Finke, Kerstin: Untersuchung paraloger SEC61-Gene und -Proteine in Eukaryoten

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Kapitel 5. Material und Methoden

5.1 Allgemeine Methoden

Molekularbiologische Methoden und genetische Experimente wurden wie bei Ausubel et al. (1992) beschrieben durchgeführt. DNA-Plasmid-Präparationen erfolgten mittels alkalischer Lyse als „Mini-“, „Midi-“ oder „Maxipräp“ aus 3 ml, 150 ml bzw. 500 ml über Nacht gewachsener Bakterienkultur, die beiden letzteren mit Hilfe der entsprechenden Qiagen-DNA-Isolierungskits (Diagen) nach Anleitung des Herstellers. Die Isolierung genomischer DNA aus Hefezellen ist unter 5.3.4. beschrieben. Die Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit Hilfe des „GenecleanR“-Kits (Bio-101) oder des „Qiaex DNA Gel Extraction“-Kits (Diagen), jeweils gemäß den Instruktionen des Herstellers. Restriktionsenzyme, Ligasen, Alkalische Phosphatase, RNase, Polynukleotidkinase u.ä. wurden in der Regel von den Firmen New England Biolabs, Promega oder Boehringer bezogen. PCR-DNA-Polymerasen (Taq-Polymerasen) stammten entweder von der Fa. Perkin Elmer Cetus, von Amersham oder von Roche, Pfu-DNA-Polymerase (rekombinant) wurde von Stratagene, dNTPs von Pharmacia bezogen. DNA-Sequenzierung erfolgte mit Hilfe des „Sequenase“-Kits (USB) oder aber mit dem „fmol“-PCR-Sequenzierungskit (Promega), jeweils nach Anleitung des Herstellers. Transformation von DNA in Bakterien erfolgte in der Regel durch Elektroporation (Elektroporationsgerät und -küvetten der Fa. Biorad), in einigen Fällen durch Hitzeschock transformationskompetenter Zellen. Die Transformation von Hefezellen ist unter 5.3.3. beschrieben.

Eine Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten vorhandenen oder neu-konstruierten Plasmide, Vektoren, Bakterien- und Hefestämme findet sich im Anhang unter 6.1. Verwendete Zellinien sind in den Abschnitten 5.2.1. sowie 5.5.3. aufgeführt.

5.2 Methoden für die RT-PCR-Analyse der beiden SEC61alpha-Gene in Säugerzellen

5.2.1 Ausgangsmaterial für die Gewinnung von RNA für die RT-PCRs

Für die RT-PCR-Analysen wurde RNA aus diversen Organen (Hirn, Herz, Niere, Leber und Milz) jeweils dreier adulter Mäuse gewonnen, zudem aus der stark vergrößerten Milz einer Maus mit einem Lymphom. Da bereits erste Experimente eine erhöhte Expression des SEC61alpha-II-Gens im Hirn gegenüber den anderen Organen zeigte, wurden einige Hirnareale für die RNA-Gewinnung aus 42 Tage alten Mäusen präpariert (der Bulbus, Teile des Großhirns, das Cerebellum und das „Rest-Hirn“). Jeweils 1 µg polyA+-RNA aus acht Embryonalstadien der Maus (Tag 8,5 bis Tag 15,5) wurde freundlicherweise von F. Schubert (Arbeitsgruppe Prof. P. Gruss, Göttingen) zur Verfügung gestellt. Weiterhin wurde RNA aus zwei Primärkulturen gewonnen: aus einer 8 Wochen alten Astrozytenkultur aus Ratte (kultiviert von Dr. M. O. Kristian Enkvist, Arbeitsgruppe Prof. Kettenmann, MDC Berlin)


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und aus Hippocampus-Neuronen (ein Zelllysat wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. T. Futerman, Rehovot, Israel). Ebenso wurde RNA aus einigen Zellinien präpariert: aus zwei Neuroblastom-Zellinien (NG 108-15 (Maus-Neuroblastom-Ratten-Gliom-Hybridzellen (Hamprecht), Passage 20) und Neuro2a (Maus-Neuroblastom-Zellinie)), aus beiden jeweils einmal im undifferenzierten und einmal im differenzierten Zustand (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von R. Beckmann, Arbeitsgruppe Prof. Hucho, FU Berlin); weiterhin aus zwei Karzinom-Zellinien: HT29 (Colon-Karzinom-Zellinie) und LCLC (Large cell lung carcinoma-Zellinie) (freundlicherweise von Dr. L. H. Finke, MDC Berlin, zur Verfügung gestellt).

5.2.2 Isolierung von RNA

Alle Arbeiten im Zusammenhang mit der Isolierung von RNA wurden unter folgenden Vorsichtsmaßregeln ausgeführt, um eine Kontamination von Proben mit ubiquitär vorkommenden RNasen zu verhindern:

Es wurden ausschließlich sterile Materialien (wie z.B. Gefäße, Pipetten, Pipettenspitzen etc.) und Lösungen benutzt. Alle Lösungen einschließlich dH2O wurden vor dem Autoklavieren 30 min bei 37°C mit 0,1 % Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt, das ein starker RNase-Inhibitor ist.

Die Isolierung von RNA geschah nach der von Chomczynski und Sacchi (1987) beschriebenen Methode mit Guanidinium-Thiocyanat und Extraktion mit H2O-gesättigtem Phenol:

Die Mausorgane wurden sofort nach Entnahme aus den Tieren kurz in Puffer (50 mM Hepes pH 7,4, 250 mM Saccharose) gespült und in Aluminiumfolie gewickelt in flüssigem Stickstoff eingefroren. Der Zellaufschluß erfolgte unter flüssigem Stickstoff zunächst mechanisch mit Hilfe eines Mörsers und Pistills (beide zuvor gründlich gereinigt, mit DEPC-dH2O gespült und mit flüssigem Stickstoff heruntergekühlt). Das Pulver wurde anschließend mit 5 ml Lysispuffer (4 M Guanidinium-Thiocyanat; 25 mM Natriumcitrat pH 7,0; 0,5 % Sarcosyl; 0,1 M 2-Mercaptoethanol) in einem zweiten Mörser lysiert. Zellen aus Kulturen wurden zweimal mit PBS gewaschen und anschließend ebenfalls durch Zugabe von 5 ml Lysispuffer lysiert. Der schleimige Zellextrakt wurde abgelöst und durch mehrfaches Aufziehen durch eine Injektionskanüle homogenisiert. Nacheinander wurden 0,5 ml 2 M Natriumacetat (pH 4,0), 5 ml H2O-gesättigtes Phenol und 1 ml Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) zugesetzt und kräftig gemischt. Nach 15 minütiger Inkubation auf Eis wurde 30 min bei 4.000 rpm und 4°C zentrifugiert und die RNA-enthaltende wässrige Phase mit 1 Vol. Isopropanol 1 h bei -20°C gefällt. Die präzipitierte RNA wurde 30 min bei 4.000 rpm und 4°C zentrifugiert und das Pellet je nach Größe in 0,5 bis 4 ml dH2O gelöst. Es folgte eine zweite Phenol/Chloroform-Extraktion mit 1 Vol. H2O-gesättigtem Phenol und 0,25 Vol. Chloroform/Isoamylalkohol; zentrifugiert wurde je nach Volumen 3 min bei 14.000 rpm oder 30 min bei 4.000 rpm. Aus der wässrigen Phase wurde die RNA mit 1 Vol. 5 M Ammonium-acetat und 2,2 Vol. Ethanol 1 h bei -20°C gefällt; anschließend wurde 15 min bei 14.000 rpm und 4°C zentrifugiert. Das RNA-Pellet wurde einmal mit 80 %igem Ethanol gewaschen, getrocknet und schließlich je nach Pelletgröße in 150 bis 600 µl dH2O gelöst. Die Menge der isolierten RNA wurde photometrisch bestimmt, indem ein Aliquot 1:100 verdünnt und die Absorption der Lösung bei einer Wellenlänge von 260 nm (OD260) gemessen wurde (OD260 = 1 entspricht 40 µg RNA/ml). Die Konzentration der Lösungen wurde auf 1 µg/µl eingestellt. Die Lagerung erfolgte für einige Tage bei -20°C, für mehrere Wochen bei -70°C.


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5.2.3 Reverse Transkription (RT)

Pro RT-Ansatz wurden 200 ng RNA mit 100 ng Hexanukleotiden in einem Volumen von 7,5 µl für 10 min bei 67°C inkubiert und anschließend auf Eis gekühlt. 12,5 µl eines Reaktionsmixes, der pro Ansatz 4 µl 5x-RTase-Puffer (Gibco), 2 µl 100 mM DTT (Gibco), 5 µl 5 mM dNTPs, 0,5 µl RNasin (Promega) und 1 µl Superscript MoMLV-RTase (Gibco) enthielt, wurden hinzugesetzt und die Ansätze für 1 h bei 42°C inkubiert. Für die Kontrollansätze enthielt der Reaktionsmix statt der RTase dH2O.

5.2.4 PCR

Die als Primer verwendeten Oligonukleotide (vgl. Abschnitt 5.2.5.) wurden als Lyophilisat von der BioTeZ Berlin-Buch GmbH bezogen und grundsätzlich mit einer Konzentration von 100 OD260nm/ml in dH2O gelöst. Aus dieser Stocklösung wurde eine 1:100-Verdünnung in dH2O hergestellt, so daß sich für die Gebrauchslösung eine Konzentration von 1 OD260nm/ml ergab. Ein Standardansatz für die PCR mit einem Endvolumen von 25 µl enthielt 2 µl des RT-Ansatzes, 13 µl dH2O, je 2,5 µl 10x PCR-Puffer, 5´Primer (1 OD260nm/ml), 3´Primer (1 OD260nm/ml) und 5 mM dNTPs sowie 0,35 µl Taq-Polymerase (Amersham). Soweit als möglich wurden Reaktionsmixe aus gemeinsamen Komponenten für die verschiedenen Ansätze hergestellt, um das Pipettieren kleiner Volumina zu vermeiden und möglichst vergleichbare Reaktionsbedingungen zu garantieren. Die PCR-Bedingungen wurden wie folgt programmiert: Auf eine anfängliche Denaturierung für 1 min bei 95°C folgten 30 Zyklen: 30 s Denaturierung bei 95°C - 30 s Annealing (Temperatur abhängig von den eingesetzten Primern) - 2 min Elongation bei 72°C. Abschließend wurde für weitere 5 min bei 72 °C inkubiert, bevor die Ansätze auf 4°C heruntergekühlt wurden. Die Annealingtemperatur wurde entsprechend der niedrigsten Schmelztemperatur der jeweils verwendeten Primer gewählt, die sich aus der Zusammensetzung ihrer Nukleotide ergibt. Die Schmelztemperatur wurde gemäß folgender Formel berechnet: für jeden Cytosin- und Guaninrest wurden 4°C, für jeden Adenin- und Thyminrest 2°C berechnet und die Summe aus allen Resten des Oligonukleotids gebildet (Wallace et al., 1979; Formel nicht gültig für lange Oligonukleotide). Bei den verwendeten Primern wurden in der Regel Annealingtemperaturen zwischen 58°C und 72 °C gewählt.

10 µl-Aliquots der Ansätze wurden zur Analyse der PCR-Produkte auf 1%-Agarose-Gele aufgetragen.

5.2.5 Primerkombinationen für RT-PCR-Experimente

Die folgende Übersicht stellt die durch RT-PCR amplifizierten cDNA-Fragmente schematisch dar unter Angabe der jeweils verwendeten Primerkombinationen. Die Kontrollen auf Typspezifität der einzelnen Primer sind ebenfalls gezeigt. Diese ergaben für keinen der eingesetzten Primer ein PCR-Produkt. Tabellarisch aufgeführt sind im Anschluß daran die Sequenzen der für die RT-PCR-Experimente verwendeten Oligonukleotide zur Amplifikation der beiden SEC61alpha-Gene, ihre Orientierung (S, sense oder AS, antisense) und jeweilige Position im Gen sowie ihre Speziesspezifität: HS-1 und -2 bezeichnen die beiden menschlichen Gene (Homo sapiens), RN-1 und -2 die aus Ratte (Rattus norwegicus), MM-1 und -2 die aus Maus (Mus musculus) und CF-1 und -2 die aus Hund (Canis familiaris).


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Bezeich-

nung

Orien-

tierung

Sequenz

Pos. im Gen

(ATG =1,2,3)

Speziesspezifität

439-22

S

5´-ATGATCATTACCATTGGGCAAG-3´

361-382

HS-2, RN-2, MM-2, CF-2

456-30

AS

5´-ACTGACATCGGCCCACTGTCCTAGTA

AATT-3´

984-955

HS-2

553-22

S

5´-ATGATCATCACTATCGGTCAGT-3´

361-382

RN-1

554-30

AS

5´-ATGACGTATCCGACCAGGTGCCCAGC

AGGC-3´

985-956

RN-1

757-21

AS

5´-TCCCATGCTGCCCACCTCGCT-3´

1416-1396

RN-1 und MM-1

758-21

AS

5´-ACCCATTCCACCAACTTCAGC-3´

1416-1396

RN-2 und MM-2

759-19

S

5´-CCGAGTGGACCTTCCAATC-3´

783-801

RN-1 und MM-1

760-19

S

5´-TCGTGTTGACTTGCCCATT-3´

783-801

RN-2 und MM-2

904-25

S

5´-GAAGTCATCAAGCCATTCTGTGTCA-3´

19-43

RN-1

1069-21

S

5´-GCCATGGGCATCAAATTTTTA-3´

-3 -18

CF-2 und HS-2

1178-19

AS

5´-GTCCCCGTACAT(G/C)CCCGTC-3´

416-399

RN-1, MM-1, RN-2 und MM-2

1179-21

AS

5´-CCCCATGCTGCCAACCTCGCT-3´

1416-1396

HS-1

1180-19

AS

5´-ACCCATCCCACCAACTTCGGC-3´

1416-1396

HS-2

1181-20

S

5´-TGCCGGAAATTCAGAAGCCA-3´

47-66

HS-1 und MM-1

1182-21

S

5´-CTACCAGAAATTCAGAAGCCT-3´

46-66

MM-2

1183-21

S

5´-CTACCAGAAATTCAGAAACCG-3´

46-66

HS-2


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Für die Amplifikation des HPRT-Gens, das als Referenzgen zum Vergleich der RNA-Mengen unterschiedlicher Präparationen eingesetzt wurde, wurden folgende Maus-spezifische Primer eingesetzt:

5.2.6 ´-race

Die 3´-Enden der Gene SEC61alpha-I aus Maus und SEC61alpha-II aus Maus und Mensch wurden durch die Methode des 3´-race (rapid amplification of cDNA ends) amplifiziert. Dabei macht man sich das Vorhandensein eines poly(A)-Schwanzes am 3´-Ende jeder mRNA zunutze. Für die reverse Transkription der RNA wird ein langes Oligonukleotid (hier: Primer 35) benutzt, dessen 3´-Abschnitt aus oligo(dT) und dessen 5´-Abschnitt aus einer selbstgewählten Sequenz besteht. Die aus dieser Reaktion resultierende cDNA wird als Template für die anschließende PCR gewählt, bei der der 3´-Primer mit dem 5´-Abschnitt des für die reverse Transkription eingesetzten Oligonukleotids überlappt (hier: Primer 32 oder 33) und der 5´-Primer aus der bekannten Sequenz des Zielgens stammt. Die nachfolgende schematische Darstellung verdeutlicht die Position der Primer bezüglich des Zielgens.

Übersicht über die für die 3´-race verwendeten Oligonukleotide:

Bezeich-

nung

Orien-

tierung

Sequenz

Position im Gen

(ATG =1,2,3)

Speziesspezifität

35-57

AS

5´-GTACGTCGTGCCGTACGACGGAACGTG

TACGGCCGCTCTGTTTTTTTTTTTTTTTTT-3´

poly(A)-Schwanz

jede mRNA

32-30

AS

5´-GTACGTCGTGCCGTACGACG-3´

überlappend mit dem 5´-Abschnitt von Primer 35

33-20

AS

5´-GAACGTGTACGGCCGCTCTG-3´

41-20

S

5´-TGGG(A/C)GCCAT(A/C)TTTGAGGAT-3´

1052 - 1071

HS-2, RN-2, CF-2, MM-2

761-22

S

5´-TATCGGGTCTGGCACCGGGATC-3´

1320-1341

RN-1

762-25

S

5´-CGCCATTGGCTCGGGCACTGGAATT-3´

1317-1341

RN-2

Reverse Transkription und PCR wurden wie in den Abschnitten 5.2.3. und 5.2.4. beschrieben durchgeführt.


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5.3 Methoden beim Arbeiten mit S. cerevisiae

5.3.1 Wachstumsbedingungen und verwendete Medien

Die Wachstumstemperatur für die Hefestämme betrug, falls nicht anders genannt, 30°C. Die Inkubation erfolgte entweder in Flüssigmedien im Schüttelwasserbad oder auf festen Medien (Agarplatten) im Brutschrank.

Verwendete Medien:

Vollmedium

YP:

1% Bacto-Yeast-Extract (Difco)

 

 

2% Bacto-Peptone (Difco)

 

 

vor Gebrauch Zugabe der sterilfiltrierten Kohlenstoffquelle:

 

YPD:

2% Glucose (Endkonz.)

 

YPGal:

2% Galaktose (Endkonz.)

 

YPS:

2% Saccharose (Endkonz.)

 

YPG:

3% Glycerin (Endkonz.)

Minimalmedium

SD:

0,67% Yeast Nitrogen Base (YNB, Difco) ohne Aminosäuren

 

 

2% Glucose

 

 

 

 

Sgal:

0,67% Yeast Nitrogen Base (YNB, Difco) ohne Aminosäuren

 

 

2% Galaktose

Supplemente für Minimalmedien:

Supplement

Endkon-

zentration

Stammlösung (Lagerung)

Zusammensetzung des

Supplement-Mixes

Adeninsulfat

20 mg/l

2 mg/l (Raumtemp., dunkel)

50 ml

Uracil

20 mg/l

2 mg/l (Raumtemp., dunkel)

50 ml

L-Tryptophan

20 mg/l

10 mg/l (-20°C)

10 ml

L-Histidin-HCl

20 mg/l

10 mg/l (4°C)

10 ml

L-Leucin

30 mg/l

10 mg/l (4°C)

15 ml

L-Lysin

30 mg/l

10 mg/l (4°C)

15 ml

Für Stämme ohne Selektionsmarker wurde bei Verwendung von Minimalmedium der komplette Supplement-Mix (3 ml Mix/100 ml Medium) zugesetzt. Für Selektionsmedien wurden einzelne Supplemente im Mix durch dH2O ersetzt.

Feste Medien (für Agarplatten) enthielten außer den Bestandteilen der Flüssigmedien 2% Agar.

YP-Medium (gegebenenfalls mit Agar) sowie Agar in dH2O für Minimalplatten wurden durch Autoklavieren sterilisiert. Die Minimalmedien, die Supplement-Mixe, die 20%igen Stocklösungen der Kohlenstoffquellen sowie 10 x YNB (6,7%) wurden sterilfiltriert.


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5.3.2 Kreuzung, Sporulation und Tetradenanalyse

5.3.2.1 Kreuzung von Hefestämmen

Die Kreuzung eines haploiden Stammes des Paarungstyps alpha mit einem des Paarungstyps a geschah durch Mischen eines Aliquots jedes Stammes (z.B. jeweils 5 µl einer Flüssigkultur) auf einer Vollmedium-Agarplatte und Inkubation bei 30°C für 6 - 8 h. Wenn möglich waren die Stämme auf unterschiedliche Marker selektionierbar, so daß durch anschließendes Ausstreichen auf Selektionsplatten Kolonien aus diploiden Zellen identifiziert werden konnten. Andernfalls wurden Zellen einzelner Kolonien (auf SPO-Agarplatten, vgl. 5.3.2.2.) auf ihre Sporulationsfähigkeit und damit Diploidie getestet (letzteres ist nicht möglich, wenn die diploiden Stämme sporulationsdefizient sein sollten (z. B. pep4-Homozygote)).

5.3.2.2 Sporulation

Die diploiden Hefen wurden für 6 - 8 h bei 30°C in Präsporulationsmedium (PSPO) inkubiert. (Bei der Temperaturwahl ist zu beachten, daß ab 34°C keine Sporulation mehr stattfindet !) Anschließend wurden die Zellen bei 5.000 rpm für 2 min zentrifugiert und einmal in Sporulationsmedium (SPO) gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wurde das Zellpellet in 1 ml SPO-Medium, das 1/4 der entsprechenden normalen Supplementkonzentration (7,5 µl) enthielt, resuspendiert. Die Sporulation erfolgte bei 30°C für etwa 2 Tage (längere Inkubation führt zu mehr keimungsunfähigen Sporen). Die Sporulation wurde im Mikroskop überprüft - optimal ist eine Sporulationsrate von 80 - 90 %. Die sporulierten Zellen wurden abzentrifugiert und in 1 ml SED (1 M Sorbit, 25 mM EDTA) aufgenommen. Bei 4°C sind die Sporen für mehrere Tage haltbar.

PSPO-Medium:

0,8 % Bacto-Yeast-Extract

 

0,3 % Bacto-Peptone

 

10 % Glucose

SPO-Medium:

1 % Kaliumacetat

 

0,1 % Bacto-Yeast-Extract

 

0,05 % Glucose

Beide Medien wurden sterilfiltriert.

5.3.2.3 Tetradenanalyse

Für die Tetradenanalyse wurden die sporulierten Zellen protoplastiert: 200 µl sporulierte Hefezellen wurden mit 10 µl 1 M DTT und 20 µl Novozym (10 mg/ml) vermischt und für etwa 15 min (gegebenenfalls auch länger) bei Raumtemperatur inkubiert. Ein Aliquot wurde auf einer Platte zur Tetradenanalyse (Vollmedium) ausgestrichen und die vier Sporen einzelner Tetraden mit Hilfe eines Mikromanipulators (MSM, Fa. Singer) getrennt. Die Analyse der Tetraden erfolgte anhand der Phänotypen bzw. der entsprechenden Selektionsmarker.


61

5.3.3 Transformation von Hefezellen mit Plasmid-DNA

Zum Transformieren von Hefezellen wurden entweder ARS/CEN-Plasmide (Single-Copy-Plasmide, 1 Plasmid pro Zelle) oder 2µ-Plasmide (Multi-Copy-Plasmide, ca. 50 Plasmide pro Zelle) eingesetzt. Die Selektion der Transformanden erfolgte über Selektionsmarkergene wie LEU2, HIS3 oder ADE2, die ein Wachstum in dem entsprechenden Selektionsmedium (vgl. 5.3.1.) ermöglichten. Für die Transformation wurden aus über Nacht gewachsenen Vorkulturen Hauptkulturen in Vollmedium YPD mit einer OD600nm von 0,2 - 0,3 pro ml Kultur angeimpft und bei 30°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Bei einer OD600nm von 0,8 - 1,2 wurden pro Transformationsansatz eine 10 OD600nm entsprechenden Menge der exponentiell wachsenden Zellen durch Zentrifugation bei Raumtemperatur und 2.000 rpm für 2 min geerntet, einmal mit dH2O und einmal mit 0,1 M LiAc/TE gewaschen und anschließend in 200 µl 0,1 M LiAc/TE pro Transformationsansatz resuspendiert. Diese 200 µl Zellen wurden in der Regel mit 7 µl der zu transformierenden Plasmid-DNA (1 µg/µl) und 15 µl Heringssperm-DNA (3 mg/ml), die zuvor hitzedenaturiert worden war (Inkubation bei 68°C für 10 min, dann auf Eis), vermischt und mit 500 µl 0,1 M LiAc/TE/40% PEG versetzt und durchmischt. Es folgte eine Inkubation bei 30°C für 30 min und bei 42°C für 15 min. Anschließend wurden die Ansätze für 3 min bei 3.000 rpm zentrifugiert, der Überstand abgenommen und das Zellpellet in 500 µl SD-Medium resuspendiert. Davon wurden 100 µl auf Selektionsplatten ausplattiert und bei 30°C inkubiert.

TE:

10 mM Tris/HCl

1 mM EDTA pH 8,0

(Stocklösung: 10x TE)

PEG:

20 % PEG 4000 oder 6000

10 mM CaCl2

10 mM Tris pH 7,5

5.3.4 Isolierung genomischer DNA aus Hefezellen

Genomische DNA wurde aus 10 ml dicht gewachsener Hefe-Kultur isoliert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert (5 min, 3.000 rpm), einmal mit 0,5 ml SED (1 M Sorbit, 25 mM EDTA) gewaschen, erneut pelletiert (2 min, 5.000 rpm) und in 0,5 ml SED/25 µl 1 M DTT/50 µl Novozym (10 mg/ml in SED/50 mM DTT) vorsichtig resuspendiert. Zur Sphäroblastierung wurden die Zellen 40 min bei 30°C inkubiert. Anschließend wurde die leicht visköse Zellsuspension 1 min bei 3.000 rpm zentrifugiert, der Überstand abgenommen und das Pellet auf 800 µl mit 10x TE (100 mM Tris/HCl; 10 mM EDTA pH 8,0) aufgefüllt und vorsichtig resuspendiert. Nach Zugabe von 50 µl SDS folgte eine Inkubation bei 65°C für 20 min. Dabei wurde das Reaktionsgefäß hin und wieder vorsichtig invertiert. Nach Zugabe von 200 µl 5 M Kaliumacetat und vorsichtiger Durchmischung wurde der Ansatz 30 min auf Eis inkubiert und anschließend für 3 min bei 14.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und zur vollständigen Abtrennung des Pellets noch einmal wie zuvor zentrifugiert. Die DNA wurde aus dem Überstand mit 100% Ethanol ausgefällt, für 10 s pelletiert, 5 min in der SpeedVac getrocknet und in 300 µl TE bei 65°C gelöst. Es folgte eine Behandlung mit 20 µl RNase A für 30 min bei 65°C. Anschließend wurde der Ansatz mit 500 µl eiskaltem Isopropanol überschichtet. An der Grenzschicht fällt die DNA aus. Diese kann entweder direkt aus dem Ansatz „gefischt“ werden, z.B. mit Hilfe einer gelben Pipettenspitze oder durch kurzes Pelletieren eingesammelt werden. Die DNA wurde in 100 µl dH2O bei 65°C gelöst und bei -20°C gelagert.


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5.4 Klonierung und Deletion der Gene SSH1, SBH1 und SBH2

5.4.1 Klonierung des SSH1-Gens

Der Klon für SSH1 wurde aus einer genomischen Bank von S. cerevisiae (die in den Vektor pSEY8 kloniert war) durch Hybridisierung mit dem folgenden Oligonukleotid isoliert: 5´-GCGCGTAGCAGAGAGAATTTGATC-3´. Die Sequenz dieses Oligonukleotids stimmt mit dem 5´-Ende des GenBank-Klons # S77888 überein. Das in dieser Arbeit verwendete Plasmid mit dem SSH1-Gen aus der genomischen Bank trug die Bezeichnung pSEC61VII (später pSSH1). Noch während der Untersuchungen des SSH1-Komplexes wurde die Sequenz des SSH1-Gens durch Feldmann et al. (1994) im Rahmen des S. cerevisiae-Genom-Sequenzierungsprojektes veröffentlicht.

5.4.2 Deletion des SSH1-Gens

Es wurden drei verschiedene Deletionskonstrukte des SSH1-Gens mit unterschiedlichen Selektionsmarkern hergestellt. Dazu wurde zunächst ein 1756 bp NheI/SnaBI-Fragment aus pSEC61VII, das das SSH1-Gen samt seinem natürlichen Promotor enthielt, entweder in die XbaI/EcoRV-Schnittstelle des Vektors pBluescript, resultierend in pKF3, oder in die XbaI/SmaI-Schnittstelle des Vektors pUC19, resultierend in pKF4, umkloniert. pKF3 war Ausgangspunkt für ein Deletionskonstrukt, in dem der größte Teil der kodierenden Region des SSH1-Gens (ein 1171 bp EcoRV/EcoRI-Fragment) durch das HIS3-Markergen (ein etwa 1,9 kb SmaI/EcoRI-Fragment aus dem Plasmid pUC-HIS) ersetzt wurde. Das resultierende Plasmid pKF5 ist somit durch Deltassh1::HIS3 charakterisiert. Zwei weitere Deletionskonstrukte entstanden aus pKF4. Für Deltassh1::LEU2 wurde ein 649 bp EcoRV/BglII-Fragment aus der kodierenden Region des SSH1-Gens durch das LEU2-Gen (ein etwa 2,2 kb BamHI/SmaI-Fragment aus dem Plasmid bsLEU) ersetzt, resultierend in pTX73. Für Deltassh1::ADE2 schließlich wurde in die EcoRV-Schnittstelle von pKF4 ein BamHI-Linker eingeführt (resultierend in pKF6) und das 649 bp BamHI/BglII-Fragment aus der kodierenden Region des SSH1-Gens durch das ADE2-Gen (ein etwa 2,2 kb BglII-Fragment aus dem Plasmid pASZ11) ersetzt, resultierend in pKF7.

5.4.3 Klonierung des SBH1-Gens

Der Klon wurde aus derselben genomischen Bank isoliert wie der für SSH1. Für das „Screening“ der Bank wurde das Oligonukleotid 5´-ACTCTACCTCCTACCATACTCC-3´ eingesetzt, dessen Sequenz mit der des 5´-untranslatierten Bereichs des GenBank-Klons # SCE9747 korrespondiert.

5.4.4 Deletion des SBH1-Gens

Zur Herstellung des Deletionskonstrukts Deltasbh1::HIS3 wurde ein 410 bp-Fragment der 5´ flankierenden Region (5´FR, Nukleotide -387 bis +23, wobei die Position +1 das A des ATG-Startcodons bezeichnet) und ein 361 bp-Fragment der 3´ flankierenden Region (3´FR, Nukleotide +224 bis + 584) des SBH1-Gens durch PCR aus genomischer DNA amplifiziert.


63

Die dafür verwendeten, nachstehend aufgeführten Primer waren für Klonierungszwecke so gewählt, daß sie an den Enden der PCR-Fragmente Restriktionsschnittstellen einführten:

Ziel-

fragment

Richtung

d. Primers

Bezeichnung des Oligonukleotids

Sequenz des Oligonukleotids und eingeführte

Restriktionsschnittstelle

5´FR

sense

94-26

5´-GCTCTAGACCGCTGCCAAGCATAAAC-3´

XbaI

5´FR

antisense

95-23

5´-CGGGATCCTGGAGGAGTTGGGCT-3´

BamHI

3´FR

sense

154-27

5´-CGGGATCCTAAAGTTGCCGGTAAGTTA-3´

BamHI

3´FR

antisense

97-26

5´-GGAATTCCATACTGTTCCAATCCAGC-3´

EcoRI

Die in den Vektor pGEM-T klonierten PCR-Fragmente (das 5´FR-Fragment in pKF24, das 3´FR-Fragment in pKF25) wurden durch Sequenzierung überprüft. Anschließend wurden beide Fragmente zusammen in den pBluescript-Vektor kloniert (pKF29) und in die BamHI-Schnittstelle zwischen den beiden Fragmenten das HIS3-Gen (ein ca. 1,7 kb BamHI-Fragment aus pUC-HIS) eingefügt, resultierend in pKF30.

5.4.5 Klonierung des SBH2-Gens

Das SBH2-Gen wurde gefunden durch „Screening“ der o.g. genomischen Hefebank mit einem degenerierten Oligonukleotid 5´-GA(AG)AA(AG)CA(AG)GCNAA(AG)CA(AG)AC-3´, dessen Sequenz sich von der Peptidsequenz EKQAKQT ableitet, die durch Sequenzierung des Sbh2-Proteins bestimmt wurde. Die vollständige Nukleotidsequenz positiver Klone wurde bestimmt. Der nachfolgend verwendete Klon (11/87) aus der genomischen Hefebank wurde mit pS61beta-II (später pSBH2) bezeichnet.

5.4.6 Deletion des SBH2-Gens

Die Deletionskonstrukte für das SBH2-Gen wurden in ähnlicher Weise wie das für das SBH1-Gen hergestellt. Das 5´FR-Fragment enthielt die Nukleotide -215 bis +17, das 3´FR-Fragment die Nukleotide +227 bis +637. Die verwendeten Oligonukleotide sind im folgenden aufgeführt:

Ziel-

fragment

Richtung

d. Primers

Bez.d.Oligo-

nukleotids

Sequenz des Oligonukleotids und eingeführte

Restriktionsschnittstelle

5´FR

sense

1763-25

5´-GCTCTAGAGCTGCCCCGGGTACCAC-3´

XbaI

5´FR

antisense

1764-28

5´-CGGGATCCCGGAACTGAAGCTGCCATTC-3´

BamHI

3´FR

sense

1765-29

5´-CGGGATCCCTTGCTTTGCATCTATTGACG-3´

BamHI

3´FR

antisense

1766-26

5´-GGAATTCCAGAGATACTCCAACTACG-3´

EcoRI


64

Die in den Vektor pGEM-T klonierten Fragmente (das 5´FR-Fragment in pKF17, das 3´FR-Fragment in pKF18) wurden durch Sequenzierung überprüft und anschließend zusammen in den pBluescript-Vektor kloniert (pKF19). In die BamHI-Schnittstelle zwischen den beiden Fragmenten wurde entweder das ADE2-Gen (ein 2,2 kb BglII-Fragment aus pASZ11), resultierend in pKF20 mit Deltasbh2::ADE2, oder das HIS3-Gen (ein ca. 1,7 kb BamHI-Fragment aus pUC-HIS), resultierend in pKF21 mit Deltasbh2::HIS3, eingefügt.

5.4.7 Einbringen der Deletionskonstrukte in Hefezellen

Die Deletionskonstrukte wurden grundsätzlich zunächst in den diploiden wt-Stamm YTX69 transformiert. Anschließend ließ man die Zellen sporulieren und führte eine Tetradenanalyse durch (vgl. 5.3.2). Nachdem klar war, daß Deletion aller drei Gene nicht letal war, wurden auch haploide Zellen mit den Deletionskonstrukten transformiert. Doppel- oder Tripelmutanten entstanden entweder durch Transformation von Zellen, die bereits eine Deletion trugen, mit einem weiteren Deletionskonstrukt (z.B. YKF16 und YKF19), oder durch Kreuzung von Einzelmutanten und nachfolgender Sporulation und Tetradendissektion (z.B. YKF24). Die Doppelmutante YKF5, die ein ts-Allel des SEC61-Gens und eine Deletion im SSH1-Gen trägt, entstand durch Transformation des sec61-2-Stammes YFP338 mit dem Deltassh1::ADE2-Deletionskonstrukt (in pKF7). Alle Deletionsstämme wurden durch Immunoblotting und in einigen Fällen auch durch Southern Blot Analyse verifiziert.

5.5 Immunfluoreszenz

5.5.1 Epitop-Tagging des SSH1-Gens

Das Ssh1-Protein wurde für die Detektion per Immunfluoreszenz mit einem Myc-Epitop am C-Terminus markiert. Dazu wurde durch stumme Mutagenese an Position 13 und 16 vor dem Stop-Codon eine KpnI-Restriktionsschnittstelle eingeführt: Aus dem Plasmid pSEC61VII wurde ein ca. 1,2 kb EcoRI-Fragment, das den C-terminalen Teil des SSH1-Gens enthält, ausgeschnitten und in den Mutagenese-Vektor pALTER (Promega) subkloniert, resultierend in dem Plasmid pKF11. Die Mutagenese wurde gemäß der Anleitung für das „Altered SitesTM in vitro Mutagenesis Systems“ (Promega) mit Hilfe des Mutagenese-Oligonukleotids 1097-28 (5´-CATAGCACCTGGTACCCCCAAGACTTGA-3´) durchgeführt und ergab das Plasmid pKF12. Die erfolgreiche Mutagenese wurde per Sequenzierung überprüft. Anschließend wurde das 1,2 kb EcoRI-Fragment aus pSEC61VII durch das mutagenisierte EcoRI-Fragment aus pKF12 ersetzt, resultierend in pKF13. Die neu-eingeführte KpnI-Schnittstelle wurde nun für die Insertion eines Linkers aus zwei Oligonukleotiden (s.u.), der für das Myc-Epitop kodierte, genutzt. Ein Klon mit fehlerfreier Insertion in korrekter Orientierung wurde durch Sequenzierung ermittelt. Das entstandene Plasmid pKF14 enthielt das SSH1-Gen mit C-terminalem Myc-Epitop unter seinem natürlichen Promotor in einem 2µm-Plasmid. Subklonierung des ca. 2,5 kb SmaI/SalI-Fragments aus pKF14 in den ARS/CEN-Vektor pRS414 (Sikorski und Hieter, 1989) führte zu dem Plasmid pKF15 (mit gleichem Insert wie pKF14), das jedoch als ARS/CEN-Plasmid in Hefezellen in einfacher Kopie vorliegt, während


65

pKF14 als (2µm-)Multicopy-Plasmid in einer Kopienanzahl von etwa 50 pro Zelle vorkommt. Beide Plasmide wurden erfolgreich für die Immunfluoreszenz eingesetzt.

Richtung

d. Primers

Bezeichnung d. Oligonukleotids

Sequenz der Oligonukleotide für den Myc-Epitop-Linker

sense

1098-54

5´-CAGGTGCTATGGAACAAAAGTTGATCTCTGAAGA

AGACTTGTAAGCATGCGTAC-3´

antisense

1099-54

5´-GCATGCTTACAAGTCTTCTTCAGAGATCAACTTTT

GTTCCATAGCACCTGGTAC-3´

5.5.2 Zellen für die Immunfluoreszenz

Für die Immunfluoreszenz wurden entweder haploide oder diploide homozygote Deltassh1-Hefestämme (YTX84, YTX85 oder YKF6) mit einem Plasmid, das das Myc-Epitop markierte SSH1-Gen trug (pKF14 oder pKF15, siehe 5.5.1.) oder einem entsprechenden Kontrollplasmid (pSEY8 oder pRS414) transformiert.

5.5.3 Antikörper für die Immunfluoreszenz

Als primäre Antikörper dienten ein Kaninchen-Antikörper spezifisch für Kar2p, der freundlicherweise von Dr. M. Rose zur Verfügung gestellt wurde, sowie der monoklonale Maus-Antikörper 9E10, der gegen das c-Myc-Epitop gerichtet ist und aus der Hybridomazellinie GE10 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. J. Behrens, Arbeitsgruppe Prof. W. Birchmeier, MDC Berlin) gewonnen wurde.

Die Hybridomzellen wurden in DMEM-Glutamax, das 10% FCS und 1% Penicillin/Streptomycin-Lösung enthielt (alle Bestandteile des Mediums von der Fa. Gibco), bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Die Antikörper wurden aus dem Kulturüberstand konfluenter Zellen gewonnen und über eine Protein G-Sepharose Säule gereinigt (Protein G Sepharose Fast Flow, Pharmacia). Dazu wurde eine 10 cm lange Säule mit einem Durchmesser von 1 cm (Sigma) bei 4°C mit ca. 2 ml Protein G-Sepharose (in Puffer/Ethanol) beladen, was etwa 1 ml gepacktes Säulenmaterial ergab. Zur Entfernung des Ethanols wurde mehrfach mit Wasser gewaschen. Nach luftblasenfreiem Einführen des Adapters (unter Wasser) wurden Schläuche und Säule mit weiteren 7 - 10 ml Wasser gespült. Die Durchflußgeschwindigkeit wurde hier und bei den folgenden Wasch- und Äquilibrierungsschritten auf etwa 0,5 ml/min eingestellt. Es folgten ein Waschschritt mit etwa 25 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0 und einer mit etwa 25 ml 0,1 M Glycin zur Entfernung eventuell gebundener Verunreinigungen. Anschließend wurde die Säule mit etwa 25 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0 äquilibriert, der pH-Wert des Eluats wurde kontrolliert. Der Hybridomüberstand wurde nach Zentrifugation bei 5.000 rpm für 10 min und Sterilfiltration (Costar-Sterilfilter, Wasserstrahlpumpe) mit einer Durchflußgeschwindigkeit von etwa 0,2 ml/min über die Säule gegeben. Es folgte ein Waschschritt mit etwa 40 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0 (0,5 ml/min), bevor mit 0,1 M Glycin pH 2,7 (Durchflußgeschwindigkeit etwa 1 ml/min) eluiert wurde. Es wurden 15 Fraktionen von 1 ml gesammelt, die direkt in Reaktionsgefäßen, in denen zur Neutralisierung 250 µl 1 M Tris pH 8,0 vorgelegt war, aufgefangen wurden. Die Säule wurde mit weiteren 25 ml 0,1 M Glycin pH 2,7 gewaschen (0,5 ml/min), mit 20 ml


66

20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0 wieder neutralisiert und unter 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0 mit 20% Ethanol bei 4°C gelagert.

Die Fraktionen wurden auf ihren Protein- und damit Antikörpergehalt durch Auftropfen von 1 µl-Aliquots auf Nitrocellulose und Amidoschwarz-Anfärbung getestet. Der Hauptanteil befand sich in den Fraktionen 4 und 5. Photometrische Konzentrationsbestimmung ergab, daß aus 250 - 300 ml Hybridomüberstand etwa 5 - 6,5 mg Protein gewonnen werden konnte. Die Fraktionen 4 - 6 wurden vereinigt, à 300 µl aliquotiert und teils bei 4°C, teils bei -20°C gelagert, die Proteinkonzentration lag bei etwa 2 mg/ml.

Als sekundäre Antikörper wurden FITC (Fluorescein 5-Isothiocyanat)-goat-anti-rabbit und FITC-goat-anti-mouse, z.T. auch Cy3-goat-anti-mouse der Fa. Dianova verwendet. Letzterer neigte dazu, stark zu überstrahlen, so daß die Strukturen nicht so deutlich erkennbar waren, wie mit den FITC-markierten Antikörpern.

5.5.4 Immunfluoreszenz von Hefezellen

Transformanden wurden in 3 ml Selektionsmedium bei 30°C über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurden sie bei einer Zelldichte von OD600nm zwischen 0,5 und 1,5 zur Fixierung mit 1/10 Vol. 36% Formaldehyd versetzt und für 1 h bei 30°C schüttelnd weiter inkubiert. 0,5 OD600nm Zellen wurden entnommen und für 3 min bei 5.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und das Pellet mit 300 µl 0,1 M Kaliumphosphat pH 6,5 gewaschen. Anschließend wurde wiederum für 3 min bei 5.000 rpm zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstandes wurde das Zellpellet mit 300 µl SED (1 M Sorbit, 25 mM EDTA) gewaschen und wie zuvor zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde nun in 100 µl SED resuspendiert und zur Sphäroblastierung der Zellen mit 5 µl 1 M DTT und 10 µl Novozym (10 mg/ml in SED mit 50 mM DTT, Lagerung bei 4°C) vermischt. Es folgte eine Inkubation bei 30°C für 25 - 35 min (je nach Zelltyp), bevor die sphäroblastierten Zellen wieder wie zuvor pelletiert wurden. Das Zellpellet wurde in 120 - 170 µl 0,1 M Kaliumphosphat pH 6,5 resuspendiert.

In der Zwischenzeit wurden Multiwell-Objektträger (10 Vertiefungen (wells) pro Objektträger, ICN) mit Poly-L-Lysin beschichtet: Die Objektträger wurden sorgfältig mit Ethanol gereinigt. Pro Vertiefung wurden 11 µl Poly-L-Lysin (Sigma; 10 mg/ml, Lagerung bei -20°C) aufgetragen. Nach kurzer Einwirkungszeit wurde die überschüssige Flüssigkeit abgesaugt, den Rest ließ man eintrocknen. Die Objektträger wurden 3x mit dH2O gewaschen und anschließend an der Luft getrocknet.

Auf die vorbereiteten Objektträger wurden 15 - 20 µl der fixierten und sphäroblastierten Zellen pro Vertiefung aufgetragen, Nach etwa 2 - 3 min, in denen sich die Zellen absetzen konnten, wurde die überschüssige Flüssigkeit abgesaugt, den Rest ließ man eintrocknen (ca. 10 - 15 min). Für die folgende Permeabilisierung der Zellen wurden die Objektträger für exakt 6 min in eiskaltem Methanol (-20°C) und 30 s in eiskaltem Aceton (-20°C) inkubiert. Man ließ die Objektträger kurz (!!!) trocknen, bevor pro Vertiefung 20 µl PBS/10%FCS aufgetragen wurde (PBS: „phosphate buffered saline“, FCS: „fetal calf serum“; beides von Gibco). Nach der Permeabilisierung der Zellen ist darauf zu achten, daß diese bei den folgenden Schritten nicht mehr austrocknen!

Der primäre Antikörper wurde in PBS/10%FCS verdünnt. Für den Kaninchen-Antikörper gegen Kar2p wurde eine Verdünnung von 1:5000 verwendet, für den Maus-Antikörper 9E10 gegen das c-Myc-Epitop bewährte sich eine Verdünnung von 1:20. Pro Vertiefung wurden 20


67

µl der Antikörperverdünnung oder zur Kontrolle 20 µl PBS/10%FCS aufgetragen. Es erfolgte in der Regel eine Inkubation über Nacht bei 4°C in einer feuchten Kammer (alternativ: für einige Stunden bei Raumtemperatur).

Nach 10maligem Waschen der Objektträger mit PBS/10%FCS wurden die Zellen mit einer 1:100 Verdünnung des sekundären Antikörpers in PBS/10%FCS inkubiert. Auch hier wurden 20 µl des jeweiligen Antikörpers Ziege-anti-Kaninchen-FITC bzw. Ziege-anti-Maus-FITC pro Vertiefung eingesetzt. Inkubiert wurde in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur für 1 h. Nach weiteren 10 Waschschritten mit PBS/10%FCS ließ man die Objektträger kurz trocknen, bevor sie mit Mounting Medium, das zur Anfärbung der Zellkerne DAPI (4´,6-diamino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid ) enthielt, benetzt und mit einem Deckglas versehen wurden.

Für das Mounting Medium wurden 9 ml Glycerin mit 1 ml P-Phenyldiaminlösung (10 mg/ml in PBS; cancerogen!!!) vermischt, bis die Lösung homogen war; dieser wurden 0,225 µl DAPI-Stocklösung (1 mg/ml in H2O, Lagerung bei -20°C) zugegeben. Nach Aliquotierung wurde das Mounting Medium dunkel bei -20°C gelagert.

Mikroskopiert wurden die Zellen bei 1000facher Vergrößerung mit einem Axiophot-Mikroskop der Fa. Zeiss. Photographiert wurde mit einem Ilford HP5 Film.

5.6 Analyse des Ssh1p-Komplexes

5.6.1 Isolierung von Membranen aus Hefezellen

5.6.1.1 Membranpräparationen in analytischem Maßstab

Für Immunoblotanalysen zellulärer Membranproteine wurden Mikrosomen aus 10 OD600nm exponentiell wachsender Hefezellen isoliert. Die Zellen wurden einmal mit 10 mM Azid (4°C) gewaschen und anschließend in 200 µl Homogenisierungspuffer mit 1/1.000 PI (s.u.) resuspendiert. Der Zellaufschluß erfolgte mit Hilfe eines der Zellsuspension entsprechenden Volumens (1 Vol.) an Glasperlen („Glassbeads, 425 - 600 µm, acid-washed“, Fa. Sigma) durch 4 Zyklen von jeweils 30 s mixen auf dem Vortex bei höchster Stufe unterbrochen von 30 s Kühlen auf Eis. Das Zelllysat wurde von den „Glassbeads“ mit zweimal 500 µl Homogenisierungspuffer, der 1/10.000 PI enthielt, abgenommen und bei 400 x g und 4°C für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bei 12.000 x g und 4°C für 10 min zentrifugiert. Das resultierende Membranpellet wurde in 100 µl SDS-Probenpuffer resuspendiert.

Homogenisierungspuffer:

 

SDS-Probenpuffer:

50 mM

Tris pH 7,5

 

2 %

SDS

10 mM

EDTA

 

10 %

Glycerin

(Lagerung bei 4°C)

 

60 mM

Tris-Base

Proteaseinhibitoren-Mix (PI):

 

50 mM

DTT

10 mg/ml

Leupeptin in dH2O

 

0,02 %

Bromphenolblau

5 mg/ml

Chymostatin in DMSO

 

(Lagerung ohne DTT bei Raumtemperatur, mit DTT bei -20°C)

5 mg/ml

Pepstatin in DMSO

(Lagerung bei -20°C)


68

5.6.1.2 Isolierung von Hefemikrosomen in präparativem Maßstab

Hefemikrosomen in präparativem Maßstab wurden je nach Bedarf aus 5 l oder 1 l Hefekultur in exponentiellem Wachstum gewonnen. Aus 5 l Kultur entsprechend etwa 80 g Hefen (Feuchtgewicht) konnten ca. 75.000 eq rauhe Mikrosomen und aus 1 l Kultur entsprechend etwa 7 -12 g Hefen (abhängig vom Stamm) ca. 7.000 - 9.000 eq rauhe Mikrosomen isoliert werden. Dabei ist 1 Äquivalent (eq) an Membranen definiert als 1 ml einer Membransuspension mit einer Absorption von 50 bei 280 nm (OD280nm = 50).

Präparationen aus 5 l Kultur:

Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 3.000 rpm für 10 min geerntet (K80-Zentrifuge) und das Feuchtgewicht bestimmt. Die Zellpellets wurden in 600 ml Waschpuffer (4°C) resuspendiert und erneut für 10 min bei 3.000 rpm und 4°C zentrifugiert (Sorvall RC5-Zentrifuge, GS3-Rotor). Anschließend wurden die Zellpellets in 20 ml 5x-Homo-genisierungspuffer resuspendiert. Der Zellaufschluß erfolgte unter ständiger Kühlung durch zwei dreiminütige Läufe in einer Glasmühle (Dynomill, W. A. Bachofen, Basel, Schweiz). Das Homogenat wurde mit etwa 500 ml 1x-Homogenisierungspuffer aus der Mühle gespült und für 10 min bei 3.000 rpm und 4°C zentrifugiert (Sorvall RC5-Zentrifuge, GS3-Rotor). Der Überstand wurde abgenommen und erneut für 10 min bei 9.000 rpm und 4°C zentrifugiert (Sorvall RC5-Zentrifuge, GS3-Rotor). Aus diesem vom Pellet sauber getrennten Überstand wurden im folgenden die Mikrosomen durch Zentrifugation bei 25.000 rpm und 4°C für 35 min gewonnen (Beckman-Ultrazentrifuge, TI45-Rotor). Der Überstand, das Zytosol, wurde abgenommen und in der Regel für andere Experimente in flüssigem Stickstoff eingefroren. Zurück blieb ein lockeres Membranpellet, das in 30 ml Membranpuffer resuspendiert wurde. Für eine Absorptionsmessung wurden die Mikrosomen 1 : 100 in 2 % SDS verdünnt. Das Verhältnis OD260nm/OD280nm lag in der Regel bei 1,7. Die rauhen Mikrosomen wurden aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C gelagert.

Waschpuffer:

 

5x-Homogenisierungspuffer:

50 mM

Hepes pH 7,5

 

250 mM

Hepes pH 7,5

25 mM

Kaliumacetat

 

50 %

Glycerin

5 mM

Magnesiumacetat

 

25 mM

Kaliumacetat

1 mM

EDTA

 

5 mM

Magnesiumacetat

2 mM

DTT

 

1 mM

EDTA

1 mM

PMSF

 

5 mM

DTT

(DTT und PMSF wurden erst kurz vor Gebrauch dazugegeben)

 

1/1.000

PI

 

2 mM

PMSF

 

 

(DTT, PI und PMSF wurden erst kurz vor Gebrauch dazugegeben)

1x-Homogenisierungspuffer:

 

50 mM

Hepes pH 7,5

 

 

10 %

Glycerin

 

Membranpuffer:

25 mM

Kaliumacetat

 

50 mM

Hepes pH 7,5

5 mM

Magnesiumacetat

 

10 %

Glycerin

1 mM

EDTA

 

2 mM

DTT

2 mM

DTT

 

1/10.000

PI

1 mM

PMSF

 

(DTT und PI wurden erst kurz vor Gebrauch dazugegeben)

(DTT und PMSF wurden erst kurz vor Gebrauch dazugegeben)

 

 

 


69

Präparationen aus 1 l Kultur:

Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 3.000 rpm für 10 min gererntet (K80-Zentrifuge) und das Feuchtgewicht bestimmt. Die Zellpellets wurden in 40 ml Aufschlußpuffer ohne PI (4°C) gewaschen, in 50 ml-Falcontubes überführt und erneut für 10 min bei 3.000 rpm und 4°C zentrifugiert (Heraeus-Zentrifuge). Anschließend wurden die Zellpellets in 20 ml Aufschlußpuffer mit PI pro 10g Feuchtmasse resuspendiert und in 70 ml-Zylinder für den Homogenisator überführt. Nach Zugabe von 10 g „Glassbeads“ (Fa. Sigma) erfolgte der Zellaufschluß im Homogenisator unter CO2-Kühlung durch drei Läufe für jeweils 40 s mit zwischenzeitlicher Kühlung auf Eis. Das Homogenat wurde von den „Glassbeads“ abgenommen (diese wurden einmal mit Aufschlußpuffer nachgespült) und in Heraeus Zentrifugengefäßen für 10 min bei 3.000 rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und erneut für 15 min bei 9.000 rpm und 4°C zentrifugiert. Aus diesem vom Pellet sauber getrennten Überstand wurden im folgenden die Mikrosomen durch Zentrifugation bei 25.000 rpm und 4°C für 35 min gewonnen (Beckman-Ultrazentrifuge, TI70-Rotor). Der Überstand, das Zytosol, wurde abgenommen und in der Regel für andere Experimente in flüssigem Stickstoff eingefroren. Zurück blieb ein lockeres Membranpellet, das in 10 ml Membranpuffer resuspendiert wurde. Für eine Absorptionsmessung wurden die Mikrosomen 1 : 100 in 2 % SDS verdünnt. Das Verhältnis OD260nm/OD280nm lag in der Regel bei 1,5 - 1,7. Die rauhen Mikrosomen wurden aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C gelagert.

Aufschlußpuffer:

 

Membranpuffer:

50 mM

Hepes pH 7,6

 

50 mM

Hepes pH 7,6

250 mM

Saccharose

 

250 mM

Saccharose

150 mM

Kaliumacetat

 

2 mM

DTT

5 mM

Magnesiumacetat

 

(DTT wurde erst kurz vor Gebrauch dazugegeben)

2 mM

DTT

 

1 mM

PMSF

 

1/1.000

PI (beim Aufschluß !)

 

(DTT, PMSF und ggf. PI wurden erst kurz vor Gebrauch dazugegeben)

 

 

5.6.2 Herstellung von Digitoninextrakten aus Hefemikrosomen

Zur Herstellung von Digitoninextrakten für analytische Zwecke (z.B. Immunpräzipitationen) wurden rauhe Mikrosomen zunächst mit einem Hochsalzpuffer gewaschen. Dazu wurden 4.000 eq Mikrosomen für 15 min bei 70.000 rpm und 4°C zentrifugiert (Beckman-Ultrazentrifuge, 100.4-Rotor) und in 3 ml Hochsalzpuffer in einem 5 ml-Dounce-Homo-genisator (aus der S-Serie der Fa. Braun, Melsungen) auf Eis resuspendiert. Die Suspension wurde 30 min auf Eis inkubiert, noch einmal gut homogenisiert und anschließend erneut wie oben zentrifugiert. Der Überstand wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C ge-lagert. Das Pellet wurde in 2 ml Digitoninpuffer im Dounce-Homogenisator auf Eis resuspen-diert, 30 min auf Eis inkubiert und während dieser Zeit hin und wieder vorsichtig homogeni-siert. Es folgte eine Zentrifugation für 30 min bei 70.000 rpm und 4°C (Beckman-Ultrazentri-fuge, 100.4-Rotor). Der resultierende Überstand, der Digitoninextrakt (DE), wurde aliquotiert in flüssigem Stickstoff eingefroren, das Digitoninpellet (DP) mit dem Dounce-Homogenisator in 2 ml dH2O resuspendiert und ebenfalls eingefroren. Gelagert wurden die Proben bei -70°C.


70

Hochsalzpuffer:

 

Digitoninpuffer:

50 mM

Hepes pH 7,6

 

2,5 %

Digitonin

5 %

Glycerin

 

50 mM

Hepes pH 7,6

800 mM

Kaliumacetat

 

10 %

Glycerin

16 mM

Magnesiumacetat

 

400 mM

Kaliumacetat

1 mM

EDTA

 

8 mM

Magnesiumacetat

2 mM

DTT

 

2 mM

DTT

1/5.000

PI

 

1/5.000

PI

(DTT und PI wurden erst kurz vor Gebrauch dazugegeben)

 

(DTT und PI wurden erst kurz vor Gebrauch dazugegeben)

Wurden größere Mengen an Digitoninextrakten benötigt, z.B. für die Reinigung des Ssh1-Komplexes, wurde im wesentlichen wie bei Panzner et al. (1995) beschrieben verfahren: 20.000 eq rauhe Mikrosomen wurden mit einem Dounce-Homogenisator auf Eis in dem dreifachen Volumen Saponinpuffer vermischt, so daß sich eine Endkonzentration von 2,5 % Saponin und 800 mM Kaliumacetat ergab. Es folgte eine Inkubation für 30 min mit anschließender Zentrifugation bei 35.000 rpm und 4 °C für 70 min (Beckman-Ultrazentrifuge, TI70-Rotor), bei der Partikel größer 100 S sedimentiert wurden. Der Überstand, der Saponinextrakt, wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C gelagert. Das Pellet wurde mit einem Dounce-Homogenisator auf Eis in 10 ml Digitoninpuffer resuspendiert, wieder für 30 min inkubiert, währenddessen hin und wieder vorsichtig homogenisiert und anschließend bei 75.000 rpm und 4°C für 30 min zentrifugiert (Beckman-Ultrazentrifuge, 100.3-Rotor). Dabei wurden Partikel größer 60 S sedimentiert. Das resultierende Digitoninpellet wurde gegebenenfalls ein zweites Mal mit dem halben Volumen Digitoninpuffer extrahiert, die Überstände vereinigt und als Digitoninextrakt in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C gelagert.

Saponinpuffer:

3,3 %

Saponin

50 mM

Hepes pH 7,6

5 %

Glycerin

1,07 M

Kaliumacetat

21 mM

Magnesiumacetat

1 mM

EDTA

2 mM

DTT (oder 5 mM beta-Mercaptoethanol)

1/5.000

PI

(DTT und PI werden erst kurz vor Gebrauch dazugegeben)

5.6.3 Präparation von RAMP-Fraktionen

Zur Isolierung ribosomen-assoziierter Membranproteine (RAMP-Fraktion) wurde zunächst verfahren wie bei der Herstellung der Digitoninextrakte. Das Digitoninpellet wurde einer zweiten Digitoninextraktion unterzogen und aus dem daraus resultierenden zweiten Digitoninpellet die ribosomengebundenen Membranproteine durch Behandlung mit Puromycin unter hohen Salzkonzentrationen freigesetzt. Dazu wurde das Pellet in


71

Puromycinpuffer mit dem Dounce-Homogenisator sorgfältig resuspendiert. Nach einer Inkubation von 1 h auf Eis wurde nochmal 0,2 mM GTP hinzugegeben, die Suspension im Wasserbad auf 28°C erwärmt und für weitere 30 min inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation für 40 min bei 100.000 rpm und 4°C (Beckman-Ultrazentrifuge, 100.4-Rotor). Der resultierende Überstand, die RAMP-Fraktion, wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C gelagert.

Puromycinpuffer:

2,5 %

Digitonin

100 mM

Hepes pH 7,6

10 %

Glycerin

800 mM

Kaliumacetat

16 mM

Magnesiumacetat

5 mM

DTT

1/2.000

PI

2 mM

Puromycin-2HCl

0,2 mM

GTP

5.6.4 Antikörper

Proteine wurden in der Regel durch SDS-PAGE und Immunoblotting untersucht. Folgende Peptidantikörper wurden für die Analysen eingesetzt:

Zielprotein

Peptid zur Immunisierung

Herkunft

Ssh1p

CNQVLGVPGAM

Cys + C-Terminus Ssh1p

Ssh1p

MSGFRLIDIVKC

N-Terminus Ssh1p + Cys

Sbh2p

AASVPPGGQRIC

N-Terminus Sbh2p + Cys

Sec61p

CLVPGFSDLM

Cys + C-Terminus Sec61p

Sbh1p

CPTPPGGQRTLQKRK

Cys + Pos. 4-17 Sbh1p

Sss1p

ARASEKGEEKKQSCA

N-Terminus Sss1p + Cys-Ala

Sec62p

CNKKKAINEKAEQN

Cys + C-Terminus Sec62p

Sec71p

CELKINNDGRLVN

Cys + C-Terminus Sec71p

Sec72p

CTARNMAEYNGE

Cys + C-Terminus Sec72p

Die Immunisierung von Kaninchen mit den drei erstgenannten antigenen Peptiden sowie die Affinitätsreinigung der gewonnenen Antiseren wurde wie bei Görlich et al., 1992 beschrieben ausgeführt. Die übrigen Antiseren lagen bereits vor.

Als sekundäre Antikörper in Immunoblots wurden Peroxidase (POD)-gekoppelte Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (Fa. Sigma) oder (für Analysen von Immunpräzipitationen) POD-gekoppeltes ProteinA (Fa. Sigma) verwendet. Die Detektion im Blot erfolgte mit Hilfe des ECL-Systems (Enhanced Chemiluminescence System) der Fa. Amersham.


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5.6.5 Immunpräzipitationen

Für Immunpräzipitationen wurden je Ansatz 100 eq Digitoninextrakt oder 200 eq RAMP-Fraktion mit 20 µl des jeweiligen Antiserums bei 4°C über Nacht unter ständiger Durchmischung auf einem Inkubationsrad inkubiert. Am folgenden Tag wurde 50 µl ProteinA-Sepharose („Protein Sepharose beads, 4 fast flow“, Pharmacia) pro Ansatz zur Entfernung des Ethanols dreimal mit IP-Puffer gewaschen und mit LD-Puffer (Low salt Digitonin buffer) äquilibriert. Die äquilibrierte Sepharose wurde mit dem Immunpräzipitationsansatz 1 h bei 4°C unter ständiger Durchmischung inkubiert. Anschließend wurden die Proben zweimal mit LD-Puffer, dem 200 mM Kaliumacetat zugesetzt war, und einmal mit dH2O gewaschen und schließlich in SDS-Probenpuffer mit DTT aufgenommen. Lagerung der Proben war bei -20°C möglich. Durch Inkubation bei 65°C für 10 min konnten die Präzipitate von der Sepharose abgelöst und mit SDS-PAGE und anschließendem Immunoblot analysiert werden. Dabei wurde im allgemeinen 1/10 des Ansatzes aufgetragen.

IP-Puffer:

 

LD-Puffer:

10 mM

Tris pH 7,5

 

20 mM

Hepes pH 7,5

150 mM

Natriumchlorid

 

10 %

Glycerin

 

 

 

1 %

Digitonin

 

 

 

2 mM

DTT

5.6.6 Reinigung des Ssh1-Komplexes (nach S. Panzner)

Zur Reinigung des Ssh1-Komplexes wurden 20.000 eq Digitoninextrakt zunächst mit SP-Sepharose vorfraktioniert. Dazu wurde der Extrakt mit LD-Puffer soweit verdünnt, daß die Salzkonzentration 150 mM betrug, und mit SP-Sepharose (1 ml Sepharose pro 40 OD280nm-Einheiten) für 1 h inkubiert. Extrakt und Sepharose wurden anschließend in einer offenen Säule getrennt: Zunächst wurde der Austauscher mit 2 Säulenvolumina einer Mischung aus 20 % HD-Puffer und 80 % LD-Puffer gewaschen, anschließend wurden die gebundenen Proteine mit einer Mischung aus 80 % HD-Puffer und 20 % LD-Puffer von der Sepharose eluiert. Nach grober Fraktionierung wurden die Peakfraktionen (spektrometrische Bestimmung) vereinigt und im weiteren verwendet. Das Eluat wurde über Nacht gegen 1 l Puffer (20 mM Hepes pH7,5, 1 mM Magnesiumacetat, 400 mM Saccharose und 2 mM DTT) dialysiert. Ausgefallene Bestandteile wurden durch Zentrifugation abgetrennt (Beckman-Ultrazentrifuge, 100.4-Rotor, 75.000 rpm, 20 min) und die Überstände über eine 20 ml-Säule mit Q-Sepharose Fast Flow, die mit 15 ml LD-Puffer mit 1/10.000 PI äquilibriert war, gegeben. Die dem Durchlauf entsprechenden Fraktionen wurden an eine 1 ml-SP-Sepharose-Säule (HiTrap SP, Pharmacia) gebunden. Es folgte ein Waschschritt mit 5 ml LD-Puffer, bevor mit 30 ml eines linearen Gradienten von 15 bis 65 % HD/LD-Puffer eluiert wurde. Dabei wurden Fraktionen von 1,5 ml aufgefangen.

HD-Puffer:

50 mM

Hepes pH 7,5

1,2 M

Kaliumacetat

10 %

Glycerin

1 %

Digitonin

2 mM

DTT


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5.7 Akkumulation von Präkursor-Proteinen in mutanten Zellen

5.7.1 Klonierung des SSH1-Gens unter Kontrolle des GAL10-Promotors

Ein 1521 bp EcoRV/SnaBI-Fragment aus pSEC61VII, das bis auf die ersten 24 Nukleotide die gesamte kodierende Region des Gens beinhaltete, wurde in die EcoRV-Schnittstelle des Vektors pGEM5Z kloniert. Dabei wurde die Orientierung des Inserts benötigt, bei der die SalI-Schnittstelle des Vektors auf der 5´-Seite des Inserts gelegen war. Das resultierende Plasmid wurde mit pTAR1 bezeichnet. Durch einen Linker, der aus zwei komplementären Oligonukleotiden (1379 und 1380, s.u.) gebildet wurde, wurde die fehlende Startregion des SSH1-Gens rekonstituiert. Dabei wurde direkt vor dem Startcodon eine SalI-Schnittstelle eingeführt und die bei dem ersten Klonierungsschritt verwendete EcoRV-Schnittstelle durch eine stumme Mutation zerstört (Pos. +24: Austausch T gegen C). Der Linker wurde in das mit SalI und EcoRV aufgeschnittene Plasmid pTAR1 ligiert, resultierend in pTAR2. Ein 1588 bp ApaI/SalI-Fragment aus pTAR2 wurde schließlich in die SalI-Schnittstelle des Vektors pF1M kloniert, so daß das SSH1-Gen unter Kontrolle des GAL10-Promotors war (pTX75). Aus pTX75 wurde die GAL10-SSH1-Fusion mit EcoRV und BamHI ausgeschnitten und in den SmaI/BamHI-geschnittenen Hefevektor pRS416 kloniert, resultierend in dem Plasmid pTX88.

5.7.2 Radioaktive Markierung der Zellen und Immunpräzipitation

Aus exponentiell wachsenden Hefekulturen in Minimalmedium wurden pro Immun-präzipitationsansatz 2 OD600nm Zellen entnommen, abzentrifugiert (2.000 rpm, 2 min, Raumtemperatur) und in 300 µl des jeweiligen, vorgewärmten Kulturmediums resuspendiert. Nach Zugabe von 80 µCi [35S]-Methionin wurden die Zellen bei der entsprechenden Inkubationstemperatur (30°C oder 38°C) für 10 min inkubiert. Zugabe von 300 µl eiskaltem Natriumazid beendete die Markierung. Es folgte eine Zentrifugation bei 5.000 rpm für 2 min. Das Zellpellet wurde in 100 µl SDS-Aufschlußpuffer (1 % SDS, 50 mM Tris pH 7,5, PI (1:5.000)) auf Eis resuspendiert und mit 1 Vol. „Glassbeads“ (Sigma) versetzt. Der Zellaufschluß erfolgte durch zwei Zyklen 30 s Lyse auf dem Vortex/30 s Inkubation auf Eis. Nach Zugabe von weiteren 100 µl SDS-Aufschlußpuffer wurde das Lysat für 5 min bei 95°C inkubiert und anschließend mit zweimal 400 µl IP-Verdünnungspuffer (1,25 % Triton, 190 mM NaCl, 60 mM Tris pH 7,5, 6 mM EDTA) von den „Glassbeads“ abgenommen. Nach einer Zentrifugation bei 14.000 rpm für 5-10 min bei 4°C wurde der Überstand für die Immunpräzipitation mit 1 µl Antikörper gegen Kar2p bzw. alpha-Faktor eingesetzt. Die verwendeten Antiseren wurden freundlicherweise von Dr. M. Rose bzw. Dr. R. Schekman zur Verfügung gestellt.

Für Immunpräzipitationen mit dem Invertase-Antikörper (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Howard Riezman, Basel) wurden die Zellen vor der radioaktiven Markierung für 20 - 25 min in Kulturmedium mit 0,1 % Glucose (statt 2 %) inkubiert, um so eine Dereprimierung des Invertase-Gens zu erreichen. Außerdem wurde die Immunpräzipitation in größerem Volumen als für die anderen beiden Antikörper durchgeführt: Der markierte Zelllysat-Überstand (ca. 1 ml) wurde mit 4 ml IP-Puffer (1 % Triton, 0,1 % SDS, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA) verdünnt. 5 µl des zur Verfügung stehenden Invertase-Antikörpers wurden zugesetzt.


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Thu Sep 14 11:45:05 2000