bekannt (Görlich et al., 1992b; Panzner et al., 1995). Da gezeigt werden konnte, daß mit dem Sec61-Komplex in Säugern der kotranslationale Transport in vitro rekonstituiert werden kann (Görlich und Rapoport, 1993), liegt es nahe, die Hypothese aufzustellen, daß auch im Hefesystem die beiden trimeren Komplexe eine Funktion im kotranslationalen Transport erfüllen. Das würde einerseits erklären, warum Zellen, denen das Sbh2-Protein zusätzlich zum Sbh1-Protein fehlt, einen stärkeren Phänotyp zeigen als Zellen, in denen nur das SBH1-Gen deletiert ist. Zum anderen wäre verständlich, warum die Sequenzhomologien zwischen dem Sec61p und dem Ssh1p in erster Linie in den zytosolischen Bereichen beider Proteine zu finden sind, die vermutlich mit dem Ribosom interagieren müßten. Die luminalen Bereiche unterscheiden sich im Vergleich dazu stärker voneinander, was vermuten läßt, daß für den kotranslationalen Transport ein gemeinsamer Interaktionspartner im Lumen des ER nicht erforderlich ist. Der dargestellte Erklärungsansatz bleibt jedoch solange hypothetisch, bis der direkte Beweis dafür erbracht ist, daß der Sec61p- und der Ssh1p-Komplex tatsächlich eine Funktion im kotranslationalen Transport haben, beispielsweise durch die Etablierung eines rekonstituierten, SRP-abhängigen Translokationssystems in Hefe ähnlich dem für Säugerzellen.

Somit kann anhand der vorliegenden Daten folgende Modellvorstellung entworfen werden: Der Sec61p-Komplex hat demnach eine modulartige Funktion: zum einen als selbständige Einheit bei der kotranslationalen Translokation und zum anderen als Bestandteil des heptameren Sec-Komplexes bei der posttranslationalen Translokation von Proteinen durch die ER-Membran. Der Ssh1p-Komplex dagegen ist ausschließlich am kotranslationalen Transport beteiligt.


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Welche Vorteile dieses zusätzliche kotranslationale Transportsysstem allerdings der Hefezelle bietet, ist bislang unklar. Eine mögliche Erklärung wäre, daß die beiden Komplexe unterschiedliche Substrate transportieren. Das würde allerdings einerseits implizieren, daß der Ssh1p-Komplex ausschließlich Proteine transportiert, die für die Zelle nicht essentiell sind, oder daß die Unterscheidung nicht absolut strikt ist. Andererseits müßten dann auch zwei unterschiedliche „Targeting“-Systeme postuliert werden, die die entsprechenden Substrate entweder zu dem einen oder anderen Komplex dirigieren. Denkbar wäre dabei ein zweites SRP, auf das es jedoch bislang keinerlei Hinweise gibt, oder eine Unterscheidung der Substrate über die Signalsequenzerkennungsfunktion des trimeren Sec61p-Komplexes (Jungnickel und Rapoport, 1995), die der Ssh1p-Komplex möglicherweise ebenfalls besitzt.

Attraktiver ist vielleicht aber die Idee, daß ein zweiter Komplex, der ausschließlich in der kotranslationalen Translokation eine Rolle spielt, es der Zelle ermöglicht, kotranslationalen und posttranslationalen Transport unabhängig voneinander zu regulieren. Denn gäbe es den Ssh1p-Komplex nicht, würde zwangsläufig jede Änderung bezüglich des Sec61p-Komplexes zugleich den kotranslationalen wie auch den posttranslationalen Transport betreffen. Der Ssh1p-Komplex könnte somit dazu dienen, die kotranslationale Translokation unter Bedingungen zu verstärken, unter denen die posttranslationale Translokation konstant bleibt, oder umgekehrt die kotranslationale Translokation konstant zu halten, wenn die posttranslationale Translokation herauf- oder herabreguliert werden muß. Denkbar wäre natürlich auch eine Regulation des posttranslationalen Transports über den Sec62p/Sec63p-Komplex. Dessen Komponenten könnten jedoch zusätzlich Funktionen in anderen Bereichen wie beispielsweise der Karyogamie oder dem Import von Proteinen in den Kern haben (Kurihara und Silver, 1993; Ng und Walter, 1996), so daß ihre Regulierbarkeit nicht allein von Anforderungen der Translokation abhängig wäre.

4.3 Die Rolle der beta-Untereinheiten in der Translokation

Welche Funktion die beta-Untereinheiten der trimeren Komplexe ausüben, ist bislang nicht geklärt. Die vorliegenden Untersuchungen für S. cerevisiae zeigten, daß unter normalen Wachstumsbedingungen die beta-Untereinheiten weder für den kotranslationalen noch für den posttranslationalen Proteintransport absolut essentiell sind. Obgleich sich in der Doppeldeletionsmutante Deltasbh1 Deltasbh2 eine leichte Akkumulation von Präkursorproteinen nachweisen ließ und aus diesen Zellen isolierte Mikrosomen eine verlangsamte Translokationsrate in vitro im Vergleich zum Wildtyp zeigten, so war doch ein Wachstumsphänotyp erst unter erhöhten Temperaturen zu beobachten. Somit muß die dimere Einheit aus alpha- und gamma-Untereinheit sowohl für den Sec61p-Komplex als auch für den Ssh1p-Komplex funktionell sein. In der Tat ließen sich stabile dimere Komplexe aus Sec61p und Sss1p bzw. Ssh1p und Sss1p aus Deletionsmutanten einer oder beider beta-Untereinheiten isolieren.

Die Situation der beta-Untereinheiten in Hefezellen erinnert stark an die in Escherichia coli: auch dort ist die von der Größe her mittlere Untereinheit SecGp des zum Sec61p-Komplex homologen trimeren SecYEGp-Komplexes nicht essentiell (Nishiyama et al., 1993, 1994). SecYp und SecEp allein sind ausreichend für die Translokation von Proteinen in rekonstituierte Proteoliposomen, auch wenn die Reaktion durch Zugabe von SecGp stark


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stimuliert wird (Akimaru et al., 1991; Nishiyama et al., 1993). Berücksichtigt man ferner, daß zwischen SecGp und Sbh1p oder Sbh2p keinerlei strukturelle Ähnlichkeit besteht, scheint es so, als würden die beta-Untereinheiten in beiden Fällen lediglich eine akzessorische Rolle bei der Translokation spielen.

Kürzlich konnten Kalies et al. (1998) im rekonstituierten in vitro-System zeigen, daß auch Sec61beta in Säugerzellen für die kotranslationale Translokation nicht essentiell ist, sie aber kinetisch erleichtert. Abwesenheit von Sec61beta verhindert nicht die eigentliche Translokation des Polypeptids, sondern führt zu Defekten in einem frühen Stadium des Translokationsprozesses. Dabei ist weder die Bindung des Komplexes aus Ribosom, naszierender Kette und SRP an die Translokationspore noch die Aufhebung des SRP-vermittelten Translationsarrestes bei fehlendem Sec61beta beeinträchtigt, sondern vermutlich die direkt darauf folgende Insertion der naszierenden Kette in den Translokationskanal. Für eine Funktion zu Beginn des Translokationsprozesses sprechen auch verschiedene Quervernetzungsexperimente. Laird und High (1997) konnten für die Insertion des multimembranspannenden Proteins Opsin abhängig von der Kettenlänge aufeinander folgende Quervernetzungen zu einem 21 kDa ribosomalen Protein, Sec61beta und schließlich Sec61alpha nachweisen. Ähnliches gilt für die Membranintegration des Sec61alpha selbst: Die naszierende Sec61alpha-Polypeptidkette befindet sich in frühen Stadien der Translokation in unmittelbarer Nähe zu bereits membranständigem Sec61alpha, Sec61beta und TRAM. Quervernetzungen des ersten Sec61alpha-Transmembransegmentes zu Sec61beta und TRAM blieben während der Insertion von mindestens drei weiteren Transmembransegmenten nachweisbar (Knight und High, 1998).

Kalies et al. (1998) untersuchten darüberhinaus mittels chemischer Quervernetzung die unmittelbare Umgebung des Sec61beta. Dieses befindet sich nicht nur wie erwartet in direkter Nachbarschaft zu Sec61alpha, sondern scheint auch spezifisch mit der 25 kD-Untereinheit des Signalpeptidase-Komplexes (SPC25) zu interagieren. Bemerkenswert ist, daß die Quervernetzungen sowohl zwischen Sec61beta und SPC25 als auch zwischen Sec61beta und Sec61alpha von der Anwesenheit membrangebundener Ribosomen abhängig sind. Diese Daten lassen sich dahingehend interpretieren, daß die Initiation der kotranslationalen Translokation durch Bindung des Ribosoms mit der naszierenden Kette an die Membran zum einen zur Sec61beta-vermittelten Rekrutierung des Signalpetidase-Komplexes an das aktive Translokon führt, zum anderen auch weitreichende strukturelle Veränderungen des Translokationskanals selbst bewirkt.

In diesem Licht läßt sich vielleicht auch das Vorhandensein des dimeren Komplexes aus Ssh1p und Sss1p ebenso wie das des trimeren Ssh1p-Komplexes mit dem N-terminal verkürzten Sbh2p in wt-Zellen von S. cerevisiae verstehen (vgl. Abb. 21B). Zwar läßt sich bislang nicht ausschließen, daß diese Varianten des Ssh1p-Komplexes lediglich Reinigungsartefakte darstellen, denkbar wäre aber auch, daß es sich hierbei um translokationsinaktive Formen oder aber um Auf- und Abbaustadien des Ssh1p-Komplexes handelt. In diesem Fall müßte jedoch gefragt werden, warum ähnliche Formen für den trimeren Sec61p-Komplex in wt-Zellen nicht nachweisbar sind.

Dies ist möglicherweise auf einige grundlegende Unterschiede, die trotz der relativ hohen Sequenzhomologie zwischen den beiden beta-Untereinheiten in S. cerevisiae bestehen, zurückzuführen. Einen wesentlichen Unterschied zeigten die vorliegenden Untersuchungs-ergebnisse beispielsweise bezüglich der Stabilität von Sbh1p und Sbh2p. So scheint Sbh1p in


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der ts-Mutante sec61-2 unbeeinflußt von der verstärkten Degradation des Sec61p sowie des Sss1p als einzige Komponente des trimeren Sec61p-Komplexes stabil und überwiegend isoliert in der ER-Membran vorzuliegen (Abschnitt 3.2.3.4. und Biederer et al., 1996). Dagegen war in der Deltassh1-Mutante der Gehalt an Sbh2p drastisch reduziert. Nimmt man allerdings an, daß die in wt-Zellen nachgewiesene N-terminal verkürzte Form des Sbh2p eine Degradationsform des Proteins darstellt, so muß in Betracht gezogen werden, daß in den Deltassh1-Zellen ein mehr oder weniger großer Teil des Sbh2p in dieser verkürzten Form vorliegen und damit von dem gegen den äußersten N-Terminus gerichteten Antikörper nicht mehr detektiert werden könnte.

Offenbar ist jedoch das Sbh2-Protein in voller Länge ohne Assoziationspartner instabil. Die Mutante Deltassh1 Deltasbh1 zeigte, daß Sbh2p mit Sec61p assoziieren kann, wenn beiden der ursprüngliche Partner fehlt. In dieser Mutante war der Gehalt an Sbh2p (in voller Länge) dem in wt-Zellen vergleichbar und nicht wie in der Einzelmutante Deltassh1 stark reduziert. So erklärt sich auch, warum die Doppelmutante Deltassh1 Deltasbh1 nicht wie die Mutante Deltasbh1 Deltasbh2 einen temperatur-sensitiven Phänotyp zeigte. Sbh2p kann also offenbar durch Assoziation mit der einen oder anderen alpha-Untereinheit stabilisiert werden. Dies deutet darauf hin, daß die beiden paralogen beta-Untereinheiten prinzipiell austauschbar und ihre Funktionen bezüglich der Proteintranslokation durch die ER-Membran vermutlich überwiegend identisch sind.

Möglicherweise hat das Sbh1p, das offenbar auch außerhalb des trimeren Sec61p-Komplexes stabil in der ER-Membran vorliegen kann, weitere Funktionen, die nicht in direktem Zusammenhang mit dem Transport von Proteinen durch die ER-Membran stehen. Das SBH1-Gen wurde von Toikkanen et al. (1996) - unter der Bezeichnung SEB1 - als ein Suppressor der sec15-1-Mutation isoliert. Sec15p ist Bestandteil des sog. „Exocyst“-Komplexes, der eine Funktion im letzten Schritt des Sekretionsweges, der Exozytose, hat (TerBush et al., 1996). Aufgrund der nachgewiesenen ER-Lokalisation des Sbh1p/Seb1p (auch bei Überexpression) und seiner bekannten Funktion als Komponente des trimeren Sec61p-Komplexes erscheint es sehr wahrscheinlich, daß die Suppression der sec15-1-Mutation auf einem indirekten Effekt beruht. Direktere Interaktionen zwischen SEC15 und SBH1/SEB1 wurden jedoch nicht ausgeschlossen (Toikkanen et al., 1996). Bislang fanden sich allerdings keine Hinweise, die diese Annahme stützen würden.

Künftigen Untersuchungen der beta-Untereinheiten in S. cerevisiae bleibt es vorbehalten zu überprüfen, ob auch die Überexpression des SBH2-Gens einen ähnlichen Suppressionseffekt auf die sec15-1-Mutation ausübt wie die des SBH1-Gens, oder ob sich hier ein weiterer Unterschied zwischen den beiden Proteinen findet. Ein weiteres Ziel sollte die Gewinnung eines zusätzlichen Antiserums sein, das auch die N-terminal verkürzte Form des Sbh2p erkennt. Damit ließe sich der mögliche Abbau des Proteins über verschiedene Zwischenstufen besser verfolgen. Unabhängig davon sollte der heptamere Sec-Komplex aus Zellen der Doppeldeletionsmutante Deltassh1 Deltasbh1, in dem Sbh2p das fehlende Sbh1p ersetzt, gereinigt und im rekonstituierten posttranslationalen Translokationssystem in vitro auf Funktionalität getestet werden. Dies würde möglicherweise Rückschlüsse auf weitere Übereinstimmungen und Unterschiede zwischen den beiden Proteinen erlauben. Die Etablierung eines kotranslationalen in vitro-Translokationssystems in Hefe ähnlich dem in Säugerzellen schließlich würde die Untersuchung des Ssh1p-Komplexes in allen seinen Varianten, gerade auch in Hinblick auf die beta-Untereinheit Sbh2p, erheblich erleichtern.


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